Антибиотикорезистентность и антибиотикопродуктивность микроорганизмов, входящих в состав пробиотических препаратов

0

Химико-биологический факультет

Кафедра микробиологии

 

 

 

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

 

 

Антибиотикорезистентность и антибиотикопродуктивность микроорганизмов, входящих в состав пробиотических препаратов

 

Аннотация

 

 

Дипломная работа состоит из 53 страниц, в том числе 8 таблиц, 3 рисунков, 50 источников литературы и 2 приложений.

В пределах данной работы рассматривается проблема эффективности совместного применения антибиотиков и пробиотиков. Работа состоит из трех глав, а так же введения и заключения.

Во введении объясняется актуальность выбранной темы, а так же цели и задачи, поставленные перед нами в ходе работы.

В первой главе рассмотрены теоретические аспекты совместного применения антибиотиков и пробиотиков.

Вторая глава характеризует материалы и методы, используемые в работе

В третьей главе описаны результаты опытно - экспериментального исследования по проблеме эффективности совместного применения антибиотиков и пробиотиков.

В заключении подведены итоги проделанной работы.

 

 

 

Abstract

 

 

This work consists of 53 pages, including 8 tables, 3 pictures, 50 cources of literature and 2 application.

Besides this work have got addresses the issue of the effectiveness of the use of antibiotics and probiotics. Work consists of 3 chapters as well as the introduction and conclusion.

The introduction explains the relevance of the chosen theme, as well as the goals and targets set out in the work ahead of us.

In the first chapter dealt with theoretical aspects of joint application of antibiotics and probiotics.

The second chapter describes the materials and methods used in the work.

The third chapter describes the results of a pilot study on the effectiveness of the use of antibiotics and probiotics.

Finally we have done the results of the work.

 

 

 

Содержание

 

 

Введение. 6

1 Теоретические основы антибиотикорезистентности и антибиотикопродуктивности микроорганизмов. 8

1.1 Антибиотикотерапия на современном этапе развития. 8

1.2 Негативное влияние антибиотиков на нормофлору человека и животных. 11

1.3 Механизмы антибиотикорезистентности условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. 16

1.4 Использование антибиотикопродуктивности пробиотических штаммов микроорганизмов для профилактики и лечения инфекционных               заболеваний……………………………………………………………………….20

1.5 Эффективность комплексного применения антибиотиков и пробиотиков для лечения инфекционных заболеваний человека и животных. 25

2 Материалы и методы исследований. 31

2.1 Исследуемые микроорганизмы.. 31

2.2 Методы определения антибиотикорезистентности микроорганизмов. 34

2.2.1 Методы определения антибиотикорезистентности микроорганизмов с применением тест-систем «Bio Meriux». 34

2.2.2 Диско-диффузионный метод определения антибиотикорезистентности микроорганизмов. 34

2.2.3 Метод последовательных разведений. 35

2.3 Методы определения антибиотикопродуктивности бактерий, входящих в состав пробиотиков. 36

2.3.1 Определение антибиотикопродуктивности микроорганизмов при культивировании в жидких питательных средах. 36

2.3.2 Совместное применение антибиотиков и пробиотиков. 37

3 Результаты изучения антибиотикорезистентности и антибиотикопродуктивности микроорганизмов, входящих в состав пробиотиков для их совместного применения с антибиотиками. 39

3.1 Изучение антибиотикорезистентности микроорганизмов, входящих в состав пробиотических препаратов «Линекс» и «Колибактерин». 39

3.2 Изучение антибиотикопродуктивности микроорганизмов, входящих в состав пробиотических препаратов «Линекс» и «Колибактерин». 41

3.3 Эффективность совместного применения антибиотиков и пробиотиков 43

Заключение. 44

Список использованных источников. 45

Приложение А Результаты антибиотикорезистентности бактерий. 49

Приложение Б Результаты антибиотикопродуктивности бактерий. 52

 


 

 

 

Введение

 

 

В начале века человечество с нетерпением ждало новых открытий, направленных на борьбу с инфекционными заболеваниями. Необходимость таких открытий была связана с тем, что болезни, вызываемые различными бактериями, уносили миллионы жизней, являясь главной причиной смертности. И вот ожидания оправдались – А. Флеминг открыл пенициллин, произошло самое выдающееся событие первой половины нашего столетия. Открытие Флеминга дало начало совершенно новому научному направлению, знаменовавшему новую эру в биологии и медицине – эру антибиотиков. Их всестороннее изучение обогатило наши представления о зависимости биологической активности органических соединений от химической структуры, приблизило к рациональному созданию антимикробных препаратов с заданными свойствами.

Основной проблемой последних лет является широкое распространение резистентных форм патогенных микроорганизмов и снижение эффективности ряда антибиотиков. Пробиотики, в отличие от антибиотиков, не оказывают отрицательного воздействия на нормальную микрофлору, поэтому их широко применяют для профилактики и лечения дисбактериозов.

Важной особенностью пробиотиков является их способность повышать противоинфекционную устойчивость организма, оказывать в ряде случаев противоаллергенное действие, регулировать и стимулировать пищеварение. В настоящее время в медицине уже широко используют лактобактерин, бифидум-бактерин, колибактерин, бификол, ацилакт и другие пробиотические препараты.

В наши дни большинство врачей назначают антибиотики и пробиотики вместе для того, чтобы снизить неблагоприятные последствия антибиотикотерапии. Это связано с тем, что антибиотики убивают не только патогенную микрофлору, но также и определенные полезные бактерии, которые живут в желудочно-кишечном тракте. Пробиотики помогают в поддержании природного равновесия полезных бактерий в кишечнике. В связи с этим в настоящее время чрезвычайно актуальным является совместное применение антибиотических и пробиотических препаратов.

Таким образом, в качестве объектов наших исследований были выбраны штаммы Escherichia coli M-17 (из пробиотика «Колибактерин»), Enterococcus faecium («Линекс») и Lactobacillus acidophilus («Линекс»).

Целью исследования явилось изучение антибиотикорезистентности и антибиотикопродуктивности исследуемых микроорганизмов для разработки подходов к совместному применению антибиотиков и пробиотиков.

Для достижения поставленной цели нами были выдвинуты следующие задачи:

  • изучить антибиотикорезистентность штаммов Escherichia coli M-17, Enterococcus faecium и Lactobacillus acidophilus, входящих в состав пробиотических препаратов, с использованием различных методов (с применением тест-систем и диско-диффузионным);
  • изучить антибиотикопродуктивность Escherichia coli M-17, Enterococcus faecium и Lactobacillus acidophilus, входящих в состав пробиотических препаратов с использованием дисков из фильтровальной бумаги;
  • определить эффективность совместного применения антибиотиков и исследуемых пробиотиков в условиях in vitro.

 

 

1 Теоретические основы антибиотикорезистентности и антибиотикопродуктивности микроорганизмов

 

1.1 Антибиотикотерапия на современном этапе развития

 

 

Антибиотики (от древнегреческого anti – против, bios – жизнь) – вещества природного или полусинтетического происхождения, подавляющие рост живых клеток, чаще всего прокариотических или простейших.

Эра антибиотиков в современном значении этого слова началась с замечательного открытия пенициллина Александром Флемингом. В 1928 г. английский ученый Александр Флеминг опубликовал статью, принесшую ему всемирную известность: он сообщил о новом, выделенном из колоний плесени, веществе, которое он назвал пенициллином. С этого момента и начинается «биография» антибиотиков, которые по праву считаются «лекарством века».

В 1871–1872 гг. появились работы русских исследователей                    В.А. Манассеина и А.Г. Полотебнова, в которых сообщалось о практическом использовании зеленой плесени для заживления кожных язв у человека. Первые сведения об антагонизме бактерий были обнародованы основоположником микробиологии Луи Пастером в 1877 г. Он обратил внимание на подавление развития возбудителя сибирской язвы некоторыми сапрофитными бактериями и высказал мысль о возможности практического использования этого явления.

Русский врач Э. Гартье (1905) применил кисломолочные продукты, приготовленные на заквасках, содержащих ацидофильную палочку, для лечения кишечных расстройств.

В конце XIX – начале XX в. были открыты антагонистические свойства у спорообразующих бактерий. К этому же периоду относятся первые работы, в которых описываются антагонистические свойства у актиномицетов. Позднее из культуры почвенной спороносной палочки Bacillus brevis Дюбо (1939) удалось выделить антибиотическое вещество, названное тиротрицином, которое представляло собой смесь двух антибиотиков – тироцидина и грамицидина. В 1942 г. советскими исследователями Г.Ф. Гаузе и                     М.Г. Бражниковой был выделен из подмосковных почв новый штамм Bacillus brevis, синтезирующий антибиотик грамицидин С, отличающийся от грамицидина Дюбо.

В 1939 г. Н.А. Красильников и А.И. Кореняко из культуры фиолетового актиномицета Actinomyces violaceus, выделенного ими из почвы, получили первый антибиотик актиномицетного происхождения – мицетин – и изучили условия биосинтеза и применения мицетина в клинике.

А. Флеминг, изучая стрептококков, выращивал их на питательной среде в чашках Петри. На одной из чашек вместе со стафилококками выросла колония плесневого гриба, вокруг которой стафилококки не развивались. Заинтересовавшись этим явлением, Флеминг выделил культуру гриба, определенную затем как Penicillium notatum. Выделить вещество, подавляющее рост стафилококков, удалось только в 1940 г. оксфордской группе исследователей. Полученный антибиотик был назван пенициллином.

С открытия пенициллина началась новая эра в лечении инфекционных болезней – эра применения антибиотиков. В короткий срок возникла и развилась новая отрасль промышленности, производящая антибиотики в крупных масштабах. Теперь вопросы микробного антагонизма приобрели важное практическое значение и работы по выявлению новых микроорганизмов – продуцентов антибиотиков стали носить целенаправленный характер.

В СССР получением пенициллина успешно занималась группа исследователей под руководством З.В. Ермольевой. В 1942 г. был выработан отечественный препарат пенициллина.

Первым антибиотиком актиномицетного происхождения, нашедшим широкое применение особенно при лечении туберкулеза, был стрептомицин, открытый в 1944 г. Ваксманом с сотрудниками. К противотуберкулезным антибиотикам относятся также открытые позже виомицин (флоримицин), циклосерин, канамицин, рифампицин.

Полезная микрофлора нашего организма обеспечивает нам защиту, необходимую для здорового существования. Но, к сожалению, полезные бактерии защитить некому. Даже разовое сильное стрессовое состояние способно привести к уничтожению всех лактобактерий в тонком кишечнике. Одна доза такого препарата, как антибиотик, который вынужденно применяется против инфекций, убивает в тысячи раз больше полезных организму бактерий, чем все население нашей планеты [1].

Способы получения антибиотиков:

  • биосинтетические (природные) антибиотики, их продуцентами выступают специальные штаммы микроорганизмов;
  • полусинтетические антибиотики, получаемые химическим соединением природного антибиотика, точнее его «ядра», с различными химическими радикалами (при этом возможно направленное создание препаратов с заданными свойствами);
  • синтетические антибиотики, источник их получения – химический синтез, возможный после определения структуры природных препаратов (например, синтетическим путём получают левомицетин).

Спектр противомикробной активности в значительной мере определяется составом клеточной оболочки бактерий. В зависимости от количества видов возбудителя, на которые они способны влиять, различают антибиотики широкого и узкого спектра действия. Широкий спектр у тетрациклинов, левомицетина, препаратов последних поколений пенициллинов, цефалоспоринов, макролидов, аминогликозидов. Чем шире спектр действия, тем легче не промахнуться в ситуациях, когда возбудитель заболевания почему-либо не идентифицирован [2].

Противомикробное действие антибиотиков имеет избирательный характер: на одни организмы они действуют сильнее, на другие – слабее или вообще не действуют.

Существует мнение, что антибиотики, из-за своего токсического воздействия приносят организму только вред. Действительно, антибиотики широкого спектра действия уничтожают не только вредные микробы и бактерии, но и полезную микрофлору, состоящую преимущественно из бифидобактерий и лактобактерий, обитающих в кишечнике, которые сдерживают размножение патогенных бактерий и грибов, снабжают организм некоторыми важными витаминами

В настоящее время распространены два подхода к подбору антибиотика:

– назначение комбинированной терапии;

– назначение антибиотиков очень широкого спектра действия, например, из класса карбопенемов (меропенем, имипенем), спектр действия которых позволяет бороться практически со всеми известными возбудителями бактериальных инфекций, исключая синегнойную палочку. Большой минус такого подхода заключается в том, что после карбопенемов очень сложно лечить возникающие инфекции. Данный подход широко распространен в хирургических отделениях для лечения хирургических же инфекций [3].

Антибиотики подавляют различные процессы: синтез компонентов клеточной стенки, функции цитоплазматической мембраны (ЦПМ), синтез белка, транскрипцию и синтез нуклеиновых кислот микроорганизмов.

С учетом механизма действия антибиотики разделяют на три основные группы:

  • ингибиторы синтеза клеточной стенки микроорганизма (пенициллины, цефалоспорины, ванкомицин, тейкопланин и др.);
  • антибиотики, нарушающие молекулярную организацию, функции клеточных мембран (полимиксин, нистатин, леворин, амфотерицин и др.);
  • антибиотики, подавляющие синтез белка и нуклеиновых кислот, в частности, ингибиторы синтеза белка на уровне рибосом (хлорамфеникол, тетрациклины, макролиды, линкомицин, аминогликозиды) и ингибиторы РНК-полимеразы (рифампицин) и др.

По характеру воздействия на бактериальную клетку антибиотики можно разделить на три группы:

  • бактериостатические (бактерии живы, но не в состоянии размножаться);
  • бактерицидные (бактерии погибают, но физически продолжают присутствовать в среде);
  • бактериолитические (бактерии погибают, и разрушаются бактериальные клеточные стенки).

Вышеперечисленные свойства в основном и диктуют выбор антибиотика для лечения инфекционного больного. При этом обязательно учитываются фармакодинамика и фармакокинетика препарата, индивидуальные особенности больного (возраст, состояние иммунитета, сопутствующие заболевания и др.).

Эффективность лечения антибиотиками при современном их назначении во многом определяется следующими факторами:

  • этиологической диагностикой заболевания, клинической диагностикой нозологических форм инфекционного заболевания, выделением возбудителя болезни с последующим определением его чувствительности к антибиотикам;
  • выбором наиболее активного и в то же время наименее токсичного для конкретного больного препарата;
  • определением оптимальной дозы антибиотика, метода его введения для создания концентрации в очаге инфекции, от двух до трех раз превышающей минимальную подавляющую концентрацию (МПК) для данного микроба;
  • знанием и учетом возможных побочных реакций на антибиотик;
  • применением по соответствующим показаниям комбинации препаратов с целью расширения спектра их действия или усиления противомикробного эффекта.

Антибиотик и микроорганизм – это две противоборствующие силы. Изобретатели антибиотиков каждый раз придумывают все более изощренные методы уничтожения микробов, а микробы, эволюционируя, создают порой уникальные, абсолютно непостижимые механизмы защиты.

Антимикробная химиотерапия проводится с использованием лекарственных средств, действие которых избирательно направлено на подавление жизнедеятельности возбудителей инфекционных заболеваний, таких как бактерии, грибы, простейшие, вирусы. Под избирательным действием понимают активность только против микроорганизмов, при сохранении жизнеспособности клеток хозяина, и действие на определённые виды и роды микроорганизмов.

Антимикробные препараты представляют собой самую многочисленную группу лекарственных средств. Так, в России в настоящее время используется более 30 различных их групп, а число препаратов превышает 200. Все антимикробные препараты, несмотря на различия в химической структуре и механизме действия, объединяет ряд специфических свойств. Во-первых, своеобразие антимикробных препаратов определяется тем, что в отличие от других лекарственных средств мишень их действия находится не в тканях человека, а в клетках микроорганизмов. Во-вторых, активность антимикробных препаратов не является постоянной, а снижается со временем, что обусловлено формированием у микробов лекарственной устойчивости (резистентности) [3].

 

 

1.2 Негативное влияние антибиотиков на нормофлору человека и животных

 

 

Человеческий организм – очень строгая саморегулирующаяся система, которую не так легко вывести из равновесия. Однако некоторые факторы все же оказывают влияние на состав микрофлоры кишечника. К ним относятся характер питания, сезон года, возраст. Но эти колебания незначительны и вполне поправимы, так что восстановление экологического равновесия наступает достаточно быстро и небольшой дисбаланс никак не отражается на состоянии здоровья человека. Другое дело, когда в силу серьезных нарушений питания и других причин биологическое равновесие нарушается так, что это влечет за собой цепную реакцию нарушений в работе других звеньев и систем организма. Тогда мы и говорим о развитии дисбактериоза [4].

С современных позиций нормальную микрофлору следует рассматривать как совокупность множества микробиоценозов, характеризующихся определенным составом и занимающих тот или иной биотоп в организме человека. В любом микробиоценозе различают постоянно встречающиеся или характерные виды (автохтонная микрофлора) и добавочные или случайные виды (транзиторная автохтонная микрофлора). Количество характерных видов относительно невелико, зато численно они представлены наиболее обильно. Недостаток или избыток того или иного субстрата или метаболита служит сигналом для усиления роста или гибели соответствующего звена экологической системы [5].

В процессе эволюции автохтонные микроорганизмы превращались во все более взаимосвязанное целое, но одновременно происходило и разделение функций, то есть их специализация. Анаэробные бактерии образуют в процессе своей жизнедеятельности продукты, используемые аэробной флорой, а последние, в свою очередь, создают условия, благоприятные для существования облигатных анаэробов. Подобная интеграция позволяет кишечной экологической системе выступать как единое целое, согласованно работающее в интересах всей системы организма человека, в которой она локализована [6].

До 200 квадратных метров всасывающей поверхности кишечника должны покрываться биологической пленкой из полезных бактерий. При отсутствии биологической пленки из полезных бактерий вся слизистая поверхность крайне обеднена. Она напоминает выжженную землю. Не происходит синтеза витаминов, иммуноглобулинов, не очищаются и не фильтруются токсины, не осуществляется защита от микробов, не происходят жизненно необходимые обменные процессы. Организм намного больше подвергается риску перегрузки органов, прогрессированию инфекций и различных заболеваний [7].

Число кишечных палочек среди других представителей микрофлоры кишечника не превышает 1 %, но они играют важнейшую роль в функционировании желудочно-кишечного тракта. Кишечные палочки являются основными конкурентами условно-патогенной микрофлоры в отношении заселения ими кишечника. Они забирают из просвета кишечника кислород, который вреден для полезных человеку бифидо- и лактобактерий. Кишечные палочки вырабатывают ряд необходимых для человека витаминов: В1, В2, В3, В5, В6, В9, B12, К, участвует в обмене холестерина, билирубина, холина, желчных и жирных кислот, оказывает влияние на всасывание железа и кальция [8].

Согласно положению отраслевого стандарта дисбактериоз кишечника – это клинико-лабораторный синдром, возникающий при целом ряде заболеваний и клинических ситуаций, который характеризуется изменением качественного или количественного состава нормофлоры определенного биотопа, а также транслокацией различных ее представителей в несвойственные биотопы, метаболическими и иммунными нарушениями, сопровождающимися клиническими симптомами у людей. Особое внимание заслуживает установленный факт, что некоторые микробные гены, особенно закодированные в плазмиде гены антибиотикорезистентности, могут передаваться между микроорганизмами и представлять серьезную клиническую проблему [7].

Факторы, которые оказывают пагубное влияние на состояние микрофлоры, разнообразны. Они во много раз уменьшают количество полезных бактерий и этим снижают иммунитет. К таким факторам можно отнести экологическое загрязнение окружающей среды, колебания погодных условий, аллергены, различного вида токсины [6]. Также, благоприятными условиями для возбудителей кишечных заболеваний являются эмоциональные расстройства, стрессы, усталость, которые негативно влияют на микрофлору кишечника. Немаловажным фактором для развития инфекций в кишечнике является прием нужных организму антибиотиков. Но после антибиотиков кишечник истощен – большое количество полезных бактерий уничтожено препаратом, необходимо срочно восстанавливать благоприятный баланс микрофлоры кишечника. После антибиотиков слизистая оболочка кишечника раздражена и уязвима, что способствует развитию различных заболеваний кишечника. Также, после антибиотиков организм обезвожен, что приводит к недостатку питания полезных бактерий, и они гибнут [9].

Если нормальный состав полезной микрофлоры кишечника нарушится, бактерии не смогут справляться со своими функциями в полном объеме. Недостаточное количество иммуноглобулинов, которые защищают организм от инфекций, отзовется снижением иммунитета, а значит, частыми простудами и другими инфекционными заболеваниями. Нарушение обновления клеток слизистой оболочки кишечника приведет к тому, что многие вещества, обязанные оставаться в кишечнике (различные яды и аллергены), начнут всасываться в кровь. Поэтому причины многих аллергических заболеваний (бронхиальной астмы, аллергических дерматитов) часто следует связывать именно с кишечными проблемами [10].

Ухудшение экологической обстановки, приводящее к снижению защитных сил организма человека и всплеску заболеваний, связанных с нарушением бактериального баланса в желудочно-кишечном тракте, обуславливает постоянный интерес к изучению адаптационных механизмов молочнокислых бактерий. Участвующие в симбиозах, как с животными, так и с растениями молочнокислые бактерии интенсивно используются в производстве пробиотических продуктов, натуральных пищевых консервантов, а также в медицине в качестве лечебных средств [11].

Было выявлено, что при колиинфекции, обусловленной гемолитическими E.coli, происходят глубокие изменения в микрофлоре кишечника у детей, ассоциированные с развитием дисбактериоза, изменяется количественный и качественный состав микрофлоры кишечника. Колибактерин давал хороший лечебный эффект у больных, в испражнениях которых выделяли энтерококки, протеи, дизентерийные бактерии и сальмонеллы [6].

Функции нормальной микрофлоры человека разнообразны. Установлено, что нормальная микрофлора участвует в регуляции газового состава кишечника и других полостей организма хозяина, обладает морфокинетическим действием, продуцирует энзимы, участвующие в метаболизме белков, углеводов, липидов и нуклеиновых кислот, продуцирует биологически активные соединения, участвует в водно-солевом обмене, в обеспечении колонизационной резистентности, в рециркуляции желчных кислот и других макромолекул, выполняют иммуногенную и мутагенную-антимутагенную функции, участвуют в детоксикации экзогенных и эндогенных субстратов, является хранилищем микробных, плазменных генов, служит источником энергии для клеток хозяина [12].

Одной из важнейших функций нормальной микрофлоры является ее участие в кооперации с организмом хозяина, в обеспечении колонизационной резистентности, под которой подразумевается совокупность механизмов, придающих стабильность нормальной микрофлоре и обеспечивающих предотвращения заселения организма хозяина посторонними микроорганизмами. В случае снижения колонизационной резистентности происходит увеличение числа и спектра потенциально патогенных микроорганизмов, их транслокация через стенку кишечника или других полостей, что может сопровождаться возникновением эндогенной инфекции или суперинфекций различной локализации [6].

Говоря о роли нормальной микрофлоры, следует иметь в виду, что ее представители при определенных условиях могут выступать и как фактор агрессии. Так, в процессе микробной трансформации в кишечнике могут формироваться продукты с большим биологическим эффектом, чем исходные соединения. Токсины и ферменты, образующиеся при дисбалансе нормальной микрофлоры, так же как и избыточный или недостаточный синтез микробных метаболитов, могут оказывать разнообразные фармакологические эффекты, которые не проявляются в условиях сбалансированного функционирования экологической системы «организм хозяина – его нормальная микрофлора» [9].

Если воздействующие факторы (фармакологические препараты, промышленные яды, пестициды, радиация, стрессы и т.п.) прямо или опосредованно влияющие на фиксацию, выживание и функционирование нормальной, добавочной и случайной микрофлоры, по своей интенсивности превышают компенсаторные механизмы экологической системы «организм хозяина - его микрофлора»; то они будут индуцировать микроэкологические нарушения, характер проявления, степень выраженности и длительность которых зависит от дозы и продолжительности воздействия. В настоящее время известно большое число химических соединений, потенциально способных вызывать микроэкологические нарушения. Это, прежде всего, антибиотики. Помимо антибиотиков такие негативные эффекты у человека вызывают многие наркологические местноанестезирующие вещества, рвотные, обволакивающие, абсорбирующие, слабительные и другие средства, которые, изменяя моторику слизистых, нарушая образование муцина (местообитание автохтонной микрофлоры), так же могут приводить к развитию дисбаланса в составе микрофлоры. Потенциально дисбиотическими агентами могут быть некоторые психотропные препараты, нитриты, нитраты, некоторые гормоны и другие [7].

Среди микроорганизмов, населяющих микрофлору человека и животных, наблюдается множество взаимоотношений: как положительных, так и отрицательных. Одной из наиболее распространенных форм взаимоотношений является антагонизм.

Антагонизм широко распространен в природных микробных сообществах, состоящих из бактерий, грибов, актиномицетов, дрожжей, водорослей, простейших и других микроорганизмов. Широкое понятие антагонизма включает и такие формы взаимоотношений, как конкуренция, хищничество, паразитизм. Нас в данном случае интересует антагонизм в узком смысле, т. е. антагонизм, обусловленный образованием антимикробных веществ и, в частности, антибиотиков. Взаимоотношения, обусловленные продукцией любых антимикробных веществ, можно назвать активным или прямым антагонизмом. В отличие от него существует пассивный, или косвенный, антагонизм, при котором подавление одних микроорганизмов происходит за счет изменения другими микробами условий окружающей среды в неблагоприятную для развития сторону. Антагонизм может быть односторонним (микроорганизм подавляет развитие своего конкурента, не реагируя на воздействие соперника) и двусторонним (происходит взаимное угнетение микроорганизмов в сообществе) [13].

Существует еще понятие направленного (насильственного), или вынужденного, антагонизма. При этих взаимоотношениях наблюдается образование антимикробных веществ (вероятно, различной природы, обладающих разным механизмом действия) только при совместном выращивании двух различных микроорганизмов, которые в условиях изолированного культивирования этих веществ не образуют. Антагонизм между микроорганизмами можно наблюдать и в лабораторных условиях. Активность продуцентов антибиотиков обычно выражают массой антибиотика, содержащейся в единице объема питательной среды, в которой выращивали продуцент [14].

Дело в том, что микроорганизмы – бактерии и грибы – вырабатывают специальные вещества – антибиотики для защиты своей территории обитания от конкурентов. Эти вещества смертельно опасны для врагов, но абсолютно безвредны для хозяина. Они помогают микробам выжить в борьбе за существование, а в последние десятилетия – после внедрения антибиотиков в медицинскую практику – помогают людям, страдающим бактериальными инфекциями. Но идея применить антибиотики для подавления болезнетворных бактерий возникла в науке не сразу [15].

Проявление микробного антагонизма широко распространено среди бактерий, в частности у представителей рода Lactobacillus. Лактобациллы способны подавлять или задерживать рост грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также дрожжевых грибов. Антагонизм лактобацилл опосредован неспецифическими метаболитами, такими как молочная кислота, перекись водорода, лизоцим, а также специфическими белками и пептидами – лактоцинами. Природа, физико-химические свойства и молекулярный механизм действия лактоцинов в настоящее время являются предметом интенсивных исследований [14, 15].

 

 

1.3 Механизмы антибиотикорезистентности условно-патогенных и патогенных микроорганизмов

 

 

В настоящее время не вызывает сомнения, что микроорганизмам свойственны сложная социальная организация и поведения. Популяция микроорганизмов может быть рассмотрена как единая кооперативная система с разделением функциональных ролей между отдельными клетками или даже как единый многоклеточный организм.

Под резистентностью (устойчивостью) понимают способность микроорганизма переносить значительно большие концентрации препарата, чем остальные микроорганизмы данного штамма (вида), или развиваться при таких концентрациях, которые превышают достигаемые в макроорганизме при введении антибиотиков, сульфаниламидов и нитрофуранов в терапевтических дозах [16].

С общебиологических позиций феномен устойчивости следует рассматривать, как одно из проявлений способности микроорганизмов адаптироваться к неблагоприятным условиям внешней среды. Устойчивость к лечебным препаратам способны формировать все возбудители инфекционных болезней (бактерии, вирусы, простейшие). Наиболее общим термином для определения этого феномена является «антимикробная резистентность» – АМР. Устойчивость бактериальных возбудителей инфекционных болезней к различным терапевтическим препаратам определяется как «антибактериальная резистентность», а их устойчивость к антибиотикам (β-лактамам, аминогликозидам, макролидам, тетрациклинам и др.) – веществам биологического происхождения или полусинтетическим производным, полученными на их основе, – как «антибиотикорезистентность» [17].

Резистентные штаммы микроорганизмов возникают при изменении генома бактериальной клетки в результате спонтанных мутаций. Последние не связаны с направленным действием на ДНК бактерии антибактериальных препаратов, которые играют роль лишь селективных агентов. В процессе селекции в результате воздействия химиотерапевтических соединений чувствительные микроорганизмы погибают, а резистентные сохраняются, размножаются и распространяются в окружающей среде. Приобретенная резистентность закрепляется и передается по наследству последующим генерациям бактерий [16].

Резистентность к антимикробным препаратам имеет огромное социально-экономическое значение и в развитых странах мира рассматривается как угроза национальной безопасности. Инфекции, вызванные резистентными штаммами, отличаются длительным течением, чаще требуют госпитализации и увеличивают продолжительность пребывания в стационаре, ухудшают прогноз для пациентов. При неэффективности препаратов выбора приходится использовать средства второго или третьего ряда, которые, зачастую, более дороги, менее безопасны и не всегда доступны. Все это увеличивает прямые и непрямые экономические затраты, а также повышает риск распространения резистентных штаммов в обществе [18].

Основой терапевтического действия антибактериальных препаратов является подавление жизнедеятельности возбудителя инфекционной болезни в результате угнетения более или менее специфичного для микроорганизмов метаболического процесса. Угнетение происходит в результате связывания антибиотика с мишенью, в качестве которой может выступать либо фермент, либо структурная молекула микроорганизма.

Резистентность микроорганизмов к антибиотикам может быть природной и приобретённой.

Истинная природная устойчивость характеризуется отсутствием у микроорганизмов мишени действия антибиотика или недоступности мишени вследствие первично низкой проницаемости или ферментативной инактивации. При наличии у бактерий природной устойчивости антибиотики клинически неэффективны. Природная резистентность является постоянным видовым признаком микроорганизмов и легко прогнозируется [19].

Под приобретённой устойчивостью понимают свойство отдельных штаммов бактерий сохранять жизнеспособность при тех концентрациях антибиотиков, которые подавляют основную часть микробной популяции.

Возможны ситуации, когда большая часть микробной популяции проявляет приобретённую устойчивость. Появление у бактерий приобретённой резистентности не обязательно сопровождается снижением клинической эффективности антибиотика. Формирование резистентности во всех случаях обусловлено генетически: приобретением новой генетической информации или изменением уровня экспрессии собственных генов [16].

Известны следующие биохимические механизмы устойчивости бактерий к антибиотикам:

  • модификация мишени действия;
  • инактивация антибиотика;
  • активное выведение антибиотика из микробной клетки (эффлюкс);
  • нарушение проницаемости внешних структур микробной клетки;
  • формирование метаболического «шунта».

Одним из первых механизмов устойчивости является модификация мишени действия антимикробных препаратов. Структура мишеней действия антибактериальных препаратов (АБП) подвержена изменчивости в результате спонтанных мутаций в кодирующих их генах или иных генетических событий. Часть таких изменений может привести к снижению (или утрате) способности мишени связываться с АБП.

Важную роль в устойчивости микроорганизмов к антибиотикам играет инактивация антимикробного препарата. Механизмы инактивации (ферментативного разрушения или модификации) существовали у бактерий, продуцирующих антибиотики, задолго до начала использования этих веществ в качестве медицинских препаратов. Скорее всего, они выполняли функции защиты бактерии-продуцента от собственного антибиотика. В последующем детерминанты резистентности распространились среди возбудителей инфекционных болезней у человека. В отличие от антибиотиков (веществ природного происхождения), химиотерапевтические препараты микробной клеткой, как правило, не инактивируются.

Немаловажную роль играет активное выведение антимикробных препаратов из микробной клетки (эффлюкс). Известны, как минимум, четыре больших семейства транспортных систем, обеспечивающих активное выведение экзогенных веществ (в том числе и АБП) из бактериальной клетки. «Базовая» активность этих систем во многом определяет уровень природной чувствительности бактерий к АБП. При активации выведения отмечают формирование приобретенной резистентности.

Нарушение проницаемости оболочки микробной клетки является одним из методов устойчивости бактерий к АБП. Этот механизм распространен, в основном, среди грамотрицательных бактерий, обладающих внешней мембраной, и является наименее специфичным в отношении АБП разных групп. Транспорт гидрофильных АБП внутрь микробной клетки осуществляется через пориновые каналы. Эффективность транспорта (как и эффективность эффлюкса) определяет уровень природной чувствительности бактерий к АБП. При нарушении структуры пориновых каналов или их утрате эффективность транспорта АБП резко снижается, что проявляется в формировании устойчивости к нескольким классам препаратов.

Защита мишени относится к наименее изученным механизмам устойчивости микроорганизмов к антибиотикам. Установлено, что бактерии способны синтезировать белки, предотвращающие связывание АБП с мишенью, причем известно, что указанные белки связываются не с АБП, а с мишенью действия и каким-то образом модифицируют ее. Ранее этот механизм был известен только для тетрациклинов, однако сравнительно недавно он был описан и для хинолонов [18].

Устойчивость бактериальных агентов инфекционных заболеваний к антибиотикам является основной причиной, ограничивающей эффективность антибактериальной терапии. Необходимо отметить, что устойчивость возбудителей к антибиотикам может варьировать в различных регионах.

Некоторые возбудители инфекционных заболеваний со времени открытия антибиотиков практически мало изменили характер первоначальной чувствительности к этим препаратам (стрептококки группы А, менингококки, бруцеллы, отдельные сальмонеллы).

Скорость развития и степень выраженности устойчивости связаны с видом и даже штаммом возбудителя. Наиболее быстро и часто резистентность к антибактериальным препаратам возникает у стафилококков, эшерихий, сальмонелл, микоплазм, протея, синегнойной палочки. Среди клостридий, стрептококков группы А, сибиреязвенных и гемофильных палочек резистентные штаммы выделяют сравнительно редко [19].

С момента зарождения антибактериальной химиотерапии было очевидно, что лечебный эффект отдельных АБП проявляется далеко не при всех инфекционных болезнях. Систематическое экспериментальное изучение антибактериального действия различных препаратов позволило установить, что отдельные таксономические группы бактерий существенно различаются по уровню чувствительности, количественным выражением которого является величина МПК к АБП [18].

Оказалось, что при значениях МПК, превосходящих максимально возможные для организма человека и животных, не проявляется клиническая эффективность АБП. Таким образом, на практике под природной устойчивостью понимают сохранение бактериями жизнеспособности в присутствии АБП в концентрациях, реально достижимых в организме человека.

Быстрое распространение разнообразных механизмов резистентности ставит перед клинической медициной и фундаментальной биологией серьезные вопросы. На сегодняшний день для оптимизации антибактериальной терапии совершенно недостаточно оценить уровень антибиотикорезистентности микроорганизма – возбудителя инфекции, фенотипическими методами. При сходных фенотипах, но различных механизмах устойчивости, клиническая эффективность антибактериальных препаратов может существенно различаться. Для формирования стратегии антибактериальной терапии на национальном и региональном уровнях необходима также информация о динамике распространения отдельных механизмов резистентности. И, наконец, детальное знание молекулярных механизмов резистентности является необходимым условием для разработки новых антибактериальных препаратов и средств диагностики устойчивости [18].

Основной целью исследования антибиотикорезистентности является выявление приобретенной устойчивости к антибактериальным препаратам у природно-чувствительных к ним микроорганизмам. Подтверждение наличия у микроорганизмов природной чувствительности или устойчивости к антибиотикам является целью практических исследований.

Исследования по оценке антибиотикорезистентности подлежат чистые культуры микроорганизмов или материал изолированных колоний с плотных питательных сред после первичного посева клинического образца, в последнем случае параллельно необходимо провести идентификацию культуры.

Основой для выбора антибактериальных препаратов, подлежащих включению в исследование, являются данные о природной устойчивости или чувствительности отдельных микроорганизмов или их групп, о распространении среди них приобретенной резистентности, а так же клинической эффективности антибиотиков [20].

В исследование целесообразно включать антибактериальные препараты, обладающие природной активностью в отношении выделенных микроорганизмов и клинически подтвержденных эффективностью при соответствующих инфекциях.

Для значительной части клинически значимых микроорганизмов рациональный выбор препаратов, подлежащих включению в исследование, можно осуществить на основании предварительной групповой идентификации до уровня семейства или рода.

 

 

1.4 Использование антибиотикопродуктивности пробиотических штаммов микроорганизмов для профилактики и лечения инфекционных заболеваний

 

 

Многие бактерии синтезируют антибиотические вещества белково-пептидной природы, убивающие родственные виды или штаммы или тормозящие их рост, или имеющие более широкий спектр антибактериального действия. Эти вещества с весьма специфическим действием получили название бактериоцинов, биосинтез которых кодируется особыми плазмидами и происходит в большинстве случаев на рибосомах.

Бактериоцины – это наиболее высокомолекулярные антибиотики. Так, например, колицины имеют молекулярную массу от 50000 до 90000 Да [21].

Бактериоциногения – биологический феномен, широко распространенный в природе и связанный с антагонизмом у бактерий. Исследования последних лет позволили выделить в самостоятельную категорию явлений антагонистическую активность микроорганизмов, характеризующуюся синтезом белковоподобных антибактериальных веществ с ограниченным диапазоном активности. Считают, что с практической точки зрения эти антибактериальные препараты, действующие на микрофлору избирательно, могут использоваться для нормализации микробного ценоза при некоторых патологиях у человека и животных [22].

Некоторые авторы считают, что бактериоциногения – явление закономерное для большинства, если не для всех видов бактерий, а отсутствие сведений объясняется недостатком исследований. В отличие от известных антибиотиков бактериоцины имеют сравнительно узкий спектр действия, т.к. активны против бактерий того же или филогенетически родственных видов. Особенно это характерно для веществ, выделенных из грамотрицательных бактерий. Для бактериоцинов грамположительных бактерий характерен более широкий спектр действия [23].

Молочнокислые бактерии образуют широкий спектр бактериоцинов: курвацин, диацетин, лактококцин, ацидоцин, лактоцин, плантацин, плантарицин и др. Бактериоцины из молочнокислых бактерий разделяют на две группы. Представители первой группы характеризуются узким спектром антибактериального действия – вызывают гибель организмов, близких к организму-продуценту. В эту группу входят лактоцин В и F-27, амиловорин, педиоцин N5P, теpмофилин А, курвацин А, амиловорин L471, энтерококцин. Бактериоцины, относящиеся ко второй группе, ингибируют рост многих видов грамположительных микроорганизмов, в том числе Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum, Clostridium sporogenes, Staphylococcus aureus, Pediococcus acidilactici, Bacillus spp., Enterococcus faecalis [24]. Перечисленные бактерии вызывают порчу пищевых продуктов, среди них есть и патогенные виды. К бактериоцинам второй группы относятся: педиоцин А, ацидоцин В, диацетин В-1, курвацин FS47, лактицин 3147, плантарицин С, энтерококцины, саливарцин, низин, саркацин 674, мутацин. Показано, что большая часть этих бактериоцинов не токсична и не иммуногенна [21, 25].

Ряд свойств бактериоцинов (инактивация протеиназами и устойчивость к нагреванию) подтверждают их белковую или пептидную природу. Изучение условий образования бактериоцинов представителями некоторых молочнокислых бактерий Lactococcus lactis, Pediococcus acidilactici, Leuconostoc carnosum, Leuconostoc mesenteroides показало, что условия, способствующие накоплению клеточной массы, обеспечивают наибольшую продукцию этих соединений [26].

На биосинтез бактериоцинов, как и у других биологически активных веществ, оказывают влияние условия культивирования продуцента: состав питательной среды, рН, температура, а также время инкубации продуцента [22].

Штамм Lactobacillus plantarum продуцирует плантарицин, обладающий широким спектром действия, максимальный биосинтез которого происходит на мясном бульоне с 0,6 % глюкозы. Бактериоцин термостабилен, имеет молекулярную массу 3500 Да, установлена его аминокислотная последовательность. Казеицин, выделенный из Lactobacillus casei, образуется при росте продуцента как в естественной, так и в синтетической средах [27].

Ряд бактериоцинов, продуцируемых молочнокислыми бактериями, изучен достаточно подробно. Так, из Lactococcus lactis выделен и очищен бактериоцин диацетин В-1, установлена его мол. масса, равная 4300 Да, определена первичная структура, включающая 37 аминокислотных остатков [13]. Бактериоцины (в том числе диацетин В-1), образуемые 14 штаммами Lactococcus lactis, выделенными из молока и молочных продуктов, обладали широким спектром действия, они ингибировали рост как Listeria innocua, так и других видов листерий, а также Pseudomonas acidilactici, Staphylococcus aureus, Lactobacillus. plantarum. Мутацин из Streptococcus mutans термостабилен, чувствителен к протеолитическим ферментам, активен против ряда грамположительных бактерий [28].

Бактериоцин амиловорин 471 образуется Lactobacillus amylovorus DCE 471. Изучены условия культивирования продуцента. Полученный препарат может быть использован в качестве биоконсерванта пищевых продуктов и кормов [29].

Листерии, развивающиеся в пищевых продуктах и приводящие к их порче, подавляются следующими бактериоцинами: курвацином FS47, диацетином В-1, педиоцином, сакацином, энтерококцинами. Способность к ингибированию роста Listeria выявлена у ряда молочнокислых бактерий, образующих бактериоцины: Lactobacillus hetveticus, Leuconostoc gelidum. Ингибирующий эффект определяли в бульоне, в стерильной пище, в процессе приготовления сосисок [30].

Изучен спектр антибиотического действия выделенных лактококков (таблица 1). Установлено, что выделенные активные бактериоцинобразующие штаммы подавляли рост грамположительных бактерий, включая спорообразуютцие бациллы Вacillus subtilis, Вacillus coagulons, Вacillus mycoides, микрококки Micrococcus luteus, Micrococcus flavum и Staphylococcus aureus, что характерно для низина А (Nisaplin) и низинобразующего лактококка штамм МГУ. Штамм 115 проявлял незначительную антибиотическую активность на грамотрицательпые микроорганизмы, а штамм 229 – только на Alcaligenes faecalis. Однако, штаммы 194 и К-205, выделенные из молока и лечебно-профилактического продукта курунга, обладали широким спектром антибактериального действия: эффективно подавляли рост как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий: Alcaligenes faecalis, Proleus vulgaris, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens. Эти штаммы проявляли и фунгицидное действие – подавляли рост Aspergillus niger, Pénicillium chrysogenum, Fusarium oxysporum, Rhodotorula aurantiaca, Candida guilliermondii, что является редким малоизвестным биологическим свойством бактериоцинов, синтезируемым бактериями [31].

 

Таблица 1 – Бактериоцины, вырабатываемые лактобактериями

 

Бактериоцины

Вид лактобактерий

Низин

Lactococcus lactis

Диплацин

Lactococcus lactis (cremoris)

Лактострепцин

Lactococcus spp.

Гельветицин

Lactococcus helveticus

Лактобревин

Lactococcus brevis

Булгарицин

Lactococcus bulgaricus

Лактоцины B, F, G,M

Lactococcus acidophilus

Плантарицин

Lactococcus plantarum

Педиоцин

Pediococcus pentosaccus

 

В 1962 г. было выделено бактериоциноподобное вещество из энтерококка; оно обладало широким спектром антимикробного действия и было нетоксично при введении животным. Показано, что энтероцины (бактериоцины из энтерококков) подавляют развитие инфекции при заражении морских свинок Clostridium septicum [32].

Энтероцин А выделен из Enterococcus faecium, очищен, исследован его химический состав (вещество содержит 47 аминокислотных остатков, включая 4 остатка цистеина, образующего дисульфидные мостики), молекулярная масса составляет 4,289 кДа. По аминокислотной последовательности энтероцин А имеет большое сходство с бактериоцинами из молочнокислых бактерий, например, низином [33].

Энтероцин 4 продуцируется Enterococcus faecalis INIA4, разработана простая методика его выделения. Он активен против грамположительных бактерий [34].

Бактериоцины образуются и другими видами энтерококков. Enterococcus faecalis S-48 образует бактериоцин с молекулярной массой 80 кДа; вещество чувствительно к протеазам, имеет узкий спектр действия – ингибирует только Enterococcus faecalis [35].

Пять бактериоцинов энтерококкового происхождения подавляли рост штаммов L.buchneri, вырабатывающих гистамин при производстве сыра. Это позволило применять штаммы Enterococcus faecalis, продуцирующих эти бактериоцины, в заквасках при производстве сыра, что предотвращало развитие L.buchneri и образование гистамина [27].

Бактериоцины, образуемые Enterococcus faecalis и Enterococcus hirae, ингибируют многие виды листерий и клостридий, вызывающих порчу продуктов питания. Обсуждается возможность использования препаратов бактериоцинов или их продуцентов при производстве молочных продуктов. Получены положительные результаты применения культур энтерококков при производстве сыра [36].

Известно, что многие молочнокислые бактерии синтезируют биологически активные пептиды или белки, обладающие антибиотическим действием, так называемые бактериоцины, которые нашли широкое применение в качестве биологических консервантов в пищевой промышленности. В частности, в 1996 г. Экспертный комитет по пищевым добавкам рекомендовал использование бактерицина низина в качестве консерванта для пищевых продуктов, ему был предоставлен «GRAS» статус (всеобще признанный как безопасный). Показано, что ряд бактериоцинов (низин, лактицин и др.), продуцируемые лактобактериями отличаются по физико-химическим свойствам, молекулярному весу и спектру действия. Каждый штамм внутри одного вида лактобактерий способен образовывать один или несколько определенных, строго специфичных для него бактериоцинов. Способность бактерий образовывать в процессе своей жизнедеятельности бактериоцины связана с условиями культивирования и компонентным составом среды. Так как молочнокислые бактерии относятся к хемоорганотрофам с очень ограниченными синтетическими возможностями, они требовательны к факторам роста, в частности, к витаминам, набору аминокислот [28, 37].

Бактериоциноподобные вещества лактобацилл при взаимодействии с патогенными кишечными палочками вызывают у последних деструктивные процессы, приводящие к гибели клеток-мишеней. Продуцируемые лактобактериями биологически активные соединения, такие как молочная кислота, перекись водорода, лизоцим и антибиотикоподобные вещества уникальны по механизмам своего бактериостатического эффекта в отношении патогенных микроорганизмов.

Лактолин выделен в 1952 г. из L.plantarum его активность проявляется в отношении ряда грамположительных микроорганизмов. А также некоторых грамотрицательных бактерий [31].

Лактоцидин описан в 1950 г. в качестве антибиотического вещества, полученного из L.acidophilum. Это неочищенный концентрат, обладающий широким спектром действия, особенно активен в отношении грамотрицательных патогенных бактерий [27].

Лактобревин выделен Е.И. Красниковым и В.И. Суденко (1967) из клеток L.brevis в виде концентрата. Он слабо диффундирует в агар, не происходит через бактериальные фильтры, неустойчив при хранении. К препарату чувствительны стафилококки, кишечные палочки и серопатогенные их варианты, дизентерийные бактерии [27].

Gratia и другие, изучая антагонистические взаимоотношения между кишечными бактериями, пришли к заключению, что причиной антагонизма является выделение этими бактериями в окружающую среду растворимых в воде антибиотических веществ, получивших название колицинов. Некоторые штаммы E. coli оказывают антагонистическое действие на представителей рода Salmonella и рода Shigella, а также задерживает рост других штаммов E.coli. Колицины, продуцируемые различными штаммами E.coli, отличаются друг от друга по своим физико-химическим свойствам, а также в отношении антибиотического спектра действия. Колицины по своей химической природе являются полипептидами или белками, ни один из которых до сих пор не был получен в очищенном виде. Структура этих соединений также до настоящего времени не установлена. Колицины растворяются в воде и в большинстве органических растворителях и не растворяются в уксусной кислоте. Некоторые препараты колицинов не инактивируются при нагревании до 100 °С. Fredericg описал штамм E.coli К 235, который образует колицин К. Этот антибиотик представляет собой бесцветное, растворимое в воде вещество, содержащее      6, 5 % азота и 1,6 % фосфора. Одна капля раствора (0,02 мл), содержащего 1 микрограмм колицина К в 1 мл полностью подавляла рост 5·107 клеток E.coli на агаре. Jacob с коллегами изучили колицин ML, образуемый штаммом E.coli ML. Этот колицин обладал активностью в отношении других штаммов E.coli. Колицин ML представлял собой вещество белковой природы с высоким молекулярным весом, которое не проходило через целлофан и адсорбировалось на активированном угле при pH от 4,0 до 9,0 [38].

Многим бактериальным видам присуща способность синтезировать разнообразные вещества подавляющие разнообразные виды патогенных и сапрофитных бактерий. Биосинтез многими бактериальными видами групп близких, но не идентичных антибиотиков свидетельствует о том, что среди близких видов и даже штаммов одного вида могут встречаться продуценты веществ с различными свойствами.

Однако обширный класс бактерий, богатый разнообразными веществами, изучен совершенно недостаточно. Даже антагонизм исследован лишь у небольшого числа описанных видов, выделение же антибиотиков предпринималось лишь у немногих из них. Но и при этих условиях у бактерий выявлена способность синтезировать антибиотические вещества, полезные для практики [38].

Перспективность исследования антибиотических свойств бактерий очевидна, она обусловлена их богатыми биосинтетическими возможностями, способностью продуцировать вещества, обладающие такими ценными свойствами, как подавление вирусов растений и животных, торможение опухолевого роста, угнетение разнообразных видов микроорганизмов.

Поэтому целесообразно всемерно развивать работы по выделению и оценке антибиотических веществ, продуцируемых уже в той или иной мере изученными видами, а главное, по изысканию новых антагонистов и продуцентов, что является основой предпосылкой для получения и использования новых антибиотически активных веществ.

Глубокое изучение физиологических особенностей бактерий-антагонистов для уточнения их систематики и выявления закономерностей антибиотикообразования, выделение и всестороннее исследование антибиотической активности полученных веществ и механизма их действия представляет задачу, решение которой будет способствовать получению важных результатов для теории и практики медицины и народного хозяйства.

 

 

1.5 Эффективность комплексного применения антибиотиков и пробиотиков для лечения инфекционных заболеваний человека и животных

 

 

Основной проблемой последних лет является широкое распространение резистентных форм патогенных микроорганизмов и снижение эффективности ряда антибиотиков.

В некоторых случаях, когда можно избежать применения антибиотиков, следует это делать, а если применять, то обязательно определяя чувствительность (разумеется, за исключением экстремальных случаев), назначать альтернативные препараты, максимально безвредные, но эффективные. К таким препаратам можно отнести пробиотики [39].

Пробиотики – живые микроорганизмы, которые при назначении в достаточном количестве оказывают положительное воздействие на здоровье.

Развитие идеи И.И. Мечникова по целенаправленному изменению состава микрофлоры желудочно-кишечного тракта путем энтерального введения культур молочно-кислых бактерий в качестве антагонистов гнилостных микробов оформилось в направление и привело к созданию нового класса бактериальных препаратов – пробиотиков [11].

Слово «пробиотик» сравнительно новое и считается, что его впервые употребил Фердинанд Верджин в 1954 г. В своей статье он сравнивает вредные эффекты антибиотиков и благоприятные эффекты полезных бактерий, называя их «probiotic». Слово пробиотик имеет греческое происхождение: pro – для, bios – жизнь, т. е. «для жизни» или «создающие жизнь» [40].

Верджин определяет пробиотики как смешанную культуру из бактерий. Они благоприятно воздействуют на организм, который принимая их, улучшает свою микрофлору.

В работе Б.А. Шендерова с соавторами (1997) прослежена история появления термина пробиотики и толкование этого термина различными исследователями. По их мнению, термин пробиотик ввели D.M. Lilly и            R.H. Stillwell в 1965 г. для обозначения микробных метаболитов, обладающих способностью стимулировать рост микроорганизмов. В 1970 г. M. Gros,           G. Jhielin назвали пробиотиками биологические препараты, представляющие собой стабилизированные культуры симбионтных микроорганизмов или продукты их ферментации, которые способствуют росту последних [41].

В 1974 г. R.B. Parker назвал пробиотиками микробные препараты (микроорганизмы или их компоненты), регулирующие микрофлору кишечника [29].

  1. Lyons и R.J. Fallоn (1992) назвали наше время «наступающей эпохой пробиотиков». И действительно, многочисленные исследования по разработке новых биопрепаратов и дальнейшее изучение механизма их лечебно-профилактического действия дают основание утверждать, что в XXI в. пробиотики в значительной степени потеснят на рынке традиционные и небезопасные для организма препараты, особенно те, которые применяются с профилактической целью. В последний период наряду с пробиотиками в ветеринарной медицине применяют пребиотики и синбиотики. К пребиотикам относятся препараты немикробного происхождения, способные оказывать позитивный эффект на организм хозяина через селективную стимуляцию роста или активности нормальной микрофлоры кишечника. Пребиотиками, в частности, являются олигосахариды, например фруктоологосахариды, активно стимулирующие рост бифидобактерий. Полагают, что при рациональной комбинации пробиотиков и пребиотиков возможен максимальный позитивный эффект. Получаемые в результате рациональной комбинации пробиотиков и пребиотиков препараты называют симбиотиками [42].

Термин «пробиотики» в настоящее время применяют преимущественно для обозначения фармакологических препаратов или биологически активных добавок (БАД), содержащих штаммы одного или нескольких представителей нормальной микрофлоры человека или микробные метаболиты, благотворно влияющие на человеческий организм [43].

Применение пробиотиков может оказывать следующие воздействия на организм:

  • воздействие на противоинфекционные защитные механизмы;
  • иммунномодуляторное;
  • улучшение барьерных функций;
  • метаболические эффекты;
  • изменение моторики и функции кишечника [34].

По составу выделяют следующие группы пробиотиков:

  • монопробиотики – препараты, содержащие микроорганизмы одного вида и штамма. В свою очередь они подразделяются на бифидосодержащие, колисодержащие, лактосодержащие, бациллярные и сахаромицетосодержащие препараты;
  • полипробиотики содержат бактерии одного вида, но разных штаммов. По составу они могут быть бифидосодержащими, лактосодержащими и бациллярными;
  • комбинированные пробиотики содержат микроорганизмы разных видов. Они представляют собой сочетания бифидо- и лактобактерий, бифидобактерий и апатогенных штаммов сoli, бифидобактерий, лактобактерий и апатогенных энтерококков [40].

Основоположником концепции пробиотиков является Мечников И.И., который еще в начале XX века предложил практическое использование микробных культур-антагонистов для борьбы с болезнетворными бактериями, причем способ применения был очень прост – употреблять простоквашу, обогащенную культурой L.bulgaricus, для профилактики различных заболеваний [7].

Фундаментальные исследования современной биологической, медицинской и ветеринарной науки позволили разработать и внедрить в практику многие пробиотики, основу которых составляют живые микробные культуры. Фундаментальные исследования взаимодействия пробиотиков с организмом животного показали, что процессы взаимодействия намного сложнее, чем простое выдавливание болезнетворных микроорганизмов. Пробиотики, в отличие от антибиотиков, не оказывают отрицательного воздействия на нормальную микрофлору, поэтому их широко применяют для профилактики и лечения дисбактериозов. В то же время эти биопрепараты характеризуются выраженным клиническим эффектом при лечении острых кишечных инфекций. Важной особенностью пробиотиков является их способность повышать противоинфекционную устойчивость организма, регулировать и стимулировать пищеварение.

В работах по изучению фармакокинетики определена выживаемость пробиотиков, доказано, что живые организмы, переходя через желудочно-кишечный тракт, не образуют в нем колоний. Сегодня пробиотики вызывают терапевтический интерес при коррекции дисбиотических нарушений при инвализирующих заболеваний кишечника, таких, как болезнь Крона, язвенный колит. Такие штаммы, как L.lactis, L.plantarum способны секретировать интерлекин-10, продуцировать супероксиддисмутазу и трехлистные пептиды. Некоторые пробиотики оказывают прямое воздействие на слизистую оболочку тонкого кишечника, ее трансформации, ее трофические и ферментативные резервы. Установлено, что в этих процессах участвуют активные субстанции – полиамины (спермин, спермедин), которые обеспечиваю биологические эффекты: стимуляцию лактазы, мальтазы, сахаразы и синтез IgA, компонентов других иммуноглобулинов в слизистой оболочке тонкой кишки [44].

Пробиотики применяют во многих областях:

  • в сельском хозяйстве (стимуляторы роста животных, борьба с желудочно-кишечными расстройствами у животных);
  • в пищевой промышленности (улучшает и восстанавливает полноценное пищеварение; увеличивает синтез витаминов; улучшает абсорбцию кальция; улучшает и нормализует обмен витаминов и минералов.);
  • в качестве моющих пробиотиков (глубокая очистка поверхности, уменьшение количества патогенных бактерий на поверхности, уничтожение неприятного запаха, снижение затрат на очистку);
  • самое главное конечно же в медицине (например, препятствуют развитию вагиноза, язвенной болезни, дисбактериоз кишечника, острые кишечные инфекции, предродовая подготовка беременных и т. д.) [9]

Пробиотики обладают морфокинетическим действием, участвуют в регуляции желчных кислот, обеспечивают колонизационную резистентность и предотвращают транслокацию патогенов, стимулируют синтез эндогенного интерферона, принимают участие в иммуногенезе и репаративных процессах в различных биотопах организма. Таким образом, бактериальные клетки пробиотика можно рассматривать как биокатализаторы многих жизненно важных процессов в организме человека [45].

В России отмечается особенная приверженность к использованию пробиотиков при самых различных состояниях, однако доказательный базис для такого широкого применения данной группы лекарственных средств до последнего времени отсутствовал. Только с конца 1990-х годах (а в основном с 1998 г.) в Национальной медицинской библиотеке США стали появляться публикации результатов контролируемых исследований и мета-анализы, в которых эффективность пробиотиков оценивалась с позиций доказательной медицины. Ряд исследований посвящен применению пробиотиков для профилактики различных состояний, в первую очередь инфекций желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и дыхательной системы, а также антибиотикассоциированной диареи и других заболеваний [20].

Показания к применению пробиотика:

  • нарушение микрофлоры ЖКТ, вызванное острыми и хроническими инфекциями, поражениями пищеварительного тракта, глистными инвазиями, приемом антибиотиков и другими факторами, губительно влияющими на нормальную микрофлору;
  • иммунодефициты;
  • витаминная недостаточность;
  • повышенные физические и умственные нагрузки;
  • изменение характера и режима питания;
  • профилактика дисбиотических нарушений ЖКТ [32].

Современные пробиотики должны соответствовать следующим критериям:

  • содержать микроорганизмы, пробиотический эффект которых доказан в рандомизированных контролируемых исследованиях;
  • обладать стабильной клинической эффективностью;
  • быть непатогенным и нетоксичным, не вызывать побочных эффектов при длительном применении;
  • оказывать положительное влияние на организм хозяина (например, увеличивать резистентность к инфекциям);
  • обладать колонизационным потенциалом, т. е. сохраняться в пищеварительном тракте до достижения максимального положительного эффекта (быть устойчивым к низкой кислотности, органическим и желчным кислотам, антимикробным токсинам и ферментам, продуцируемым патогенной микрофлорой);
  • быть стабильным и сохранять жизнеспособные бактерии при длительном сроке хранения [46].

Принципиальные требования предъявляются и к штаммам бактерий, на основе которых создаются пробиотики. Они должны:

  • быть выделены от здоровых людей и идентифицированы до вида по фено- и генотипическим признакам;
  • иметь генетический паспорт;
  • обладать широким спектром антагонистической активности в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов;
  • не должны угнетать нормальный микробиоценоз;
  • быть безопасными для людей, включая иммунологическую безопасность;
  • производственные штаммы должны быть стабильными по биологической активности и удовлетворять технологическим требованиям [47].

Согласно принятой в 1996 г. классификации препараты, нормализующие кишечную микрофлору, разделяются на 4 поколения.

Пробиотики первого поколения: бифидумбактерин и лактобактерин применяются как монопрепараты, преимущественно, для профилактики заболеваний или для коррекции микрофлоры в случае дисбактериоза I степени. При острых кишечных инфекциях (ОКИ) данные пробиотики рациональнее применять либо в комплексной терапии с другими биопрепаратами и сорбентами, либо в реабилитационных курсах [38].

Пробиотики второго поколения состоят из споровых бацилл и дрожжеподобных грибов. Споровые препараты содержат бациллы IP (бактисубтилл, флонивин) или сенную палочку в виде одного штамма (бактиспорин и споробактерин) или в сочетании с лихиениформными бациллами (биоспорин). Препарат из дрожжеподобных грибов (энтерол) включает сахаромицеты. Несмотря на то, что споровые бациллы и дрожжеподобные грибы не относятся к облигатной микрофлоре человека, при попадании в ЖКТ они выполняют частично сходные функции с препаратами из нормальной флоры. В основе их действия лежит способность подавлять патогенные и условнопатогенные бактерии [34].

Самоэлиминирующиеся антагонисты назначаются при легких и средне-тяжелых формах ОКИ, острых неинфекционных диареях, субкомпенсированных дисбактериозах, обычно коротким курсом от пяти до семи дней, с последующим долечиванием пробиотиками из нормальной микрофлоры [16].

Препарат энтерол рекомендуется также для лечения антибиотикоассоциированных диарей, т. к. доказана его антагонистическая активность в отношении клостридий [48].

Пробиотики третьего поколения представляют собой комбинированные препараты. Это могут быть поликомпонентные пробиотики, состоящие из нескольких симбиотических штаммов бактерий одного (ацилакт, аципол) или разных (линекс, бифиформ) видов, усиливающих действие друг друга. К комбинированным препаратам относятся также лекарственные средства, в которых к активно действующим бактериям добавлены вещества, повышающие эффективность пробиотика или способные сами дополнительно нормализовать кишечную микрофлору. Так в препаратах бифидумбактерине в порошке и бифилизе наряду с бифидобактериями содержатся бифидогенный моносахарид лактоза или фактор неспецифической защиты лизоцим, поликомпонентный пробиотики бифиформ дополнительно включает лактулозу, а аципол –иммуномодулирющую субстанцию – полисахарид кефирного грибка. Пробиотики третьего поколения такие, как ацилакт, аципол, бифиформ назначаются в случаях заболеваний ОКИ средне-тяжелой формы (при тяжелой форме – только в комплексной терапии). При лечении хронических гастроэнтерологических заболеваний и коррекции микрофлоры кишечника при дисбактериозах различной степени используются наряду с вышеуказанными также бифидумбактерин в порошке, линекс, бифилиз [38, 46].

Пробиотики четвертого поколения представлены двумя сорбированными препаратами – бифидумбактерином форте и пробифором. Сорбированные пробиотики содержат бифидобактерии, иммобилизованные на частицах измельченного угля (количество бифидобактерий в пробифоре на порядок больше, чем в бифидумбактерине форте). За счет такой иммобилизованной структуры сорбированные бифидобактерии эффективно колонизируют слизистую оболочку кишечника, оказывая более выраженное протективное действие, чем несорбированные аналоги. Такие препараты лучше, чем их несорбированные формы подавляют патогенные и условнопатогенные микроорганизмы при дисбактериозе, более успешно восстанавливают защитную микрофлору [34, 49]

 

 

2 Материалы и методы исследований

 

2.1 Исследуемые микроорганизмы

 

 

Кишечная палочка – факультативный анаэроб, грамотрицательная палочка семейства Enterobacteriaceae, рода Escherichia, обитает в кишечнике животных и человека, подвижна, спор не образует.

Кишечная палочка впервые выделена и описана в 1885 г. Т. Эшерихом.

Одни из биотипов кишечной палочки (банальные штаммы) являются комменсалами кишечного тракта людей и животных, другие относятся к паразитам, вызывающим заболевания. Длительное применение антибиотиков широкого спектра действия приводит к гибели кишечной палочки и развитию дисбактериоза.

Штамм E.coli М-17 обладает выраженной антагонистической активностью против патогенных кишечных палочек, шигелл, низкой в отношении стафилококков, в том числе S.aureus, С.albicans, Streptococcus spp.; высокими адгезивными свойствами.

Бактерии хорошо растут на простых питательных средах: мясопептонном бульоне (МПБ), мясопептонном агаре (МПА). На МПБ дают обильный рост при значительном помутнении среды; осадок небольшой, сероватого цвета, легкоразбивающийся. Образуют пристеночное кольцо, пленка на поверхности бульона обычно отсутствует. На МПА колонии прозрачные с серовато-голубым отливом, легко сливающиеся между собой. На среде Эндо образуют плоские красные колонии средней величины. Красные колонии могут быть с темным металлическим блеском (Е.coli) или без блеска (E.aerogenes). Для лактозоотрицательных вариантов кишечной палочки характерны бесцветные колонии. Им свойственна широкая приспособительная изменчивость, в результате которой возникают разнообразные варианты, что усложняет их классификацию

Лактобактерии (Lactobacillus) – род грам положительных факультативно анаэробных или микроаэрофильных бактерий. Один из важнейших в группе молочнокислых бактерий, большинство членов которой превращают лактозу и другие углеводы в молочную кислоту. В большинстве случаев они непатогенны, многие виды выполняют положительную роль в питании человека. У человека они постоянно присутствуют в кишечнике, во влагалище, где являются симбионтами и составляют значительную часть микрофлоры кишечника. Многие виды принимают участие в разложении остатков растений. Они продуцируют молочную кислоту, а кислая среда препятствует росту многих патогенных бактерий и грибов.

Некоторые виды Lactobacillus нашли применение в промышленности для производства кефира, йогурта, сыров. Лактобактерии участвуют в процессах засолки овощей, в приготовлении маринадов и других продуктов, используют также синтетическую и биотехнологическую молочную кислоту. Брожение силоса приводит к торможению развития плесеней, что обеспечивает животных ценным кормом.

Штаммы молочнокислых бактерий используют в производстве медицинских препаратов, предназначенных для восстановления нормальной микрофлоры кишечника (после инфекционных заболеваний, антибиотикотерапии).

Бифидо- и лактобактерии составляют до 90 % микрофлоры ЖКТ и способствуют полноценному пищеварению. На этом их полезная роль не заканчивается – они ещё необходимы для создания «эффекта экранирования» слизистой ЖКТ. То есть, они препятствуют проникновению болезнетворных бактерий; выведения из организма различных токсинов, канцерогенов, аллергенов, солей тяжелых металлов (недаром их считают «второй печенью»); синтеза иммуноглобулинов и интерферона, повышающего иммунитет организма; утилизации белков – аллергенов, которые не успели перевариться в верхних отделах желудочно-кишечного тракта; синтеза и всасывания витаминов, в первую очередь, витаминов группы В, Д и важных аминокислот и микроэлементов: железа, кальция. Несмотря на такое разнообразие полезных функций, они очень уязвимы.

Но на этом полезные свойства лактобактерий не заканчиваются: они нейтрализуют действие фенольных ферментов, поддерживающих разрастание раковых клеток в кишечнике, препятствуя тем самым развитию рака молочной железы и толстого кишечника.

L.acidophilus естественно встречается в пищеварительном тракте и вагине человека и некоторых других млекопитающих. L.acidophilus ферментирует лактозу до молочной кислоты, подобно многим другим (хотя и не всем) молочнокислым бактериям. Некоторые родственные виды производят этанол, диоксид углерода и уксусную кислоту, однако L.acidophilus является гомоферментативным организмом, который производит только молочную кислоту. Как и большинство бактерий, L.acidophilus могут быть убиты нагревом, влажностью или прямым солнечным светом.

Enterococcus faecium – вид энтерококков, входящий в состав нормальной микрофлоры пищеварительного тракта человека, а также некоторых млекопитающих. По принятой ранее классификации энтерококки относились к стрептококкам класса D и Еnterococcus faecium назывались Streptococcus faecium

Энтерококки – молочнокислые грамположительные бактерии, не образующие спор и капсул, факультативные анаэробы (способные использовать энергию брожения и поэтому, жить и при больших и при ничтожных количествах кислорода). Оптимальная температура культивирования энтерококков от 35 °С до 37 °С. Энтерококки осуществляют метаболизм бродильного типа, ферментируют разнообразные углеводы с образованием молочной кислоты, но не газа, снижая кислотность среды от 4,2 до 4,6 pH. Энтерококки высокорезистентны к различным факторам внешней среды и дезинфицирующим средствам, могут длительное время сохранять жизнеспособность на предметах домашнего обихода, выдерживают нагревание до 60 °С в течение 30 минут.

Bacillus subtilis – грамположительная, спорообразующая аэробная почвенная бактерия. Палочковидная бактерия, размер 3-5·0,6 мкм. Споры овальные, не превышающие размер клетки, расположены центрально. Перитрихиальное расположение жгутиков, подвижная. Колонии сухие, мелкоморщинистые, бархатистые, бесцветные или розовые. Край колонии волнистый. Растёт на МПА, МПБ, а также на средах, содержащих растительные остатки, простых синтетических питательных средах для гетеротрофов. Хемоорганогетеротроф, аммонифицирует белки, расщепляет крахмал, гликоген. По данным из Большой советской энциклопедии (2001 года), непатогенна. По данным из зарубежных источников, также непатогенна.

Bacillus cereus – грамположительная, спорообразующая почвенная бактерия. Вызывает токсикоинфекции у человека. Хемоорганогетеротроф, факультативный анаэроб, способен к нитратредукции. Растёт на простых питательных средах, на плотных питательных средах обрузует плоские, мелкобугристые, слегка вогнутые, матовые колонии. Край волнистый. Клетки крупные от 1 до 4 мкм, эндоспоры расположены центрально, не превышают размер клетки. Жгутики расположены перетрихиально.

Морфологически Bacillus cereus напоминает сибиреязвенную палочку; основные отличия – подвижность и гемолитическая активность. В мазках бактерии располагаются в виде штакетника. Температурный оптимум    роста 30 °С; оптимум рН от 7 до 9,5. На агаре возбудитель образует «распластанные» колонии с неровными краями; колонии окружены широкой зоной гемолиза. Со временем колонии приобретают характерный восковидный вид. В жидких средах образуют нежную плёнку на поверхности, белый хлопьевидный осадок и помутнение бульона. Бактерии проявляют высокую протеолитическую активность и разжижают желатину от 1 до 4 суток; все штаммы образуют лецитиназу и ацетоин. Образуют кислоту на средах с глюкозой и мальтозой.

Staphylococcus aureus – грамположительная бактерия, имеет шаровидную форму, которую часто находят в носу и на коже людей. Кокки располагаются в виде гроздьев винограда. Это факультативный анаэроб, хемоорганогетеротроф, каталаза и коагулаза положительный (это означает, что он может производить ферменты каталазу и коагулазу). Под микроскопом имеет золотистую окраску в отличие от большинства бактерий, которые чаще всего бесцветны. Хорошо растет на обычных средах, в частности на кровяном агаре.

Salmonella enteritidis – грамотрицательная палочка, размером 2¸5 мкм в длину и от 0,7 до 1,5 мкм в ширину, ни спор, ни капсул сальмонеллы не образуют. Они факультативные анаэробы, хемоорганотрофы, оксидаза отрицательные, каталаза отрицательные, имеют жгутики, подвижны, хорошо растут на обычных питательных средах при температуре от + 6 °C до + 46 °С, оптимум роста + 37 °С.

 

 

2.2 Методы определения антибиотикорезистентности микроорганизмов

 

2.2.1 Метод определения антибиотикорезистентности с применением тест-систем «Bio Merieux»

 

 

При проведении исследования нами использовались тест-системы «Bio Merieux» (Франция), предназначенные для определения антибиотикорезистентности в течение от 18 до 24 ч. Они состоят из прозрачной полимерной пластинки с 20 микропробирками объемом 0,25 мл, содержащими разные антибиотики различной концентрации.

В жидкую питательную среду добавляем 0,05 мл инокулюма, затем во все микропробирки вносим по 0,135 мл суспензии бактерий. Посевы инкубируем при температуре 37 оС в течение от 18 до 24 ч. Результаты учитываем визуально с контрольными лунками, заполняем бланки с кодами цифрового профиля.

 

 

2.2.2 Диско-диффузионный метод определения антибиотикорезистентности микроорганизмов

 

 

Диско-диффузионный метод (ДДМ) определения чувствительности основан на способности антибиотика диффундировать из стандартных дисков, пропитанных антибиотиками в питательную среду, угнетая рост микрооганизмов, посеянных на поверхность агара [47].

При использовании этого метода в стерильные чашки Петри диаметром 100 мм, расположенные на горизонтальной поверхности, наливают по 20 мл расплавленного питательного агара. Перед посевом поверхность среды должна быть подсушена для того, чтобы посевной материал мог ровно распределиться и легко впитаться. В качестве посевного материала используется суточная культура тест-организма, приготовленная с агаровой культуры. 0,1 мл бактериальной взвеси наносится на поверхность агара и равномерно распределяется шпателем. Затем на поверхность засеянной среды стерильным пинцетом накладывают диски, пропитанные различными антибиотиками. В каждой чашке может быть испытано действие нескольких антибиотиков (до 5 или 6). Непосредственно после аппликации дисков чашки Петри помещают в термостат кверху дном и инкубируют при температуре 37 оС в течение от 18 до 24 часов.

Оценка результатов ведется по наличию зон задержки роста микробов вокруг дисков, что свидетельствует либо о чувствительности возбудителя к препарату, либо об его устойчивости к данному антибиотику (рисунок 1).

 

1 – тест-организм, посеянный «газоном», 2 – стандартные диски, содержащие антибиотики, 3 – устойчивость тест-организма,                       4 – чувствительность тест-организма.

Рисунок 1 – Схема определения антибиотикорезистентности

 

Отсутствие роста тест-организма на расстоянии более 10 мм от диска с антибиотиком будет указывать чувствительность штамма. Если же тест-микроорганизм развивается в непосредственной близости от диска, пропитанного антибиотиком, то это означает, что данный микроорганизм устойчив в действию антибиотика. Диаметр зон задержки роста с учетом диаметра самого диска измеряют с точностью до 1 мм.

 

 

2.2.3 Метод последовательных разведений

 

 

Данный метод используется для определения количества антибиотика в культуральных жидкостях, растворах или экстрактах. Для работы подготавливаем питательный бульон, пригодный для развития выбранного тест-организма. Непременным условием опыта является прозрачность бульона. Одновременно с этим подготавливаем и культуру тест-организма. Стерильный питательный бульон разливаем в чистые стерильные пробирки. Количество бульона должно обеспечивать нужную степень разведения изучаемого антибиотика.

Подготавливаем ряд пробирок с питательным бульоном по 3 мл. В первую пробирку вносим 6 мл физиологического раствора для разбавления антибиотика (разведение 1:1), тщательно перемешиваем и 3 мл смеси переносим во вторую пробирку (разведение 1:2). Затем 3 мл смеси последовательно переносим в 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10 пробирку в результате получая разведения 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512. Из последней пробирки 3 мл бульона удаляем (рисунок 2).

 

 

 

           
           

 

Рабочий раствор антибиотика

 

3мл

сброс

 

                    1:1      1:2    1:4    1:8    1:16  1:32  1:64  1:128 1:256 1:512

Рисунок 2 – Алгоритм определения чувствительности одной исследуемой культуры к одному АБП методом разведений в жидкой питательной среде

 

В полученный ряд разведений антибиотического вещества в каждую пробирку вносим по 0,03 мл клеток тест-организмов. Затем пробирки помещаем в термостат продолжительностью от 20 до 24 ч. при температуре       37 оС. После этого в пробирках определяем визуально наличие или отсутствие роста тест-организма по сравнению с контролями. В опыте используются три контроля: контроль среды, контроль антибиотика, контроль микроорганизма. Наличие роста микроорганизма в бульоне (помутнение бульона) или на поверхности агара свидетельствует о том, что данная концентрация антибиотика недостаточна, чтобы подавить его жизнеспособность. По мере увеличения концентрации антибиотика рост микроорганизма ухудшается. Первую наименьшую концентрацию антибиотика (из серии последовательных разведений), где визуально не определяется бактериальный рост принято считать МПК [50].

На основании получаемых количественных данных (диаметра зоны подавления роста антибиотика или значения МПК) микроорганизмы подразделяют на чувствительные, умеренно резистентные и резистентные. Затем мы отбираем те антибиотики, к которым условно-патогенные микроорганизмы оказались умеренно чувствительными, а бактерии – устойчивы, для дальнейшего совместного использования антибиотика и пробиотика.

 

 

2.3 Методы определения антибиотикопродуктивности бактерий входящих в состав пробиотиков

 

2.3.1 Метод определение антибиотиотикопродуктивности микроорганизмов при культивировании их в жидких питательных средах

 

 

Антибиотикопродуктивность бактерий определяют путем культивирования бактерий в жидких питательных средах с определенной периодичностью, для того, чтобы определить на какое время приходится наибольшая выработка антибиотикоподобных веществ. Для того, чтобы это определить, мы использовали метод с агаровыми лунками.

Ход исследования при методе с агаровыми лунками состоит из следующих этапов:

а) в стерильные пробирки со средой вносили инокулят и инкубировали при температуре 37 оС в течение 48, 72 и 96 часов (столь длительный срок инкубирования связан с тем, что антибиотические вещества вырабатываются микроорганизмами в случае конкуренции за питательные вещества, либо при дефиците питательных веществ);

б) после инкубирования проводили центрифугирование при 1500 оборотах в минуту в течение 10 минут. Затем фильтровали надосадочную жидкость с использованием стерильных надосадок на шприцы с PES мембраной (диаметр фильтра – 25 мм, диаметр пор – 0,22 мм);

в) подготовленные чашки Петри с МПБ засеивали тест-организмы: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enteritidis;

г) затем ранее приготовленные диски из фильтровальной бумаги обмакивали в фильтратом и выкладывали диски (диаметром 10мм) на чашки с тест-культурами;

д) чашки помещали в термостат на время от 20 до 24 ч. при температуре 37 оС. За это время вокруг колоний образуются зоны отсутствия роста тест-организма. Произвели замер диаметров зон, образовавшихся вокруг лунок.

 

 

2.3.2 Совместное применение антибиотиков и пробиотиков

 

 

Выше изложенные методы изучения антибиотикорезистентности и антибиотикопродуктивности послужили ключом для разработки подходов к совместному применению антибиотиков и пробиотиков (рисунок 3).

 

Рисунок 3 – Схема определения индивидуального и комплексного влияния антибиотика и пробиотика на подавление тест-организма

 

Чашки Петри с МПА засеяли сплошным «газоном» тест-организмами (S.aureus, E.coli, S.enteritidis, B.subtilis, B.cereus). Затем наложили диски из фильтровальной бумаги: первый – фильтрат, второй – антибиотик определенной концентрации, к которому условно-патогенные микроорганизмы оказались умеренно чувствительными, а третий – фильтрат и антибиотик, для того, чтобы узнать их влияние друг на друга.

На основании полученных данных была проведена статистическая обработка. Были посчитаны средние значения с ошибкой средней, достоверность результатов. Для обработки данных использовалось программное обеспечение Microsoft Office Excel, которое является модулем программного обеспечения анализа и обработки данных AtteStat.

 


 

 

3 Результаты изучения антибиотикорезистентности и антибиотикопродуктивности бактерий, входящих в состав пробиотиков для их совместного применения с антибиотиками

 

 

Целесообразность одновременного применения пробиотиков с большинством используемых в клинической практике антибиотиков в настоящий момент является предметом дискуссии, поскольку пробиотические микроорганизмы чувствительны ко многим антимикробным препаратам. Установлено, что антибиотикорезистентность бактерий существенно отличается у различных штаммов. Данные по антибиотикорезистентности необходимо обязательно учитывать при отборе штаммов для конструирования препаратов-пробиотиков [24].

 

 

3.1 Изучение антибиотикорезистентности микроорганизмов, входящих в состав пробиотических препаратов «Линекс» и «Колибакиерин»

 

 

Первоначальным этапом нашего исследования было определение антибиотикорезистентности пробиотических препаратов («Колибактерин» и «Линекс») на основе Escherichia coli М 17, Enterococcus faecium, Lactobacillus acidophilus с применением тест-систем «Bio Merieux» и ДДМ.

Критерием отбора антибиотиков для ДДМ, к которым исследуемые штаммы микроорганизмов проявляли резистентность послужило определение антибиотикочувствительности с использованием тест-систем «Bio Merieux» чтобы отобрать антибиотики, к которым исследуемые микроорганизмы устойчивы, а тест-организмы – умеренно-чувствительны. Сравнительные данные по обоим методам приведены в таблицах А.1 и А.2.

В таблице А.1 представлены антибиотики из тест-систем «Bio Merieux». Все три исследуемых штамма оказались устойчивы к пенициллину, ампициллину, к цефуроксиму (из группы цефалоспоринов), к линкомицину (из группы линкозамидов), колистину (из группы полимиксинов). Escherichia coli и Enterococcus faecium оказались устойчивы к тикарциллину, мециллинаму (из группы пенициллинов), к цефтазидиму (из группы цефалоспоринов), к имипенему (из группы карбопенемов), к эритромицину и ристомицину (из группы макролидов). Escherichia coli M17 устойчива к аминогликозиду (из группы пенециллинов), цефатоксиму, цефатетану (из группы цефалоспоринов), гентамицину (из группы аминогликозидов). В свою очередь Enterococcus faecium проявляет устойчивость к цефокситину (из группы цефалоспоринов), стрептомицину, канамицину (из группы аминогликозидов), азтреонаму (из группы монобактамов). Lactobacillus acidophilus оказался устойчивым к стрептомицину и канамицину (из группы аминогликозидов), цефоперазону (из группы цефалоспоринов), тетрациклину (из группы тетрациклины). Эти антибиотики нам необходимы в дальнейших исследованиях определениях антибиотикорезистентности ДДМ.

Из тест-рганизмов Snteritidis умеренно-чувствительна к пенициллину, ко всем антибиотикам из группы аминогликозидов, к цефуроксиму, цефокситину, цефоперазону, цефиксиму (цефалоспорины), к хлорамфениколу (левомиценины). S.aureus и E.coli устойчивы к пенициллину, но умеренно-чувствительны к ампициллину, мециллинаму (пенициллины), к стрептомицину (аминогликозиды).

Оба штамма бактерии рода Bacillus оказались устойчивы к пенициллину, оксациллину, тикарциллину, мециллинаму (из группы пенициллинов), к цефуроксиму, цефтазидиму, цефлулодину, цефиксиму (из группы цефалоспоринов), к имипенему (из группы карбопенемов), к линкомицину (из группы линкозамидов), к хлорамфениколу (из группы левомицетинов), к азтреонаму (из группы монобактамов) и к колистину (из группы полимиксинов).

Антибиотикорезистентность проверяли также ДДМ при использовании стандартных дисков, содержащих антибиотики.

По результатам ДДМ (таблица А.2) исследуемые микроорганизмы оказались устойчивыми к пенициллину, ампициллину, оксациллину (пенициллины), Escherichia coli M17 и Enterococcus faecium к эритромицину, пристамицину (макролиды), линкомицину (линкозамиды), колистину (полимексины), а Enterococcus faecium проявляет устойчивость к цефуроксиму, цефоперазону, цефазолину (цефалоспорины), Escherichia coli M17 в ванкомицину (гликопептиды), Lactobacillus acidophilus проявил устойчивость еще и к гентамицину (из группы аминогликозидов), цефотаксиму и цефуроксиму (из группы цефалоспоринов), тетрациклину (тетрациклины )

Наиболее устойчивым является штамм Lactobacillus acidophilus, который дает наименьшие зоны подавление антибиотиками, а            Escherichia coli M17 более чувствителен к антибиотикам, так как для него характерны наибольшие зоны подавления роста. Среди тест-организмов наиболее чувствительным является S.aureus, а устойчивым S.enteritidis.

Исходя из проведенных предварительных исследований, нами были отобраны те антибиотики, к которым исследуемые микроорганизмы оказались устойчивыми. В частности наибольший интерес для дальнейших исследований представили следующие антибиотики:

  • пенициллин, ампициллин, оксациллин (группа пенициллинов);
  • цефуроксим, цефоперазон, цефазолин, цефотаксим (группа цефалоспоринов);
  • канамицин, гентамицин (группа аминогликозидов);
  • эритромицин, пристамицин (группа макролидов);
  • линкомицин (группа линкозамидов);
  • колистин (группа полимексинов).

В дальнейшем мы определили МПК изучаемых антибиотиков, влияющих на рост исследуемых микроорганизмов. Для определения МПК использовали метод последовательных разведений (таблица 2).

 

Таблица 2 – Значения МПК антибиотиков для исследуемых микроорганизмов

В микрограммах

Escherichia coli M-17

Enterococcus faecium

Lactobacillus acidophilus

Антибиотик

Значение МПК

Антибиотик

Значение МПК

Антибиотик

Значение МПК

Пенициллин

14293,356

±1559,300

Пенициллин

8281,4±718,6

Пенициллин

8281,4±718,6

Ампициллин

200,350±4,069

Ампициллин

6510±13

Ампициллин

6510±1302

Ванкомицин

814±20

Цефазолин

10410±26

Оксациллин

5208±1302

Линкомицин

15620±30

Цефуроксим

4883±976

Цефотаксим

5208±1302

Эритромицин

651±20

Цефтриаксон

5208±13

Цефуроксим

4883,0±976,3

 

 

Цефоперазон

5208±13

Гентамицин

10416,3±2604,0

 

 

Эритромицин

203±40

Тетрациклин

5208±1302

 

 

Канамицин

5208±13

 

 

 

Анализ ряда разведений растворов антибиотиков позволил определить концентрации, которые оказывают бактерицидное и бактериостатическое действие на исследуемые микроорганизмы, а также концентрации, которые не оказывают влияния на рост.

Для определения наличия роста исследуемых микроорганизмов пробирки с посевами просматривают в проходящем свете. Рост культуры в присутствии антибиотика сравнивают с контрольной пробиркой, содержащей исходный инокулюм и хранившейся в холодильнике. МПК определяют по наименьшей концентрации антибиотика, которая подавляет видимый рост микроорганизма.

Исходя из данных таблиц следует, что Enterococcus faecium обладает большей устойчивостью, чем Escherichia coli M-17, для которой необходима меньшая концетрация антибиотика для ее подавления.

 

 

3.2 Изучение антибиотикопродуктивности микроорганизмов, входящих в состав пробиотических препаратов «Линекс» и «Колибакиерин»

 

 

Для решения второй задачи нами проводились исследования по изучению антибиотикопродуктивности исследуемых микроорганизмов, в ходе которых была выявлена их антагонистическая активность относительно     тест-организмов. Наибольшая антагонистическая активность была выявлена по отношению к Escherichia coli.

В первую очередь, мы попытались определить, на какие сутки происходит наибольшая выработка антибиотикоподобных веществ в питательную среду. Для этого мы использовали метод с агаровыми лунками. Исследуемые микроорганизмы выращивали в питательном бульоне в течение 48, 72 и 96 часов. В дальнейшем опыте использовали фильтрат от бактерий, по результатам которого выяснили, что наибольшая выработка антибиотикоподобных веществ происходит на вторые сутки у Escherichia coli М-17 и Lactobacillus acidophilus, на третьи сутки культивирования Enterococcus faecium. Это можно объясняснить ростом популяции бактерий и конкуренцией за питательные компоненты среды.

 

Таблица 3 – Сравнительная таблица по антибиотикопродуктивности методом наложения дисков

В миллиметрах

Название штамма

Bacillus subtillis

534

Bacillus

cereus

IP 5832

Staphylococcus aureus

Escherichia

coli

Salmonella enteritidis

Escherichia

coli M-17

9,00±0,58

12,30±0,33

Enterococcus

faecium

10,30±0,33

10,00±0,58

Lactobacillus acidophilus

7,80±0,56

8,00±0,58

8,40±0,58

 

Исходя из анализа данных (таблица 3), полученных в результате эксперимента следует, что наибольшей антагонистической активностью обладает Escherichia coli M-17, а наименьшей – Lactobacillus acidophilus.

 

 

Рисунок 2 – Антибиотикопродуктивность Escherichia coli M-17 по отношению к Escherichia coli методом наложения дисков из фильтровальной бумаги

 

Все вышеизложенные данные послужили основой для решения последней задачи, а именно эффективности совместного использования антибиотиков и пробиотиков.

3.3 Эффективность комплексного применения антибиотиков и пробиотиков

 

 

При необходимости антибактериальной терапии рекомендовано совместное применение с антибиотиками пробиотиков. И в такой ситуации очень важно чтобы штаммы, входящие в состав пробиотика были антибиотикоустойчивые.

Для каждой группы антибиотиков характерна своя мишень действия. Совместное применение с антибиотиком пробиотика может не только предотвратить развитие дисбактериоза, но и усилить эффект подавления патогенной и условно-патогенной микрофлоры, путем выработки пробиотиком антибиотикоподобных веществ, которые оказывают влияние на другую мишень действия. В этом случае можно установить явление синергизма (или аддитивность), когда происходит суммация антагонистического действия антибиотиков и пробиотиков, что имеет большую практическую значимость. Также можно зарегистрировать либо негативный эффект (антагонизм), когда антибиотикоподобные вещества, вырабатываемые бактериями могут блокировать мишени действия антибиотиков, либо отсутствие эффекта.

Учитывая результаты определения антибитикорезистентности исследуемых микроорганизмов к антибиотикам, нами был проведен опыт по определению эффективности совместного действия антибиотиков и пробиотиков на условно-патогенные микроорганизмы (рисунок 3).

Из таблиц Б.3, Б.4, Б.5 видно, что совместное использование пробиотических препаратов на основе Escherichia coli M17 с пенициллином и линкомицином, а также Enterococcus faecium с цефуроксимом и пенициллином при подавлении тест-организма Salmonella enteritidis является неэффективным. А практический интерес представляет сочетанное применение пробиотического препарата «Колибактерина» с линкомицином, ампициллином и пенициллином при подавлении Staphylococcus aureus и Escherichia coli , а также использование препарата «Линекс» с цефоперазоном, ампициллином, пенициллином, эритромицином по отношению к Escherichia coli.

 

Рисунок 3 – Совместное применение антибиотиков и пробиотиков

Заключение

 

 

Широкое распространение резистентных форм патогенных и условно-патогенных микроорганизмов является результатом неэффективности или снижением эффективности ряда антибиотиков. Это в свою очередь требует создания и разработки новых антибактериальных препаратов с улучшенными свойствами, либо поиска новых продуцентов антибиотических веществ. Способностью вырабатывать антибиотики обладают не все микроорганизмы, а лишь некоторые штаммы отдельных видов

Применение антибактериальных препаратов приводит к нежелательным последствиям, нарушает состав и активность нормальной микрофлоры ЖКТ. К сожалению, в настоящее время нельзя полностью отказаться от использования антибактериальных препаратов в клинической практике. Накопленные научные данные подтверждают эффективность совместного использования антибиотиков и пробиотиков. В частности показано, что сочетанное применение с антибиотиком пробиотика может не только предотвратить развитие дисбактериоза, но и усилить эффект подавления патогенной и условно-патогенной микрофлоры, путем выработки пробиотиком антибиотикоподобных веществ, которые оказывают влияние на другую мишень действия.

Все исследуемые микроорганизмы оказались устойчивыми к пенициллину, ампициллину, оксациллину (пенициллины), Escherichia coli M17 и Enterococcus faecium к эритромицину, ристамицину (макролиды), линкомицину (линкозамиды), колистину (полимексины), а Enterococcus faecium проявляет устойчивость к цефуроксиму, цефоперазону, цефазолину (цефалоспорины), Escherichia coli M17 в ванкомицину (гликопептиды), Lactobacillus acidophilus проявил устойчивость еще и к гентамицину (из группы аминогликозидов), цефотаксиму и цефуроксиму (из группы цефалоспоринов), тетрациклину (тетрациклины )

В результате исследований было установлено, что исследуемые микроорганизмы, входящие в состав пробиотических препаратов (Escherichia coli M17 и Enterococcus faecium) вырабатывают антибиотикоподобные вещества по отношению к S.aureus и E.coli.

Комплексное применение антибиотиков и пробиотиков в одном случае приводит к негативному эффекту (Enterococcus faecium совместно с цефтриаксоном по отношению к Sureus), в другом к положительному результату (Escherichia coli M17 совместно с ванкомицином по отношению к Escherichia coli), а в третьем случае нейтрально (Enterococcus faecium с канамицином по отношению к Bacillus subtilis 534).

 

 

 

Список использованных источников

 

 

  • Городецкий, О. И. Антибиотики: жизнь против жизни [Электронный ресурс] – Режим доступа: http://www.health-ua.com/articles/1156.html10.2009.
  • Никитин, А. В. Антибиотики и макроорганизм /А.В. Никитин // Антибиотики и химиотерапия. – 2000. – № 12. – С. 31-36.
  • Reid, G. Probiotics to Prevent the need for, and augment the use of antibiotics / G. Reid // Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. – – Vol.17. – №5. – Р.291-295.
  • Скворцов, В. В. Дисбиоз кишечника и антибиотик-ассоциированная диарея, диагностика и лечение / В.В. Скворцов // Лечащий врач. – 2008. – № 2. – С.43 - 47.
  • Шендеров, Б. А. Антимикробные препараты и нормальная микрофлора. Проблемы и возможные пути их решения / Б.А. Шендеров // Антибиотики и химиотерапия. – 1988. - Т. 32. - № 12. - С. 921-926
  • Воробьев, А. А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства и защитные функции / А.А. Воробьев, Е.А. Лыкова // Микробиология. – 1999. – № 6. – С. 102-105.
  • Ткаченко, А. Г. Адаптивные функции полиаминов Escherichia coli при сублетальных воздействиях антибиотиков / А.Г. Ткаченко, М.С. Шумков,    А.В. Ахова // Микробиология. - - Т. 78. – № 1. – С. 32-41.
  • Федотова, Т. А. Роль дисбактериоза кишечника в формировании иммунной недостаточности у детей / Т.А. Федотова, А.Ч. Михайленко,        С.Ф. Сергеева // Иммунология. – 2001. – Т. 3. - С.41-45.
  • Рахманова, А. Г. Кишечные инфекции (стратегия и тактика лечения) / А.Г. Рахманова, В.А. Неверов, В.К. Пригожина // Лечащий врач. – 2001. – № 12. – С. 53-56.
  • Бондаренко, В. М. Микроэкологические изменения кишечника и их коррекция с помощью лечебно-профилактических препаратов / В.М. Бондаренко, Н.М. Грачева, Т.В. Мацулевич, А.А. Воробьев // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колонпроктологии. – 2003. – № 20. – С. 66-76.
  • Бондаренко, В. М. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией / В.М. Бондаренко, А.А. Воробьев // Микробиология. – 2004. – № 1. – С. 84-92.
  • Пинегин, Б. В. Современные представления о стимуляции антиинфекционного иммунитета с помощью иммуномодулирующих препаратов / Б.В. Пинегин // Антибиотики и химиотерапия. – 2000. – № 12. – С.3-8.
  • Голод, Н. А. Адаптация молочнокислых бактерий к неблагоприятным для роста условиям / Н.А. Голод, Н.Г. Лойко, А.Л. Мулюкин, Е.С. Воронин // Микробиология. – 2009. - Т. 78. - № 3. - C. 317-335.
  • Рыбалченко, О. В. Электронно-микроскопическое исследование межклеточных взаимодействий микроорганизмов при антагонистическом характере взаимоотношений / О.В. Рыбалченко // Микробиология. - - Т. 75. - № 4. - С. 550-555.
  • Мелентьев, А. И. Применение бацилл-антагонистов против грибов, разрушающих сырую древесину / А.И. Мелентьев, П. Хелисто, Л.Ю. Кузьмина, Н.Ф. Галимзянова, Г.Э. Актуганов, Т. Корпела // Журнал прикладная биохимия и микробиология. – 2006. – том 42. - № 1. – С. 70-75.
  • Акаева, Ф. С. Множественная антибиотикорезистентность ассоциативной микрофлоры при урогенитальной патологии / Ф.С. Акаева, О.С. Омарова, А.А. Адиева, М.М. Меджидов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - - № 6. - С. 85-87.
  • Nolewajka-Lasak, R. Antibiotic sensitivity of Enterobacteriaceae isolated from women vagina and uterine cervix / R. Nolewajka-Lasak, M. Rajca, K. Kaminski, Borriello // Med. Dosw. Microbiol. - 2003 – Vol. 55 – P. 351-356
  • Бухарин, О. В. Биоритмы антибиотикорезистентности микроорганизмов / О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова, С.Б. Фадеев // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2008. - № 5. - C.35-38.
  • McAuliffe, O. Lantibiotics: structure, biosynthesis and mode of action / O. McAuliffe, R.P. Ross., C. Hill // FEMS Microbiol.Rev. – 2001 – Vol. 25 – P. 285-308.
  • Gibson, G. R. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics / G.R. Gibson, М.В. Roberfroid // J. Nutr. – 1995. – Vol.125. – Р.1401-1412.
  • Kligler, B. A Probiotics. / В. Kligler, А. Cohrssen // Am Fam Physician.– 2008. – 78 – P. 1073-1078.
  • Новик, Г. И. Биологическая активность микроорганизмов-пробиотиков / Г.И. Новик, Г.И. Мелентьев, А.А. Самарцев, Н.И. Астапович, М.А. Каврус, А.Н. Михалюк // Журнал прикладная биохимия и микробиология. – 2006. – Т. 42. - № 2. – С. 187-194.
  • Смирнов, В. В. Пробиотики на основе живых культур микроорганизмов / В.В. Смирнов, Н.К. Коваленко, В.С. Подгорский, И.Б. Сорокулова // Микробиология. - - Т. 64. - № 4 – С. 62–80.
  • Ефременкова, О. А. Антибиотики: жизнь продолжается / О.А. Ефременкова // Наука и жизнь. – 2006. – № 8. – С. 48-56.
  • Borriello, S. Safety of probiotics that contain lactobacilli or bifidobacteria / S. Borriello, W. Hammes, W. Holzapfel et al // Clinical Infectious Diseases. – 2003. - 36 – P. 775–780.
  • Гюльахмедов, С. Г. Выделение и характеристика бактериоциноподобных ингибиторных веществ молочнокислых бактерий, изолированных из азербайджанских сыров. / С.Г. Гюльахмедов, Н.Ф. Абдуллаева, Н.Ф. Гусейнова, С. В. Науменко // Прикладная биохимия и микробиология. - - Т. 45. - № 3. - C. 297-303.
  • Стоянова, Л. Г. Регуляция синтеза бактериоцина рекомбинантного штамма Lactobacillus lactis subsp.lactis F-116 компонентным составом среды / Л.Г. Стоянова, Н.А. Левина // Микробиология. – 2006. - Т. 75. - № 3. - С. 342-348.
  • Roberfroid, M. D. Prebiotics: preferential substrates for specific germs / М.D. Roberfroid // Am. J. Clin. Nutr. – 2001. – Vol. 73. – № 1. – Р.406-409.
  • Гришель, А. И. Пробиотики и их роль в современной медицине / А.И. Гришель, Е.П. Кишкурно // Вестник фармации. – 2009. – № 1. – С. 90-93.
  • Temmerman, R. Identification and antibiotic susceptibility of bacterial isolates from probiotic products / R. Temmerman, В. Pot, G. Huys, J. Swings // Int. Food Microbiol. – 2003. – Vol. 81. – Р. 1-10.
  • Weizman, Z Effect of a probiotic infant formula on infections in child care centers: comparison of two probiotic agents / Weizman, G. Asli, A. Alsheikh // Pediatrics. – 2005. –Vol. 115. – № 1. – Р.5-9.
  • Sheu, B. S. Pre-treatment with Lactobacillus and Bifidobacteria-containing Yogurt can improve the efficacy of quadruple therapy for the residual   pylori infection after the failed triple therapy / В.S. Sheu // Am. J. Clin. Nutr. – 2006. – Vol. 83. – № 4. – Р.864-869.
  • Rousseaux, C. Lactobacillus acidophilus modulates intestinal pain and induces opioid and cannabinoid receptors / C. Rousseaux, X. Thuru, A. Gelot // Nat. Med. – 2007. - 13 - P.35-37.
  • Лыкова, Е. А. Пробиотики: характеристика препаратов и выбор в педиатрической практике / Е.А. Лыкова, Л.Н. Мазанкова // Антибиотики и химиотерапия. – 2001. – № 3. – С.21 - 25.
  • Fan, Y.. A probiotic treatment containing Lactobacillus, Bifidobacterium and Enterococcus improves IBS symptoms in an open label trial / Y. Fan, S. Chen, Y. Yu, Alsheikh // J. Zhejiang. Univ. Sci. – 2006. – Vol. 7 – P. 987-991.
  • Меньшиков, В. В. Клиническая лабораторная аналитика. Частные аналитические технологии в клинической лаборатории IV том / В.В. Меньшиков // Агат-Мед. – М., – 2003. – С. 278-286.
  • Collins, M. D. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut / M.D. Collins, G.R. Gibson // Am.J.Clin.Nutr. - – Vol. 69. – № 5. – Р.1052-1057.
  • Mandell, L. A. The battle against emerging antibiotic resistance: Should fluoroquinolones be used to treat children? / L.A. Mandell, L.R. Peterson, L.R. Wise, D. Hooper, D.E. Low, U.B. Schaad, K.P. Klugman // Clinical Infectious Diseases.– 2002. – Vol. 35 - Р. 721-727.
  • Faber, S. Are probiotics useful in irritable bowel syndrome? / S. Faber // J. Clin. Gastroenterol. – 2003. – 37 – P. 93–94.
  • Грачева, Н. М. Пробиотики в комплексном лечении больных с заболеваниями ЖКТ с сопутствующим дисбактериозом кишечника / Н.М. Грачева, О.С. Партин, А.А. Аваков // Лечаший врач. - - № 9. – C. 78-79.
  • Guardabassi, L. Antibiotics: Mode of action and mechanisms of resistance / L. Guardabassi, P. Courvalin // American Society for Microbiology. – Washington. – 2003. – № 11. – P. 1-18.
  • Fuller, R. Probiotics and prebiotics: microflora management for improved gut health / R. Fuller, G. R Gibson. // Clin. Microbiol. Infect. – 1998. – Vol. 4. – P. 477-
  • Шабанова, Н. А. Влияние метаболитов Lactobacillus fermentum на ультраструктуру патогенных эшерихий / Н.А. Шабанова, В.В. Гостева, Н.В. Клицунова, В.М. Бондаренко // Журнал микробиологии, эпидемиологии, иммунобиологии. - - № 2. – С. 3-6.
  • Cremonini, F. Meta-analysis: the effect of probiotic administration on antibiotic-associated diarrhea / F. Cremonini, S. Di Caro, E. Nista // Aliment Pharmacol Ther. – 2002. - 16 – P. 1461-1467.
  • Cummings, J. H. Prebiotics digestion and fermentation / J.H. Cummings, G.T. Macfarlane // Am. J. Clin. Nutr. – 2001. – Vol. – № 8 – Р. 415-420.
  • Лыкова, Е. А. Коррекция пробиотиками микроэкологических и иммунных нарушений при гастродуоденальной патологии у детей / Е.А. Лыкова, В.М. Бондаренко, Ю.А. Изачик // Журнал микробиологии, эпидемиологии, иммунобиологии. – 1996. – № 2. – С.88-91.
  • Мазанкова, Л. Н. Пробиотики: характеристика препаратов и выбор в педиатрической практике / Л.Н. Мазанкова, Е.А. Лыкова // Детские инфекции. – 2004. – № 1. – С. 18-23.
  • Teitelbaum J. Probiotics and the Treatment of Infectious Diarrhea / J.Teitelbaum // Pediatr. Infect. Dis. J. – 2005. - 24. - №3. – P. 267-268.
  • Осипова, И. Г. Споровые пробиотики / И.Г. Осипова, Н.А. Михайлова, И.Б. Сорокулова, Е.А. Васильева, А.А. Гайдеров // Журнал микробиологии, эпидемиологии, иммунобиологии– 2003. – №3. – С.113 - 119.
  • Сизенцов, А. Н. Методы определения антибиотикопродуктивности и антибиотикорезистентности. Методические указания к лабораторному практикуму / А.Н. Сизенцов. – Оренбург. – 2009. – 107 с.


 

Приложение А

(обязательное)

 

Изучение антибиотикорезистентности микроорганизмов

 

Таблица 1 – Сравнительная таблица по антибиотикорезистентности с применением тест-систем «Bio Merieux»

 

 

Антибиотики

 

B.subtillis

       534

 

B.cereus 5832

 

E. coli-M17

 

L.acidophilus

 

E. faecium

 

S. aureus

 

 

E. coli

 

 

S.enteriditis

Пенециллины

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Penicilline

R

R

R

R

R

R

R

I

Ampicilline

S

I

R

R

R

I

I

S

Oxacilline

R

R

R

R

S

I

S

S

Amoxicilline

S

S

R

S

S

S

R

S

Ticarcilline

R

R

S

I

R

R

R

S

Mecillinam

R

R

R

S

R

I

I

R

Цефалоспорины

Cefuroxime

R

R

R

R

R

I

R

I

Cefotaxime

I

R

R

I

I

I

R

I

Ceftazidime

R

R

R

I

R

R

R

S

Cefactor

S

S

I

I

I

S

S

I

Cefamandole

S

S

I

S

I

S

S

R

Cefotetan

I

S

R

S

I

S

S

R

Cefoxitine

R

S

S

I

R

S

S

S

Cefoperazone

S

S

S

R

S

I

S

R

Cefixime

R

R

R

I

R

R

I

S

Карбопинемы

Imipeneme

R

R

R

S

R

I

R

S

Гликопептиды

Vancomycine

S

S

R

I

I

S

R

R

Teicoplanine

S

S

R

S

S

S

S

R

Монобактамы

Aztreonam

R

R

I

 

S

 

 

R

I

S

I

Продолжение таблицы 1

 

Тетрациклины

Tetracycline

R

S

S

R

S

S

S

I

Линкозамиды

Lincomycine

R

R

R

R

R

R

R

S

Макролиды

Erythromycine

I

I

R

S

R

S

R

I

Pristinamycine

S

R

R

I

R

I

R

S

Левомицетины

Chloramphenikol

R

R

I

S

S

I

S

I

Полимиксины

Colistine

R

R

R

R

R

I

I

S

 

Примечание: R – устойчивость, S – чувствительность, I – умеренная чувствительность

 

Таблица 2 – Сравнительная таблица по антибиотикорезистентности исследуемых микроорганизмов, входящих в состав пробиотиков, с применением диско-диффузионного метода

В миллиметрах

Антибиотики

B.subtillis

534

B.cereus

IP 5832

E. coli M 17

L.acidophilus

E. faecium

S. aureus

E. coli

S. enteriditis

Пенициллины

 

1

2

3

4

5

5

6

7

 

Penicilline

25,00±0,58

R

R

R

R

24,70±0,33

R

20,70±0,67**

Ampicilline

26,00±0,58

17,70±0,33***

R

R

R

29,30±0,33

17,30±0,67***

25,70±0,67

Oxacilline

30,30±0,33

14,70±0,33***

R

R

R

32,70±0,33

R

R

Аминогликозиды

Streptomycine

25,30±0,33

34,00±0,58

32,00±0,58

21,30±0,88

32,00±0,58

20,00±0,58**

19,70±0,33***

18,30±0,33***

Kanamycine

27,00±0,58

20,70±0,67**

25,00±0,58

19,30±0,33

25,00±0,58

25,70±0,33

25,00±0,58

22,00±0,58**

Gentamicine

 

35,00±0,58

30,30±0,88*

29,70±0,33**

R

29,30±0,33**

46,30±0,88

24,70±0,33***

23,70±0,33***

Продолжение таблицы 2

 

Аминогликозиды

Cefuroxime

21,00±0,58

R

23,30±0,88

R

R

22,30±0,33

29,30±0,33

19,00±0,58

Cefotaxime

36,30±0,67

20,00±0,58***

33,00±0,57

R

24,33±0,33***

24,70±0,33***

28,30±0,33***

20,70±0,33***

Cefamandole

R

R

34,30±0,33

22,00±0,57

24,70±0,33

16,00±0,58

25,67±0,33

20,00±0,58

Cefasoline

30,70±0,67

32,70±0,33

24,70±1,87

21,00±0,58

R

32,30±0,33

28,70±0,67

32,00±1,00

Гликопептиды

Vancomycine

21,3±0,88

17,7±0,33*

R

21,3±0,67

16,7±0,67*

22,0±0,58

25,0±0,58

22,7±0,33

Тетрацеклины

Tetracycline

25,3±0,33

21,3±0,33**

25±1,15

R

31,33±1,5

25,7±0,67

23,7±0,33*

22,0±1,15*

Линкозамиды

Lincomycine

20,0±0,58

18,0±0,58

R

14,7±0,33

R

28,0±0,58

22,0±0,58

13,3±0,67**

Макролиды

Erythromycine

33,0±0,58

28,3±0,88*

R

21,0±0,58

R

21,7±0,33***

13,0±0,58*

R

Pristinamycine

R

22±0,91

R

18,33±0,88

R

18,7±0,67

15,7±0,33

13±0,21

Полимиксины

Colistine

R

R

R

18,0±0,67

R

16,3±0,33

17,3±0,67

16,7±0,67

Примечание: *Р < 0,05; **Р < 0,01; ***Р < 0,001

 

 

 

 

Приложение Б

(обязательное)

 

Эффективность совместного использования антибиотиков и пробиотиков

 

 

Таблица 3 – Обобщающая таблица по комплексному применению антибиотиков и пробиотиков на основе Escherichia coli M-17 в отношении тест-организмов

 

 

Lincomycine

Vancomycine

Erytromycine

Ampicilline

Penecilline

B.cereus IP 5832

-

-

 

-

-

B.subtilis 534

 

-

-

-

 

E.coli

   

-

-

 

S.aureus

-

-

     

S.enteriditis

 

-

 

-

 

Примечание:   – аддитивный эффект,   – негативный эффект, -   – отсутствие эффекта

 

Таблица 4 – Обобщающая таблица по комплексному применению антибиотиков и пробиотиков на основе Enterococcus faecium в отношении тест-организмов

 

 

Cefuroxime

Ceftriaxon

Cefoperazone

Canamycine

Ampicilline

Cefazoline

 

Penecilline

 

Erythromycine

B.cereus 5832

-

 

-

 

-

   

-

B.subtilis 534

   

-

-

 

-

 

-

E. coli

 

-

 

-

 

-

   

 

 

Продолжение таблицы 4

 

S. aureus

-

 

-

 

-

 

-

 

S. enteriditis

 

-

 

-

 

-

 

-

Примечание:   – аддитивный эффект,   – негативный эффект, -   – нет эффекта

 

Таблица 5 – Обобщающая таблица по комплексному применению антибиотиков и пробиотиков на основе Enterococcus faecium в отношении тест-организмов

 

 

Cefuroxime

Ceftriaxon

Cefoperazone

Canamycine

Ampicilline

Cefazoline

 

Penecilline

 

B.cereus 5832

-

 

-

 

-

   

B.subtilis 534

-

 

-

   

-

-

E. coli

 

-

 

-

-

-

 

S. aureus

-

 

-

   

-

-

S. enteriditis

 

-

 

-

-

-

 

Примечание:   – аддитивный эффект,   – негативный эффект, -   – нет эффекта

 

 Скачать: У вас нет доступа к скачиванию файлов с нашего сервера. КАК ТУТ СКАЧИВАТЬ
У вас нет доступа к скачиванию файлов с нашего сервера. КАК ТУТ СКАЧИВАТЬ
У вас нет доступа к скачиванию файлов с нашего сервера. КАК ТУТ СКАЧИВАТЬ

Категория: Дипломные работы / Дипломные работы по биологии

Уважаемый посетитель, Вы зашли на сайт как незарегистрированный пользователь.
Мы рекомендуем Вам зарегистрироваться либо войти на сайт под своим именем.