Министерство образования и науки Российской Федерации

 

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ

 

 

Химико-биологический факультет

 

Кафедра биохимии и микробиологии

 

КУРСОВАЯ РАБОТА

 

По дисциплине «Современные методы микробиологии»»

 

 

Электронная микроскопия

 

 

Аннотация

 

Данная курсовая работа посвящена теме «Электронная микроскопия».

В этой работе историю развития, принципы и методы электронной микроскопии. Большое место  уделено изучению применению электронной микроскопии.

Работа содержит  29 страниц текста, 7 рисунков и 24 источника литературы.

 

 

 

 

Содержание

 

Введение. 4

1 История электронной микроскопии. 4

2 Принципы электронной микроскопии. 7

3 Применение электронного микроскопа. 9

  3.1 Подготовка образцов. 10

  3.2 Возможности и ограничения применения электронной микроскопии. 14

  3.3 Меры безопасности при подготовке электронно- микроскопических образцов  16

4 Методы электронной микроскопии. 17

5 Визуализация в электронном микроскопе. 17

6 Лабораторная работа. 22

Заключение. 27

Список использованных источников. 28

 

Введение

 

Методы электронной микроскопии завоевали такую популярность, что в настоящее время невозможно пред­ставить себе лабораторию, занимающуюся исследова­нием материалов, их не применяющую. Первые успехи электронной микроскопии следует отнести к 30-м годам, когда с ее помощью была выявлена структура ряда органических материалов и биологических объектов. В исследованиях неорганических материалов, в особенно­сти металлических сплавов, позиции электронной ми укрепились с появлением с высоким напряжением кВ и выше) и еще в большей благодаря техники получения , позволившей работать с материалом, а не со слепками-репликами. так называемой электронной микроскопии своим появлением и развитием теория механизма деформации . Прочные позиции электронная и в ряде разделов материа.

Усиление интереса к микроскопии объясняется обстоятельств. Это, , расширение метода благодаря самых различных приставок: для при низких (до  150 °С) и высоких (до °С) температурах, наблюдения непосредственно в микро, исследования рентгеновских микроучастков (до 1 мкм и ) объектов, получения жений в рассеянных и др. Во-вторых, существенное (до 1 Е и менее) способности электронных , что сделало их конкурентоспособными с микроскопами в получении изображений решетки. Наконец, параллельно с микроско исследованиями детально дифракци картины вплоть до таких тонких де, как диффузионное рассеяние .

Все шире и растровая электронная скопия, сконцентрировавшая все просвечивающей микроскопии.

 

 

 

 

 

 

 

 

1 История электронной микроскопии

 

 

В теории электронной лежат работы физиков, лауреатов премии , открывшего в 1898 электрон; Э. Резерфорда, планетарной модели ; и Луи де Бройля, в начале 1920-х волновую природу пучка. Хронология , ставших для создания электронного , представлена в таблице 1.

В году, то есть чем через после открытия природы электронов, М. и Е. Руска в Германии и построили электронный микроскоп с линзами и получили изображения (рисунок 1). этот был примитивным и не подходил для нужд, он был способен объекты в 400 раз. Вскоре получены и электронные микрофотографии объектов. В 1939 фирма «Сименс» в выпустила промышленную модель электронного микроскопа с разрешением (20 нм), разработанную Б. Б и Е. Руской. Во Второй мировой установка была и работы по электронной прекращены [1].

 

 

Рисунок 1 ― Первый электронный микроскоп, созданный М. Кнолем и  Е. Руской в 1931 г. в Германии

 

В это же в Советском Союзе, в Ленинграде создавался электронный микроскоп. и финансировало эти министерство оборонной . Первый отечественный с электромагнитной оптикой был новым и увеличение до 10000 раз. над ним не прекращалась даже в годы войны и , что позволило уже в году построить , более совершенную электронного микроскопа с в 25000 раз, для проведения серийных -микроскопических исследований. Уже производство микроскопов на поток. отечественными электронными были СУМы Сумского завода [1].

 

Таблица 1― История развития электронного микроскопа

 

Дата	Имя	Событие
1897	Дж. Томпсон	Открыл электрон
1911	Н. Бор, Резерфорд	Создали планетарную модель атома
1924	Луи де Бройль	Установил длину волны движущихся электронов λ=h/mv λ ― длина волны h ― постоянная Планка m ― масса v ― скорость (при 60 кВ = 0.005 нм)
1926	Х. Буш	Создал первую электромагнитную линзу, фокусирующую электронные лучи
1931	М. Кноль, Е. Руска	Сконструировали первый электронный микроскоп
1931	Дэвиссон, Кларк	Описали свойства электростатических линз
1934	Драйст, Мюллер	Превзошли разрешение световых микроскопов
1939	Б. Боррис, Е. Руска	Первый коммерческий электронный микроскоп (Siemens) ― разрешение 20 нм
1942	СССР	Первый советский электронный микроскоп, увеличение 10000 раз.

 

Первые микроскопы давали очень сильное электромагнитное излучение, поэтому при работе с ними приходилось ставить защитные свинцовые экраны. В современных электронных микроскопах свинцовая броня зашита в колонну микроскопа.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2 Принципы микроскопии

 

 

Электронный ― это электронно-оптический прибор, в электроны с энергией в образуют , давая увеличенное микроскопического объекта на экране. Просвечивающий микроскоп во подобен световому , но в отличие от светового , для освещения образцов в нем не свет, т.е. фотонов, а потоки , а вместо стеклянных ― электромагнитные. Электронное формируется и магнитными полями так же, как световое ― оптическими [2]. Схема просвечивающего микроскопа на рисунке 2, сравнение и электронного микроскопа ― на 3.

 

 

Рисунок 2 ― Схема просвечивающего электронного микроскопа:1 ― источник электронов, 2 ― ускоряющая система, 3 ― диафрагма, 4 ― конденсорная линза, 5 ― образец, 6 ― объективная линза, 7 ―  диафрагма, 8 ― проекционная линза, 9 ― экран или пленка, 10 ― увеличенное изображение

 

В просвечивающем электронном имеются прожектор, ряд конденсорных , объективная линза и система, которая окуляру, но действительное изображение на й экран. Источником обычно служит катод из или гексаборида лантана. электрически изолирован от части прибора, и ускоряются электрическим полем. Для такого поля поддерживают под напряжением 100 кВ относительно электродов, фокусирующих в узкий пучок. Эта прибора называется прожектором. электроны сильно веществом, в колонне , где движутся электроны, быть . Здесь  поддерживается , не превышающее одной атмосферного [1].

 

 

 

Рисунок 3 ― Сканирующий (б) и просвечивающий (в) электронный микроскопы по сравнению со световым (1) микроскопом

 

Электромагнитная линза представляет из себя несколько тысяч витков проволоки, по которым проходит ток, создавая магнитное поле, которое отклоняет и фокусирует пучок электронов так же, как стеклянная линза фокусирует световой пучок (рисунок 4).

 

 

 Рисунок 4 ― Электромагнитная линза

Магнитное поле, создаваемое витками катушки, по которой проходит ток, действует как собирающая линза, фокусное расстояние которой можно изменять, меняя ток. Поскольку оптическая сила такой линзы, т.е. способность фокусировать электроны, зависит от напряженности магнитного поля вблизи оси, для ее увеличения желательно сконцентрировать магнитное поле в минимально возможном объеме. Практически это достигается тем, что катушку почти полностью закрывают магнитной «броней» из специального никель-кобальтового сплава, оставляя лишь узкий зазор в ее внутренней части [3].

Ряд линз (на схеме лишь последняя) электронный пучок на . Обычно из них создает неувеличенное источника электронов, а контролирует размер участка на . Диафрагмой последней линзы определяется пучка в плоскости . Образец в магнитном поле линзы с большой силой ― самой линзы электронного микроскопа, определяется предельное разрешение прибора. объективной ограничиваются ее диафрагмой так же, как это в фотоаппарате или световом . Объективная линза увеличенное объекта (обычно с порядка 100), увеличение, вносимое и проекционной , лежит в пределах от несколько меньшей 10 до большей 1000. образом, увеличение, которое получить в современных микроскопах, составляет 1000000 раз.

ускоряются, а затем магнитными линзами. изображение, создаваемое , которые через диафрагму , преобразуется люминесцентным в видимое или регистрируется на [4].

Контраст в просвечивающем электронном обусловлен рассеянием при прохождении электронного через . Проходя через , одни электроны беспрепятственно сквозь , другие . Степень рассеяния от толщины образца, его и средней атомной в данной . Участки повышенной , увеличенной толщины, расположения тяжелых выглядят на как темные зоны на фоне. Окончательное электронное изображение в видимое люминесцентного экрана, светится под действием бомбардировки. Это изображение, как , рассматривают бинокуляр. Окончательное регистрируется на фотопластинке или на компьютера. В последнем используется   CCD камера, отображающая в живом времени на .

3 Применение электронного

 

 

В настоящее электронные микроскопы немаловажной составляющей передовых лабораторий. Их для исследования образцов, мельчайших , молекул, клинических , кристаллических структур и для различных . Также электронные широко используются для технического соответствия и дефектов и в индустрии, к примеру, при полупроводников. Способность положение отдельных внутри делает электронные незаменимыми в нанотехнологиях [5].

Что биологических исследований, микроскопия в цитологии, клеточной , ботанике, энтомологии, биологии и микробиологии. С иммуноэлектронной появилась возможность интересующую молекулу с до нескольких нанометров. В                        электронно-микроскопический применяется в токсикологии, , для диагностики, определения состава тканей, инородных , в патоморфологии, а также для контроля качества и т.д.

 

3.1 образцов

 

 

Основополагающим в микроскопии приготовление образцов. огромное количество , позволяющих успешно в электронном самые различные [3].

Чтобы образец было посмотреть в электронный , он должен соответствовать критериям: быть , контрастным, прозрачным для электронов, , устойчивым к высокому и электромагнитному излучению. того, образец быть тонким (не более 100 нм), пучок электронов мог сквозь него. выполнялось это , образец должен либо небольшой , либо быть залит в смолу и порезан на срезы [5].

Как понятно из выше требований к , он должен соответствующим образом .

Методика варьирует раз в зависимости от образца, но принципы обозначить так: 1) фиксация ( объект на нужной в его нативном состоянии),  2) ― замещение органическими растворителями ( спиртом, ацетоном),             3) в смолу (пропитка эпоксидной для придания ему твердости для нарезки срезов), 4) ультратонких срезов , полупрозрачных для электронов,             5) окраска солями тяжелых , такими как свинец, , непрозрачными для электронов, с целью контрастного изображения.

будут подробно методы образца для электронно-микроскопического .

 

 

3.1.1 Сеточки

 

 

от выбранного , для помещения в просвечивающий микроскоп образец поместить на сеточку. называют металлические диски 3 мм и толщиной 0.01 мм с очень регулярной решеткой. типы представлены на рисунке 5 [6].

 

 

Рисунок 5 ― Электронно-микроскопические сеточки

 

для просвечивающей электронной используют медные , в случае микроскопии ― никелевые или . Образец помещают на и вставляют в держатель микроскопа.

Та образца, которая на ячейках между сеточки, и будет под электронным . Сама решетка , изготовленная из меди никеля (иногда ), соответственно, для пучка электронов).

 

 

3.1.2 окрашивание

 

 

Данный пригоден для вирусов, бактерий, , макромолекулярных комплексов и изолированных органелл. адсорбируются на поверхности сеточек, формварной пленкой и тонким слоем [7].

Сеточки плавают на поверхности раствора образца в буфере (на капле объемом 3 - 5 мкл) несколько секунд, за это время материал адсорбируется на сеточке. Затем сеточки с прикрепившимися к ним частицами быстро промываются водой и помещаются на несколько секунд (до 1 минуты) на капли 1 – 5 процентного раствора красителя (солей тяжелых металлов, например, уранилацетата или молибдата аммония). Далее сеточки снимаются с помощью пинцета и излишек красителя убирается фильтровальной бумагой. Вокруг образца остается слой красителя толщиной 100 - 300 нм. Такое окрашивание называется «негативным», поскольку краситель заполняет пространство вокруг образца, которое представляется очерченным в негативном контрасте [8].

 

 

Рисунок 6 ― Схема методики негативного окрашивания

 

Хотя этот способ является самым тривиальным, в руках специалиста он позволяет получить изображение относительно высокого уровня разрешения.

Этот подход легко совместим с иммуномечением. Одним из ограничений является то, что только антигены, находящиеся на поверхности частиц, могут быть маркированы.

 

 

3.1.3 Контрастирование срезов

 

 

Сеточки с прикрепленными к ним срезами окрашивают в растворах уранилацетата и цитрата свинца (по Рейнольдсу) для усиления контраста. Контрастирующие растворы предварительно центрифугируют (5 мин., х10000) Методика окраски:

1) окраска уранилацетатом натрия (3 мин);

2) промывка дистиллированной водой (30 секунд под струей воды);

3) окраска цитратом свинца (4 мин);

4) отмывка под струей дистиллированной воды.

Окрашивание проводят на каплях раствора красителя, помещая сеточки на капли срезами вниз. Сеточки держат пинцетом за самый край, чтобы контрастирующий агент не скапливался под пинцетом. Снимают сеточку, проталкивая ее кусочком фильтровальной бумаги между браншами пинцета. Для предотвращения выпадения свинца окраску проводят на капле цитрата свинца, которую помещают на пленку Parafilm под чашку Петри и обкладывают гранулами чистого NaOH [9].

После промывки дистиллированной водой и высушивания сеточки готовы к анализу в электронном микроскопе.

Для иммуноэлектронной микроскопии окраску тяжелыми металлами проводят после иммуномечения золотом. Преимуществом этого метода в том, что срезы на сеточках могут храниться долгое время и все еще быть пригодными для дальнейшего иммуномечения. Более того, на этих срезах можно проводить иммунофлуоресцентный анализ [4].

 

 

Рисунок 7 ― Контрастирование срезов цитратом свинца. Сеточки помещаются в чашку Петри на капли свинца срезами вниз на 3 минуты, затем промываются и аккуратно снимаются с пинцета кусочком фильтровальной бумаги

 

 

3.1.4 Иммуноэлектронное мечение

 

 

мечение ― это визуализация на срезах или на изолированных частиц с первичных антител, впоследствии распознаются антителами, легко детектирующиеся под частицы золота.

задачи иммуноэлектронной : 

-не изменить ультраструктур

-не допустить или артефактного

-перераспределения   добиться высокого

-получить полного доступа к

Соответственно, более требования предъявляются к пробоподготовки. В фиксации и заливки максимально сохраниться . Поэтому для иммуноэлектронной применяют на метакрилатной основе. , в 80-е годы столетия были Ловикрилы  ― гидрофильный Lowicryl K4M и гидрофобный HM20. Уже публикации показали их потенциал для золотом. Заливка в смолы схожа со заливкой в эпоксидные, с той , что полимеризация при облучении ультрафиолетом и не высокой температуры. того, эти смолы использоваться не при комнатной температуре, но и при температурах. К примеру, в прогрессивного понижения (PLT ― lowering of temperature) со стадии дегидратации постепенно снижается до −35 ◦C и проходит до −35 ◦C под . Образец полимеризуется от одного до трех дней, а затем еще «дозревает» при комнатной температуре и при солнечном свете. Ловикрил HM23 может полимеризоваться даже при −80 ◦C, что делает его незаменимым в методе замораживания-замещения. Альтернативой ловикрилу являются смолы LR white и LR gold. Их применение совместимо с обработкой тетраоксидом осмия и 50 позволяет сочетать иммуномечение с хорошей ссохранностью структур [9].

Все смолы, используемые в электронной микроскопии, потенциально токсичны, в особенности ловикрилы, и при работе с ними следует соблюдать правила техники безопасности, работать в вытяжном шкафу и в резиновых перчатках.

 

 

3.2 Возможности и ограничения применения электронной микроскопии

 

 

Преимущества электронной микроскопии:

1.Высокая разрешающая способность электронного микроскопа позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа. Поэтому ЭМ применяется для изучения ультраструктур микроорганизмов и макромолекулярных структур;

2.Сочетание ЭМ с другими методами позволяет проводить электронно-радиоавтографические, электронно-гистохимические, электронно-иммунологические исследования. ЭМ нашла широкое применение в морфологии, микробиологии, вирусологии, иммунологии, генетике, биохимии, онкологии [10].

Недостатки электронного микроскопа:

1) подготовленный к исследованию материал должен быть мертвым, так как в процессе наблюдения он находится в вакууме;

2) трудно быть уверенным, что объект воспроизводит живую клетку во всех ее деталях, поскольку фиксация и окрашивание исследуемого материала могут изменить или повредить ее структуру;

3) дорого стоит и сам электронный микроскоп и его обслуживание;

4) подготовка материала для работы с микроскопом отнимает много времени и требует высокой квалификации персонала;

5) исследуемые образцы под действием пучка электронов постепенно разрушаются. Поэтому, если требуется детальное изучение образца, необходимо его фотографировать.

 

 

3.3 Меры безопасности при подготовке                                электронно-микроскопических образцов

 

 

Работая с электронным микроскопом, следует соблюдать правила техники безопасности. Большинство реагентов, применяемых в электронной микроскопии, ядовиты, и обращаться с ними надо осторожно. Всю пробоподготовку проводить в халате и резиновых перчатках [11].

Тетраоксид осмия токсичен и очень летуч, работать с ним разрешается только в вытяжном шкафу. Пары тетраоксида осмия раздражают дыхательные пути и могут вызвать тяжелые поражения глаз. Раствор едкий и вызывает ожоги. При попадании на кожу необходимо немедленно смыть проточной водой.

Глутаральдегид менее токсичен и летуч, но при попадании на кожу может вызывать дерматит.

Ацетон легко воспламеняется, с ним нельзя работать возле открытого пламени. При длительном вдыхании может вызывать поражение печени.

Эпоксидные смолы, применяемые для заливки (эпон, Агар) токсичны и могут вызывать дерматит. В экспериментах на животных показано, что эти вещества обладают канцерогенными свойствами. Работать только в перчатках!

Метакрилаты летучи и легко воспламеняются, работать только в вытяжном шкафу.

Свинец, содержащийся в используемом для контрастировании срезов цитрате свинца, способен проникать через неповрежденную кожу. Если цитрат свинца разливается и высыхает, свинец вместе с пылью попадает в дыхательные пути. До и после работы с ним следует тщательно вытирать стол и мыть руки [12].

 

 

 

 

4 Методы электронной микроскопии

 

 

По принципу конструкции электронный микроскоп очень сходен с оптическим: в нем есть источник освещения (катод электронной пушки), конденсорная система (конденсорная магнитная линза), объектив (объективная магнитная линза), окуляр (проекционные магнитные линзы), только вместо сетчатки глаза электроны попадают на люминœесцирующий экран или на фотопластинку [13].

часть такого представляет собой цилиндр (колонка ), из которого воздух для того, не было взаимодействия с молекулами газов и вольфрамовой накаливания в катоде пушки. Между и анодом подается напряжение (от 50 до кВ), что служит причиной электронов. В центре есть отверстие, через электроны формируют , идущий вниз по микроскопа. Линзы микроскопа из себя электромагниты, которых может путь электронов ( стеклянные изменяют путь ). В конденсорной линзе электронов фиксируется и на объект, с электроны взаимодействуют, , рассеиваются, поглощаются или без изменения. Электроны, через , фокусируются объективной , которая формирует первичное изображение . Так же как в световом , объективная линза его основные показатели. изображение увеличивается линзой и на экран, покрытый слоем, светящимся при на него электронов. светящегося изображение можно на фотопластинку и получить [14].

Напряжение, используется для электронов в большинстве (трансмиссионных) электронных , достигает 50 - 150 кВ. При в 50 кВ электрон длиной волны в 0,05 А, и в случае теоретически было бы получить в 0,025 А (d ~ 0,5 l). При в современных конструкциях микроскопов достигается около 1 А (0,1 нм) из-за стабильности , стабильности тока , неоднородности металла линз и других прибора ( возможно еще повысить электронного микроскопа в 100 ). Но и достигнутое разрешение: оно сейчас уже в 106 раз разрешающей способности !

На экранах и электронных микроскопов увеличение до 50 000 раз, затем при фотопечати можно еще 10-кратное . В итоге конечное , при котором максимально разрешение, достигает 106.

электронно-микроскопическое с флуоресцирующего экрана с цифровой телекамеры передаваться прямо в , где на экране его обрабатывают различным (изменяют увеличение, изображения, проводят отдельных и т.д.).

Сегодня максимальное электронного микроскопа () реализуется только при металлов или решеток. На биологических такого разрешения пока не удается низкой объекта. Биологические для исследования в ЭМ помещаются на сеточки, покрытые пленками ― (коллодий, углерод), в основном из углерода. толщина биологического с плотностью 1 г/см³, выявляемого при напряжении в электронном 50 кВ, равна 50 А. Вирусы, на поддерживающей , видны в данном в виде бесструктурных , а молекулы нуклеиновых (толщина ДНК 20 А) вообще не видны низкого контраста. биологических объектов , используя металлы или их соли .

Ультрамикротомия. При пучка электронов биологический часть электронов , что приводит к нагреванию и к его деформации. В этой требуется очень тонкие (не выше 0,1 мкм). их изготовления сходна с той, что в световой . Клетки и ткани для сначала фиксируют. В фиксаторов используются растворы альдегида. Применяется фиксация: сначала альдегидом, а затем , который как металл контрастирует структуры. Затем, обезвоживания, ткани эпоксидными или другими пластиками в , мономерной форме. При таких пластмасс ими объект заключенным в твердые , которые уже можно на тонкие срезы. срезы с помощью использования приборов ― ультрамикротомов. получаемых ультратонких обычно мала (0,1 - 1 мм²), в с этим все операции при идут под микроскопическим . Срезы, на сетках с подложкой, контрастируют – ‹‹окрашивают›› с солей тяжелых . Для этого соли свинца и , которые связываясь с структурами на срезе, их контрастируют .

Этот метод применять цитохимические на уровне электронной .

В электронно-микроскопических возможно применение . В этом случае сверхтонкозернистые эмульсии ( гранул 0,02 - 0,06 мкм).

Все применение получают криоультрамикротомии, ᴛ.ᴇ. получение с замороженных , моментально охлажденных до жидкого азота. При этом происходит одномоментное всех метаболических , а вода из жидкой переходит в твердую, но не , ее молекулярная беспорядочна (стекловидное ). Такие твердые при температуре жидкого можно на ультратонкие срезы [7].

Во проведения иммунохимических используют антитела, с частицами золота͵ локализованного на и указывающего места искомого антигена.

. Используется для структуры различных компонентов клетки. Метод на том, что объект сначала замораживают азотом, а затем при той же переносят в специальную установку. Там замороженный механическим скалывается охлажденным . При этом обнажаются зоны замороженных . В вакууме воды, перешедшей в форму, возгоняется, а поверхность скола покрывается слоем испаренного , а затем металла. С и сохраняющего прижизненную материала реплику скола. уже в условиях комнатной ткань или клетки в кислотах, но при этом остается , ее изучают в электронном . Данный метод увидеть, что как на , так и в толщине клеточных располагаются глобулы белков, что мембраны не по своей [17].

Метод корпускулярных объектов. объектами называют вирусов, , выделенные клеточные (рибосомы, мембраны, и т.д.), макромолекулы.

Широко методом биологических объектов  оттенение металлами. его следующим образом. В вакуумных производится термическое металла при котором металла разлетаются от испарения по траекториям. Встречаясь с объектом, они осаждаются на нем в слоя; его толщина в местах, направлению полета металла. В участках, где экранирует пучок , возникнут ‹‹››. Следовательно, напыленная объекта имеет плотность, чем напыленная (фон), и в с этим объект . Метод широко не только для контрастирования , рибосом, но и для тонких молекул кислот. Для контрастирования платина, палладий, их , уран [2].

 негативном контрастировании  растворами солей металлов применяют аммоний, , фосфорно-вольфрамовую кислоту (). Водные растворы веществ смешивают с объектами, а их наносят на пленки-подложки и . После этого (к примеру, вирусы) как бы погруженными в слой аморфного высокой плотности. В микроскопе они выглядят как объекты на фоне (как ). Преимущества метода в том, что растворенные соли проникать объекта и выявлять его детали. Негативное широко применяется при вирусов, комплексов мембран. тяжелых металлов при позитивном контрастировании. В случае вещество связывается со , повышает ее электронную . Часто для позитивного нуклеиновых используют растворы в спирте или в ацетоне .

Метод высоковольтной микроскопии. Сегодня приборы с напряжением 1 - 3 млн. вольт. высоковольтных электронных состоит по сути в том, что на них можно получить не только более высокое разрешение, но и просматривать образцы большой толщины (1 - 10 мкм). Одновременно с высоковольтной микроскопией использование стереоскопической съемки позволяет получать информацию о трехмерной организации внутриклеточных структур с высоким их разрешением (около 0,5 нм).

Метод сканирующей (растровой) электронной микроскопии. Данный метод даёт трехмерную картину поверхности клетки. При сканирующей электронной микроскопии пучок электронов (зонд) пробегает по поверхности объекта, и полученная информация передается на электронно-лучевую трубку [19].

С помощью растровой электронной микроскопии можно получить информацию о химическом составе в тех или иных участках клеток. К примеру, метод рентгеноспектрального микроанализа основан на идентификации и количественной оценке содержания химических элементов по спектрам характеристического рентгеновского излучения, возникающего при взаимодействии первичных электронов с атомами объекта.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5 Визуализация в электронном микроскопе

 

 

Все электронные микроскопы ― сложные и дорогостоящие приборы. К работе с ними допускают только после предварительного обучения.

Перенос электронов происходит в условиях высокого вакуума. Для сохранения этого вакуума сеточки с держателем образца сначала помещают в шлюзовой отсек, где откачивается занесенный снаружи воздух. Затем сеточки аккуратно сдвигают в центр объективной электромагнитной линзы. Вверху колонны электронного микроскопа располагается источник электронов  ―  катод, выполненный в виде вольфрамовой нити или кристалла гексаборида лантана. Образец исследуется при ускоряющем напряжении 80-120 кВ в обычных микроскопах и до 1000000В в специальных высоковольтных микроскопах (в биологических исследованиях не используемых) [19].

Электронно-плотный материал (биологический материал, окрашенный тяжелыми металлами) отражает электроны, а электронно-прозрачный пропускает. Таким образом, электроны проходят через колонну, через объективную и проекторные линзы и так формируется изображении, которое можно наблюдать глазами на фосфофлуоресцентном экране, а затем запечатлеть на пленке или зарегистрировать CCD камерой и сохранить в цифровом виде.

Достигая флуоресцентного экрана, электроны возбуждают сигнал, который воспринимается человеческим глазом как зеленый свет с силуэтом прокрашенных структур на нем [20].

Сдвинув флуоресцентный экран, мы направляем поток электронов на фотопленку, где изображение детектируется на фотоэмульсии, либо, в современных микроскопах, захват изображения осуществляет CCD камера.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6 Лабораторная работа

 

Тема: «Электронная микроскопия»

 

Цель работы: ознакомиться с устройством и основными характеристиками электронного микроскопа.

 

Разрешающая способность современных электронных микроскопов составляет 0,2 - 0,4 нм, рабочее увеличение в среднем 100 000 раз.

Просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ) ― это электроннооптический прибор, в котором пучки электронов используются для формирования изображения исследуемого объекта. Электронные микроскопы позволяют увидеть и изучить строение отдельных молекул, коллоидов, вирусов, кристаллических решеток, материалов и многое другое. Наивысшим достижением современной электронной микроскопии является визуализация отдельных атомов тяжелых элементов и прямое наблюдение кристаллической решетки. Электронные микроскопы получили широкое распространение в практике научно-исследовательских работ. Практически в каждом институте физико-химического и биологического профиля используется электронный микроскоп [21].

Электронный микроскоп принадлежит к числу наиболее полезных приборов в области методов исследования микроструктуры вещества. Разрешающая способность микроскопа ― способность давать раздельное изображение точек расположенных в непосредственной близости друг к другу. В световой оптике предел разрешения равен половине длины волны (500 нм) используемого в микроскопе излучения ― т.е. около 250 нм. Разрешение электронного микроскопа достигает 0,1 нм. Длина волны электронов в ПЭМ при энергии электронов 100 кэВ 7 равна 0,0037 нм, но столь высокое разрешение не удается получить из-за наличия некорректируемых аберраций электронной оптики.

Электронный микроскоп широко используется в различных областях науки и техники. Например, с помощью электронного микроскопа в биологии исследуются элементы клеток, структура белков, нуклеиновые кислоты, вирусы и др. В материаловедении электронный микроскоп позволил изучить процессы роста и кристаллизации тонких пленок, структурные превращения в процессе термической обработки и механического воздействия. Практически все разработки полупроводниковой электроники связаны с использованием электронного микроскопа для визуализации дефектов и тонкой структуры кристаллов и слоев, выявления причин отказов [22].

Изобретение электронной оптики принадлежит Г.Бушу, который      1926 г. сообщил о том, что магнитные и электростатическое поля, с осевой симметрией, действуют на заряженные частицы как линзы. Вскоре Де Бройль сообщил о перспективах создания электронного микроскопа своему ученику изобретателю голографии Габору, который, однако, посчитал это невозможным по причине того, что объект, помещенный на пути электронного пучка должен сгореть. Тем не менее, в 1931 году немецкий физик Руска построил первый электронный микроскоп.

 

Принцип и основные характеристики микроскопа

 

Просвечивающий микроскоп из электронной пушки и магнитных линз, из которых служат для освещающего с небольшой расходимостью, а для создания увеличенного . Электронный микроскоп с тонкими на просвет. С толстыми работа производиться на (сканирующих) электронных или с исследуемого образца снимается реплика для исследования ее в электронном микроскопе .

Электронная

Для получения электронного используют явление эмиссии. Источником является вольфрамовая нить 0,1 мм V-образного изгиба. нагревается переменным до температуры °С и становится источником . Система, образованная , анодом и нитью называется пушкой. Ток электронного зависит от температуры .

Конденсорные линзы

из электронной , пучок попадает в конденсорной линзы, его фокусирует и направляет.

линза

для первоначального увеличения . Это очень важная микроскопа, так как любые изображения в объективной линзе большие искажения изображения в целом. Для большого фокусное расстояние линзы должно как можно короче. Для поле быть, как можно и ограничено в пространстве. поля достигается увеличения витков. Для уменьшения поля используют ― магнитопровод для катушки из материала. располагают полюсные , с малым зазором полюсами и с отверстием 4 - 6 мм для прохода и размещения образца. достигается интенсивное в малом объеме. Так как в большое витков и сильный ток, то подвергается нагреву, , ток через катушку изменяться со . Это может вызвать фокусного расстояния и изображения. Для устранения хроматической линз применяют охлаждение и электронную тока в линзах .

Объект в непосредственной близости от плоскости линзы. через образец, пучок , отклоняясь от тяжелых и поглощаясь более участками. Для повышения изображения в фокальной плоскости линзы (плоскость дифракционного изображения) апертурная , которая обрезает , рассеянные на структурах с периодами меньшими тех, которых получить [20].

Про и проекционная линзы. линза служит для увеличения объекта и получения его изображения на экране и на фотопластинке. Для плавного увеличения и большего увеличения объективной и проекционной ставят промежуточную .

Основные и системы электронного

Электронно-оптическая система содержит:

- электронную ;

- две конденсорные ;

- камеры образцов с столиком перемещения ;

- камеры шлюзования ;

- объективную ;

- промежуточную линзу;

- линзу;

- камеры ;

- фотокамеры с системой фотопластинок или .

 

Система электропитания :

- высоковольтный источник питания электронной ;

- стабилизированные питания линз;

- управления токами и .

 

Вакуумная система содержит:

- два насоса предварительного (до 1.10 мм. рт. ст.);

- два паромасляных диффузионных (до 10ˉ⁷ мм. рт. ст.); - клапанный механизм вакуумной .

 

Приготовления препаратов:

 

прямые и косвенные приготовления препаратов.

1. При методах материал наносят на пленку-подложку, предварительно на опорную металлическую , содержащую до 100 в 1 мм.
2. Используют органические или пленки-подложки из коллодия, , углерода, кварца и др.
3. При микроскопии эти не должны обнаруживать структуры и при этом достаточно прочными, выдержать электронами.

Широкое получил метод различных микроорганизмов на коллодиевых , находящихся на поверхности среды, и серийного их в электронном микроскопе.

 

При методе:

1. На наносят тонкий какого-либо вещества (, кварц, углерод, пластмассы)
2. отпечаток-реплику структуры его .

Приготовленный таким препарат изучают в микроскопе.

 

  работы:

 

1. Включить микроскопа.
2. Произвести вакуумной системы.
3. электропитание и электронной пушки.
4. изображение катода на экране.
5. Установить через камеру и получить его .
6. Получить изображение с дифракционной решетки и график увеличения от тока в линзе.
7. Установить увеличение 100-50 тыс. , сфокусировать и сделать снимок пленки с выдержкой 3-5 сек.

 

:

 

1. Разрешающая способность микроскопа?
2. образом исследуется массивных образцов в электронном микроскопе?
3. образом изменение увеличения в электронном микроскопе?

 

на вопросы:

 

1. Разрешающая современных микроскопов составляет нм, рабочее увеличение в 100 000 раз.

2.Электронный микроскоп ― это электронно ― оптический прибор, в котором электроны с энергией в мегавольты образуют пучки, давая увеличенное изображение микроскопического объекта на флуоресцентном экране. Просвечивающий электронный микроскоп во многом подобен световому микроскопу, но в отличие от светового микроскопа, для освещения образцов в нем используют не свет, т.е. поток фотонов, а потоки электронов, а вместо стеклянных линз ― электромагнитные. Электронное изображение формируется электрическими и магнитными полями примерно так же, как световое ― оптическими линзами

3. Изменение увеличения осуществляется регулировкой тока промежуточной линзы.

 

Вывод: ознакомились с устройством и основными характеристиками электронного микроскопа и рассмотрели: ― Salmonella typhimurium и Бактериофаг

 

 

 

Заключение

 

Начиная электронно-микроскопическое исследование и столкнувшись со всем множеством методов, бывает трудно решить, какой именно метод выбрать для того или иного объекта. Многое зависит от масштаба, является ли образец изолированной частицей, клеткой, тканью, органом, или целым организмом. Образец размером более 1 мм следует порезать на небольшие фрагменты перед началом пробоподготовки. толщиной менее мкм можно смотреть , используя метод окрашивания, все, что необходимо заполимеризовать и на ультратонкие срезы. посмотреть внутренние мембран метод замораживания-скалывания. число электронно-микроскопических проводится на ультратонких , позволяющих в рассмотреть ультраструктуру . Если в задачу локализация антигенов, рутинной в смолу проводится в специальные смолы с иммуномечением на срезах. Для иммунолокализации и морфологии структур метод замораживания ― [16].

Методы микроскопии сложны и трудоемки, и овладеть искусством микроскопии, требуется время и на покупку дорогостоящего , поэтому в мире не так групп, занимающихся микроскопией на уровне.

 

 

Список использованных источников

 

• Электронная микроскопия [Электронный ресурс]. / Москва. – laser.– Режим доступа: http://wiki.laser.ru/be/bse/001/008/126/079.htm
• Хабаров, Б Техническая диагностика и ремонт бытовой радиоэлектронной аппаратуры/ Г.Куликов. ―М., 2012. ―376 с.
• Киселев, Н.А., Электронная микроскопия биологических макромолекул/ Н.А Киселев. ―М., 2015. ―529 с.
• Шиммель, Г., Методика электронной микроскопии/ Г. Шиммель.― М., 1972.― 811 с.
• Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих/ Б.Уикли. Москва: Мир, 2008.― 324 с.
• Хокс, П., Электронная оптика и электронная микроскопия/ П. Хокс. ―М., 2013. ―723с.
• Балашов, Ю. С., Миккау Н. Е., Изучение живых животных в растровом электронном микроскопе/ Ю.С. Балашов. ―М., 1977.― 224 с.
• Tribe, М. A., Eraut, M. R., Basic biology course, book 2/                     М. A Tribe.— Electron microscopy and cellstructure, Camb., 2013.
• Электронная микроскопия в цитологических исследованиях[Электронный ресурс]. / Москва. –nsu.ru.– Режим доступа: http://www.nsu.ru/xmlui/bitstream/handle/nsu/589/EM-in-cytology.pdf
• Пономарев, А.П., Мищенко, В.А. Электронная микроскопия вирусов, животных и некоторых условно-патогенных микроорганизмов/ А.П. Пономарев, В.А. Мищенко.― М: Фолиант, 2005.― 610 с.
• Стоянова, И. Г., Анаскин, И. Ф., Основы методов просвечивающей электронной микроскопии/И.Г.Стоянова, И.Ф. Анаскин. ― М., 2000.―328 с.
• Утевский, Л. М., Дифракционная электронная микроскопия в металловедении/ Л.М. Утевский. ―М., 1999.―127 с.
•  Danilatos, G.D. Environmental scanning electron microscopy in colour/       Microscopy.― CUP Archive, 2016.
• Вайнштейн, Б. К., Восстановление пространственной структуры биологических объектов по электронным микрофотографиям/ Б.К. Вайнштейн.―М., 2011.― 530 с.
• Электронная микроскопия [Электронный ресурс]. / Москва. – medical-enc.– Режим доступа: http://www.medical-enc.ru/26/electron-microscopy.shtml
• Хейденрайх, Р. Основы просвечивающей электронной микроскопии/ Р.Хейденрайх. ―М.: Мир, 1966.―471с.
• Виды электронного микроскопа [Электронный ресурс]. / Москва. – article.– Режим доступа:http://fb.ru/article/220910/vidyi-mikroskopov-opisanie-osnovnyie-harakteristiki-naznachenie-chem-elektronnyiy-mikroskop-otlichaetsya-ot-svetovogo
• Рассел, Д. Растровый электронный микроскоп/ Д. Рассел.― М., 2012. 523 с.
• Синдро, Д. Аналитическая просвечивающая электронная микроскопия/ Д. Синдро. ― М., 2014.― 286 с.
• Дюков, В.Г., Непийко, С.А., Седов Н.Н Электронная микроскопия/ В.Г. Дюков, С.А. Непийко. ― Киев: Наук. думка, 2014. ― 200 с.
• Кулаков, Ю.А Электронная микроскопия/ Ю.А. Кулаков ― М.: Знание,2012. ― 64 с.
• James M. Modern microbiology/ J. Martin .― CUP Archive, 2015.
• Фульц, Б., Хау, Дж. М. Просвечивающая электронная микроскопия и дифрактометрия материалов/ Б. Фульц, Дж. М. Хау. ― М., 2011.― 824 с.
• Электронная микроскопия [Электронный ресурс]. / Москва. – bestreferat.– Режим доступа: http://www.bestreferat.ru/referat-215687.html

 Скачать: konelskaya-elektronnaya-mikroskopiya.rar