Привет студент

Химико-биологический факультет
Кафедра микробиологии

 

 

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

luxI-luxR подобные системы регулирования Quorum sensing микроорганизмов и возможные пути их ингибирования

 

Содержание

Введение ........................................................................................................................3

1. luxI-luxR подобные системы Quorum sensing.........................................................4

1.1 Пути биокоммуникации микроорганизмов………………………......….............4

1.1.1 Механические пути коммуникации микроорганизмов………….....................4

1.1.2 Физические пути коммуникации микроорганизмов……………….................5

1.1.3 Химические пути коммуникации микроорганизмов………………................5

• История открытия системы Quorum sensing…………………………..............6
• Эффект Quorum sensing и механизм его реализации........................................8
• Quorum sensing зависимые системы с лактонами гомосерина как агентами межклеточной коммуникации (системы типа «luxI-luxR»)…................................10
  • Система QS Vibrio fischeri ……………..………………………….....….........11
  • Система QS Pseudomonas aeruginosa……..……………………….................13
  • Система QS Chromobacterium violaceum…………………………….............14

1.5 Синтез АГЛ и механизм его взаимодействия с luxR – подобными белками…………………………………………………………………….................15

2 Методы исследования luxI-luxR подобных систем Quorum sensing....................18

2.1 Бактериальные биосенсоры АГЛ.........................................................................18

2.1.1 Биосенсоры коротко- и среднецепочечных молекул АГЛ.............................19

2.1.2 Биосенсоры длинноцепочечных молекул АГЛ...............................................20

2.1.3 Биосенсоры с широким спектром обнаружения АГЛ....................................21

2.1.4 Биосенсоры, способные обнаружить АГЛ на клеточном уровне..................21

2.2 Причины отрицательного результата детекции биосенсорами АГЛ...............22

2.3 Положительные и отрицательные стороны применения биосенсоров............23

3 Пути ингибирования системы Quorum sensing ……………………….................25

3.1 Подавление синтеза аутоиндукторов системы QS…………………….............25

3.2 Деградация аутоиндукторов QS - систем специфическими ферментами…...………………………………………………………….......…........27

3.3 Ингибирование связывания аутоиндукторов с соответствующими рецепторными белками……………………………………………………..............28

Заключение………………………………………………………………..................33

Список используемой литературы............................................................................34

Приложение А - Примеры системы QS с различными аутоиндукторами.............38

 

 

 

 

 

Введение

 

 

Последние 20 лет внимание многочисленных исследователей, работающих с микроорганизмами в различных областях биологии и медицины, обращено на явление получившее название «чувство кворума» (Quorum Sensing, QS). QS — особый тип регуляции экспрессии генов, зависящей от плотности популяции бактерий; он основан на действии низкомолекулярных сигнальных молекул различной природы, аутоиндукторов, которые накапливаются в культуре при высоких плотностях популяции бактерий [1, 2, 3]. С помощью аутоиндукторов осуществляется коммуникация бактерий — передача информации между клетками бактерий, принадлежащих к одному и тому же или к разным видам, родам, и даже семействам [1-4, 6, 7]. Примером аутоиндукторов грамотрицательных бактерий, являются ацил-гомосеринлактоны (АГЛ). Благодаря QS регуляции, бактерии получают возможность координировано контролировать экспрессию генов во всем сообществе. Передача информации от клетки к клетке с использованием QS - систем, которая приводит к индукции специализированных наборов генов, способствует быстрой адаптации популяций бактерий к меняющимся условиям и их выживанию в среде [1, 3].

В настоящее время QS регуляция обнаружена более чем у 500 видов бактерий. Регуляторные системы типа QS участвуют во взаимодействии бактерий с высшими организмами — животными и растениями, в регуляции вирулентности, формировании биопленок, регуляции экспрессии генов, связанных с синтезом различных экзоферментов, токсинов, антибиотиков и других вторичных метаболитов, в конъюгации и др. Исследование QS систем регуляции, их роли в метаболизме и взаимодействии бактерий определяет новый подход к изучению поведения бактерий в природных условиях. Эти исследования могут иметь огромное прикладное значение [1-6].

Особое внимание уделяется изучению роли QS в регуляции патогенности бактерий. Используя QS системы регуляции, патогенные бактерии при достижении высокой плотности популяции начинают синхронный синтез факторов вирулентности, вызывающих разрушение тканей организма, что способствует успешному преодолению бактериями иммунного ответа организма-хозяина. Данный факт обусловил появление нового направления, связанного с использованием QS регуляции в качестве потенциальной мишени для борьбы с инфекционными заболеваниями [3-6]. Лекарственные средства, подавляющие функционирование QS систем, направлены непосредственно на подавление патогенности бактерий и получили название «ядов патогенности». В настоящее время этот подход рассматривается как новая, перспективная стратегия антимикробной терапии. Подобные лекарственные препараты могут быть перспективными для использования не только в медицине, но и для борьбы с бактериальными инфекциями животных и растений в сельском хозяйстве, а также в пищевых технологиях [3-6].

 

1 luxI-luxR подобные системы Quorum sensing

 

1.1 Пути биокоммуникации микроорганизмов

 

 

В последнее десятилетие неуклонно расширяется список изученных микробных процессов, реализуемых только при наличии достаточной плотности популяции. Эти исследования продолжают начатые уже около 100 лет тому назад изыскания. Уже тогда исследовался, например, вопрос о том, почему культивирование бактерий часто не удается, если взята слишком низкая плотность инокулята. В 1988 г. Дж. Шапиро [7] также писал, что споры миксобактерий прорастают только при достаточно высокой их концентрации в среде. Уже в начале 80-х годов, как известно, изучением плотностно-зависимых процессов в микробных популяциях активно занимались В.И. Дуда, Г.И. Эль-Регистан и др. [8, 9]. Была исследована природа некоторых химических факторов (ауторегуляторов), накапливающихся в культуре и вызывающих те или иные эффекты, например, автолиз клеток (фактор d₂ жирнокислотной природы [9]).

Среди изучаемых каналов коммуникации между живыми организмами, три канала коммуникации являются наиболее эволюционно-консервативными и в полной мере функционируют уже у одноклеточных форм жизни [3, 10,11]. Речь идёт о передаче информации путём

1) непосредственного (механического) контакта между организмами;

2) генерации тех или иных физических полей;

3) выработки диффундирующих в среде химических агентов.

Все три канала коммуникации, вероятно, принимают участие в "эффектах кворума".

    

 

1.1.1 Механический путь коммуникации микроорганизмов

 

 

Такой контакт клеток необходим при коммуникации посредством поверхностных органелл, таких как, например, пили, и компонентов экзополимерного матрикса, покрывающего отдельные клетки, их группы, всю колонию в целом. В частности, процесс агрегации и споруляции у M. xanthus зависит от пилей типа IV (гомологи пилей типа IV есть у патогенных бактерий Pseudomonas aeruginosa и Neisseria gonorhoeae, где они также обусловливают социально координированные клеточные движения [12]), от полисахаридно-белковых фибрилл и от липополисахаридного О-антигена внешнего слоя наружной мембраны [12, 13]. Все эти поверхностные клеточные структуры синтезируются с помощью так называемых S (social) генов, ответственных за коллективные, координированные перемещения клеток и формирование структур надклеточного уровня. Им противопоставляют также имеющиеся у миксобактерий А (adventurous) гены, позволяющие клеткам покидать край растущей колонии [12].

Своего рода промежуточное положение между недиффундирующими и свободно диффундирующими агентами коммуникации у миксобактерий занимают тяжи (trails) из биополимеров матрикса, которые отделяются от образовавшей их клетки, тем самым пролагая путь другим клеткам-"путешественницам", дающим начало дочерним колониям [13].

 

 

1.1.2 Физический путь коммуникации микроорганизмов

 

 

В литературе накапливаются данные о взаимовлиянии микробных колоний в ситуации, когда невозможен обмен химическими сигналами. Так, гибнущая под воздействием хлорамфеникола культура Vibrio costicola посылает сигнал, стимулирующий рост другой культуры, отделенной от неё слоем стекла [14]. В ряде случаев предполагается синергидное действие различных каналов межклеточной коммуникации, а именно химических сигналов и физических полей; это вытекает из опытов по влиянию одной бактериальной колонии на адгезивные свойства другой [14, 15]. В качестве конкретных физических факторов гипотетически предлагаются:

1) электромагнитные волны [14] (по аналогии с эукариотическими клетками, где эффекты ультрафиолетовых лучей установлены – это митогенетический эффект А. Гурвича);

2) ультразвук [14, 15].

Необходимо признать, что физические факторы дистантной коммуникации микробных клеток и их роль в плотностно-зависимых процессах пока ещё находятся в стадии "первоначального накопления" эмпирических данных [16].

 

 

1.1.3 Химическая коммуникация микроорганизмов

 

 

Наибольшую роль в образовании коммуникативных каналов, как уже упоминалось раньше, играют диффундирующие в среде химические агенты. В роли химических агентов выступают различные вещества, выполняющие роль, как правило, активаторов транскрипции генов-мишеней [3, 4, 17].

В качестве аутоиндукторов QS микроорганизмы используют широкий спектр химеских сигнальных молекул:

а) ацилированные лактоны гомосерина, регулирующие широкий круг плотностно-зависимых коллективных процессов у грамотрицательных бактерий (Vibrio fischeri; Vibrio harveyi, Pseudomonas aeruginosa и др.) [3, 17];

1. b) пептиды, регулирующие конъюгативный плазмидный перенос у Enterococcus, развитие воздушного мицелия у Streptomyces, споруляцию у Bacillus и др.[18];
2. c) аминокислоты и сходные с ними e) аминные соединения (2-гептил-З-гидрокси-4-хинолон – PQS), регулирующие агрегацию бактериальных клеток (E. coli, Salmonella typhimurium, Myxococcus xanthus) и формирование швермеров у Proteus [3, 17].

Механизмы синтеза этих агентов, а так же функции структур, с которыми они взаимодействуют для запуска системы «чувства кворума», хорошо изучены. Рассмотрим некоторые из них более подробно.

 

 

1.2 История открытия системы Quorum sensing

 

 

Первое открытие в области социальной жизни бактерий было сделано в начале 60-х годов прошлого столетия и касалось колонии светящихся бактерий Vibrio fischeri. Эти бактерии поселяются в теле кальмаров, живущих на отмелях вокруг Гавайских островов. (фотографии 1 и 2). В течение жаркого дня кальмар отдыхает, зарывшись в песок морского дна, а ночью отправляется на охоту. В лунном свете тёмное тело кальмара становится заметным для хищников, однако бактерии, покрывающие кожу кальмара, продуцируют голубоватое свечение, похожее на лунный свет. Это своего рода маскировка [3].

 

 

(Фотографии 1 и 2 - Гавайский кальмар Euprymna scolopes)

 

Микробиолог Вудланд Хастингс (Woodland Hastings) заметил удивительную вещь. Колония Vibrio fischeri в стенах лаборатории удваивала свою численность каждые двадцать минут, однако количество светящегося пигмента —люциферазы — оставалось на заданом уровне в течение многих часов. Таким образом, интенсивность свечения не зависима от численности. Только когда колония бактерий слишком разрасталась, количество люциферазы начинало слабо расти [3].

Учёному стало очевидно, что бактерии в состоянии оценить количество членов колонии и действовать исходя из этого. Это умение бактерий действовать коллективно было названо «чувством кворума» (quorum sensing). Доктор Хастингс недооценил своё открытие, полагая, что «чувство кворума» присуще только морским бактериям, возможно только Vibrio fischeri. Студент Хастингса Кеннет Нилсон (Kenneth Nealson) несколько раз пытался опубликовать работу в научных изданиях по микробиологии, где писал о коммуникации между бактериями Vibrio fischeri. В публикациях ему отказывали, поскольку считалось, что бактерии не социальны [3].

Таким образом, эффект кворума был впервые обнаружен у морских биолюминесцирующих бактерий Vibrio fischeri и V. harveyi. В 1970 году Нельсон с соавторами [5] сообщили, что V. fischeri продуцирует внеклеточный фактор, аутоиндуктор, который регулирует продукцию люциферазы – отвечающего за биолюминесценцию фермента. В 1981 г. было продемонстрировано [6], что аутоиндуктором является N-3-(оксогексаноил)-L-гомосеринлактон (оксогексаноил-ГЛ). Дальнейшее обнаружение кворумных сенсорных систем, основанных на действии АГЛ, у условно патогенных для человека бактерий Pseudomonas aeruginosa и у растительных патогенов Erwinia carotovora и Agrobacterium tumefaciens позволило считать, что данное явление распространено более широко. В настоящее время обнаружено более пятидесяти видов микроорганизмов, продуцирующих АГЛ. Очень часто регулируемые с помощью АГЛ гены связаны с взаимодействием с эукариотическим хозяином [6].

 

 

1.3 Эффект системы Quorum sensing и механизм его реализации

 

 

Прокариоты используют сложные сигнальные механизмы для адаптации к изменениям окружающей среды, в том числе к изменению рН, температуры, осмотического давления и доступности питательных веществ [3, 20]. Такие сигнальные молекулы позволяют индивидуальным бактериальным клеткам начать совместное действие только тогда, когда будет достигнута пороговая плотность бактериальной популяции или кворум. Для описания способности определенных бактерий отслеживать собственную популяционную плотность и модулировать экспрессию соответствующих генов был предложен термин Quorum sensing или эффект кворума (QS) [2, 20, 21].

Кворумные регуляторные системы основаны на действии двух основных компонентов: низкомолекулярной диффузионной сигнальной молекулы, концентрация которой увеличивается в соответствии с ростом популяции, и белкового фактора транскрипции, который при взаимодействии с сигнальной молекулой активирует транскрипцию соответствующих генов [3].

Механизмы реакций чувства кворума различаются у грамположительных и грамотрицательных бактерий, общие данные этих систем приведены в приложении А.

Грамположительные бактерии обычно осуществляют коммуникации, используя олигопептидные сигнальные молекулы (рисунок 1). Передача сигналов в большинстве случаев включает двухкомпонентный механизм фосфорилирования. Как правило, состояние кворума достигается при переходе популяции бактериальных клеток в стационарную фазу роста. Именно в это время обнаруживаются сигнальные молекулы, при помощи которых клетки контактируют друг с другом [22].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рисунок 1 - Экспрессия генов системы QS грамположительных бактерий

 

Общую схему коммуникаций грамположительных бактерий можно представить следующим образом: сначала в клетке синтезируется предшественник, который, модифицируясь, превращается в зрелый олигопептид. Последний экскретируется наружу клетки экспортером. Молекулы олигопептида накапливаются в межклеточном пространстве по мере того, как растёт плотность бактериальных клеток. Двухкомпонентная сенсорная киназа, пронизывающая мембрану, распознает сигнал и осуществляет его передачу в клетку в процессе каскадного фосфорилирования. В клетке олигопептидная молекула взаимодействует с целевым геном (генами) [21, 22].

Более чем у 450 видов грамотрицательных бактерий обнаружены кворум-зависимые системы, в которых сигнальными молекулами служат различные ацилгомосеринлактоны. Общую схему коммуникаций грамотрицательных бактерий можно представить следующим образом (рисунок 2).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рисунок 2 - Экспрессия генов системы QS грамотрицательных бактерий

 

В системе QS грамотрицательных бактерий белки семейства Luxl являются аутоиндукторными синтазами и катализируют формирование специфических ацилгомосеринлактонных аутоиндукторных молекул. Аутоиндукторы свободно диффундируют через мембрану и аккумулируются по мере увеличения плотности клеток. Белки семейства LuxR связывают родственные им аутоиндукторы при достижении достаточно высокой концентрации сигнальных молекул. Комплекс LuxR - аутоиндуктор связывается с промотором целевых генов, запуская их транскрипцию [18, 23].

 

 

1.4 Кворум-зависимые системы с лактонами гомосерина как агентами межклеточной коммуникации (системы типа «luxI-luxR»)

 

Рассмотрим пример QS-системы грамотрицательных бактерий с ацильными производными ГСЛ. Такой тип QS-системы называется luxI –luxR типа, широко распространен среди грамотрицательных микроорганизмов (таблица 1) [1-4, 21, 22, 23].

 

Таблица 1 – QS-система типа «luxI-luxR» для некоторых представителей

 

Микроорганизм	Функция	Аутоиндукторы	Генная система
Vibrio fischeri	биолюминесценция	N-(3-оксогексаноил)-L-лактон гомосерина	luxI-luxR
	биолюминесценция	N-октаноил-L-лактон гомосерина	ainS-ainR
V. harveyi	биолюминесценция	N-(3-оксибутаноил)-L-лактон гомосерина	luxL, luxM; luxR, luxN
	биолюминесценция	AI-2	luxS-luxQ
Erwinia carotovora	синтез внеклеточных гидролитических ферментов	N-(3-оксогексаноил)-L-лактон гомосерина	ecaI (expI) – ecaR (expR) carI - carR
	синтез антибиотика карбапенема
Pseudomonas aeruginosa	синтез факторов вирулентности	N-(3-оксододеканоил)-L-лактон гомосерина	lasI-lasR
	синтез факторов вирулентности	N-бутаноил-L-лактон гомосерина	vsmI-vsmR, или rhlI-rhlR
Agrobacterium tumefaciens	конъюгативный перенос Ti-плазмид	N-3-(оксо-октаноил)-L-лактон гомосерина	traR-traI
Serratia liquefaciens	стимуляция движения клеток-швермеров по агару	N-бутаноил-L-лактон гомосерина	swr
Streptomyces griseus	синтез стрептомицина, развитие воздушного мицелия, споруляция.	2-изокапроил-3-оксиметил-γ-бутиролактон гомосерина	отличаются от типичной системы "luxI-luxR"

1.4.1 Система QS Vibrio fischeri

 

 

Впервые система QS типа luxI-luxR была описанный для V. fischeri [1, 2, 22, 23]. Система включает 2 основных блока генов. Один из этих блоков—оперон luxICDABEG, чьи гены имеют следующие функции:

Ген luxI кодирует белок (LuxI, 193 аминокислоты), который по всей вероятности функционирует как синтаза химического агента межклеточной коммуникации, чьё накопление в среде сигнализирует клеткам V. fischeri о достижении пороговой плотности (кворума) для биолюминесценции. Агент коммуникации синтезируется из S-аденозилметионина и 3-оксогексаноил-кофермента А и представляет собой N-(3-оксогексаноил)-L-лактон гомосерина (3-ОГЛГ).

Гены luxA и luxB кодируют, соответственно, субъединицы a и b люциферазы (ферментного комплекса, ответственного за биолюминесценцию).

Гены lux C, D, E кодируют редуктазу жирных кислот (один из окисляемых субстратов в ходе люциферазной реакции, приводящей к испусканию кванта света)

Ген lux G кодирует редуктазу флавинмононуклетида (другой субстрат, также окисляемый в люциферазной реакции) (рисунок 3).

 

 

Рисунок 3 - Структурные гены биолюминесценции и порядок их расположения на бактериальной хромосоме

 

Другой генный блок включает ген lux R, чей белковый продукт LuxR (250 аминокислот) связывает фактор 3-ОГЛГ. Комплекс LuxR-3-ОГЛГ связывается с промоторным участком оперона luxICDABEG и активирует его транскрипцию. В отсутствие 3-ОГЛГ оперон luxICDABEG экспрессируется на низком "базовом" уровне. Белок LuxR в отсутствие 3-ОГЛГ функционирует как репрессор, в частности, гена luxR, кодирующего сам этот белок. По мере повышения концентрации клеток V. fischeri накапливающийся в среде 3-ОГЛГ начинает выступать как "аутоиндуктор": наряду со структурными генами его комплекс с LuxR активирует и транскрипцию luxI, т.е. синтез самого 3-ОГЛГ [16, 25], активирующего в комплексе с LuxR транскрипцию оперона lux в новых и новых клетках V. fischeri. Поэтому лавинообразно нарастает синтез всех компонентов люциферазной системы и начинается интенсивное свечение бактерий [24, 25].

Помимо LuxI-синтазы у V. fischeri идентифицирован белок AinS, который не гомологичен LuxI, но имеет 34% гомологию с С-терминальным доменом LuxM-белка V. harveyi, который осуществляет позитивную регуляцию биолюминесценции у данного микроорганизма [26]. Продуктом LuxM-синтазы является гидроксигексаноил-ГЛ.

AinS-синтаза отвечает за продукцию октаноил-ГЛ [27]. В настоящее время показано [27], что обе кворумные системы последовательно индуцируют биолюминесценцию и необходимы для успешной колонизации световых органов моллюсков (рисунок 4). На ранних стадиях процесса колонизации LuxO-белок репрессирует экспрессию генов, ответственных за биолюминесценцию. LuxO ингибирует транскрипцию litR-гена, кодирующего активатор транскрипции lux-оперона и luxR-гена. При достижении плотности 10^-8 клеток на миллилитр синтезируемый с помощью AinS сигнал оказывает двойной эффект: во-первых, индуцирует биолюминесценцию в результате прямого связывания с LuxR и инактивирует LuxO, и, во-вторых, усиливает транскрипцию litR-гена. В свою очередь, LitR-белок позитивно влияет на транскрипцию luxR, что при увеличении плотности популяции усиливает биолюминесценцию, регулируемую кворумной сенсорной системой LuxI-LuxR [27, 28].

Рисунок 4 - Иерархический ауторегуляторный каскад Vibrio fischeri

 

 

1.4.2 Система QS Pseudomonas aeruginosa

 

 

Другой пример использования в качестве сигнальных молекул гомосеринлактонов показан для Pseudomonas aeruginosa - патогена для животных. Патогенность у Р. aeruginosa обусловлена широким арсеналом факторов вирулентности [26, 29]. Одни из них ассоциированы с клеткой (пили, адгезины, липополисахариды), другие секретируются (протеазы, рамнолипиды, экзофермент S, экзотоксин А, антибиотик пиоцианин и т. д.). Образование многих из внеклеточных факторов вирулентности контролируется системами межклеточного взаимодействия. Центральными компонентами таких взаимодействий служат las- и rhl-системы QS-системы, активирующие экспрессию генов в зависимости от величины плотности клеток микроорганизма. Каждая система представлена двумя генами: один кодирует фермент, при помощи которого синтезируется специфический аутоиндуктор - ацилированный гомосеринлактон (lasl/rhll); другой кодирует активатор транскрипции, с которым связывается соответствующий аутоиндуктор (lasR/rhIR) (рисунок 5). Аутоиндуктором систем las и rhi является N-(3-оксододеканоил)-L-гомосеринлактон (З-оксо-С12-HSL), для экспорта которого из клетки служит специальная система, получившая название MexEF-OprN-помпа и N-бутирил-L-гомосеринлактон (C4-HSL) соответственно [16] .

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рисунок 5 - Сетевая ауторегуляторная система Pseudomonas aeruginosa

 

Система las контролирует экспрессию генов, кодирующих такие факторы вирулентности, как эластазы А, В, а также щелочную протеазу; система rhi - ферменты биосинтеза рамнолипидов, пиоцианина. [30]. Было продемонстрировано, что LasR/LasI и RhlR/RhlI регуляторные системы взаимодействуют между собой по принципу каскадной иерархии [31]. Кроме того, P. aeruginosa использует эффект кворума для контроля образования биопленок. Формирование биопленок, как считается, защищает входящие в них микроорганизмы от фагоцитов и системы комплемента организма хозяина и обеспечивает повышенную устойчивость к антибиотикам. Показано, что синтез оксододеканоил-ГЛ ферментом LasI является обязательным для нормального формирования биопленки [30, 31].

Недавно была обнаружена третья сигнальная молекула, принимающая участие в реакциях QS у P.aeruginosa - 2-гептил-З-гидрокси-4-хинолон (PQS). Эта сигнальная молекула может контролировать уровень экспрессии las В, кодирующего эластазу Las В, а также уровень экспрессии rhil, кодирующего синтазу C4-HSL.

 

1.4.3 Сиcтема QS Chromobacterium violaceum

 

 

Chromobacterium violaceum один из миллиона видов свободноживущих микроорганизмов, которые населяют почву и воду в тропической и субтропической зонах. Это возможно, потому что C. violaceum смогла адаптироваться к жизни в суровых условиях окружающей среды: в условиях нехватки питательных веществ, высокого уровня радиации и ядов [34] . 

1. violaceum редко вызывает инфекции человека, но когда вызывает, то является причиной множества смертей. Наиболее часто заболевание, вызванные C. violaceum, встречаются в Австралии, Южной Америке и Юго-восточной Азии, где типичными болезнями являются такие болезни, как кожные воспаления, сепсис, абсцесс печени и глазные инфекции. 

Природный штамм C. violaceum образует фиолетовый пигмент виолацеин (violacein), который обладает свойствами антибиотика, также установлено, что violacein участвует в защите от видимого излучения, что и позволяет бактерии выжить в почве тропических и субтропических районов земного шара [35]. Синтез пигмента регулируется системой QS, которая включает AГЛ - N-гексаноил-гомосерин-лактон (С6-ГСЛ). Два гена Cvii и Cvir были выявлены в геноме C. violaceum, кодируещие белки CviI - С6-ГСЛ синтазы и CviR - регуляторный белкок, структурно и функционально схожие с белками, которые участвуют в контроле биолюминесценции Vibrio fischeri. Сигнальные молекулы продуцируются бактерией и свободно диффундируют из клетки в окружающую среду [39]

При достижении определенной концентрации в среде аутоиндукторы проникают в бактериальные клетки, связываются с CviR и активируют ген Cvii - С6-ГСЛ синтазы, что приводит к массовой продукции C6-ГСЛ. Эта сигнальная молекула связывается с оператором Cvir, вызывая его выражение. Увеличение CviR позволяет ему связываться с транскрипционным сайтом оперона биосинтеза violacein vioABDC (рисунок 6) и запустить экспессию, что приведет к увеличению пигмента. CviR способен стимулировать экспрессию других генов в C. violaceum, таких, как хитиназы и экзопротеазы.

 

Рисунок 6 - Схематическое изображение структурных генов оперона биосинтеза пигмента violacein

 

• Синтез АГЛ и механизм его взаимодействия с LuxR-подобными белками

 

 

Все АГЛ имеют в составе молекулы гомосеринлактоновое кольцо, однако ацилированные боковые цепи различных АГЛ значительно отличаются по длине, степени замещенности и насыщенности (рисунок 7).

Общая гидрофобность молекулы представляет собой баланс между некоторой гидрофильностью гомосеринлактонового кольца и гидрофобностью боковой цепи. Такая амфипатическая структура, возможно, позволяет АГЛ проникать через фосфолипидный бислой мембраны и, кроме того, существовать во внутри- и внеклеточных водных средах.

Все идентифицированные АГЛ имеют в боковой цепи от 4 до 14 атомов углерода и количество их кратно двум (С6, С8, С12). В целом именно длина боковой цепи и химическая модификация в β-позиции обеспечивают высокую специфичность QS систем [22].

 

A – оксогексаноил-ГСЛ (оксо-С6-ГСЛ); B – бутаноил-ГСЛ (С4-ГСЛ);

C – гидроксибутаноил-ГСЛ (гидроксиС4-ГСЛ); D – гексаноил-ГСЛ (С6-ГСЛ); E – оксооктаноил-ГСЛ (оксоС8-ГСЛ); F – оксодеканоил-ГСЛ (оксоС10-ГСЛ); G – оксододеканоил-ГСЛ (оксоС12-ГСЛ).

 

Рисунок 7 – Структурные формулы АГЛ.

 

АГЛ имеют общую структуру алифатической цепочки различной длины, присоединенной через амидную связь к лактонизированному остатку гомосерина. LuxI катализирует связывание S-аденозилметионина (SAM) с жирнокислотной цепочкой, синтезированной при участии ацил-ацил переносящего белка (ACP) [33]. Последующая за образованием амидной связи лактонизация S-аденозилметионина приводит к образованию кольца, освобождению АГЛ и образованию побочного продукта - 5-метилтиоаденозина (MTA) (рисунок 8) .

Рисунок 8 - Синтез АГЛ и механизм его действия

 

Поскольку образуется множество АГЛ с отличающимися структурами боковых цепей, то гомологи LuxI-белка должны распознавать различные коньюгаты ацил-ACP. Выяснено, что аминоконцевой домен молекулы является высококонсервативным и содержит 10 аминокислотных остатков, полностью гомологичных у различных белков LuxI-типа. Среди этих десяти консервативных аминокислот 7 является заряженными. Исходя из данных, что карбоксиконцевой домен является более вариабельным у различных представителей LuxI-белков, сделано предположение, что именно он обеспечивает распознавание различных ацилированных цепочек в молекулах ацил-ACP [37, 38].

Кроме того, анализ нескольких мутантных белков LuxI-типа позволил идентифицировать положение аминокислотных остатков, имеющих существенное значение для функциональной активности белка [2, 23]. Так, мутации, приводящие к полному отсутствию функциональной активности LuxI-белков, затрагивают область с 25 по 70 аминокислотный остаток; на основании чего можно сделать вывод о том, что эта область отвечает за ферментативную активность белка, а именно за формирование амидных связей. Анализ точечных мутантов показал, что по всей длине молекулы белка имеются консервативные остатки. С помощью сайт-направленного мутагенеза было продемонстрировано [22], что остатки цистеина в LuxI-белке не имеют значения для его функциональной активности, но важны для проявления функциональной активности у RhlI-белка Р. aeruginosa и TraI-белка Agrobacterium tumefaciens [22].

Все белки LuxR-типа имеют 18-23% гомологии. В белке можно выделить два четких кластера - домена, которые характеризуются высокой консервативностью: область, отвечающая за взаимодействие с АГЛ – N-концевой домен и ДНК-связывающую последовательность – С-концевой домен (рисунок 9).

 

 

Рисунок 9 - Димеры: сенсорный белок (LuxR) – ГСЛ

 

Ответная реакция на АГЛ реализуется белками LuxR-типа в несколько этапов:

а) специфичное связывание с соответствующей молекулой АГЛ;

б) конформационные изменения либо мультимеризация;

в) присоединение к или освобождение специфической регуляторной последовательности, находящейся перед геном-мишенью;

г) как правило, активация транскрипции [2].

В настоящее время механизм взаимодействия молекулы АГЛ и связывающего ее домена не достаточно хорошо изучен, но при использовании аналогов АГЛ удалось показать, что белки LuxR-типа распознают характерные особенности как гомосеринлактона, так и ацильной цепи. [9].

Считается, что гомологи LuxR должны формировать димер для лучшего связывания ДНК, а именно lux-бокса, обладающего двойной симметрией. lux-бокс – это последовательность ДНК в 20 пар оснований, представленная инвертированными повторами. Активация транскрипции LuxR-белком зависит от расположения lux-бокса относительно промотора. Кроме того, для активации необходимо, чтобы с LuxR-белком взаимодействовали обе части двойного повтора [21].

 

2 Методы исследования luxI-luxR подобных систем Quorum sensing

 

 

QS является предметом подробного исследования последние десятилетия, было точно установлено, что этот процесс играет ключевую роль в бактериальной межклеточной коммуникации. В познании принципов QS большую роль сыграли простые методы обнаружения АГЛ с использованием бактериальных биосенсоров за счет фенотипических проявлений в них после контакта с экзогенными АГЛ. Рассмотрим более подробно методы и бактериальные биосенсоры, которые используются в настоящее время для обнаружения различных АГЛ [37].

 

 

2.1 Бактериальные биосенсоры АГЛ

 

 

Очень большое количество АГЛ системы QS были определены в основном за счет использования бактериальных биосенсоров, которые детектируют присутствие АГЛ. Эти биосенсоры не продуцируют АГЛ, но содержат функциональные белки семейства LuxR, гены которых клонированные вместе с соответствующим промотором (как правило, промотором родственным luxI), что положительно регулирует транскрипцию гена-репортера (например, биолюминесценции, продукции β-галактозидазы, зеленого -флуоресцентного белка и violacein пигмента  [37]. 

Первым шагом в обнаружении системы luxI-luxR QS служит проверка тестируемого штамма на производство АГЛ. Каждый биосенсор содержит конкретный ген, семейства luxR, демонстрируя тем самым специфичность к определенному АГЛ. Для определения узкого диапазона АГЛ при тестировании штамма на производство АГЛ важно использовать несколько биосенсоров, отвечающих на АГЛ с различными структурными особенностями [37].

Штаммы-биосенсоры могут быть использованы по-разному:

1) тестируемые штаммы могут быть выращены на плотной питательной среде в виде полоски вблизи биосенсора, располагаясь перпендикулярно друг к другу в виде буквы «Т» . Фенотипическое изменение на стыке этих штаммов объясняется экзогенным выделением АГЛ тестируемым штаммом. Могут использоваться и модификации метода. Данный метод носит название «чашечный метод» (ЧМ).

2) АГЛ могут быть извлечены из супернатанта тестируемого штамма, находящегося в конце экспоненциальной фазы роста, и протестированы методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на вращающейся С₁₈-фазовой пластинке. Супернатант во много раз увеличивает чувствительность биосенсора на восприятие АГЛ. АГЛ выделяют органическим растворителем, который затем удаляют путем сушки [38]. Тестируемые образцы и контроли помещают в ТСХ-пластины, и после хроматографии, поверх пластин помещают биосенсорные штаммы. Каждый АГЛ мигрирует с характерной ему скоростью, в зависимости от длины цепи, формируя в конце пути фигуру определенной формы, выявляемую с помощью репортерного штамма – биосенсора. С₃-оксо-ГСЛ формируют пятна в виде капель, а алканоил-ГСЛ и С₃-гидрокси-ГСЛ – в виде круга [38, 39]. Разделение с помощью ТХС в сочетании с АГЛ-биосенсором дает быстрый и прямой визуальный результат. Но АГЛ не могут быть однозначно определены этим методом, а только позволяет предварительно предположить структуру молекулы. Более точные результаты дает спектроскопический метод [40].

3) Некоторые АГЛ-биосенсоры могут быть использованы для количественного определения АГЛ (количественный метод, КМ) путем измерения активность репортерной системы, отвечающей за биолюминесценцию, продукцию β-галактозидазы, зеленого флуоресцентного белка и пигмента violacein и др., в штамме-биосенсоре. Это полезно для изучения регуляции синтеза АГЛ и для определения различия уровня производства АГЛ. Для количественного метода нужно точно определить, используя синтетические АГЛ, минимальное количество АГЛ, требуемое для ответа системы, и максимальное количество насыщения, чтобы правильно подбирать дозы [37].

4) Фиксацию зеленого флуоресцентного белка можно проводить и с помощью флуоресцентного микроскопа (ФМ).

 

 

2.1.1 Биосенсоры коротко- и среднецепочечных АГЛ

 

 

Некоторые АГЛ биосенсоров были построены на основе нескольких белков семейства LuxR, которые способны обнаруживать АГЛ, имеющие ацильную цепи С₄ до C₈ в длину. Обычно используется биосенсор на основе Chromobacterium violaceum , производящий антибактериальный фиолетовый пигмент violacein. C. violaceum регулирует violacein-производство через cviI/R QS-систему, продуцирующую и отвечающую на C₆-АГЛ. Был получен методами генной инженерии мутантный штамм C. violaceum 026 (СV026), который имеет инактивированный ген синтазы АГЛ, что приводит к неспособности синтезировать АГЛ и образовать пигмент [39]. Образование виолацеина индуцируется путем экзогенного внесения в среду культивирования АГЛ. Неудивительно, что наиболее активным АИ для CV026 является C₆-АГЛ, также система достаточно хорошо отвечает на C₆-3-оксо-АГЛ и C₈-АГЛ (оба в шесть раз менее активены, чем C₆-AГЛ), С₈-3-оксо-АГЛ (в 11 раз менее активен) и C₄-АГЛ (в 30 раз менее активен). Штамм CV026 реагирует очень плохо на С₄-3-оксо-AГЛ, а АГЛ-ы с ацильными цепочками, с C₁₀ и большей цепью имеют слабо или вообще не выраженное действие. Кроме того, штамм абсолютно не отвечает на все 3-гидрокси-AГЛ-ы. Этот штамм хорошо подходит для тестов на твердых средах, а также метода TСХ с техникой наложения пластин с биосенсорами [37, 39].

Другие биосенсоры были получены путем внедрения плазмид, несущих гены luxCDABE оперона Photorhabdus luminescens, в результате в качестве репортерной системы выступает система биолюминесценции [41, 42]. Эти плазмиды, как правило, внедряют в Escherichia coli, которая не производит АГЛ.  Плазмиды pSB401 и pHV200I ^-  основаны на luxR из V. fischeri и родственныx luxI промотерах контроля выражения luxCDABE [41]. Они наиболее чувствительны к родственным C₆-3-оксо-AГЛ и хорошо чувствительны к C₆-AГЛ, С₈-3-оксо-АГЛ и C₈-АГЛ. Эффект слабо наблюдался при тестировании C₄-АГЛ, С₁₀-и других длинноцепочечных AГЛ-ов. Наличие AГЛ-ов вызывает биолюминесценцию E. coli, которая, в анализе TСХ может быть обнаружена путем использовании подложки биосенсора на авторадиографической бумаге, чаще учет биолюминесценции ведется с помощью биолюминометра [37]. Эти два LuxR биосенсора, E. coli (pSB401) и E. coli (pHV200I^-), могут быть использованы для количественной оценки АГЛ, так как они особенно чувствительны к низкой концентрации АГЛ, однако для этого необходимо использовать биолюминометр. Плазмиды pSB403 содержит те же гены, ответственные за биолюминесценцию, что и pSB401, но имеет более широкий круг хозяев. Наконец, биосенсором чувствительным к C₄-AГЛ является  E. coli (pSB536); данная плазмида pSB536 построена с использованием гена ahyR из Aeromonas hydrophyla и промотора гена ahyI, связанного с luxCDABE [37] . Похожим биосенсором является E. сoli pAL101, отвечающая на С₄-AГЛ, она состоит из rhlR и родственного промотора  rhlI сшитого с luxCDABE. RhiI-R QS система относится к Р. Aeruginosa [43, 45]. Важно, что это биосенсоры работает лучше, если в рекомбинантном штамме E. сoli присутствует ген sdiA. SdiA является аналогом белка семейства LuxR, которые могут активировать промотор rhlI , таким образом, они помогают обнаружить С₄-AГЛ, при этом E. сoli не имеет белки аналогичные белкам семейства LuxI- синтазы и, поэтому не синтезируют AГЛ-ы [37].

 

 

2.1.2 Биосенсоры длинноцепочечных АГЛ

 

 

Биосенсоры для обнаружения С₁₀-АГЛ, С₁₂-АГЛ и их 3-оксо производных основаны на LasI-R системе QS Р. aeruginosa, которая производит и отвечает на С₁₂-3-оксо-АГЛ. Плазмиды биосенсора pSB1075 содержат ген lasR и ген промотора контроля выражения luxCDABE. Эта плазмида может быть встроена в  штамм E. сoli, который удобно использовать в ТСХ для обнаружения С₁₂-3-оксо-AГЛ, С₁₀-3-оксо-АГЛ и С₁₂-АГЛ [42]. Другой биосенсор  E. сoli, несущий плазмиду pKDT17, также основан на LasI-R системе, но эта плазмида содержит lasR под контролем промотора lasB:LacZ, поэтому ответ на экзогенные АГЛ обнаруживаются с помощью β-галактозидазы. Ген lasB  кодирует эластазы, и регулируется lasI-R системой QS [43]. E. сoli (pKDT17) - биосенсор может быть использован при анализе ТСХ на обнаружение таких АГЛ как: С₁₀-АГЛ, С₁₂-АГЛ и их 3-оксо производных.  Оба биосенсора могут быть использованы для количественной оценки АГЛ, pSB1075 - с помощью люменометра, и pKDT17 через стандартный методы определения β-галактозидазы [37]. 

 

 

2.1.3 Биосенсоры с широким спектром обнаружения АГЛ

 

 

Применение биосенсоров ограничено специфичностью рецепторного белка к определенным АГЛ.  Биосенсоры на основе traI-R QS системы Agrobacterium tumefaciens обнаруживают широкий спектр АГЛ-ов и также обладают высокой чувствительностью к этим соединениям. Система генов traI-R QS локализованы в Ti-плазмиде, она производит и отвечает на С₈-3-оксо-АГЛ. QS-система А. tumefaciens участвует в регуляции коньюгативной передачи многих плазмиды [44]. Из всех АГЛ-биосенсоров, построенных до сих пор, А. tumefaciens отображает широкий спектр чувствительности к AГЛ в самой низкой концентрации. Биосенсоры, продуцирующие β-галактозидазы, особенно хорошо подходит для анализа TСХ. Она настолько чувствительна ко многим АГЛ, что требует лишь небольших объемов экстрактов, выделенных из супернатанта тестируемой культуры. Также данный биосенсор АГЛ может исследоваться чашечным методом, при этом культуру выращивают в подходящей среде, содержащей X-Гал. После инкубации в течение ночи, внесение АГЛ приведет к формированию синей зоне вокруг места применения [37, 44]. Этот биосенсор обнаруживает 3-оксо-замещенные АГЛ, производные АГЛ с длиной цепи от 4 до 12 атомов углерода, а также 3-незамещенные-АГЛ, за исключением C4-АГЛ. Важно отметить, что этот датчик может обнаружить 3-гидрокси производные, точнее C₆-3-гидрокси-AГЛ, С₈-3-гидрокси-АГЛ и С₁₀-3-гидрокси-АГЛ [37].

Применяются и другие биосенсоры на основе А. tumefaciens  такие как WCF47 (pCF218) (pCF372), штамм WCF47 имеет мутацию в гене traI и, следовательно, не производит АГЛ. Плазмиды pCF218 содержит traR , который сшит с промотором tetR, а плазмида pCF372 содержит промотор traI транскрипционно сшитого с lacZ. Как и в других случаях биосенсор              A. tumefaciens может быть использован в ТСХ и количественном анализе АГЛ. Проводят различные модификации биосенсоров с целью повысить их чувствительность и расширить диапазон восприятия АГЛ [37, 44].

1.1.4 Биосенсоры, способные обнаружить АГЛ на одноклеточном уровне

 

 

До 1999 года понимание АГЛ-системы QS у бактерий, основывалось в основном на экспериментах в пробирках.  Способность контролировать АГЛ молекулы в естественных условиях в первую очередь определяется созданием сенсорных плазмид АГЛ, которые используют нетоксичные репортерные гены (гены, кодирующие зеленый флуоресцентный белок (GFP)), которые могут быть обнаружены с помощью флуоресцентной микроскопии [49]. Биосенсор содержит либо стабильный gfp-ген либо нестабильный [gfp(ASV)], необходимый для обнаружения переходных АГЛ [46].  Эти сенсоры могут быть использованы в чашечном методе (Т-полоска) и TСХ анализе с использованием флуоресцирующего микроскопа. Реальное преимущество этих сенсоров заключается в том, что их можно использовать внутриклеточно для обнаружения производства АГЛ.  Были получены плазмиды pJBA130 и pJBA132, содержащие компоненты гена системы QS V. fischeri и стабильную или нестабильную версию gfp, соответственно. Эти плазмиды имеют широкий диапазон хозяинов-репликонов и тем самым могут реплицироваться в большинство грамотрицательных бактерий [48]. Штаммы реагируют лучше на С₆-3-оксо-AГЛ, в 10 раз ниже чувствительность на C₆-АГЛ, С₈-АГЛ и С₁₂-3-оксо-АГЛ, и по крайней мере в 500 раз менее чувствительны к С₄-АГЛ. Такие и подобные сенсоры использовались для визуализации продукции АГЛ Р. aeruginosa в легких зараженных мышей.

Два других биосенсора АГЛ на основе GFP, со встроенными плазмидами pKR-C12 (P. aeruginosa PAO1 Las - система) и pAS-C8 (Burkholderia cepacia CepI/R система), реагируют на различные спектры АГЛ-молекул [47]. Биосенсоры, содержащие плазмиду pKR-C12, наиболее чувствительны к родственным С₁₂-3-оксо-АГЛ. Биосенсоры, содержащие плазмиду pAS-C8, наиболее чувствительны к C₈-АГЛ. Плазмиды pKR-C12 и pAS-C8 использовались для изучения межвидовой коммуникации между P. aeruginosa и B. cepacia, которые являются двумя условно-патогенных микроорганизмов, заражающих легкие муковисцидозом. Биосенсоры АГЛ, основанные на Gfp, также выявляют связи различных бактериальных популяций ризосферы консорциума растений [37, 47]. 

 

 

2.2 Причины отрицательного результата детекции биосенсорами АГЛ

 

 

Отрицательный результат может означать, что испытуемые штаммы не производят АГЛ; испытуемые штаммы синтезирует неизвестный АГЛ, который просто не обнаруживается биосенсором, это маловероятно, но не может быть исключено; испытуемые штаммы синтезируют АГЛ в очень низких концентрациях, которые находятся ниже порога чувствительности биосенсора [37].

Ложноотрицательные результаты с использование биосенсоров АГЛ иногда могут возникать из-за бактериостатического эффект соединений, вырабатываемые бактериями, используемыми в качестве биосенсора. Этого можно избежать, если сенсорная система АГЛ полностью содержится в пределах плазмиды, которая может трансформироваться в целевую бактерию. Важно следить за рН культуральной жидкости или рН твердых сред, так как АГЛ будут гидролизоваться в основных условиях. Наконец, длинноцепочечные АГЛ могут обладать низкой проницаемостью через клеточную мембрану, что влияет на обнаружение их в тестах [37].

 

 

2.3 Положительные и отрицательные стороны применения биосенсоров

 

 

Большинство биосенсоров АГЛ, описанных в данном обзоре, приведены в таблице 2. Технологии использования биосенсоров АГЛ играют важную роль в быстром выделении и изучении АГЛ системы-QS в грамотрицательных бактериях. Одной из причин является то, что стандартная технология гибридизации ДНК, а также ПЦР-стратегии не могут быть использованы для анализа АГЛ QS-систем из-за отсутствия сходства нуклеотидных последовательностей между luxI и luxR гомологами [37].

Существуют определенные ограничения, и нужно быть осторожными в интерпретации данных, полученных с использованием биосенсоров АГЛ. Полученные экстракт могут содержать не АГЛ соединения, а иные вещества, которые могут ингибировать или активировать ответ биосенсоров. Кроме того, результаты с отрицательной реакцией поиска АГЛ биосенсором, нельзя точно интерпретировать как то, что тестируемый бактериальный штамм не производит АГЛ. АГЛ, как правило, активны в очень низких концентрациях, и технологии биосенсоров позволяет количественно учитывать АГЛ. Различные гомологи LuxR имеют разнообразные сходства с различными АГЛ, это ведет к неточным результатам сравнения активности одного АГЛ с ответом, полученным от других АГЛ [37].

Разработка и использование технологии биосенсоров АГЛ будет играть важную роль в будущих исследованиях, которые могут включать взаимодействие и общение прокариот с эукариотами, обнаружение АГЛ в пробах окружающей среды и бактериальных межвидовых и межродовых отношениях.

 

 

 

 

Таблица 2 - Биосенсоры АГЛ

Штамм / плазмида сенсора	Хозяин	система QS	Репортернаяе система	Характерные АГЛ	Обнаруживаемые АГЛ	Метод тестирования	Ссылка
С. violaceumCV026	С. violaceum	CviI/R ( С. violaceum )	Violacein пигмент	C6-АГЛ	С6-3-оксо-АГЛ C8-АГЛ C8-3-оксо-АГЛ C4-АГЛ	ЧМ, ТСХ	McClean с соавт.(1997)
pSB401	E. coli	LuxI/R ( V. fisheri )	luxCDABE	С6-3-оксо-АГЛ	C6-C8 АГЛ-3-оксо-АГЛ C8-АГЛ	ТСХ, КМ.	Winson и др..(1998a)
pHV200I -	E. coli	LuxI/R ( V. fisheri )	luxCDABE	С6-3-оксо-АГЛ	C6-C8 АГЛ-3-оксо-АГЛ C8-АГЛ	ТСХ, КМ.	Pearson с соавт.(1994)
pSB536	E. coli	AhyI / R ( А. hydrophyla )	luxCDABE	С4-АГЛ		ТСХ, КМ.	Swift с соавт.(1997)
pAL101	E. coli (sdiA мутант)	RhlI/R (P. aeruginosa)	luxCDABE	С4-АГЛ		ТСХ, КМ.	Lindsay и Ahmer (2005)
pSB1075	E. coli	LasI/R (P. aeruginosa)	luxCDABE	С12-3-оксо-АГЛ	С10-3-оксо-АГЛ C12-АГЛ	ТСХ, КМ.	Winson  и др..(1998a)
pKDT17	E. coli	LasI/R (P. aeruginosa)	β-галактозидазы	С12-3-оксо-АГЛ	С12-С10-АГЛ АХЛ С10-3-оксо-АГЛ	ТСХ, КМ.	Pearson  c соавт.(1994)
M71LZ	P. aeruginosa	LasI/R (P. aeruginosa)	β-галактозидазы	С12-3-оксо-АГЛ	С10-3-оксо-АГЛ	КМ.	Dong  c соавт.(2005)
pZLR4	А. tumefaciens NT1	TraI/R (A. tumefaciens)	β-галактозидазы	С8-3-оксо-АГЛ	Все 3-оксо-АГЛs C6-C8-АГЛ АХЛ С10-С12-АГЛ АХЛ С14-АГЛ C6-3-гидрокси-АГЛ C8-3-гидрокси-АГЛ С10-3-гидрокси-АГЛ	ЧМ, ТСХ, КМ.	Farrand c соавт.(2002)
S. meliloti sinI::lacZ	S. meliloti sinI::lacZ	SinI/R (S. meliloti) )	β-галактозидазы	С14-3-оксо-АГЛ	С16 :1-3-оксо-АГЛ C16-C16 АХЛ :1-АГЛ С14-АГЛ	ЧМ, ТСХ, КМ.	Llamas c соавт (2004)
pJNSinR	S. meliloti sinI::lacZ	SinI/R (S. meliloti) )	β-галактозидазы	Как и выше с большей чувствительностью	Как и выше с большей чувствительностью	ЧМ, ТСХ, КМ.	Llamas c соавт (2004
pKR-C12	Широкий круг хозяев	LasI/R (P. aeruginosa)	gfp	С12-3-оксо-АГЛ	С10-3-оксо-АГЛ	ФМ	Riedel c соавт.(2001)
pJBA-132	Широкий круг хозяев	LuxI/R (V. fisheri)	gfp	С6-3-оксо-АГЛ	C6-C8-АГЛ, С10-АГЛ	ФМ	Andersen c соавт.(2001)

ЧМ - чашечный метод (анализа "Т" в твердых средах).  ТСХ – тонкослойная хроматография. ФМ – флуоресцентная микроскопия. КМ – количественный метод [37].

 

3 Пути ингибирования системы Quorum sensing

 

 

Исследования QS-регуляции, проведенные в последние годы, показали, что использование QS-систем может иметь огромное значение для практики. В настоящее время во многих микробиологических, иммунолог и биотехнологических лабораториях занимаются разработкой нового подхода в борьбе с инфекционными заболеваниями, формированием биопленок на основе ингибирования QS-систем [4].]

Так как QS-системы играют важную роль в регуляции вирулентности бактерий, ингибирование QS приводит к подавлению синтеза факторов вирулентности у бактерий. Лекарственные средства, направленные на подавление QS-систем предложено называть «ядами патогенности», так как они предназначаются именно для подавления патогенности бактерий [4, 5]. В отличие от классических антимикробных лекарств (прежде всего антибиотиков), они не должны обладать бактерицидным или бактериостатическим эффектом. Важное следствие этого – отсутствие селективного давления, ведущего к быстрому образованию резистентных к антибактериальным веществам форм патогенных бактерий. Образование и широкое распространение бактериальных возбудителей, устойчивых к традиционным лекарственным препаратам, является в настоящее время одной из важнейших проблем современной медицины [4, 5].

Еще одной серьезной проблемой антимикробной терапии является способность патогенных бактерий формировать биопленки. Биоплёнки - высокоупорядоченные бактериальные сообщества, которые позволяют бактериям жить в прикреплённом состоянии. Способность бактерий образовывать биоплёнки интересна ввиду того, что представители патогенных для человека и животных возбудителей проявляют устойчивость к действию антимикробных веществ, дезинфектантов, действию иммунной защиты организма хозяина. Поэтому лекарства, основанные на подавлении QS, перспективны для подавления образования биопленок бактерий [4, 5, 50]

Ингибирование функционирования QS-систем может быть достигнуто несколькими способами [4, 5]:

1. Подавление синтеза аутоиндукторов QS- систем.
2. Деградация аутоиндукторов QS – систем специфическими ферментами.
3. Ингибирование связывания аутоиндукторов с соответствующими рецепторными белками.

 

 

• Подавление синтеза аутоиндукторов QS- систем

 

 

Известно, что субстратом для синтеза аутоиндукторов АГЛ и АИ-2 является S-аденозилметионин (SAM). Большинство работ по подавлению синтеза АГЛ связаны с изучением действия различных аналогов SAM. Показано, что аналоги SAM, например, S-аденозилгомоцистеин, S-аденозилцистеин действуют как сильные ингибиторы синтеза АГЛ у Pseudomonas aeruginosa [49] (рисунок 10).

 

 

Рисунок 10 – Переход аденозилметионина в аденозилгомоцестеин

 

Показано, что некоторые антибиотики - макролиды, ингибиторы синтеза белка на рибосомальном уровне - в концентрациях, не ингибирующих рост бактерий, подавляют синтез АГЛ и некоторых факторов вирулентности. Например, субингибирующие концентрации эритромицина (рисунок 11) подавляли синтез AГЛ и факторов вирулентности - гемолизина, протеаз, гемагглютининов – у P. aeruginosa.

 

Бактерии, подвергнутые действию антибиотика, были менее вирулентны для мышей. Эти данные согласуются с результатами клинических наблюдений, показавших эффективность применения низких доз эритромицина и других макролидов при инфекциях, вызванных штаммами P. aeruginosa, устойчивых к этим антибиотикам [50, 51].

Азитромицин в концентрации 2 мкг/мл, не ингибирующей рост P. aeruginosa, подавлял синтез AГЛ, а также продукцию факторов вирулентности эластазы и рамнолипидов. При этом добавление в культуру АГЛ экзогенно приводило к восстановлению продукции этих факторов вирулентности, показывая, что именно синтез AГЛ является первичной мишенью действия антибиотика. Механизм действия макролидных антибиотиков на синтез АГЛ остается в настоящее время неясным [49, 50, 51, 52].

 

 

• Деградация аутоиндукторов QS - систем специфическими ферментами

 

 

Деградация аутоиндукторов QS-систем - один из перспективных путей борьбы с бактериальными инфекциями. Разложение АГЛ может быть следствием действия специфических ферментов бактерий и высших организмов, высоких pH, повышенной температуры культивирования бактерий, они могут также подвергаться щелочному гидролизу [53]. В настоящее время проводится активный скрининг ферментов, деградирующих АГЛ, в первую очередь, лактоназ, разрушающих гомосеринлактонное кольцо (рисунок 12).

Рисунок 12 – Структура АГЛ и пути деградации молекулы лактоназой и ацилазой (пунктирными линиями указаны места действия ферментов)

 

Лактоназы, гидролизующие АГЛ, были найдены у бацилл (белок AiiA) [56]. Введение клонированного гена aiiA в клетки фитопатогенной бактерии Erwinia carotovora снижало синтез АГЛ и в результате уменьшало активность пектолитических ферментов и проявление других симптомов заболевания растений [55, 56]. Присутствие этого фермента в клетках бактерий в значительной степени определяет их способность к подавлению фитопатогенных бактерий, у которых вирулентность регулируется QS- системами с участием АГЛ, что открывает новые возможности при разработке эффективных бактериальных препаратов для биологической борьбы с заболеваниями растений [56, 55]. Получены трансгенные растения, экспрессирующие введенный в их геном бактериальный ген aiiA; эти растения были существенно менее чувствительны к инфекции E. carotovora [55].

Изучается также способность АГЛ-ацилаз, продуцируемых бактериями, деградировать АГЛ [56, 57].

Высшие организмы также обнаруживают механизмы специфической деградации АГЛ. Большой интерес представляют данные о том, что клетки эпителия дыхательных путей человека способны инактивировать АГЛ P. aeruginosa - 3OC12-HSL, но не C4-HSL. Эта инактивация имеет, по- видимому, ферментативную природу. Деградации подвергаются и другие АГЛ, например, C6-HSL . Способность к деградации АГЛ обнаружена у некоторых клеток млекопитающих [60]. Эта находка открывает новую область исследований и позволяет надеяться, что человеческий организм имеет еще одну линию защиты от бактериальных инфекций - через взаимодействие с QS-регуляцией вирулентности бактерий.

 

 

• Ингибирование связывания аутоиндукторов с соответствующими рецепторными белками

 

 

Осуществляется с помощью молекул антагонистов аутоиндукторов, которые мешают связыванию АИ с молекулами рецепторных белков (рисунок 13).

 

 

Рисунок 13 – Действие антагонистов

 

Подавление функционирования QS-систем регуляции может быть достигнуто при помощи антагонистов аутоиндукторов, которые мешают связыванию аутоиндуктора с молекулами рецепторных белков. Показано, что такие ингибиторы могут конкурировать с АГЛ - в этом случае они структурно близки сигнальной молекуле аутоиндуктора и взаимодействуют с участком связывания АГЛ в рецепторном белке, но не активируют этот белок. Неконкурентные ингибиторы могут иметь слабое сходство с АГЛ, или вообще не быть сходными с ним. Эти соединения связываются с различными участками рецепторного белка. Подобные ингибиторы активно изучаются, поиск конкурентных ингибиторов проводится с использованием компьютерного дизайна [49]. Получены данные о подавлении QS-регуляции аналогами АГЛ, несущими модификации в различных частях молекулы - в ацильных цепях и гомосеринлактонном кольце. Длина ацильной цепи имеет существенное значение для активности АГЛ. Аналоги АГЛ с более длинными, чем у нативных АГЛ, ацильными цепями могли быть ингибиторами активности QS-систем [49, 39]. Замена 3-оксо- групп на 3-гидроксильные или метильные, введение ненасыщенных связей в ацильные цепи приводит к значительному снижению активности АГЛ [59].

Модификации в гомосеринлактонном кольце молекул АГЛ существенно влияют на их активность. Природные АГЛ являются L-изомерами. D-изомеры, в основном, биологической активностью не обладают [49]. Ацильная цепь, по-видимому, необходима для биологической активности АГЛ. Замена гомосеринлактонного кольца на гомоцистеинлактонное уменьшало активность аутоиндуктора на порядок, а замена на гомосеринлактамное кольцо приводило к отсутствию активирующих или антагонистических свойств. Однако, молекулы, в которых гомосеринлактон заменен на гомосеринтиолактон, могут сохранять активность при функционировании некоторых QS-систем [49, 50, 51].

Изучении действия аналогов АГЛ Las-системы P. aeruginosa с заменами в гомосеринлактонном кольце показало, что эти замены по-разному влияют на взаимодействие аналогов с белками RhlR и LasR . Этот факт может свидетельствовать о том, что два рецепторных белка P. aeruginosa различаются в участках связывания с АГЛ [32].

Все больше внимания уделяется природным антагонистам аутоиндукторов QS, производным фуранонов, в том числе галогенизированным, производные пенициллиновой кислоты, патулина (рисунок 14). Обнаружено, что австралийская красная водоросль Delisea pulchra синтезирует различные галогенизированные фураноны, препятствующие колонизации этой водоросли морскими бактериями, у которых QS-система участвует в регуляции метаболических процессов, и, таким образом, защищает растения от действия бактерий. Фураноны D. pulchra содержат фурановое кольцо с замещенной в положении C-3 ацильной цепью и атомами брома в положении C-4. Замещения в положении C-5 могут варьировать [51]. Фураноны из природных источников галогенизированы в различных положениях атомами брома, йода или хлора [39, 49, 50].

После обнаружения эффекта фуранонов, образуемых D. pulchra, в различных лабораториях провели широкий скрининг природных соединений и химически синтезировали производные фуранонов, ингибиторов QS, в том числе производные фуранонов с ацильными цепями различной длины. Оказалось, что даже производные фуранонов без ацильной цепи с двумя атомами брома ингибировало QS-систему P. aeruginosa [49]. Обнаружено, что производные фуранонов продуцируются различными организмами: морскими зелеными, красными и бурыми водорослями, грибами, асцидиями, актиномицетами и др.

Рисунок 14 - Природные ингибиторы

 

Изучение механизма действия этих веществ на QS системы показало, что соединения фураноновой природы конкурируют с АГЛ за участок связывания с рецепторными белками LuxR типа. Связывание фуранонов с рецептором влияет на стабильность комплекса белок-лиганд, приводя к быстрому расщеплению рецепторного белка [62].

Действие фуранонов приводило к подавлению различных клеточных процессов, регулируемых QS: биолюминесценции Vibrio fischeri ; продукции факторов вирулентности у P. aeruginosa, Erwinia carotovora; образования биопленок [49, 62]. Многие химически синтезированные фураноны были значительно эффективнее, чем природные [49]. Большой интерес представляет тот факт, что синтетические фураноны были активны против бактерий в составе биопленок в тех же концентрациях, что и против QS-регуляции планктонно размножающихся бактерий. Для подавления инфекций, вызванных P. aeruginosa, растущих в биопленках, требуются существенно более высокие дозы антибиотиков [49].

Использование биологических микрочипов позволило установить, что соединения фураноновой природы влияют на экспрессию 93 генов P. aeruginosa PAO1; функционирование 80% этих генов, например, генов эластазы, протеазы LasA, участвующих в синтезе рамнолипидов, феназинов, цианида, хитиназы регулировалось с участием QS-систем [49].

Показано, что (5Z)-4-бромо-5-(бромометилен)-3-бутил-2(5H)-фуранон, продуцируемое водорослью D. pulchra производное фуранона, ингибирует QS в клетках E. coli с участием AI-2 ; это соединение подавляло также формирование биопленки и вызывало репрессию 56 генов E. coli, 79% которых индуцировалось AI-2. Под действием указанного соединения внеклеточная концентрация AI-2 уменьшалась вдвое. Предполагается, что этот эффект осуществлялся на посттранскрипционном уровне [61].

Патулин – это поликетидный лактон, продуцируемый некоторыми грибами родов Penicillium, Aspergillus и Byssochlamys, растущими на соках, включая яблочный, грушевый и виноградный. Патулин впервые был выделен в 1940. Патулин можно изолировать в виде бесцветных или белых кристаллов. Он растворим в воде, метаноле, этаноле, ацетонитриле и менее растворим в диэтиловом эфире и бензоле

Патулин действует как антибиотик широкого спектра действия и проверен на эффективность при общих простудных заболеваниях, также была отмечена его активность в подавлении образовании биопленок P. aeruginosa

Приведенные данные показывают, что производные фуранонов, патулина, пенициллиновой кислоты перспективны для получения на их основе терапевтических агентов, направленных против патогенности бактерий. Однако, испытанные к настоящему времени соединения, способные подавлять QS-регуляцию, токсичны для человека [49]. Актуальную задачу представляет их модификация и поиски новых, нетоксичных веществ, пригодных для клинического применения.

Много работ по поиску ингибиторов QS направлены на изучение растительных экстрактов и вытяжек. Иммунная система растений устроена по иному, поэтому они синтезируют и выделяют защитные молекулы против патогенных микроорганизмив, в том числе и способных к QS. Американские ученые получили первый антагонист аутоиндуктора, выделенный из листьев конокарпуса– это эллаготанин (рисунок 15).

Вескалагин - Касталагин-

Рисунок 15 - Изомерная форма эллаготанина

 

Бактерии и эукариотические организмы продуцируют вещества иной природы, подавляющие QS-регуляцию у бактерий - циклические дипептиды (дикетопиперазины), соединения, способные активировать QS-систему (рисунок 16). Предполагают, что они также взаимодействуют с участками связывания АГЛ с рецепторными белками [49].

Дикетопиперазины - шестичленные гетероциклические соединения, производные пиперазина, циклические ангидриды α-аминокислот: дикетопиперазины — бесцветные кристаллы; нейтральные соединения, легко растворимые в горячей воде, трудно — в холодной. При гидролизе образуются дипептиды, затем аминокислоты; натрием в спирте восстанавливаются до пиперазинов. могут быть получены циклизацией α-аминокислот или их эфиров, а также выделены из гидролизатов белков.

 

 

Рисунок 16 – Дикетопиперазин

 

Таким образом, уже исследовано и протестировано на различных биосенсорах большая группа ингибирующих веществ системы QS как химически синтезированных, так и природного происхождения. Все они обладают, как правило, ярко выраженным ингибирующим свойством, некоторые сохраняют бактерицидный эффект. Но, среди всех этих ингибиторов не выявленного универсального средства ингибирования системы QS, многие вещества обладают токсическими свойствами, и не пригодны для применения в терапевтических целях.

 

Заключение

 

 

Мы рассмотрели такое явление как эффект кворума, который способен регулировать широкий спектр физиологических процессов у различных видов грамотрицательных бактерий. Многие патогены растений и животных используют эффект кворума для регуляции свойств вирулентности, что может быть использовано на практике, если каким-то образом влиять на передачу сигнала. В настоящее время исследования в области биотехнологии сфокусированы на разработке антогонистов АГЛ. В медицине такие вещества могут быть использованы в качестве антимикробных препаратов, а в растениеводстве – для защиты сельскохозяйственных культур от фитопатогенов.

Кроме того, посредством эффекта кворума регулируются процессы синтеза антибиотиков и других высокоценных продуктов, что может быть использовано для регуляции экспрессии генов и роста бактериальных культур в условиях производства. Однако возможности практического применения эффекта кворума и АГЛ как специфических регуляторов различных осуществляемых бактериями процессов ограничиваются недостаточной изученностью механизмов действия QS систем и всех возможных эффектов действия аутоиндукторов этой группы.

 

Список используемых источников

 

 

1. Завильгельский, Г.Б. "Quorum sensing", или как бактерии "разговаривают" друг с другом / Г.Б. Завильгельский, И.В. Манухов // Ж. Молекуляр. биология. - 2001.- Т. 35. -№ 2. - С. 268-277.
2. Гинцбург, А.Л. "Quorum sensing" или социальное поведение бактерий / А.Л. Гинцбург, Т.С. Ильина, Ю.М. Романова // Ж. Микробиология. - 2003.- № 5. - С. 86-93.
3. Смольская, С.В. Механизмы межклеточных взаимодействий у прокариот / С.В. Смольская, А.Г. Песнякевич / Труды Белорусского государственного университета // Физиологические, биохимические и молекулярные основы функционирования биосистем. Выпуск 1. – 2006. - С. 42-55. УДК 575.826.
4. Хмель, И.А. Quorum-sensing регуляция экспрессии генов: фундаментальные и прикладные аспекты, роль в коммуникации бактерий / И.А. Хмель // Ж. Микробиология. - 2006. – Т. 75. - №4. – С. 457-464.
5. Хмель, И.А. Quorum Sensing регуляция экспрессии генов – перспективная мешень для создания лекарств против патогенности бактерий / И.А. Хмель, А.З. Метлицкая // Ж. Мол. биология. - 2006. - Т. 40. - С. 195-210.
6. Ильина, Т.С. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития / Т.С. Ильина,  Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург // Ж. Генетика. - 2004.-Т. 40. - № 11.-С. 1-12.
7. Шапиро, Дж. А.Бактерии как многоклеточные организмы / Дж.А. Шапиро // Ж. В мире науки. - 1998. - № 8. - С. 46-54.
8. Светличный, В.А. Характеристики ауторегуляторного фактора d₂, вызывающего автолиз клеток Pseudomonas carboxydoflava и Bacillus cereus / Г.И. Эль-Регистан, А.К. Романова, В.И. Дуда // Ж. Микробиология. - 1983. - Т. 52.- № 1. - С. 33-38.
9. Fuqua, W.C. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators / W.C. Fuqua, S.C. Winans, E.P J. Greenberg // J. Bacteriol. - 1994. - V.176. - N. 2. - P. 269-275.
10. Greenberg, E.P.Quorum sensing by bacteria // E.P. Greenberg, S. Winans, C. Fuqua / Ann. Rev. Microbiol. - 1996. - V. 50. - P. 727-751.
11. Олескин, А.В. Надорганизменный уровень взаимодействия в микробных популяциях // А.В. Олескин / Ж. Микробиология. - 1993. - Т.62. - № 3. - С. 389-403.
12. Bowden, M.G. The Myxococcus Xanthus lipopolysaccharide O-antigen is required for social motility and multicellular development / M.G. Bowden, H.B.Kaplan // J. Molecular Microbiology. - 1998. - V. 30. - N 2. - P. 275-284.
13. Bacterial locomotion and signal transduction / M.D. Mamson, J.D. Armitage, J.A. Hoch, R.M. Macnab // J. Bacteriol. - 1998. - V.180. - N 5. - P. 1009-1022.
14. Cellular signals regulating antibiotic sensitivities of bacteria / Matsuhashi M.[et al.] //  Microbial Drug Res. - 1996. - V. 2. - N. 1. - P. 91-93.
15. Казначеев, В.П. Сверхслабое излучение в межклеточных взаимодействиях / В.П. Казначеев, Л.П. Михайлова // Новосибирск: Наука. -1981. - 144 с.
16. Influence of the MexAB-OprH multidrug efflux system on quorum sensing inPseudomonas aeruginosa / K. Evans [et al.]. // Bacteriol. - 1998. - V. 180. - N. 20. - P. 5443-5447.
17. Шпаков, А.О. Системы сигнальной трансдукции прокариот / А.О. Шпаков, М.Н. Перцева // Журнал эволюционной биохимии физиологии. - 2008. – Т. 44. - № 2. – С. 113-130.
18. Шпаков, А.О. Сигнальные молекулы бактерий пептидной природы QS-типа / А.О. Шпаков // Ж. Микробиология. - 2009. – Т. 78. - № 2. – С. 163-175.
19. Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов / Ю.А. Николаев, А.Л. Мулюкин, И.Ю. Степаненко, Г.И. Эль-Регистан // Ж. Микробиология. - 2008. – Т. 75. - № 4. – С. 489-496.
20. Эль-Регистан, Г.И. Адаптогенные функции внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов / Г.И. Эль-Регистан [и др.] // Ж. Микробиология. - 2006. – Т. 75. - № 4. – С. 446-456.
21. Waters, C.M. Quorum sensing cell-to-cell communication in bacteria / C.M. Waters, B.L. Bassle // Annu. Rev Cell Dev. Biol. - – V. 21. – P. 319-346.
22. Fuqua, C. Regulation of gene expression by cell-to-cell communication: acyl-homoserine lactone quorum sensing / C. Fuqua, R.M. Parsek, E.P. Greenberg // Annu. Rev. Genet. - 2001. – V. 35. – P. 439 – 468.
23. Stock, A.M. Two-component signal transduction / A.M. Stock, V.L. Robinson, P.N. Goudreau // Annu. Rev. Biochem. – 2000. – V. 69. – P.183 – 215.
24. Acyl homoserine-lactone quorum-sensing signal generation / M.R. Parsek. [et al.]. // Natl. Acad. Sci. USA. - 1999. – V. 96. – P. 4360-4365.
25. Kaplan, H.B. Diffusion of autoinducer is involved in regulation of the Vibrio fischeri luminescence system / H.B. Kaplan, E.P. Greenberg // J. Bacteriol. – 1985. – V. 163. - № 17. – P. 1210 – 1214.
26. . Parsek, M.R. Analysis of random and site-directed mutations in rhlI, a Pseudomonas aeruginosa gene encoding an acylhomoserine lactone synthase / M.R. Parsek, A.L. Schaefer, E.P. Greenberg // Molecular Microbiology. - 1997. – V. 26. – P. 301 – 310.
27. The Vibrio fischeri quorum-sensing systems ain and lux sequentially induce luminescence gene expression and are important for persistence in squid host / C. Lupp [et al.]. // Molecular Microbiology. - 2003. – V. 50 - № 1. – P. 319-331.
28. Lupp, C. Vibrio fischeri uses two quorum-sensing systems for the regulation of early and late colonization factors / C. Lupp, E.G. Ruby // J. Bacteriol. - 2005. – V. 187. - № 11. – P. 3620-3629.
29. Mutational analysis of Vibrio fischeri LuxI polypeptide: critical regions of an autounducer synthase / B.L. Hanzelka [et al.] // J. Bacteriol. – 1997. – V. 179. - № 22. – P. 4882 – 4887.
30. N-acyl homoserine lactone binding to the CarR receptor determines quorum-sensing specificity in Erwinia / M. Welch [et al.]. // EMBO J. – 2000. – V. 19. – P. 631 – 641.
31. Microarray analysis of Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing regulons: effects of growth phase and environment / V.E. Wagner [et al.] // J. Bacteriol. – 2003. – V. 185 - № 7. – P. 2080-2095.
32. Smith, R.S. Pseudomonas aeruginosa quorum sensing as a potential antimicrobial target / R.S. Smith, B.H. Iglewski // J. Clin. Invest. – 2003. – V. 112. – P. 1460-1465.
33. Fray, R.G. Altering plant – microbe interaction through artificially manipulating bacterial quorum sensing / R.G. Fray // Annals of Botany. – 2002. – V. 89. – P. 245 – 243.
34. Piper, K.R. Quorum sensing but not autoinduction of Ti plasmid conjugal transfer requires control by the opine regulon and the antiactivator TraM / K.R. Piper, S.K. Farrand // J. Bacteriol. – 2000. – V. 182. - № 4. – P. 1080-1088.
35. Quorum-sensing in Gram-negative bacteria / N. A. Whitehead [et al.] // FEMS Microbiol. Rev. - 2001. –V. 25. - P. 365–404.
36. Blosser, R. S. Extraction of violacein from Chromobacterium violaceum provides a new quantitative bioassay for N-acyl homoserine lactone autoinducers / R. S. Blosser, Gray, K. M. // J. Microbiol. Methods. – 2000. - 40 – P. 47–55.
37. Steindler, L. Detection of quorum-sensing N -acylhomoserine lactone signal molecules by bacterial biosensors / L. Steindler, V. Venturi // FEMS Microbiol. Lett. - 2006. - V. 266. - N 1. - Р. 1-9.
38. Lindsay, A. Effect of sdiA on biosensors of N-acylhomoserine lactones / A. Lindsay, B.M. Ahmer // J. Bacteriol. – 2005. – V. 187. – P. 5054–5058.
39. Quorum sensing and Chromobacterium violaceum: exploitation of violacein production and inhibition for the detection of N- acylhomoserine lactones / K.H. McClean [et al.] // Microbiology. – 1997. – V. 143. – P. 3703–3711.
40. Detecting and characterizing N-acyl-homoserine lactone signal molecules by thin-layer chromatography / P.D. Shaw [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA. – 1997. –V. 94. – P. 6036–6041.
41. Construction and analysis of luxCDABE-based plasmid sensors for investigating N-acyl-homoserine lactone-mediated quorum sensing / M.K. Winson [et al.] // FEMS Microbiol Lett. – 1998 a. – V. 163. – P. 185–192.
42. Engineering the luxCDABE genes from Photorhabdus luminescens to provide a bioluminescent reporter for constitutive and promoter probe plasmids and mini-Tn5 constructs / M.K. Winson [et al.] // FEMS Microbiol Lett. – 1998 a. – V. 163. – P. 193–202.
43. Structure of the autoinducer required for expression of Pseudomonas aeruginosa virulence genes / J.P. Pearson [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1994. –V. 91. - P. 197–201.
44. Quorum sensing in Aeromonas hydrophila and Aeromonas salmonicida: identification of the LuxRI homologs AhyRI and AsaRI and their cognate N-acylhomoserine lactone signal molecules / S. Swift // J. Bacteriol. – 1997. – V. 179. – P. 5271–5281.
45. The two-component response regulator PprB modulates quorum-sensing signal production and global gene expression in Pseudomonas aeruginosa / Y.H. Dong [et al.] // Mol. Microbiol. – 2005. – V. 56. – P. 1287–1301.
46. Farrand, S.K. Quorum-sensing system of Agrobacterium plasmids: analysis and utility / S.K. Farrand, Y. Qin, P. Oger // Methods Enzymol. – 2002. – V. 358. –P. 452–484.
47. N-acylhomoserine-lactone-mediated communication between Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia in mixed biofilms / K. Riedel [et al.] // Microbiology. - 2001. – V. 147. – P. 3249–3262.
48. Gfp-based N-acyl homoserine-lactone sensor systems for detection of bacterial communication / J.B. Andersen [et al.] // Appl Environ Microbiol. - 2001. – V. 67. – P. 575–585.
49. Hentzer, M. Pharmacological inhibition of quorum sensing for the treatment of chronic bacterial infections / M. Hentzer, M. Givskov // J. Clin. Invest. – 2003. - V. 112. - P. 1300-1307.
50. "Subinhibitory" erythromycin represses production of Pseudomonas aeruginosa lectins, autoinducer and virulence factors / D. Sofer, N. Gilboa-Garber, A. Belz, N.C. Garber // Chemotherapy. - 1999. – V. 45. – P. 335-341.
51. Regulatory effects of macrolides on bacterial virulence: potential role as quorum-sensing inhibitors / K. Tateda, T.J. Standiford, J.C. Pechere, K. // Yamaguchi Curr. Pharm. Des. - 2004. – V. 10. – P. 3055-3065.
52. Azitromycin inhibits quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa / Tateda [et al.] // J. Antimicribial Agents and Chemother. - 2001. – V. 45. – P. 1930-1933.
53. N-acylhomoserine lactones undergo lactonolysis in a pH-, temperature-, and acyl chain length-dependent manner during growth of Yersinia pseudotuberculosis and Pseudomonas aeruginosa /A. Yates [et al.] // J. Infect. Immun. - 2002. – V. 70. – P. 5635-5646.
54. AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora / Y.H. Dong, J.L. Xu, X.Z. Li, L.H. Zhang // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2000. – V. 97. – P. 3526-31.
55. March, J.C. Quorum Sensing and bacterial cross-talk in biotechnology / J.C. March, W.E. Bentley // Current Opinion in Biotechnology. - 2004. – V. 15. – P. 495-502.
56. Leadbetter, J.R. Metabolism of acyl-homoserine lactone quorum-sensing signals by Variovorax paradoxus / J.R. Leadbetter, E.P. Greenberg // J. Bacteriol. -2000. – V. 182. - P. 6921-6926.
57. Inactivation of a Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing signal by human airway epithelia / C.K. Chun [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2004. – V.101 – P.3587-3590.
58. Suga, H. Molecular mechanisms of bacterial quorum sensing as a new drug target / H. Suga, K. Smith // Current Opinion in Chemical Biology. - 2003. – V. 7. – P. 586-591.
59. Martinelli, D. Effects of natural and chemically synthesized furanones on quorum sensing in Chromobacterium violaceum / Martinelli // J. BMC Microbiology. - 2004. – V. 4. – P. 25.
60. Teplitski, M. Plants secrete substances that mimic bacterial N-acyl homoserine lactone signal activities and affect population density-dependent behaviours in associated bacteria / M. Teplitski, J. B. Robinson W. D. Bauer // Mol. Plant–Microbe Interact. – 2000. – V. 13. – P. 637–648.
61. Halogenated furanones inhibit quorum sensing through accelerated LuxR tumover / M. Manefifild [et al.] // J. Microbiolody (UK). – 2002. – V. 148. – P. 1119-1127.
62. Differential gene expression shows nanural brominated furanones interfere with the autoinducer-2 bacterial signaling systern of Escherichia coli / I. Ren [et al.] // J. Biotechnol. Bioeng. – 2004. – V. 88. – P. 630-642.

Приложение А

(справочное)

 

Таблица А.1 - Примеры системы QS с различными аутоиндукторами

 

Микроорганизм	Функция:	Аутоиндукторы:
1. Системы типа "luxI-luxR" и др. системы с производными лактонов гомосерина
Vibrio fischeri	биолюминесценция	N-(3-оксогексаноил)-L-лактон гомосерина
	биолюминесценция	N-октаноил-L-лактон гомосерина
V. harveyi	биолюминесценция	N-(3-оксибутаноил)-L-лактоном гомосерина
	биолюминесценция	не идентифицированное соединение AI-2
Erwinia carotovora	синтез внеклеточных гидролитических ферментов (пектиназ, целлюлаз и др.)	N-(3-оксогексаноил)-L-лактон гомосерина
	синтез антибиотика карбапенема
Pseudomonas aeruginosa	синтез факторов вирулентности (система lasI-lasR)	N-(3-оксододеканоил)-L-лактон гомосерина
	синтез факторов вирулентности (система vsmI-vsmR, или rhlI-rhlR)	N-бутаноил-L-лактон гомосерина
Agrobacterium tumefaciens	конъюгативный перенос Ti-плазмид	N-3-(оксо-октаноил)-L-лактон гомосерина
Serratia liquefaciens	стимуляция движения клеток-швермеров по агару	N-бутаноил-L-лактон гомосерина
Yersinia enterocolitica	инфекционный процесс с участием Yop-белков	N-(3-оксогексаноил)-L-лактон гомосерина и N-гексаноил-L-лактон гомосерина
Streptomyces griseus	синтез стрептомицина, развитие воздушного мицелия, споруляция. Примечание: системы стрептомицетов отличаются от типичной системы "luxI-luxR"	2-изокапроил-3-оксиметил-γ-бутиролактон гомосерина
S. virginiae	синтез виргиниамицина	различные бутиролактоны и бутанолиды

 

Продолжение таблицы - А.1 Примеры системы QS с различными аутоиндукторами

 

Микроорганизм	Функция:	Аутоиндукторы:
2. Системы с пептидной активацией
Enterococcus faecalis	конъюгативный перенос плазмид	гекса- или октопептиды, например cPD1 (H-Phe-Leu-Val-Met-Phe-Leu-Ser-Gly-OH)
Bacillus subtilis	споруляция, компетентность к трансформации	пентапептид H-Ala-Arg-Asn-Glu-Thr-OH и др.
Streptococcus pneumoniae	компетентность к трансформации	гептадекапептид H-Glu-Met-Arg-Leu-Ser-Lys-Phe-Phe-Arg-Asp-Phe-Ile-Leu-Gln-Arg-Lys-Lys-OH
Xanthomonas maltophila	стимуляция роста	гомолог хорионного гонадотропина
Micrococcus luteus	стимуляция роста после периода покоя	белок (мол. вес 19 кДа)
Volvox carteri (зелёная водоросль)	половой процесс	гликопротеин
Paramecium tetraurelia (инфузория)	стимуляция роста	белок (мол. вес 17 кДа)
3. Системы с аминными/аминокислотными аутоиндукторами.
Myxococcus xanthus	роение и образование плодовых тел (ранние этапы)	фактор А – смесь аминокислот (с преобладанием тирозина, пролина, фенилаланина, лейцина, изолейцина) с примесью коротких пептидов
Proteus mirabilis	формирование швермеров	глутамин
E. coli	колониальная макро- и микроструктура	аспарагиновая кислота

 

 

Скачать: diplom1.doc