Привет студент

Физический факультет

Кафедра радиофизики и электроники

 

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

 

Методические подходы к определению гидрофобности поверхности микроскопических грибов

 

 

 

Аннотация

 

 

В данной работе рассматриваются теоретические, методологические и практические вопросы определения гидрофобности поверхности микроскопических грибов.

В исследовании рассмотрены теоретические основы гидрофобности, краткая характеристика микроскопических грибов. Апробированы наиболее распространенные методы определения поверхностной гидрофобности микроорганизмов: солевой агрегационный тест, метод межфазного разделения в системе ПЭГ-Декстран и метод контактного краевого угла. Объектом исследования явился штамм пекарских дрожжей вида Saccharomyces cerevisiae.

По данным проведенного исследования наиболее эффективным методом определения гидрофобности, применяемый по отношению к клеткам микроскопических грибов, является метод контактного краевого угла.

Полученные результаты свидетельствуют об изменении поверхностных свойств дрожжевых клеток в связи с фазами роста популяции, что может быть связано с изменениями метаболической активности по мере развития (старения) клеток.

Работа содержит 59 страниц, 14 рисунков, 2 таблицы, 58 использованных источников.

 

 

 

 

 

 

Abstract

 

 

Degree work operation theoretical, methodological and practical questions of microscopic fungus surface hydrophobicity determination.

Theoretical basis of hydrophobicity, brief characteristic of microscopic fungus are given in the research. The most widespread methods of microscopic fungus surface hydrophobicity determination are approved: salt aggregation test, interphase division in PEG-Dextran system method and contact angle method. The test subject of the research is culture of Saccharomyces cerevisiae.

According to the research the most effective hydrophobicity determination method that is used towards microscopic fungus cells is contact angle method.

Results received testify modification of yeast cells surface which shows common rules of cell culture metabolic reorganization from spirit to acetic fermentation.

Degree work contains 59 pages, including 14 figures, 2 tables and 58 sources of the literature.

 

 

 

 

Содержание

 

 

Введение. 7

1     Гидрофобность в микробном мире. 9

1.1 Поверхностные феномены микроорганизмов. 9

1.1.1     Адгезия и гидрофобность. 10

1.1.2 Фагоцитоз и гидрофобность. 13

1.1.3 Гидрофобность микроорганизмов и их патогенность. 14

1.1.4 Поверхностные структуры бактерий детерминирующие их гидрофобность  15

1.2 Методы измерения гидрофобности бактерий. 17

1.2.1 Измерение методом контактного угла. 17

1.2.2 Методы измерения поверхностной гидрофобности основанные на адгезии  19

1.2.3 Солевой агрегационный тест. 21

1.2.4 Метод оценки межмолекулярных взаимодействий. 22

1.2.5 Косвенные методы определения гидрофобности. 23

1.2.6 Метод межфазного разделения. 24

1.2.7 Сравнительный анализ методов измерения гидрофобности бактериальных клеток  26

1.3 Характеристика микроскопических грибов. 28

1.3.1 Строение грибов. 28

1.3.2 Способы размножения и классификация грибов. 30

1.3.3     Условия и типы роста грибов. 33

1.3.4     Диморфизм. 35

1.3.5 Грибы рода Saccharomyces. 36

1.3.6 Грибы рода Candida. 36

1.3.7 Грибы рода Malassezia. 38

2     Материалы и методы.. 41

2.1 Объект исследования, культивирование и подготовка   дрожжевых клеток  41

2.2 Определение концентрации дрожжей в жидких средах. 41

2.3 Солевой агрегационный тест. 43

2.4 Определения гидрофильно-липофильного баланса клеток. 44

2.5 Методика измерения контактного угла. 45

3     Результаты исследования. 48

3.1 Солевой агрегационный тест. 48

3.2 Разделение в двухфазной системе ПЭГ-Декстран. 49

3.3 Контактный угол. 50

Заключение. 53

Список использованных источников. 56

 

Введение

 

 

Важность гидрофобности микроорганизмов при адгезии1) в живых системах и связь между гидрофобностью поверхности клетки и фагоцитозом2) были известны еще в 20-х годах прошлого столетия. На протяжении многих лет проводились исследования по изучению влияния различных поверхностных феноменов, в частности на степень гидрофобности, на взаимодействие клеток, однако эти исследования были немногочисленными. В последующие годы отмечалось снижение научного интереса к изучению бактериальной гидрофобности и изучению взаимодействий бактерий в воздушно-водных системах.

В течение прошедших двух столетий было предложено разнообразное число методов для измерения гидрофобности микроорганизмов, что сопровождалось повышенным интересом к физико-химическим феноменам, происходящих на поверхности прокариотических3) и эукариотических4) клеток. Различные явления, которые сопровождают эти состояния, будь то межфазное натяжение, поверхностная энергия или ряд других, вносят свой вклад в возможность клетки микроорганизма удержаться на границе двух фаз, особенно в системе «вода-воздух».

Гидрофобные взаимодействия были вовлечены в широкий круг явлений, связанных с прилипанием. При этом применялся целый спектр методов, включая разделение в масляно-водной и воздушно-водной системах, прилипание к пластикам, к эпителиальным клеткам, фагоцитам, к поверхности зуба, применялось наслаивание субстрата на поверхность воды, сульфидным гранулам, адгезия к поверхности различных частиц, и друг к другу. На сегодняшний день разработаны различные методические под­ходы для измерения гидрофобности поверхности клеток микроорганизмов, основанные на различных физико-химических принципах. Однако все эти подходы хорошо апробированы на бактериальных клетках и недостаточно изучены в плане применимости по отношению к клеткам микроскопических грибов.

В настоящее время существует проблема адгезии патогенных микроорганизмов к различным поверхностям, причем как биологическим, так и небиологическим.

Актуальность изучения поверхностных свойств микроскопических грибов связана с высокой распространенностью грибов-симбионтов человека, являющихся одновременно условно-патогенными микроорганизмами. При этом они паразитируют на поверхностях слизистых и кожи человека, и их циклы развития в организме тесно связаны с адгезией к клеткам макроорганизма, а значит, зависят от поверхностных свойств.

В этой связи целью настоящего исследования явился выбор оптимального метода определения гидрофобности микроскопических грибов.

В соответствии с целью определены следующие задачи:

• дать общее определение гидрофобности поверхности микроорганизмов;
• изучить особенности методов определения гидрофобности микроорганизмов;
• дать характеристику микроскопическим грибам как наименее изученным микроорганизмам с точки зрения поверхностных свойств;
• апробировать наиболее распространенные методы определения гидрофобности поверхности микроорганизмов на клетках грибов рода Saccharomyces;
• на основе полученных результатов определить наиболее эффективный метод определения гидрофобности микроскопических грибов.

В данной работе для определения гидрофобности поверхности микроскопических грибов были применены следующие методы:

• солевой агрегационный метод;
• метод межфазного разделения;
• метод контактного краевого угла.

Гидрофобность поверхности клеток достаточно вариабельный признак, связанный не только с методикой измерения, но и с условиями роста и возрастом клеток. Разные методы измерения гидрофобности в той или иной мере отражают истинную гидрофобность поверхности, но не всегда коррелируют между собой.

Данные методы широко используется в биохимии для определения свободной энергии на поверхности протеинов, макромолекул и клеток, в медицине для изучения межфазного взаимодействия как фагоцитарных, так и бактери­альных клеток в монослойных культурах. Немаловажное значение имеет степень гидрофобности при адгезии бактерий к биоматериалам используемым в клинике.

 

1          Гидрофобность в микробном мире

 

1.1   Поверхностные феномены микроорганизмов

 

 

Поверхность микроорганизмов по существу является неоднородной с точки зрения физикохимии. На ней расположено большое число гидрофобных и гидрофильных сайтов [9].

Общая концепция гидрофобных взаимодействий при адгезии в биологических системах интенсивно рассматривалась в 70-80-е годы. Тогда и было впервые дано определение поверхностной энергии и тесно связанной с ней гидрофобности. Поверхностная энергия определялась как компонент свободной энергии, которой характеризуется граница раздела двух фаз «жид­кость–воздух», «твердое тело–жидкость» или «твердое тело–воздух». Но чаще всего гидрофобность как явление связывали с молекулами или частицами, которые «избегают» воды, не заряжены, не полярны, не способны формировать водородные связи или имеют низкую поверхно­стную энергию [4]. Но действием одних лишь водородных связей невозможно было объяснить агрегацию1), возникающую при участии неполярных групп. Такие взаимодействия возникают на клеточных мембранах, внутренних областях белковых молекул и при взаимодействии клеток.

Теории, объясняющие суть этих явлений подчеркивают сильно выраженную способность молекул воды «сцепляться» между собой и переориентироваться таким образом, что возрастает структурированность воды. В связи с этим процесс гидрофобных взаимодействий можно представить себе, как явление перемещения неполярных групп молекул, из воды в гидрофобные области, образуемые за счет ассоциации неполярных групп [1, 40]. Изменение свободной энергии касается иерархического расположения водных молекул на поверхности субстрата и клетки, и, согласно А. Бен-Нейму, неполярные части поверхности, находящиеся в водной фазе, будут окружены молекулами воды, чья структурированность больше, чем таковая молекул в водной фазе [10]. Существование такого структурированного водного слоя связано, с уменьшением энтропии и увеличением упорядоченности системы [34].

Гидрофобные взаимодействия усиливаются с увеличением ионной силы из-за подавления электростатических взаимодействий. В некоторой температурной точке гидрофобные взаимодействия увеличиваются с увеличением температуры. Изменение температуры может вызвать повышение сольватации2) и уменьшить поверхностную напряженность, которая противодействует гидрофобным взаимодействиям.

Гидрофобные взаимодействия усиливаются с увеличением неполярного характера одной или обеих взаимодействующих поверхностей и при добавлении «salting-out»1) ионов. При высоких концентрациях salting-out ионов, последние оказывали неблагоприятное воздействие на растворимость, увеличивая поверхностную напряженность воды и приводя к усилению гидрофобных взаимодействий.

 

 

1.1.1                   Адгезия и гидрофобность

 

 

Роль гидрофобных взаимодействий при бактериальной адгезии сложна, и термин «гидрофобная бактерия», вероятно, является неправильным. Способность некоторых бактерий удерживаться на поверхности масляных капелек и предотвращать их соединение, предполагает сходство их с амфипатическими молекулами (молекулы, одна часть которой является гидрофобной, а другая - гидрофильной), которые могут взаимодействовать как с водной, так и с масляной фазой [5, 35]. Поверхности, к которым прикрепляются бактерии, часто содержат как полярные, так и неполярные элементы. Степень сродства каждого будет влиять на уровень и структуру ближайших слоев молекул воды и таким образом определять энергетическую обусловленность феномена прилипания.

Таким образом, взаимодействие между гидрофильными и гидрофобными компонентами поверхности, будут определять полный вклад гидрофобных взаимодействий в процесс адгезии. При этом результат процесса прилипания, может быть предсказан с помощью методов поверхностной термодинамики, поскольку межфазное напряжение есть отражение взаимосвязи свободных энергий между рассматриваемыми поверхностями и молекулами воды, окружающими их [35].

В 1983 году Д. Р. Абсолом и соавторы получили две группы экспериментальных результатов, подтверждающих данный вывод [57]. Одна группа состояла из межфазных напряжений в системе клетка-клетка, а вторая группа представляла собой ряд величин изменения адгезии клеток к поверхностям при изменении межфазных напряжений в присутствии различных концентраций поверхностно-активных веществ (например, диметилсульфоксида). Согласно предложенной концепции, прилипание не зависит от поверхностной энергии субстрата, когда поверхностные энергии бактерий и среды равны. Прилипание к гидрофильным поверхностям увеличивается лишь тогда, когда напряженность бактериальной поверхности больше, чем таковая окружающей жидкой фазы. Прилипание к гидрофобным поверхностям происходит тогда, когда поверхностная напряженность водной фазы выше, чем таковая у бактериальных клеток. Высокая степень адгезии характерна для высокогидрофобных бактерий и не зависит от поверхностной напряженности водной фазы.

Если ли­ганд-рецепторный контакт направлен на реализацию функции узнавания (например, в системе «антиген–антитело»), то функция гидрофобного взаимодействия сводится к возможности преодолеть электростатический барьер между клетками и таким образом сблизиться. При этом, учи­тывая отрицательный заряд на мембране как прокариотических, так и эукариотических клеток, взаимодействие типа «клетка-клетка» становится эффективным лишь при возникновении между ними гидро­фобных связей [17, 24, 25, 34, 35].

Различные исследования свидетельствуют о неопределенном характере бактериального прилипания к поверхностям с низкой поверхностной энергией. С другой стороны, существуют примеры (Acinetobacter calcoaceticus), показывающие, что некоторые микроорганизмы способны твердо удерживаться в жидких и твердых углеводородах, на пластиковых поверхностях, на поверхности зуба, на буккальном эпителии, пузырьках воздуха и даже на поверхности металлов. Таким образом, не удивительно, что многие исследователи соглашаются с тем, что гидрофобные взаимодействия, которые провоцируют бактериальную адгезию, не зависят от молекулярной специфичности между бактериальными поверхностными компонентами и рецепторами на субстрате прикрепления или от «молекулярной текстуры» двух поверхностей.

Так, Г. А. Ботта показал важную роль поверхностных компонентов стрептококков группы А, которые могут являться амфипатическими молекулами и, таким образом, являться ингибиторами1) адгезии к фарингеальным клеткам. Однако возможно, что при адгезии на тканях хозяина, существуют определенные механизмы узнавания между гидрофобными участками и стереоспецифическими рецепторами, функционирующими таким же образом, как сывороточный альбумин связывает гидрофобные молекулы. Возможно, что гидрофобные взаимодействия, в дополнении к их способности провоцировать адгезию per se (само по себе), могут также вносить определенный вклад в стереоспецифические механизмы адгезии.

Наличие бактериальной капсулы или слизи, уменьшает гидрофобность бактериальной поверхности (например, у Phormidum spp.) [4, 58]. Ферментативное удаление капсулы (Acinetobacter calcoaceticus) ведет к увеличению адгезии к гексадекану с 0 % до 100 %. Активная адгезия штаммов Streptococcus pyogenes к гексадекану приписывается отсутствию в капсуле гиалуроновой кислоты.

Еще одним немаловажным аспектом участия гидрофобных свойств бактерий в их адгезии к слизистым оболочкам является взаимодействие с секреторными иммуноглобулинами [15, 48]. В целом эта проблема не отмечена какими-либо исключительными закономерностями, и ее рассмотрение может быть сведено к указанию на выраженное гидрофилизующее действие секреторных IgA на поверхность бактерий. Особенность заключается в том, что секреторные IgA являются единственным классом антител, снижающим гидрофобность поверхности, на которую осаждаются. На поверхности сли­зистых оболочек эффект секреторного IgA направлен на снижение гидрофобности бакте­риальной поверхности, т.е. на понижение адгезивности микроорганизма, что ведет к повышению колони­зационной резистентности биоценоза1).

Именно вследствие этого феномена при обработке бактерий секретом слюнных желез наблюдается снижение их гидрофобности и адгезивности (стрептококков) к частицам угля [15]. В опытах с Salmonella typhimurium было показано, что присоединение секре­торного IgA значительно снижало высокую исходную гидрофоб­ность бактериальной поверхности, что приводило к снижению фаго­цитоза нейтрофилами и антиадгезивным эффектам [30].

Высокая степень гидрофобности спор по сравнению с вегетативными клетками сопровождается усилением адгезии к углеводородам и полиэтиленгликолю (в водной двухфазной системе) и увеличением расслоения в воздушно-водной системе, что может означать наличие у спор определенных биологических преимуществ при их распространении с аэрозолями [30]. Однако, увеличение гидрофобности спор в сравнении с вегетативными клетками не универсально: спорообразование у Myxococcus xanthys снижает гидрофобность клеток.

Немаловажное значение имеет степень гидрофобности при адгезии бактерий к биоматериалам используемым в клинике. У бактерий, изолированных с инфицированных катетеров и слизистой трахеи, высокая степень гидрофобности была обнаружена у 92 % штаммов2) [52]. Существенное значение имеет и материал, из которого выполнены катетеры, инфузионные трубки и другие приспособления, используемые длительно и не подвергавшиеся дезинфекции кипячением и автоклавированием. Адгезия бактерий к этим материалам может приводить не только к осложнениям и утяжелению течения болезни, но и к хронизации процесса. В этой связи определяющими при адгезии на поверхности биоматериалов являются поверхностные свойства не только бактерий, но и собственно биоматериалов. Согласно исследованиям Т. Р. Нэу, основными микроорганизмами, покрывающими поверхности биоматериалов, состоящих из силиконированной резины, являются грамположительные кокки, основной «стратегией» которых при этом является модификация своей поверхности в сторону увеличения гидрофобности, что усиливает прилипание к поверхностям приборов.

 

 

1.1.2 Фагоцитоз и гидрофобность

 

 

Критическое значение в процессе захвата фагоцитами бактериальных клеток имеет фактор межфазного натяжения, находящийся в прямой зависимости от физико-химических свойств клеточных поверхностей. Высокая степень гидрофобности является необходимым условием для эффективного фагоцитоза, при этом повышение степени гидрофобности бактериальных клеток служит одним из механиз­мов иммунологической защиты макроорганизма от патогенных бак­терий. Различные факты указывают на гидрофобизацию как наиболее частый опсонический феномен, связанный с изменением поверхностной энергии фагоцитируемых частиц. При этом антитела и комплемент резко повышают гидрофобность бактериальной клетки, приближая ее по этому при­знаку к инертной частице [6, 7, 9].

Капсульное вещество, наиболее часто упоминающееся при рассмотрении антифагоцитарных свойств микроорганизмов и обладающее высокими гидрофильными свойствами, делает бактериальную клетку устойчивой к поглощению фагоцитами, в том числе за счет значительного снижения гидрофобности инкапсулированной бактерии, поскольку, чем гидрофильнее объект поглощения, тем труднее процесс фагоцитоза [6, 30]. Этим в определенной степени объясняется ситуация, при которой инкапсулированные бактерии подвергаются фагоцитозу лишь в том случае, если в макроорганизме формируются антикапсулярные антитела.

Механизм фагоцитоза инертных частиц не содержит каких либо особенностей, которые отличали бы его от обычного фагоцитоза. Необычность же данного феномена заключается в том, что связывание иммуноглобулинов частицами латекса сопровождается заметным увеличением степени их гидрофобности. Многие авторы отмечали, что различия в способности к фагоцитозу у человеческих нейтрофилов обусловлена в большей степени гидрофобностью бескапсульных форм бактерий по сравнению с бактериями, имеющими капсулу [6].

Обобщая изложенное, можно сказать, что главной закономерностью, описывающей процесс фагоцитоза с точки зрения гидрофобности фагоцита и фагоцитируемого объекта, является получившая свое экспериментальное подтверждение концепция, указывающая на то, что фагоциты, имеющие собственную степень гидрофобности, фагоцитируют лишь те клетки, гидрофобность которых равна или больше таковой у фагоцитов [19]. При этом становится важным не столько изменение степени гидрофобности бактерий, сколько уменьшение разницы между значениями гидрофобности бактерии и фагоцита [12-14].

 

1.1.3 Гидрофобность микроорганизмов и их патогенность

 

 

Роль бактериальной гидрофобности в инфекционном процессе неоднозначна. Неспецифичность бактериальной гидрофобности, вносит свой вклад, как уже говорилось, и в процессы адгезии на поверхности слизистых, и в феномен последующего фагоцитоза [30]. Через призму этих феноменов традиционно оценивается роль поверхностных явлений в развитии инфекционного процесса.

Известные факты, свидетельствующие о взаимосвязи гидрофобности бактериальной поверхности с тем или иным типом инфекционного процесса, весьма многочисленны [6, 7, 18, 24, 28, 35]. Однако, большинство из них посвящены изучению относительно небольших групп штаммов и характеризуют достаточно специфические ситуации в практике медицинской бактериологии. В сущности, эти исследования сводятся к определению собственно гидрофобности бактерий и используют самые разнообразные методические подходы, что исключает возможность сравнительного анализа этого параметра. Косвенные же сравнения или сопоставления в пределах небольших групп бактериальных культур или ограниченного числа источников их выделения, по мнению ряда авторов [7, 15, 48], существенно ограничивают возможное использование гидрофобных характеристик в медико-биологической практике.

Наиболее важным для понимания данной проблемы является то что коагулазоотрицательные стафилококки, изолированные со слизистых при перитонитах, в 8,5 % случаев были более гидрофильными, в отличие от штаммов, выращенных на стандартной жидкой питательной среде, среди которых гидрофобных культур было намного больше – 66 %. Культуры Bacillus cereus от больных с периодонтитом лучше адгезировались к коллагену I типа, фибриногену и ПМЯЛ (полиморфноядерные лейкоциты) на 6 сутки, чем бактерии выросшие в 1 сутки, что соответствовало низкой степени гидрофобности бактерий, выросших на 1 сутки и высокой степени гидрофобности бактерий на 6 сутки. Клинические изоляты Actinobacillus actinomycetem comitans и Haemophilus aphrophilus были более гидрофобны, чем музейные штаммы, при этом агаровые культуры Haemophilus aphrophilus были гидрофильнее, чем штаммы выращенные в бульоне. Адгезия высокогидрофобных бактерий к катетерам и инфузионным иглам, приводила к инфекционным осложнениям и развитию тромбофлебитов у детей [25]. При определении гидрофобности штаммов стрептококков группы D, выделенных из сыворотки больных с септицемией, была показана высокая степень их гидрофобности, что объяснялось авторами наличием липотейхоевых кислот (ЛТК). В работе [12] у клинических изолятов Clostridium difficile с разной вирулентностью и штаммов Escherichia coli, выделенных при пиелонефрите, оценивался поверхностный заряд, гидрофобность и гемагглютинация; при этом электрокинетический потенциал возрастал с уменьшением гидрофобности клеток, а степень гидрофобности увеличивалась по мере роста бактерий.

Адгезия к уроэпителию всегда выступала как проявление вирулентного потенциала возбудителей инфекций мочевого тракта. Разделение уропатогенных штаммов Staphylococcus saprophyticus в двухфазной системе водагидрокарбонат, выявило высокую степень гидрофобности у 79 % бактерий. Штаммы Escherichia coli выделенные от больных с пиелонефритом и диареей в от 40 % до 60 % случаев отличались более высокой степенью гидрофобности, чем штаммы изолированные от здоровых людей (в 16,7 % случаев) [12].

Связь между поверхностной гидрофобностью бактериальных клеток и их патогенностью была показана рядом исследователей на Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Mycobacterium lepraemurium, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia psittaci и Pseudomonas aeruginosa. Таким образом, адгезия к фагоцитам и прилипание к эпителиальным клеткам принципиально отличаются с точки зрения физики поверхностей. Эти феномены в целом соответствуют двум различным «стратегиям» выживания микроорганизмов в организме. В этой связи роль поверхностных явлений и, в частности, гидрофобности с большой долей надежности можно свести к оценке потенциальной опасности или необходимости для бактерий их адгезии к эукариотическим клеткам организма. В случае с фагоцитозом, бактериальные патогены, в большинстве своем чувствительные к фагоцитарному киллингу, способны снижать вероятность столкновения с фагоцитами и ингибировать захват в том числе через снижение гидрофобности своей клеточной поверхности. В случае персистирования1) на слизистых оболочках, наблюдается обратная картина, и нередко среди высеваемых культур обнаруживаются высокогидрофобные варианты, порой способные к самопроизвольной агрегации в растворах электролитов с относительно низкой ионной силой.

 

 

1.1.4 Поверхностные структуры бактерий детерминирующие их гидрофобность

 

 

При рассмотрении гидрофобных свойств поверхности, уместно рассматривать их как интегральный показатель всей поверхности клетки. При этом поверхностные структуры вносят определенный вклад в общее явление гидрофобности. «Гидрофобины» повышают гидрофобность клетки, «гидрофилины» – ее снижают. Если называть гидрофобины «адгезинами», то это предположило бы их роль в адгезии.

В бактериальной клетке функцию распознавания и прикрепления несут субстанции, названные адгезинами. У грамотрицательных бактерий адгезины входят в состав фимбрий. Функциональные особенности фимбрий свидетельствуют об их способности узнавать различные структуры на поверхности эукариотической клетки и связываться с ними. В основе прикрепления фибринированных бактерий к клеткам тканей организма лежит сродство соответствующих фимбриальных адгезинов к структурам, выполняющим функцию рецепторов. Но помимо комплементарного взаимодействия, в адгезии участвуют гидрофобные и электростатические силы, обусловливающие неспецифическое прикрепление фимбрий. Так при определении степени гидрофобности штаммов Acinetobacter calcoaceticus, был показан вклад тонких фимбрий в гидрофобность поверхности клеток. Удаление фимбрий или культивирование бактерий на бедных средах приводило к гидрофилизации поверхности и снижению адгезивного потенциала [19].

Почти все фимбрии, исследованные до настоящего времени, содержат высокую пропорцию гидрофобных аминокислотных остатков. Но из этого не следует, что все фимбрии гидрофобины, так как их способность подвергаться гидрофобным взаимодействиям зависела бы от пространственного расположения этих остатков, чем от их количества.

Часто величина гидрофобности бактерий зависела от наличия на поверхности различных по природе веществ или уровня дефектности поверхности клетки [14]. Шероховатые штаммы грамотрицательных бактерий (S.typhimurium, E.coli) были более гидрофобны, чем исходные гладкие S-формы, возможно из-за потери поверхностных олигосахаридов. При адгезии Streptococcus pyogenes к буккальному эпителию определенные бактериальные «гидрофобины» (например, комплекс «М протеин + ЛТК») могут быть узнаваемы некоторыми эпителиальными рецепторами клетки (фибронектином) и провоцировать феномен адгезии за счет этого специфического механизма.

Возможная роль антибиотика грамицидина S, способствующего гидрофобизации поверхности спор, была продемонстрирована рядом исследователей. В частности ими было показано, что споры бактерий продуцирующих антибиотик, отличались большей степенью гидрофобности от спор мутантных штаммов не продуцирующих грамицидин S [12]. Тогда как добавление разных концентраций грамицидина S к спорам мутантного штамма, в зависимости от дозы, повышало степень гидрофобности последнего. На основании этих результатов было сделано предположение, что катионная часть грамицидина S связывается с анионными рецепторами на поверхности спор, выставляя гидрофобные аминокислотные остатки молекулы антибиотика на поверхность споры.

Рядом исследователей было показано, что степень гидрофобности клеток часто коррелирует с повышенной чувствительностью к различным гидрофобным веществам и некоторым антибиотикам.

В 1997 г. А. Хостак и соавторы, показали что гидрофилизация поверхности Shigella dysenteria была вызвана воздействием субингибиторных концентраций аминогликозидов (амикацин, тобрамицин, гентамицин). Инкубация с субингибиторными концентрациями ципрофлокса­цина, норфлоксацина и эноксациллина приводила к снижению исходной степени гидрофобности у штаммов Klebsiella pneumoniae.

Субингибиторные концентрации различных антибиотиков по-разному оказывали влияние на гидрофобность бактерий вида Salmonella enteritidis, в большинстве случаев приводя к гидрофилизации клеточной поверхности [30].

Несколько исследователей заявили о наличие корреляции между продукцией продигиозана (полисахаридный препарат, стимулирующий естественный иммунитет) и высокой гидрофобностью поверхности клетки [8, 13, 12, 25].

Таким образом, гидрофобность клеток, как интегральный показатель отражающих состояние поверхности бактериальной клетки, значительно варьирует в зависимости от количества гидрофобных структур, на число и конформационные изменения которых могут оказывать регулирующее влияние, как различные антибиотические вещества, так и условия культивирования клеток.

Физика поверхности имеет огромное практическое значение при испытании поверхностно-активных веществ, детергентов, прочих веществ, повышающих и снижающих адгезию, в частности к вживляемым протезам и контактным линзам. На сегодня известно 5 групп методов, используемых для изучения гидрофобности, которые подробно описаны в ряде обзоров            [5, 12-18].

 

 

1.2 Методы измерения гидрофобности бактерий

 

1.2.1 Измерение методом контактного угла

 

 

При соприкосновении жидкости с твердым телом наблюдается смачивание или несмачивание этого тела с жидкостью. Если граничат друг с другом сразу три вещества: твердое, жидкое и газообразное, как показано на рисунке 1.1, то вся си­стема принимает конфигурацию, соответствующую минимуму суммарной поверхностной энергии [21-23, 41].

 

 

Рисунок 1.1 – Схематическое изображение капли жидкости на поверхности твердого тела

В частности, контур, по которому граничат все три вещества, располагается на поверхности твердого тела таким образом, чтобы сумма проекций всех приложенных к каждому элементу контура сил поверхностного натяжения на направление, в котором элемент контура может перемещаться (т.е. на   направление   касательной   к поверхности твердого тела), была равна нулю. Условие равновесия элемента контура длиной ∆l записывается следующим образом:

 

 

где – коэффициенты поверхностного натяжения на границах: твердое тело – газ, твердое тело – жидкость и жидкость – газ.

Отсчитываемый внутри жидкости угол θ между ка­сательными к поверхности твердого тела и к поверхно­сти жидкости называется контактным (краевым) углом.

В соответствии с формулой (1.1)

 

 

Если то , и жидкость смачивает твердое тело, поверхность которого в этом случае является гидрофильной.

В случае то , жидкость не смачивает тело, поверхность которого гидрофобная.

Это метод был применен для изучения межфазного взаимодействия как фагоцитарных, так и бактери­альных клеток в монослойных культурах [3, 17, 21, 28, 36-38].

Установлена корреляционная связь величины кон­тактного угла, образованного каплей водно-солевого раствора и по­верхностью монослоя эукариотических и прокариотических клеток, со степенью гидрофобности этих клеток. Чем больше величина угла, тем выше степень гидрофобности [38, 45].

Приготовление клеточных субстратов требует особой тщательности. Клетки собираются на целлулозно-ацетатном фильтре, с диаметром пор    0,45 мкм, пленка должна содержать от 10 до 70 клеточных слоев. Для стандартизации содержания воды, фильтры с клетками уравновешивают в чашках Петри на поверхности агара1) (1 % в воде, содержащей 10 объемных процентов глицерола) в течение 1-3 часов. В дальнейшем фильтры, установленные на плоской жесткой подложке, помещают в атмосферу со стандартизованной температурой и влажностью (от 20 °С до 22 °С и от 53 % до 59 %).

Контактные углы измеряются как функция времени. Капли дистиллированной воды при помощи пастеровской пипетки, наносят на поверхность монослоя клеток, фотографируют, и контактный угол определяют из равенства:

 

 

где h – высота измеряемого изображения, мкм;

       l – длина изображенной капли, мкм.

Формула 1.3 справедлива для небольших значений углов.

Методика измерения контактного угла, позволяет оценить свободную энергию поверхности клеток и применялась для изучения фагоцитоза [13] и адгезии клеток к твердым субстратам [29]. Причем наиболее подходящим для этих целей, по мнению большинства исследова­телей, является получение серии контактных углов со сходными жидкостями, имеющими разное поверхностное натяжение. При этом серия контактных углов выстраива­ется в прямую линию, напоминающую логарифмическую прямую.

В 1983 г. К. Дж. Ван Осс с соавторами предположили, что эта методика позволяет получать количественную информацию относительно собственной гидрофобности клеток, включая измерение поверхностной энергии бактерий. Результаты, полученные с использованием этого метода, были подтверждены другими методами.

В 1982 г. М. Флетчер и К. Маршал представили модификацию метода, в которой измеряли контактный угол воздушных пузырей на поверхности клеток, окруженных водой. Этот метод использовался для изучения гидрофобности цианобактерий [12].

В 1980 г. Р. Нефилд предложил заменить воздух, окружающий водную каплю маслом. Принимая во внимание, что большинство исследователей использовали для измерения контактного угла воду или физиологический раствор, Х. Дж. Бушер с соавторами определили поверхностные энергии бактерий колонизировавших слизистую ротовой полости, используя в качестве капли смесь пропанола и бромонафталена с водой [15].

 

 

1.2.2 Методы измерения поверхностной гидрофобности              основанные на адгезии

 

Хроматографический метод определение гидрофобности

 

 

Этот метод, первоначально используемый для разделения белка, нашел широкое применение для определения бактериальной гидрофобности. Методика основывается на измерении количества клеток, удерживаемых гидрофобным гелем. При этом определяется два параметра выражающие процент удержанных гелем клеток:

 

 

 

где – общее количество клеток содержащихся во взвеси;

       – количество клеток, которые не удерживаются гелем, при условии           гидрофобных взаимодействий и высокой ионной силы;

       – количество клеток, которые не удерживаются гелем, при условиях, которые удовлетворяют гидрофильным взаимодействиям – низкая ионная сила;

       – количество клеток удерживаемая гелем с высокой ионной силой (более 4 M) при низких значениях электростатических взаимодействий (гидрофобная фракция);

       – количество клеток, которые удерживаются в условиях с низкими значениями рН (гидрофильная фракция).

Согласно этой методике, водные суспензии шариков сефарозы с ковалентно связанными гидрофобными радикалами (фенильные или актильные группы), обычно упаковываются в маленькие колонки, в которые приливается суспензия бактерий. Процент удерживаемых клеток может быть определен различными методами: турбодиметрическим (по формирующимся при высеве КОЕ (колониеобразующая единица)) или измерением радиоактивности. Во многих случаях, для активации адгезии к гелю добавляют так называемые «salting-out» агенты. В некоторых случаях, прилипшие клетки могут быть десорбированы снижением ионной силы элюента (растворитель) или добавлением ПАВ (поверхностно-активные вещества). Эта методика сегодня используется биохимиками для разделения белков [17, 47].

 

 

Адгезия бактерий к углеводородам

 

 

Разделение бактерий в масляно – водной системе, изучалось различными исследователями, начиная с 1924 года, включая большое количество исследователей работающих в областях, связанных с нефтяной промышленностью. В 1980 году бактериальное прилипание к углеводородам (bacterial adhesion to hydrocarbon, ВАТН) было предложено как простой и удобный метод для измерения бактериальной гидрофобности. Согласно этому методу, отмытые бактериальные суспензии смешивались при контролируемых условиях с алифатическими (гексадекан) или ароматическими (ксилен) жидкими углеводородами. Высоко гидрофобные бактерии адгезируются на масляных капельках после смешивания.

Эта техника и различные ее модификации использовались для изучения бактериальной гидрофобности у широкого круга бактериальных видов и клеточных взвесей при различных условиях роста бактериальных популяций и при других контролируемых параметрах. Методика позволяла обогащать взвесь гидрофобными мутантами Acinetobacter calcoaceticus, Serratia marcescens и Streptococcus sanguis [14, 53].

 

 

Адгезия на твердых поверхностях

 

 

Метод основан на существующей корреляции между степенью гидрофобности поверхности клеток и их адгезией к полистиролу. Клеточная суспензия помещается на полистироловые чашки на некоторое время (например, клетки микроскопических грибов 2,5´10⁸ клеток/мл – 1 час; бактерии 5´10⁸ клетка/мл – 12 часов). Супернатанты1) удаляют, а чашки ополаскивают дистиллированной водой. Количество клеток прилипших к полистиролу подсчитывают при обычной световой микроскопии.

Способность бактериальных клеток удерживаться непосредственно на поверхности пластика, была использована рядом исследователей для количественной оценки гидрофобности.

Измерение количества адгезировавшихся клеток может осуществляться несколькими методами, от прямого подсчета под микроскопом до измерения поглощения (оптической плотности) красителя.

В 1983 г. Д. Р. Абсолом впервые использовал эту методику для определения бактериальной гидрофобности [57, 58]. Бактерии, суспендированные в различных концентрациях DMSO (диметилсульфоксида) контактировали с гладкими и твердыми поверхностями с различной величиной свободной поверхностной энергии. Но значения поверхностных энергий бактерий варьировали в пределах узкого диапазона. Поэтому трудно предположить, как бы повела себя методика со штаммами, которые в целом можно было бы охарактеризовать как высокогидрофобные.

 

 

1.2.3 Солевой агрегационный тест

 

 

Эта методика, описанная в 1981 г. М. Линдалом, основана на предпосылке, что одни и те же закономерности описывают осаждение молекул белка из водного раствора и агрегацию бактериальных клеток. Иными словами, чем больше гидрофобных клеток в исследуемой взвеси бактерий, тем в большей степени увеличивается скорость агрегации бактериальных клеток. По этой методике бактериальные клетки суспендировались в фосфатном буфере с добавлением сульфата аммония. Она в большем проценте случаев коррелирует с другими методами измерения гидрофобности. Но конфигурационные изменения на поверхности клетки, происходящие из-за высоких концентраций соли, могут привести к ошибкам измерения.

О гидрофобности поверхности клеток судят по наименьшей концентрации сульфата аммония, которая дает визуально определяемые агрегаты клеток. Провоцирование клеточной флоккуляции1) происходит за счет повышения концентрации соли. Порядок концентраций сульфата аммония, при котором наблюдается преципитация2) клеток, есть мера их гидрофобности. Самые гид­рофобные преципитируют при низкой концентрации соли, а гидрофильные осаждаются при высоких.

Теоретической основой для таких взаимодействий, является термодинамический подход - свободная энергия прилипания двух идентичных клеток в высокой степени отрицательная, поскольку их поверхностная энергия отличается от свободной энергии окружающей жидкости – выше или ниже нее [47].

 

 

1.2.4 Метод оценки межмолекулярных взаимодействий

 

 

Метод основан на способности гидрофобных сайтов бактериальной поверхности связывать определенное количество молекул пальмитиновой или додекановой кислоты. Он описывает разделение указанных кислот между бактериальной поверхностью и буфером, где фактор разделения используется как мера сродства поверхности клетки к соответствующей жирной кислоте.

В 1948 г. M.T. Даер и, позднее, М. Дж. Хилл в 1963 г., использовали различные поверхностно активные вещества для определения поверхностной гидрофобности у штаммов стафилококков и стрептококков [26]. В этих исследованиях к бактериальным суспензиям добавлялись низкие концентрации поверхностно-активных веществ, обычно отрицательно заряженных, чтобы устранить электростатические взаимодействия между положительно заряженными веществами и отрицательно заряженной поверхностью бактерий. Изменения электрофоретической подвижности клеток приписывалось авторами феномену закрепления молекул поверхностно-активных веществ при взаимодействии с гидрофобной поверхностью клетки и связывалось со степенью гидрофобности соответствующей поверхности клеток.

Этот принцип использовался С. Келлбергом с 1980 по 1984 гг. для измерения прикрепления меченной радиоактивным изотопом додекановой кислоты к бактериальным клеткам. Анализ результатов нескольких штаммов показал, что бактерии могут отличаться числом сайтов, доступных для связывания гидрофобных молекул. С помощью этой методики удалось получить важную информацию относительно природы и числа гидрофобных сайтов на поверхности бактериальной клетки.

Главная особенность такого определения гидрофобности – простота, и возможность проводить исследование «в пределах клеточной поверхности», то есть, изучая связывание специфических молекул непосредственно с сайтами, которые обычно не контактируют с внешней средой.

 

 

1.2.5 Косвенные методы определения гидрофобности

 

 

Гидрофобные взаимодействия ингибируются широким диапазоном молекул, включая те, которые могут оказывать поверхностно-активные или хаотропные эффекты. В некоторых случаях роль гидрофобных взаимодействий для процессов прилипания может быть признана основной, в случае, если речь идет о способности таких веществ ингибировать или полностью прекращать адгезию. Адгезия Thiobacillus к сульфидным гранулам ингибируется додецилсульфатом натрия. Прилипание Pseudomonas aeruginosa к эритроцитам ингибируется хаотропными агентами1); причем предполагается причастность к этому процессу гидрофобных взаимодействий. При адгезии Mycoplasma gallisepticum к человеческим эритроцитам, определялось количество гидрофобных (адгезировавшихся на мембране эритроцита) и гидрофильных бактерий в исследуемом материале.

Ингибирование бактериальной аутоагрегации и коагрегации за счет поверхностно-активных веществ подчеркивает важность гидрофобных взаимодействий при этих явлениях. Показано, что этанол зачастую оказывает мощное ингибирующее действие на адгезию бактериальных клеток [11, 14]. Вполне вероятно также, что большинство бактериальных клеток представителей нормального микробиоценоза на поверхности человеческого буккального эпителия удерживается c помощью гидрофобных взаимодействий, так как впоследствии их можно десорбировать низкими концентрациями эмульсии амфипатического полимера.

 

 

1.2.6 Метод межфазного разделения

 

 

Метод оценивает дистрибутивное разделение клеточных взвесей между водой и жидкой органической фазой. Несколько десятилетий назад П. Альбертссон предложил метод для разделения частиц, основанный на распределении между двумя полимерными водными фазами, обогащенными декстраном и полиэтиленгликолем [47].

Биохимиками уже давно используется метод двухфазного разделения для определения свободной энергии на поверхности протеинов и макромолекул. На сегодня этот метод является наиболее подходящим для измерения гидрофобности клеток. Он позволяет не только определить свободную энергию клеток, но и количественно ее измерить.

Теоретическими предпосылками для данного метода являются следующие постулаты:

1) свободная энергия и ее изменения сопровождают клетку или частицу при переходе из одной жидкой фазы через интерфазу во вторую фазу;

2) электростатические эффекты важны для экспериментальных условий, где заряд клеток или потенциал между фазами варьирует, что обычно связано с изменениями в составе электро­литов;

3) взаимодействие между компонентами системы также может породить сопутствующее изменение гидрофобности (фосфаты и поли­этиленгликоль);

4) если состав электролитов постоянен, то вклад электростатических сил в химический потенциал тоже постоянен, а коэффициенты разделения могут быть определены по разнице поверхностных энергий;

5) высокая или низкая концентрация клеток в одной из фаз коррелирует с величиной контактного угла.

Разделение клеток в двухфазной системе происходит с формированием трех фрак­ций: первая – клетки или частицы в верхней фазе, гидрофобная фракция, с высокой поверхностной энергией; вторая – клетки или частицы в нижней фазе, гидрофильная фракция, с низкой поверхностной энергией; третья – клетки или частицы в межфазном пространстве, фракция с промежуточ­ным значением поверхностной энергии. Очень часто в межфазное пространство выпадают агглютинаты1) клеток, что в конечном итоге может сказаться на результатах измерения гидрофобности.

Другая особенность – это большой размер и разнородность клеток. Разде­ление крупного объекта между двумя фазами отличается от разделения идеальной, не уменьшающейся точки, в которой все части поверхности связаны и двигаются вместе. Это явление подобно тем, которые сопро­вождают фазовые изменения, связанные с таянием и замораживанием.

На практике, невозможно точно промерить все эффективные зоны поверхно­сти клеток. В какой-то мере это связано с тем, что гликокаликс1) имеет волокнистую или коллоидальную поверхность.

В целом же существует линейная зависимость между логарифмом коэффициента разделения и различием в межфазной свободной энергии. Полученная зависимость справедлива для систем, у которых межфазная поверхностная энергия обусловлена не только вандерваальсовыми, но и электростатическими взаимодействиями. Функция равновесного распределения является линейной функцией различия в гидрофобности, если распределение происходит между двумя жидкими фазами или между жидкостью и твердой фазой с одина­ковым ионным составом, но с различной гидрофобностью. Иными словами, гидрофобные частицы в водной суспензии проявляют тенденцию к взаимодействию пропорционально коэффициенту распределения или растворимости в неполярных растворителях. Так называемый гидрофоб­ный эффект указывает на то, что константа равновесия для агрегации гидрофобных частиц зависит от поверхностной энергии частиц в сус­пензии.  

Метод распределения позволяет измерять гидрофобность объектов при использовании ряда двухфазных водных полимерных систем с постоян­ным ионным составом и варьирующими концентрациями неионных фазообразующих полимеров. В таблице 1 представлены различные значения межфазного натяжения в водной системе декстрана - полиэтиленгликоль.

 

Таблица 1 - Межфазное натяжение на границе водных растворов декстрана и полиэтиленгликоля (по И. Лефковитсу, Б. Пернису, 1983 г.)

 

Концентрация, %		Межфазное натяжение σ, M±m, H/м
Декстран Т500	ПЭГ 20000
5,0	5,0	22,8 ± 1,42
4,5	4,5	17,0 ± 1,11
4,0	4,3	6,41 ± 0,56
3,5	3,5	1,11 ± 0,07
3,0	3,0	0,64 ± 0,06
8,0	5,0	65,5 ± 1,5
7,0	4,5	30,0 ± 5,0
6,0	4,3	7,4 ± 0,2
5,0	4,0	3,1 ± 0,1
5,2	3,5	2,1 ± 0,1
5,0	3,0	0,46 ± 0,0

 

С помощью этого метода можно также измерять поверхностный заряд частиц, варьируя состав или концентра­цию солей в системах с неизменной концентрацией полимеров. Эти подходы были использованы для раздельного изучения вандерваальсо­вых и электростатических эффектов.

Гидрофобность полиэтиленгликолевой фазы может быть увеличена ковалентным связыванием с ацильными группами, увеличивая сродство гидрофобности бактерий к этой фазе в отличие от декстрановой [53].

Одна из возможных проблем, связанная с этой методикой состоит в том, что часть бактерий может остаться в межфазном пространстве, тем самым усложняя интерпретацию полученных результатов. Тем не менее, эта методика может рассматриваться как относительно щадящая клетки, так как сохраняет их жизнеспособными, и избегает использования высоких концентраций солей или органических растворителей.

В 1980 г. А. Герсон и Р. Акит сообщили о прямой корреляции между методом двухфазного разделения и методом краевого угла, отнеся их к методам позволяющих определять, как качественную, так и количественную сторону поверхностной гидрофобности.

 

 

1.2.7 Сравнительный анализ методов измерения гидрофобности бактериальных клеток

 

 

Многие авторы неоднократно показывали, что гидрофобность поверхности клеток достаточно вариабельный признак и привязана не только к методике измерения, но и к условиям роста, аэрации и возрасту клеток. Разные методы измерения гидрофобности в той или иной мере отражают истинную гидрофобность поверхности, но не всегда коррелируют между собой.

Солевой агрегационный тест относится к разряду достаточно простых методов для определения поверхностной гидрофобности. Фактически, тест «высаливания» связан с изменением концентрации сульфата аммония, позволяющего при нормальных условиях и в зависимости от поверхностной энергии приводить к агрегации клеток. Метод относится к недостаточно чувствительным и может использоваться для обнаружения высоко гидрофобных микроорганизмов. Известны примеры, когда данные полученные этим методом были менее достоверны по сравнению с результатами, полученными другими методами, например, штаммы Staphylococcus aureus, выделенные из очагов инфекций, в солевом агрегационном тесте проявляли высокую степень гидрофобности поверхности, что не соответствовало действительности.

Метод контактного угла относится к сложным методам, требующим соблюдения определенных режимов при измерении. Измерения гидрофобности с использованием метода контактного угла имеет хорошо определяемое физическое значение в терминах термодинамики межфазных процессов. Низкая воспроизводимость результатов – одна из проблем метода измерения краевого угла. Она связана как с проникновением воды в пленку клеток, так и с высыханием (потерей воды) пленки. Остается под вопросом жизнеспособность клеток в монослое.

Разработанные позже подходы позволяющие сохранять жизнеспособные клетки, погружая их в течение всего опыта в физиологическую среду, позволили измерять ту часть свободной энергии клетки, которая обусловлена дисперсионными и вандерваальсовыми взаимодействиями. Но во многих случаях необходимо определять вклад как дисперсионных, так и гидрофобных взаимодействий [17, 26, 27, 47]. Модификация метода с использованием двух несмешивающихся жидкостей при измерении краевых уг­лов требует наличия подходящих камер для образцов.

Метод двухфазного разделения уже давно используется биохимиками для определения свободной энергии на поверхности про­теинов, макромолекул или же клеток. При этом если величина свободной энергии является отрицательной, то при существенно более высокой свободной энергии аттракции произойдет спонтан­ное отталкивание частиц, краевых цепочек макромолекул или участвующих в процессе клеток.

Многими авторами были опробованы самые различные водорастворимые гидрофильные полимеры, такие как полиэтиленгликоль, декстран, фиколл, ксантан. Большое количество примеров нековалентного аттрактивного (притяжение) или репульсивного (отталкивание) взаимодействия в системах «клетка–клетка», вынудило многих ис­следователей на поиск методов количественного измерения их энергий. Проблема измерения свободной энергии клеток, была решена использованием пары несмешивающихся жидкостей (полиэтиленгликоль – декстран). Одним из преимуществ этой методики перед другими является возможность измерять как полярные, так и неполярные взаимодействия «клетка – клетка». Смешиванием этих двух полимеров можно получить ряд растворов с разным поверхностным натя­жением (см. таблицу 1).

Второе преимущество бифазных систем водных поли­меров заключается в очень низком межфазном натяжении. Нет согласия, среди исследователей относительно единой шкалы гидрофобности, в связи со значительной вариабельностью гидрофобности у бактерий в пределах штамма. Про­блема в основном связана с фактом, что гидрофобность есть ин­тегральный показатель поверхности клеток и может быть изме­рена не напрямую, а через явления, которые отражают природу межмолекулярных взаимодействий. Тогда как различные методы измерения гидрофобности, описываемые в литературе, используют при этом разные параметры. На межфазное натяжение оказывает влияние и присутствие солей. В основном это связано с присутствием солей кальция и магния. Этим ве­роятно можно объяснить результаты неудачных опытов по распределению клеток в двухфазных системах.

Хроматографический метод. Термодинамический подход к феномену адгезии обеспечивает теоретическое объяснение данной методике. Низкая поверхностная энергия клеток и отрицательная свободная энергия создают условия благоприятные для прилипания. Однако на результаты может повлиять электростатическое взаимодействие между клетками, а также между клеткой и субстратом, и изменение pH. При высоком pH и низкой ионной силе раствора, электростатическое отталкивание может предотвратить адгезию клеток на полистироле или к фенилсефарозе, исключая лишь адгезию высокогидрофобных бактерий.

Измерение стандартным способом позволяет выделять гидрофильные микроорганизмы, которые фактически остаются в растворе. Большой разброс результатов измерения гидрофобности говорит о различном количестве бактерий удерживаемым гелем. Это может быть связано как с размером клеток, так и с их строением. Причем метод требует точного и тщательного соблюдения режимов постановки эксперимента. К тому же бактерии могут удерживаться не только в пределах геля, но и между гелем и колонкой, так что исследования предпочтительно выполнять, смешивая шарики с бактериальными клетками и разделяя свободные клетки от связанных. В некоторых случаях бактерии могут прилипать к шарикам сефарозы.

Адгезия бактерий к углеводородам. Одним из главных ограничений метода является его многофакторный характер. Разработан также и количественный подход, основанный на кинетике прилипания к гексадекану. Результаты, полученные с использованием этого метода, обычно коррелируют с результатами полученными другими методами. Однако при измерении гидрофобности нескольких штаммов энтеробактерий, у которых гидрофобность была определена другими методами, было показано, что они плохо или совсем не удерживаются гексадеканом. В тоже время, адгезия R-варианта Escherichia coli к гексадекану увеличивалась от 0 % до 76 %, при добавлении к бактериальной суспензии сульфата аммония. На основании этих исследований можно предположить, что многие штаммы энтеробактерий в отсутствии salting-out агентов обладают явно низкой гидрофобностью, намного меньшей, чем гидрофобность сильно удерживаемых углеводородами бактерий (например, Streptococcus pyogenes, Acinetobacter calcoaceticus и Serratia marcescens) [47].

В целом же методики, основанные на адгезии к углеводородам, поставили больше вопросов, чем ответов. Некоторые из них являются чрезвычайно важными для понимания этого феномена и требуют дальнейшего разъяснения.

 

 

1.3 Характеристика микроскопических грибов

 

1.3.1 Строение грибов

 

 

Грибы - большая гетерогенная группа гетеротрофных микроорганизмов, одноклеточных или многоклеточных, среди которых есть сапрофиты, паразиты растений и животных, симбионты [2, 8]. Все грибы, занемногим исключением, имеют мицелиальное строение, т.е. их вегетативное тело (таллом) состоит из мицелия или грибницы, которая представляет собой систему ветвящихся нитей (гиф), пронизывающих субстрат и имеющих с ним большую поверхность соприкосновения, через которую осуществляется адсорбция питательных веществ [18].

Подавляющее большинство грибов имеет микроскопические размеры. В природе непосредственно их нельзя обнаружить невооруженным глазом. Такие грибы называют микромицетами. Диаметр клетки грибов варьирует от 1 до 50 мкм.

Грибы - неподвижные организмы, подвижными бывают только отдельные стадии в цикле развития. Они лишены хлорофилла, поэтому необходимое условие их существования - наличие органического углерода.

Грибы - эукариотные микроорганизмы. Клетка гриба состоит из клеточной оболочки (снаружи она часто бывает покрыта слизистым слоем — капсулой), ломасом, цитоплазмы с цитоплазматической мембраной, эндоплазматической сетью, митохонд­риями, рибосомами, аппаратом Гольджи (диктиосомами) и ядрами. Иногда в клетке грибов есть вакуоли и различные включения [31].

Клеточная оболочка, осуществляющая у грибов многочисленные функции, в том числе активного всасывания питательных веществ из субстрата, в качестве основных компонентов содержит хитин, полиса­хариды, в том числе глюканы, белки и жиры. Обычно слой молекул глюканов покрывает сверху молекулы хитина. Хитин — вещество, со­держащее азот,— в оболочках многих видов грибов составляет до 60 % сухой массы. Химическая природа хитина — линейный полимер, в мо­лекулу которого входят β-1,4-связанные единицы N-ацетилглюкозамина. В оболочках грибных клеток они собраны в кристаллиты. Полиса­хариды (d-глюкоза, N-ацетилглюкозамин, d-манноза) составляют до 90 % содержимого оболочки клетки. В клеточной оболочке грибов имеются также пигменты (меланины, хиноны), сюда же входят раз­личные ионы и соли.

Электронно-микроскопическое изучение оболочек клеток грибов показывает, что они состоят из нескольких слоев фи­бриллярного строения. Эти фибриллы, представляющие собой белковые микротрубочки, образуют скелет, который служит основой для осталь­ных компонентов оболочки [4]. Клеточная оболочка придает форму клеткам гиф и органам размножения. Ее поверхность является местом локализации некоторых ферментов.

Проницаемость клетки и ее спо­собность связывать определенные вещества играют роль в питании гри­бов, их отношении к фунгицидам, антибиотикам. В результате лизиса клеточная оболочка грибов может разрушаться двумя путями: воздей­ствием ферментов, выделяемых другими клетками или организмами, и воздействием ферментов, образуемых в клетке самого гриба. Наибо­лее важными ферментами, катализирующими разложение отдельных компонентов клеточной оболочки грибов, являются α- и β-глюканазы, протеазы и пептидазы, целлюлазы, липазы, хитиназы, гексозаминидазы, глюкуронидазы, глюкозаминидазы, целлобиазы. Комплекс ферментов зависит от особенностей компонентов клеточной оболочки разных ви­дов грибов. На поверхности клеточной оболочки и цитоплазматической мембраны локализованы ферменты, превращающие не усваиваемые клеткой полимеры в усваиваемые мономеры. Отличительным признаком клеточной оболочки некоторых представителей низших грибов является отсутствие в ней хитина и наличие только целлюлозы.

 

 

1.3.2 Способы размножения и классификация грибов

 

 

Грибы имеют разнообразные способы размножения - вегетативное, бесполое, половое [32, 35]. Органы бесполого размножения грибов разнообразны по строению и характеру образования и являются основой для классификации этих организмов. Бесполое размножение - размножение с образованием специали­зированных органов, появлению которых не предшествует слияние клеток или объединение ядер. Наиболее обычный способ бесполого размножения у грибов - размножение путем спор, образующихся в специализированных органах. Споры грибов очень разнообразны по строение и форме - округлые, овальные, цилиндрические, игловидные, скрученные, спирально звездчатые и т.д. На рисунке 1.2 изображены споры плесневых грибов.

 

 

Рисунок 1.2 – Споры плесневого гриба под микроскопом              

 

Бесполые споры у одних грибов образуются в специальных вместилищах - спорангиях и называются спорангиоспорами, у других споры образуются открыто на специализированных гифах или на мицелии различными способами и называются конидиями.

Спорангий закрытое образование, содержащее обычно большое количество спорангиоспор. Образуется спорангий на специализированной гифе, называемой спорангиеносцем, изображенный на рисунке 1.3.

 

 

a – Mucor, б – Aspergillus, в – Penucillum.

Рисунок 1.3 – Типы бесполого спорообразованя у грибов              

 

Вегетативное размножение - это размножение без образования каких бы то ни было специализированных органов размножения, чаще всего это размножение отдельными участками мицелия, каждая часть которого способна дать начало новому организму. Это свойство мицелия используется для поддержания роста грибов на искусственных питательных средах путем переноса кусочков мицелия с одной среды на другую. Вегетативным является так же размножение, при котором в гифах предварительно образуются частые перегородки, и затем гифы распадаются по ним на отдельные клетки овальной или цилиндрической формы, называемые оидиями или артроспорами. Если такие клетки до своего разделения покрываются более толстой оболочкой, то они называются хламидоспорами. Некоторые грибы могут образовывать почкующийся мицелий.

Половое размножение - осуществляется путем слияния двух ядер в одной клетке или слияния двух специализированных половых клеток - гамет. В результате полового процесса образуется особая половая клетка - зигота, которая прорастает, давая половые споры.

Выделяют три типа грибов, имеющих половой способ размножения (так называ­емые совершенные грибы): зигомицеты (Zygomycota), аскомицеты (Ascomycota) и базидиомицеты (Basidiomycota). Отдельно выделяют условный, формальный тип грибов — дейтеромицеты (Deiteromycota), у которых имеется только бесполый способ размножения (так называемые несовершенные грибы).

Зигомицеты относятся к низшим грибам (мицелий несептированный). Они включают представителей родов Mucor, Rhizopus, Rhizomucor, Absidia, Basidiobolus, Conidiobolus. Распространены в почве и воздухе. Могут вызывать зигомикоз (мукоромикоз) легких, головного мозга и других органов человека.

Аскомицеты (сумчатые грибы) имеют септированный ми­целий (кроме одноклеточных дрожжей). Свое название они получили от основного органа плодоношения — сумки, или аска, содержащего 4 или 8 гаплоидных половых спор (аскоспор).

К аскомицетам относятся отдельные представители (телеоморфы) родов Aspergillus и Penicillium. Большинство грибов родов Aspergillus, Penicillium являются анаморфами, т.е. размножаются только бесполым путем, с по­мощью бесполых спор — конидий и должны быть отнесены по этому признаку к несовершенным грибам [2, 18, 33, 55]. У гри­бов рода Aspergillus на концах плодоносящих гиф, конидиеносцах, имеются утолщения — стеригмы, фиалиды, на которых образуются цепочки конидий («леечная плесень»). У грибов рода Penicillium (кистевик) плодоносящая гифа напоминает кисточку. Не которые виды аспергилл могут вызывать аспергиллезы и афлатоксикозы. Пенициллы могут вызывать заболевания — пенициллиозы.

Представителями аскомицетов являются также дрожжи (ро­ды Saccharomyces, телеоморфы многих видов Candida) [39]. Заболевания, вызываемые некоторыми видами дрожжей, получили название дрожжевых микозов. К аскомицетам относится и возбудитель эрготизма (спорынья Claviceps purpurea), паразитирующий на злаках.

Многие виды аскомицетов являются продуцентами анти­биотиков, используются в биотехнологии.

Базидиомицеты (шляпочные грибы) имеют септированный мицелий. Они образуют половые споры — базидиоспоры путем отшнуровывания от базидия — концевой клетки мицелия, гомологичной аску. К базидиомицетам относятся некоторые дрожжи, напри­мер, телеоморфы Cryptococcus neoformans.

Дейтеромицеты (другие названия — несовершенные грибы, Fungi imperfecti, анаморфные грибы, конидиальные грибы) являются условным, формальным типом грибов, кото­рый объединяет грибы, не имеющие полового размножения. Слово «формальный» означает, что потенциально эти грибы могут иметь половой способ размножения; при установлении последнего факта грибы переносят в один из известных ти­пов — Ascomycota или Basidiomycota и присваивают им на­звание телеоморфной формы.

Дейтеромицеты образуют септированный мицелий, раз­множаются только бесполым путем в результате формирования конидий. Недавно вместо термина «дейтеромицеты» предложен термин «митоспоровые грибы» — грибы, размно­жающиеся неполовыми спорами, т. е. путем митоза. К дейтеромицетам относятся несовершенные дрожжи (дрожжеподобные грибы), например, некоторые грибы рода Candida, поражающие кожу, слизистые оболочки и внутрен­ние органы (кандидоз) [30].

 

 

1.3.3                   Условия и типы роста грибов

 

 

Грибы чрезвычайно устойчивы к химическим и физическим воздействиям. Лекарственное средство убивают их в концентрациях, проявляющий токсический органотропный эффект. Дезинфицирующие средства уничтожают их в волосах за 8–20 мин. Температурный диапазон роста грибов – от 15 ºC до 50 ºC. Грибы рода Epidermophyton гибнут при 48 ºC через 5-10 мин. Споры Trichophyton выдерживают сухой жар до 75 ºC, но погибают во влажной атмосфере уже при 52 ºC. Прямой солнечный свет ингибирует рост в культурах; наиболее чувтвительны различные виды Microsporum, наименее – виды Candida [44]. Грибы относительно радиорезистентны, а также малочувствительны к умеренному УФ- и рентгеновскому излучению. Более того, облучение в низких дозах стимулирует их рост. Различают мицелиальный и дрожжевой типы роста грибов.

Мицелиальный рост дают плесневые грибы, которые образуют ветвящиеся тонкие нити – гифы (от греч. hypha - паутина), содержащие цитоплазму и органеллы. Толщина гиф колеблется от 2 до 100 мкм, которые сплетаются в грибницу, или мицелий (от греч. mykes - гриб, и helos - нарост). Образование мицелия - отличительный признак истинных грибов (Eumycota). Гифы высших грибов содержат перегородки (септы), разделяющие их на отдельные клетки. Септы имеют отверстия, позволяющие цитоплазме и некоторым органеллам перетекать из одной клетки в другую.

Гифы низших грибов перегородок не имеют. Они пред­ставлены многоядерными клетками и называются ценоцитными, или асептированными. Таким образом, в целом плесневой гриб представляет собой ценоцит (от греч. koinos - общий, и kytos - клетка) – обширную территорию цитоплазмы с множеством ядер, располагающуюся в скоплении трубок-гиф [55].

Врастающая в субстрат часть тела гриба, абсорбирующая питательные вещества, - вегетативный мицелий, а растущая на поверхности субстрата часть – воздушный мицелий. Вегетативный мицелий утилизирует необходимые питательные вещества и источники энергии из субстрата. У некоторых видов в его состав входят специализированные гифы: спирально извитые, ризоформные (напоминающие корни), чётковидные, роговидные и другие,

Вегетативный мицелий утилизирует необходимые питательные вещества и источники энергии из субстрата. У некоторых видов в его состав входят специализированные гифы: спирально извитые, ризоформные (напоминающие корни), чётковидные, роговидные и другие.

Воздушный мицелий придает поверхности колоний плесневых грибов характерную шерстистую или пушистую фактуру. Нередко воздушный мицелий образуют специализированные гифы, несущие репродуктивные структуры – спорофоры, которые подразделяют на конидио- и спорангиофоры. Они отвечают за бесполое размножение.

Мицелиальные грибы распространены повсеместно. Особенно много их в почве и местах с повышенной влажностью. Схема роста плесневых грибов на питательной среде представлена на рисунке 1.4.

 

 

 

Рисунок 1.4 – Схема роста плесневых грибов на питательной среде

 

Дрожжами называют грибы, которые существуют на протяжении всего или большей части жизненного цикла в виде различных одиночных клеток [41].

Дрожжи обладают всеми основными свойствами и признаками грибных организмов, но одноклеточность их строения и большое значение отношения площади поверхности к объему влечет за собой более высокую скорость обмена веществ, чем у мицелиальных грибов.

На плотных питательных средах растут в виде блестящих колоний разного цвета, формы и консистенции, а в жидких средах образуют муть, пленки и осадки. Дрожжевые клетки морфологически довольно разнообразны. Они могут иметь круглую, овальную, удлиненно-цилиндрическую, лимоновидную, бутылевидную, треугольную или серповидную форму. Размеры одиночных дрожжевых клеток лежат в пределах от 1 до 10 мкм, чаще от 3 до 7 мкм. Иногда клетки могут объединяться в различные более или менее прочные структуры в виде ложного (псевдо) или настоящего мицелия. Форма клетки в значительной степени зависит от способа вегетативного размножения.

По типу полового размножения они распределены среди высших грибов — аскомицет и базидиомицет [43]. При бесполом размно­жении дрожжи образуют почки или делятся, что приводит к одноклеточному росту. Могут образовывать псевдогифы и ложный мицелий (псевдомицелий) в виде цепочек удлинен­ных клеток — «сарделек».

Грибы, аналогичные дрожжам, но не имеющие полового способа размножения, называют дрожжеподобными. Они размножаются только бесполым способом — почкованием или делением [54].

Почкованию предшествует лизис участка клеточной стенки и выпячивание фрагмента цитоплазмы. Затем в ядре материнской клетки происходит митоз, и образовавшееся новое ядро переносится в отпочковывающийся фрагмент цитоплазмы. В последующем между материнской клеткой и почкой образуется перегородка, восстанавливающая целостность клеточных стенок и изолирующая дочерние клетки – бластоконидии, или бластоспоры.

Образование бластоконидий представлено на рисунке 1.5.

 

Рисунок 1.5 – Образование бластоконидий у дрожжей и дрожжеподобных грибов

 

Дрожжи – аэробы1), энергию получают в процессе дыхания, но в анаэробных условиях (отсутствие в окружающей среде кислорода) осуществляют спиртовое брожение, расщепляя углеводы по гликолитическому пути. В условиях аэрации процесс спиртового брожения подавляется и активируется дыхание. Подавление спиртового брожения кислородом получило название «эффект Пастера». Этот эффект рассматривается как результат конкурирующего взаимодействия энергетических путей, в частности, гликолиза и дыхания, функционирующих у дрожжей [43, 54, 56].

Дрожжи различаются своей потребностью в витаминах, фактором роста для дрожжей служат витамины группы В.

 

 

1.3.4                   Диморфизм

 

 

Многие грибы характеризуются ди­морфизмом - способностью к гифальному (мицелиальному) или дрожжеподобному росту, в зависимости от условий куль­тивирования. Например, в инфицированном организме они растут в виде дрожжеподобных клеток (дрожжевая фаза), а на питательных средах образуют гифы и мицелий. Такая ре­акция связана с температурным фактором: при комнатной температуре образуется мицелий, а при 37 °С (при температу­ре тела человека) — дрожжеподобные клетки. Диморфизм характерен для многих возбудителей системных микозов (родов Histoplasma, Blastomyces, Coccidioides и Paracoccidioides), а также для видов Candida и Sporothrix schenckii [8, 20, 31, 32, 54].

 

 

1.3.5 Грибы рода Saccharomyces

 

 

Saccharomyces – род дрожжей из класса Архиаскомицеты (Archiascomycetes) порядка Сахаромицеты (Saccharomycetales). Эукариотные овальные или сферические, реже удлиненные клетки диаметром до 10 мкм, соединенные по две или в небольшие группы. Мицелия не образуют. Размножаются почкованием и аскоспорами. Известно около 20 видов [20].

Жизненный цикл сахаромицетов связан с растениями (размножаются в сочных плодах, нектаре) и насекомыми (служат белковой пищей для личинок), которые являются их переносчиками. Например, дрозофилы, питаясь соком плодов, откладывают яйца под их кожуру и одновременно вводят некоторое количество сахаромицетов (кустарное виноделие основано на том, что плоды всегда содержат дрожжи). Кроме природных, сахаромицеты включают так называемые культурные дрожжи (в основном S. cerevisiae) – пекарские, пивные, спиртовые и др., используемые в соответствующих отраслях пищевой промышленности [50, 54]. Все сахаромицеты активно сбраживают простые углеводы с образованием этилового спирта и углекислого газа:

 

 

Сахаромицеты синтезируют и аккумулируют большое количество витаминов группы В и используются в медицине при авитаминозах. Некоторые виды вызывают порчу мёда и сладких продуктов. Патогенных форм среди сахаромицетов нет. Они удобные модели эукариотических клеток в радиобиологических исследованиях, космической биологии, цитологии, иммунологии. Генетически детально изученный вид S. cerevisiae используют в генетике и биотехнологии; методами генной инженерии в его ДНК встраивают и клонируют гены, ответственные за синтез гормонов и других ценных соединений.

 

 

1.3.6 Грибы рода Candida

 

 

Виды рода Candida, являющиеся частью нормальной микрофлоры, могут вторгаться в ткань (эндогенная инфекция) и вызывать кандидоз.

Дрожжеподобные грибы рода Candida являются одноклеточными микроорганизмами. Молодые клетки имеют круглую или яйцевидную форму, зрелые — удлиненную или округлую. Диаметр колеблется от 2 до 5 мкм. Зрелые значительно крупнее молодых, длина их достигает от 12 до 16 мкм. Способны образовывать псевдомицелий — нити из удлиненных клеток, бластоспоры или клетки-почки, сидящие на перетяжках псевдомицелия, и хламидоспоры — споры с плотной двойной оболочкой, представленные на рисунке 1.6 [30].

 

Рисунок 1.6 – Грибы рода Candida albicans

 

Клетка дрожжеподобного гриба имеет сложное строение: 5-6-слойную клеточную стенку, ядро с ядерной мембраной, вакуоли, митохондрии, трабекулярные каналы клеточной стенки и перфоративный орган, который обладает выраженным повреждающим воздействием на клетки хозяина. Стенка клетки Candid содержит фосфолипазу, которая способствует проникновению гриба в эпителиальную клетку. Так, при гистологическом исследовании биопсированных кусочков слизистой обнаружено глубокое проникновение грибов и размножение их как в поверхностных, промежуточных, так и в базальных клетках эпителиального слоя [33]. Характерные биохимические свойства: способность ферментировать и ассимилировать1) углеводы; тропизм2) к тканям, богатым гликогеном, т.е. обладают гликофилией.          Дрожжеподобные грибы рода Candida аэробы. Они хорошо растут на кровяных и сывороточных средах, гидролизате дрожжей, отварах из картофеля, моркови, кукурузы и риса, а также на пивном сусле. Благоприятной для выращивания кандидозных грибов является температура от 30 °С до 37 °С, при комнатной температуре (от 15 °С до 17 °С) рост их несколько замедляется. На плотных агаровых средах вырастают колонии крупнее, чем на бактериальных: их размер достигает 1 см в диаметре. Консистенция сметанообразная, иногда тягучая или крошковатая. Преобладают круглые, слегка приподнятые или плоские колонии. Поверхность их может быть гладкой, матовой или блестящей, исчерченной или крупноскладчатой [42].

В качестве питания из азотистых веществ они используют сывороточные белки, аминокислоты, казеин, мочевину, из минеральных — сульфат аммония, из углеводов — крахмал, декстрин, органические кислоты, многоатомные спирты [50]. Оптимальной для роста грибов считается рН 6,0- 6,5, но они могут длительно пребывать в очень кислых средах (рН 2,5-3,0), хотя развитие их там замедляется. Рост грибов также задерживается при температуре 40 °С, полное отмирание клеток наступает при температуре выше 50 °С, а кипячение в течение нескольких минут убивает их.

Патогенность различных грибов рода Candida для животных и человека неодинакова. Наиболее патогенным для человека признан вид С. albicans, на втором месте, особенно для детей, С. tropicalis [44]. К факторам патогенности грибов относятся секреция протеолитических ферментов, гемолизинов и несвязанных липидов и адгезия к клеткам эпителия с последующей дерматонекротической активностью. Следует учитывать, что грибы рода Candida относится к условно-патогенным микробам, поэтому в патогенезе кандидозной инфекции решающую роль играют не столько патогенные факторы грибов, сколько состояние макроорганизма, его иммунной системы.

 

 

1.3.7 Грибы рода Malassezia

 

 

Грибы рода Malassezia способны существовать и в форме дрожжей и в мицелиальной форме. В культуре клеток в основном преобладает форма дрожжей, но у некоторых видов могут быть замечены и гифы.

Несколько групп исследователей преуспели в том, чтобы вызвать формирование мицелия in vitro (вне живого организма), используя разнообразные среды, хотя не все изолируемые Malassezia в состоянии подвергнуться этому преобразованию [39].Клетки дрожжей могут иметь грушевидную, овальную, яйцевидную, или цилиндрическую форму [42]. Грибам рода Malassezia присуще бесполое размножение монополярным энтеробластическим почкованием [44]. Зародыши могут формироваться как на узкой, так и на широкой основе [42]. Материнская и дочерняя клетки разделены на перегородку, и дочерняя клетка, отделяясь, оставляет почечный рубец в виде воротничка, через который появляются последующие дочерние клетки [44]. В результате клетка приобретает характерную, для монополярного почкования, форму в виде груши или лампочки.

Клеточная стенка грибов рода Malassezia недостаточно охарактеризована. По сравнению с другим дрожжами она очень толстая (приблизительно 0,12 мкм) и составляет от 26 % до 37 % объема клетки [46]. Главные компоненты клеточной стенки – маннопротеины (от 75 % до 80 %), белки (10 %), липиды (от 15 % до 20 %) и хитин (от 1 % до 2 %), с небольшим содержанием азота и серы.

Физиология разновидностей грибов рода Malassezia плохо изучена, проблемы с надежной культивацией и поддержанием организма препятствовали продвижению в этой области. В 1939 г., Бенхэм отмечал, что Malassezia неспособны ферментировать сахара. В качестве единственного источника углерода организм использует липиды, не требует витаминов или электролитов, и предпочтительно использует метионин как единственный источник серы, но может также использовать цистин или цистеин. В качестве источников азота в состоянии использовать многие аминокислоты, а так же соли аммония. Несмотря на то, что организм обычно выращивается in vitro при аэробных условиях, он также в состоянии расти при микроаэрофильных и анаэробных условиях.

Существует предположение, что иммуномодуляторная способность дрожжей рода Malassezia связана с липидами клеточной стенки [49]. Зависимость роста Malassezia от липидов было впервые отмечено в 1939 г., но не было изучено подробно до Шифрина и Марра, продемонстрировавших неспособность организма синтезировать длинноцепочечные жирные кислоты, необходимые при синтезе миристиновой кислоты. Дальнейшие работы показали, что добавления большинства жирных кислот с длиной углеродной цепи больше 10 способны поддерживать рост культуры. Источник липида, используемый в течение роста, влияет на состав жирных кислот организма. Предположено, что жирные кислоты не используются как источники энергии, а непосредственно включаются в липиды клетки, не будучи далее вовлеченными в метаболизм. Другой метаболит Malassezia – азелаиновая кислота – дикарбоксильная, C9 кислота. В дополнение к наличию антибактериальной и противогрибковой деятельности, азелаиновая кислота препятствует быстрому увеличению нескольких линий опухолевых клеток и уменьшает производство активных форм кислорода в нейтрофилах, тормозя процессы клеточного метаболизма [39].

Разновидности грибов рода Malassezia вырабатывают ряд ферментов и метаболитов. Они обладают липолитической деятельностью как in vitro так и in vivo (в естественных условиях, внутри живого организм), что указывает на производство липазы. Липаза располагается в клеточной стенке и/или в мембранных участках в цитоплазме.

Культуры Malassezia производят характерный "фруктовый" запах, описанный в работах Ван Аббэ. Эта особенность была уникальна для Malassezia и была предложена как возможный способ дифференцировать этот род от других. Дрожжи рода Malassezia являются липофильными представителями нормальной микрофлоры кожного покрова теплокровных животных, при соответствующих условиях, переходя в мицелиальную форму, они вызывают поверхностные инфекции кожи и связанных с ней структур. Образуя мицелиальную форму, Malassezia, по-видимому, разрушают клетки эпидермиса, а не просто проникают между ними. Организм утрачивает способность контролировать рост дрожжей Malassezia, и их количество значительно увеличивается. Подобного рода изменения ведут к разрушению дермального барьера и возникновению воспалительных изменений.

В настоящее время наиболее известным и общепринятым заболеванием, вызванным грибами рода Malassezia, является разноцветный лишай. При этом поражаются самые поверхностные слои эпидермиса. Другими распространенными заболеваниями, связанными с грибами Malassezia, считают Malassezia-фолликулит, себорейный дерматит и перхоть.

Заболевания, ассоциированные с грибами рода Malassezia, являются в основном хроническими и характерны для людей с подавленной иммунной системой и предрасположенных к аллергии. Лечение их направлено на устранение дрожжей с помощью различных антимикотиков [46]. Многие аспекты патогенеза и патогенных свойств грибов рода Malassezia до конца не ясны [39, 42, 44, 49].

 

 

 

 

2          Материалы и методы

 

2.1   Объект исследования, культивирование и подготовка  дрожжевых клеток

 

 

Объектом исследования явилась коммерческий штамм пекарских дрожжей вида Saccharomyces cerevisiae. Хранение осуществляли в условиях низкой температуры (+4 °С) в виде густого осадка отмытых живых дрожжевых клеток, предварительно выращенных на среде Сабуро с добавлением 5 % глюкозы.

Культивирование грибов для проведения экспериментальной серии производили в среде, содержащей 10 % глюкозы и 0,1 % мочевины в объеме 200 мл при посевной дозе, эквивалентной 2 г прессованных дрожжей при температуре 30 °С. Срок культивирования составлял 3 суток, в течение которых популяция грибов достигала стационарной фазы роста с проявлением начальных признаков деградации культуры, что было определено в предварительных экспериментах.

Отбор части популяции клеток для определения гидрофобности и измерение оптической плотности суспензии осуществляли на 1, 2 и 3 сутки культивирования. При этом для приостановления процесса брожения на суспензию воздействовали 0,5 %-ным раствором хлоргексидина. Затем клетки трижды отмывали центрифугированием при 1500 об/мин (Элекон ЦЛМН-Р10-0,1) в дистиллированной воде. Для последующих измерений полученную отмытую суспензию клеток дрожжей доводили до оптической плотности 0,50±0,05.

 

 

2.2   Определение концентрации дрожжей в жидких средах

 

 

Количество дрожжей на литр определяется на заводах хлебопекарной и бродильной промышленности. Это основной показатель, при помощи которого регулируют режим питания дрожжей в дрожжерастительных аппаратах [3, 28, 51].

Определение количества дрожжей, накопившихся в дрожжерастительном аппарате, по мутности при помощи прибора - нефелометра является наиболее быстрым и достоверным.

Прибор такого типа удобен. Фотоэлектрический микроколориметр -нефелометр (спектрофотометр Apel PD-303) является универсальным прибором, предназначенным для определения концентрации жидкостных окрашенных растворов, а также взвесей эмульсий и коллоидных растворов. Этот прибор объединяет в себе два прибора: колориметр и нефелометр.

В основу работы прибора положен принцип уравнивания интенсивности двух лучевых потоков при помощи переменной щелевой диафрагмы. Определение производится путем сравнивания лучистых потоков, проходящих через эталонную и испытуемую жидкость, или сравнивают с градуированной кривой   соответствующей набору растворов, известных концентраций [2, 56].

Методика работы. Определение производили в кюветах, имеющих расстояние между гранями 1 см. Прежде всего, необходимо построить градуировочную шкалу. Для этого приготавливают ряд взвесей прессованных дрожжей в воде. Материалом исследования служат дрожжи рода Saccharomyces cerevisiae. Взвеси готовят с таким расчетом, чтобы количество прессованных дрожжей с содержанием влаги 75 % соответствовало тем количествам дрожжей, которые имеются в дрожжерастительных аппаратах.

В мерную колбу на 100 мл добавили 1,000 г прессованных дрожжей, довели объем раствора до метки дистиллированной водой. В 9 мерных колб на 50 мл налили 1; 2; 3; 4; 5; 6; 8; 10; 12 мл раствора суспензии, полученного в колбе на 100 мл, довели до метки дистиллированной водой. Затем определили оптическую плотность D приготовленных растворов с помощью спектрофотометра. Работа проводилась в тройной повторности при λ = 582 нм. Раствор сравнения дистиллированная вода.

Концентрацию дрожжей в одном литре раствора вычисляли по формуле 2.1:

 

 

где - объем колбы 50 мл;

       - объем суспензии, взятый для разбавления, мл.

Результаты измерения оптической плотности и вычисленные концентрации дрожжей представлены в таблице 2.

 

Таблица 2 – Зависимость оптической плотности раствора от концентрации дрожжей

№ опыта	1	2	3
Концентрация дрожжей, (г/л)	Оптическая плотность	Оптическая плотность	Оптическая плотность
0,004	0,038	0,042	0,080
0,016	0,072	0,081	0,114
0,036	0,126	0,119	0,157
0,064	0,166	0,163	0,197
0,100	0,193	0,200	0,231
0,144	0,224	0,239	0,271

 

Продолжение таблицы 2

Концентрация дрожжей, (г/л)	Оптическая плотность	Оптическая плотность	Оптическая плотность
0,256	0,307	0,313	0,359
0,400	0,382	0,396	0,463
0,576	0,442	0,458	0,551

 

Затем производим построение градуировочного графика D = f (С), с учетом указанных разбавлений.

Рисунок 2.1 - График зависимости оптической плотности от концентрации дрожжей в 1 литре раствора

 

По построенной калибровочной кривой, можно определить количество дрожжей в любой суспензии.

 

 

2.3   Солевой агрегационный тест

 

 

Эта методика, описанная М. Линдалом и соавторами в 1981 г., основана на предпосылке, что одни и те же закономерности описывают осаждение молекул белка из водного раствора и агрегацию бактериальных клеток. Иными словами, чем больше гидрофобных клеток в исследуемой взвеси бактерий, тем в большей степени увеличивается скорость агрегации бактериальных клеток. По этой методике бактериальные клетки суспендировались в фосфатном буфере с добавлением сульфата аммония. Она в большем проценте случаев коррелирует с другими методами измерения гидрофобности. Но конфигурационные изменения на поверхности клетки, происходящие из-за высоких концентраций соли, могут привести к ошибкам измерения [54].

Провоцирование клеточной флокуляции происходит за счет повышения концентрации соли. Порядок концентраций сульфата аммония, при которой наблюдается преципитация клеток, есть мера их гидрофобности.

Реализация метода. Приготовили ряд разведений сульфата аммония в интервале концентраций от 0 М до 3 М с шагом от 0,2 до 0,4 М. На стекле смешали от 50 до 100 мкл взвеси микроорганизмов (около 10¹⁰ клеток в 1 мл или 10-кратный концентрат взвеси с 10 ед. оптической плотности по стандарту мутности) и эквивалентное количество раствора (NH₄)₂SO₄. Степень гидрофобности оценивали по минимальной концентрации сульфата аммония в смеси, вызывающей видимую глазом агглютинацию (агрегацию) микробных клеток, и выражли в единицах молярной концентрации сульфата аммония. Чем выше значение концентрации, тем ниже гидрофобность и, соответственно, выше гидрофильность исследуемых клеток.

 

 

2.4   Определения гидрофильно-липофильного баланса клеток

 

 

Для измерения степени гидрофобности поверхности дрожжевых клеток был применен принцип двухфазного разделения исследуемой взвеси в системе "жидкость-жидкость" с несмешивающимися водными фазами, обогащенными полиэтилен гликолем (PEG 6000) и декстраном (Т500) [32]. Конечные концентрации указанных компонентов в системе доводились до уровня 4,5 % декстрана и 6,2 % полиэтиленгликоля, что обеспечивало широкий диапазон чувствительности методики и средний уровень межфазного поверхностного натяжения. В качестве растворителя использовали 0,15 М раствор NaCl. При составлении системы учитывалась также конечная концентрация испытуемых дрожжей, которая была равна примерно 5´10⁹ клеток/мл. Эмульгирование смеси производили непосредственно после добавления в нее дрожжей путем интенсивного встряхивания при комнатной температуре на вортексе (около 2000 об/мин) в течение 120 секунд. Расслаивание осуществляли в два этапа: сначала мягким центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 минут, затем отстаиванием при комнатной температуре в течение 30 минут.

Оптические плотности верхней (обогащенной PEG6000, гидрофобной фазы) и нижней (обогащенной декстраном, гидрофильной фазы) фаз системы производили на спектрофотометр Apel PD-303 при длине волны 541 нм в 1-сантиметровой кювете. Оценку гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) поверхности испытуемых дрожжей осуществляли по формуле (2.2).

 

 

где D_PEG - оптическая плотность верхней фазы;

     D_Dextran - оптическая плотность нижней фазы системы после расслоения.

При ГЛБ > 0 наблюдаем высокую гидрофобность, т.е. концентрация исследуемых клеток в верхней фазе, обогащенной полиэтиленгликолем больше чем в нижней фазе. При ГЛБ = 0 концентрация клеток в обеих фазах практически одинакова, что соответствует умеренной гидрофобности. В случае если концентрация клеток в нижней фазе, обогащенной декстраном, больше чем в верхней фазе, ГЛБ < 0, что соответствует низкой гидрофобности.

 

 

2.5   Методика измерения контактного угла

 

 

Взаимодействие между молекулами жидкости и газа, твердого тела или нерастворимой в ней другой жидкости приводит к образованию поверхности раздела фаз (межфазные поверхности). Капля жидкости на столе имеет три поверхности раздела: жидкость – поверхность, жидкость – газ, газ - поверхность; форма капли зависит от свойств всех трех фаз. Метод лежащей капли (или контактного угла) – это оптическое определение краевого угла с целью установления характеристик смачивания на локальном участке поверхности твердого тела.

Контактный угол θ – это угол между каплей жидкости и твердой поверхностью, на которую она нанесена. Установлена корреляционная связь величины кон­тактного угла, образованного каплей водно-солевого раствора и по­верхностью монослоя эукариотических и прокариотических клеток, со степенью гидрофобности этих клеток. Чем больше величина угла, тем выше степень гидрофобности.

Методика измерения контактного угла, позволяет оценить свободную энергию поверхности клеток и применялась для изучения фагоцитоза [45] и адгезии клеток к твердым субстратам [21]. Причем наиболее подходящим для этих целей, по мнению большинства исследова­телей, является получение серии контактных углов со сходными жидкостями, имеющими разное поверхностное натяжение.

В наших экспериментах применен вариант метода, использующий сухие пленки дрожжевых клеток (более 200 образцов), нанесенных на поверхность покровных стекол (16×16 мм). Стандартизация количества клеток реализована за счет одинакового объема (1 мл) нанесенной на стекло суспензии дрожжевых клеток с одинаковой оптической плотностью (0,50±0,05). Предварительно высушенные до постоянной массы (от 5 до 7 суток при 37 °С) стекла помещались в стеклянную кювету, наполненную ксилолом, предварительно насыщенным водой.

С помощью автоматического микродозатора на испытуемую поверхность клеток наносили каплю дистиллированной воды объемом 10 мкл. Через 50-60 секунд (период стабилизации капли) производили фотографирование объекта (Nikon D7000, объектив Гелиос 44-2, ФР = 50 мм, комплект насадок для макросъемки, примерное увеличение 1:1). На рисунке 2.2 представлена капля дистиллированной воды, нанесенной на поверхность пленки.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рисунок 2.2 – Капля дистиллированной воды, нанесенной на поверхность пленки дрожжей рода Saccharomyces

 

Для определения краевого контактного угла θ использовали геометрическое построение, отраженное на рисунке 2.3. Представляли изображенную каплю как круговой сегмент (допущение). Строили окружность и совмещали ее с контуром капли.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рисунок 2.3 – Изображение окружности, совмещенной с контуром капли

Т.к. на рисунке 2.4 ∆ АВС ~ ∆ АВО по первому признаку подобия треугольников (равенство двух углов), следовательно, углы θ и α равны. Определили угол α. В данной работе было произведено свыше 180 измерений контактного краевого угла.

 

 

Рисунок 2.4 – Геометрическое изображение капли лежащей на поверхности пленки

 

Таким образом, в работе нами использовано три основных метода измерения гидрофобности, основанные на трех различных принципах измерения и физических феноменах: солевой     агрегационный тест, метод межфазного разделения и метод определения контактного угла.

3          Результаты исследования

 

3.1 Солевой агрегационный тест

 

 

Солевой агрегационный тест относится к разряду достаточно простых методов для определения поверхностной гидрофобности. Готовят ряд разведений сульфата аммония. На стекле смешивают взвеси дрожжей и эквивалентное количество раствора (NH₄)₂SO₄, как показано на схеме 3.1. Фактически, тест «высаливания» связан с изменением концентрации сульфата аммония, позволяющего при нормальных условиях и в зависимости от поверхностной энергии приводить к агрегации клеток.

Концентрация (NH4)2SO4	0,5 М	1,0 М	2,0 М	3,0 М
Сульфат      аммония   дрожжи
Готовая Суспензия

 

Рисунок 3.1 – Схема солевого агрегационного метода

 

Она в большем проценте случаев коррелирует с другими методами измерения гидрофобности. Но конфигурационные изменения на поверхности клетки, происходящие из-за высоких концентраций соли, могут привести к ошибкам измерения.

Метод относится к недостаточно чувствительным и может использоваться для обнаружения высоко гидрофобных микроорганизмов. Конфигурационные изменения на поверхности клетки, происходящие из-за высоких концентраций соли, могут привести к ошибкам измерения.

В дополнение к сомнительному измерению гидрофобности, ассоциаты клеток могут изменяться из-за сил электростатического отталкивания. Этот метод не позволяет точно измерить гидрофобность клеточной поверхности.

Результаты, полученные при применении солевого агрегационного теста на нативных дрожжевых клетках, указывают на высокую степень сродства их поверхности к молекулам воды (высокая гидрофильность). Это обстоятельство делало практически невозможным и/или неинформативным определение гидрофобности клеток сахаромицетов данным методом. Агрегация нативных клеток наблюдалась не во всех случаях и лишь при предельно высоких концентрациях сульфата аммония (от 2,5 до 3 М). Многократное повторение измерений с использованием диапазона концентраций сульфата аммония от 0 до 3 М показало крайне неустойчивые результаты.

Сделан вывод о неприменимости данного метода для определения гидрофобности клеток микроскопических грибов.

 

 

3.2   Разделение в двухфазной системе ПЭГ-Декстран

 

 

На сегодня этот метод является наиболее подходящим для измерения гидрофобности макромолекул и бактериальных клеток. Он позволяет не только определить свободную энергию клеток, но и количественно ее измерить (имея информацию о свойствах компонентов двухфазной системы).

Разделение клеток в двухфазной системе, как показано на схеме 3.1, происходит с формированием трех фрак­ций: первая – клетки или частицы в верхней фазе, гидрофобная фракция, с высокой поверхностной энергией; вторая – клетки или частицы в нижней фазе, гидрофильная фракция, с низкой поверхностной энергией; третья – клетки или частицы в межфазном пространстве, фракция с промежуточ­ным значением поверхностной энергии.

 

Рисунок 3.2 – Схема метода межфазного разделения (в сопоставлении с методом контактного угла)

С помощью этого метода можно также измерять поверхностный заряд частиц, варьируя состав или концентра­цию солей в системах с неизменной концентрацией полимеров. Одна из возможных проблем, связанная с этой методикой состоит в том, что часть клеток может остаться в межфазном пространстве, тем самым усложняя интерпретацию полученных результатов. Тем не менее, эта методика может рассматриваться как относительно щадящая клетки, так как сохраняет их жизнеспособными и избегает использования высоких концентраций солей или органических растворителей.

Одним из преимуществ этой методики перед другими является возможность измерять как полярные, так и неполярные взаимодействия «клетка – клетка». Смешиванием этих двух полимеров можно получить ряд растворов с разным поверхностным натя­жением. Второе преимущество бифазных систем водных поли­меров заключается в очень низком межфазном натяжении. Нет согласия, среди исследователей относительно единой шкалы гидрофобности. Про­блема в основном связана с фактом, что гидрофобность есть ин­тегральный показатель поверхности клеток и может быть изме­рена не напрямую, а через явления, которые отражают природу межмолекулярных взаимодействий. Тогда как различные методы измерения гидрофобности, описываемые в литературе, используют при этом разные параметры. На межфазное натяжение оказывает влияние и присутствие солей. В основном это связано с присутствием солей кальция и магния. Этим ве­роятно можно объяснить результаты неудачных опытов по распределению клеток в двухфазных системах.

Использование метода разделения в двухфазной системе ПЭГ-Декстран для определения гидрофобности дрожжевых клеток показало слабую воспроизводимость получаемых результатов. Причиной этого явились размеры и масса испытуемых клеток, существенно превышающие размеры и массу бактериальных клеток (диаметр от 0,5 до 5,0 мкм), что на фоне высокой гидрофильности дрожжей приводило к крайней нестабильности суспензии клеток в расслаивающейся системе растворов ПЭГ-Декстран. Большая часть клеток концентрировалась на границе фаз, значительная часть при этом концентрировалась в гидрофильной «декстрановой» фазе. Как результат, ничтожная часть клеток концентрировалась в верхней «полиэтиленгликолевой» фазе, причем концентрация клеток в этой фазе была чрезвычайно нестабильна при повторных измерениях, что приводило к большому разбросу получаемых результатов измерений.

Сделан вывод о неприменимости данного метода для измерения гидрофобности клеток микроскопических грибов.

 

 

3.3   Контактный угол

 

 

Метод контактного угла относится к сложным методам, требующим соблюдения определенных режимов при измерении. Модификация метода с использованием двух несмешивающихся жидкостей при измерении краевых уг­лов требует наличия подходящих камер для образцов. В то же время методика обладает также высокой производительностью и технологичностью.

Одним из преимущества метода является не чувствительность к размерам и массе клеток, а также возможность измерять гидрофобные взаимодействия в различных средах в широком диапазоне.

Данная работа была выполнена в рамках исследований проводимых совместно со старшим лаборантом кафедры пищевой биотехнологии ОГУ Клиниченко Е. В.

При изучении изменения гидрофобности дрожжей в процессе роста периодической культуры показано изменение этого параметра. На рисунке 3.3 изображена капля дистиллированной воды, нанесенная на пленку в различные сутки культивирования.

 

а

б

в

 

Рисунок 3.3 – Изображение капли воды на поверхности пленки в первые (а), вторые (б) и третьи (в) сутки культивирования дрожжей

 

При этом контактный краевой угол составил через сутки культивирования (фаза экспоненциального роста) – (88,1 ± 1,9)°, на 2-е сутки (фаза стационарного роста) - (99,1 ± 1,1)°, на 3-и сутки (поздняя стационарная фаза) – (92,4 ± 1,0)°. Иллюстрация полученных результатов приведена на рисунке 3.4.

 

 

 

 

 

 

Рисунок 3.4 – График изменения величины контактного краевого угла (гидрофобности) в зависимости от времени культивирования дрожжей

 

Полученные результаты свидетельствуют об изменении поверхностных свойств дрожжевых клеток в связи с фазами роста популяции, что может быть связано с изменениями метаболической активности по мере развития (старения) клеток.

 

Заключение

 

 

Гидрофобность клеток, как интегральный показатель отражающий состояние поверхности клеток микроорганизма, значительно варьирует в зависимости от количества гидрофобных структур, на число и конформационные изменения которых могут оказывать регулирующее влияние, как различные антибиотические вещества, так и условия культивирования клеток.

Явление гидрофобности имеет важное значение в процессах адгезии к фагоцитам и прилипание к эпителиальным клеткам, которые в целом соответствуют двум стратегиям выживания микроорганизмов в организме с точки зрения поверхностных явлений.

Разработаны различные методические подходы для определения гидрофобности клеток микроорганизмов, основанные на различных физико-химических принципах.

Методы, основанные на адгезии микроорганизмов к различным субстратам:

• хроматографический метод;
• адгезия к углеводородам;
• адгезия на твердых поверхностях.

Хроматографический метод, применяемый в биохимии для разделения белка, используется для определения бактериальной гидрофобности.

В нефтяной промышленности широко применяется метод, основанный на адгезии микроорганизмов к жидким углеводородам, в качестве которых используют гексадекан и ксилол.

Метод, основанный на явлении конкуренции за молекулы воды между исследуемыми клетками и электролитом:

• солевой агрегационный тест.

Методы, основные на визуализации процесса взаимодействия воды с исследуемой взвесью микроорганизмов:

• метод контактного краевого угла;
• метод Ребиндера (максимального давления в пузырьке воздуха);
• метод падающей капли;
• капиллярные методы.

Метод, основанный на разделении взвеси микроорганизмов в двухфазной системе ПЭГ-Декстран:

• метод межфазного разделения.

Данные методы широко применяются для определения бактериальной гидрофобности, но недостаточно изучены в плане применимости по отношению к клеткам микроскопических грибов.

Грибы - большая гетерогенная группа гетеротрофных микроорганизмов, одноклеточных или многоклеточных, среди которых есть сапрофиты, симбионты, паразиты растений и животных. Для микроскопических грибов характерны крупные размеры клеток (от 1 до 50 мкм), наличие толстой клеточной стенки, образование агрегатов, рост и размножение с большой скоростью. Относительно радиорезистентны, а также малочувствительны к умеренному УФ- и рентгеновскому излучению.

Грибы — одни из важнейших объектов биотехнологии, применяемые для производства антибиотиков и других лекарственных средств, некоторых химических веществ, используемые в пищевой промышленности и в технических целях.

В настоящее время значительное внимание уделяется изучению поверхностных свойств микроскопических грибов, что связано с высокой распространенностью грибов-симбионтов, паразитирующих на поверхностях слизистых и кожи человека, вызывающих при определенных условиях различные заболевания.

В данной работе для определения гидрофобности поверхности микроскопических грибов были применены следующие методы:

• солевой агрегационный метод;
• метод межфазного разделения;
• метод контактного краевого угла.

Солевой агрегационный тест является достаточно простым методом определения поверхностной гидрофобности. В то же время относится к недостаточно чувствительным и может использоваться для обнаружения высоко гидрофобных микроорганизмов. Неприменимость методики выражался в невозможности измерения относительно низких значений гидрофобности (характерных для пекарских дрожжей) и, как следствие, в высоких (предельных) концентрациях сульфата аммония, необходимых для агрегации клеток Saccharomyces cerevisiae.

Метод межфазного разделения на сегодня является наиболее подходящим для измерения гидрофобности макромолекул и бактериальных клеток. Он позволяет не только определить свободную энергию клеток, но и количественно ее измерить (имея информацию о свойствах компонентов двухфазной системы).

Неприменимость данной методики заключался невозможностью измерения степени распределения клеток дрожжей между фазами, что обусловлено их относительно большими размерами и массой, которые в свою очередь привели к выпадению осадка клеток до полного расслоения двухфазной системы.

По данным проведенного исследования наиболее эффективным методом определения гидрофобности, применяемый по отношению к клеткам микроскопических грибов, является метод контактного краевого угла.

Одним из преимуществ метода является не чувствительность к размерам и массе клеток, а также возможность измерять гидрофобные взаимодействия в различных средах в широком диапазоне.

Полученные результаты свидетельствуют об изменении поверхностных свойств дрожжевых клеток в связи с фазами роста популяции, что может быть связано с изменениями метаболической активности по мере развития (старения) клеток.

Таким образом, цель данного исследования достигнута, поставленные задачи, связанные с апробированием методов определения гидрофобности поверхности микроскопических грибов, выполнены:

• рассмотрены теоретические основы поверхностной гидрофобности;
• изучены особенности методов определения гидрофобности микроорганизмов, основанные на различных физико-химических принципах;
• дана характеристика микроскопическим грибам;
• апробированы наиболее распространенные методы определения гидрофобности поверхности микроорганизмов на клетках грибов рода Saccharomyces;
• сделан вывод о наибольшей применимости метода определения поверхностной гидрофобности микроскопических грибов основанного на измерении контактного краевого угла (угол между каплей жидкости и твердой поверхностью, на которую она нанесена).

Широкое применение метода контактного угла в биохимии, медицине, пищевой биотехнологии и других областях обусловлено высокой производительностью и технологичностью.

Перспектива использования методики связана с развитием исследований физико-химических свойств дрожжей, проводимых на кафедре пищевой биотехнологии ОГУ.

Полученные результаты могут успешно использоваться в прикладной и экспериментальной биотехнологии при определении качества и возраста процессов брожения, вызванных микроскопическими грибами.

 

 

 

Список использованных источников

 

 

• Асонов, Н. Р. Микробиология / Н. Р. Асоноев. – М.: Агромпромиздат, 1989. – 350 с.
• Афанасьев, О. В. Микробиология: контроль хлебопекарного производства / О. В. Афанасьев. – М.: Пищевая промышленность, 1976. – 131 с.
• Бабаева, И. П. Методы выделения и идентификации дрожжей / И. П. Бабаева, В. И. Голубев. – М.: Пищевая промышленность, 1979. – 120 с.
• Браун, Е. Дж. Иммунология: в 3 т: пер. с англ. / Е. Дж. Браун,  К. А. Джойнер. – М.: Мир, 1987. – Т. 3: Комплемент. – 503 с.
• Брилис, В.И. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов / Т. А. Брилене, Х. П. Ленцнер, А. А. Ленцнер. // Лаб. дело.– 1986.– №4. – С. 210-212.
• Брудастов, Ю. А. Антикомплементарная активность бактерий: автореф. дис. … канд. мед. наук / Ю. А. Брудастов. - Челябинск, 1992. - 21 с.
• Воробьев, А. А. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии: учебник / А. А. Воробьева, А. С. Быкова. - М.: Медицинское информационное агентство, 2003. – 236 с. - ISBN 5-89481-136-8.
• Воробьев, А. А. Микробиология и иммунология: учебник / А. А. Воробьева. - М.: Медицина, 2000. – 464 с.- ISBN 5-225-04208-2.
• Геннис, Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функции: пер. с англ. – М.: Мир, 1997. – 624 с. - ISBN 5-03-002419-0.
• Герхарда, Ф. Методы общей бактериологии: пер. с англ. / Ф. Герхарда. – М.: Мир, 1983.- 482 с.
• Гусев, М. В. Микробиология / М. В. Гусев.- М.: Издательский центр «Академия», 2003. – 464 с. - ISBN 5-7695-1403-5.
• Джерсон, Д. Применение методов физики поверхностей в иммунологии / Д. Джерсон. // Иммунология. Методы исследования: пер. с англ. – М.: Мир, 1983. – №5. – С.122-158.
• Домарадский, И. В. О взаимоотношениях эпителиальных клеток слизистых оболочек с микробами – внутриклеточными паразитами / И. В. Домарадский, В. Н. Бабин. // Мед. паразитол. – 1996. – №4. – С. 3-8.
• Дудка, И. А. Справочник миколога и грибника / И.А. Дудка,      С. П. Вассер. - К.: Наукова думка, 1987. – 532 с.
• Егорова, Н. С. Практикум по микробиологии / Н. С. Егорова. – М.: Изд. МГУ, 1976. – 307 с.
• Езепчук, Ю. В. Патогенность как функция биомолекул / Ю. В. Езепчук. – М.: Медицина: АМН CCCP, 1985. – 240 с.
• Елинова, Н.П. Химическая микробиология: учебник / Н.П. Елинова. – М.: Высш. шк., 1989. – 448 с. - ISBN 5-06-000089-3.
• Жвирблянская, А. Ю. Дрожжи в пивоварении / А. Ю. Жвирблянская, В. С. Исаева. – М.: Изд. АН СССР, 1963. – 112 с.
• Иродов, И. Е. Физика макросистем. Основные законы / И. Е. Иродов. – М.: Высш.шк., 1991.- 285 с. - ISBN 5-81302-026-3.
• Карпова, Г. В. Микробиология: методические указания / Г. В Карпова. – Оренбург: ОГУ, 2001. – 47 с.
• Касаткина, И. Л. Репетитор по физике. Теория: Механика. Молекулярная физика. Термодинамика. Электромагнетизм / И. Л. Касаткина. – Ростов н/Д: изд-во «Феникс», 2005. – 608 с. - ISBN 5-222-05832-8.
• Колешко, О.И. Микробиология с основами вирусологии: учебник / Колешко О.И., Завезенова Т.В. – Иркутск: Изд-во Иркут. Ун-та, 2003. – 452 с. - ISBN 5-7430-0094-8.
• Кузник, Б. И. Иммуногенез, гемостаз и неспецифическая резистентность организма / Б. И. Кузник, Н. В. Васильев, Н. Н. Цыбиков. – М.: Медицина, 1989. – 157 с.
• Кэбот, Е. Экспериментальная иммунохимия: пер. с англ. / Е. Кэбот, М. Мейер. – М.: Мир, 1968. – 246 с.
• Лакин, Г. Ф. Биометрия / Г. Ф. Лакин. – М.: Высш. шк., 1990. – 352 с.
• Ли, Э. Спиртные напитки: особенности брожения и производства: пер. с англ. / Э. Ли, Дж. Пигготт. – СПб.: Профессия, 2006. – 552 с. - ISBN 5-93913-086-0.
• Лисовская, С. А. Адгезия и антигенные характеристики штаммов Candida albicans при поверхностных кандидозах / С. А. Лисовская. // Успехи медицинской микологии. – М.: Нац. академия микологии, 2006. – №7. –        С. 119-121.
• Маянский, А. Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге / А. Н. Маянский, Д. Н. Маянский. – Новосибирск: Наука, 1989. – 344 с.
• Мишустин, Е. Н. Микробиология / Е. Н. Мишустин, В. Т. Елиев. – М.: Колос, 1985. – 246 с.
• Мюллер, Г. Микробиология пищевых продуктов / Г. Мюллер,    П. Литц, Т. Д. Минх. – М.: Пищевая промышленность, 1977. – 246 с.
• Мюллер, Э. Микология: пер. с нем. / Э. Мюллер. - М.: Мир, 1995. – 343 с. - ISBN 5-03-002999-0.
• Петров, Р.В. Клеточные мембраны и иммунитет: учеб. пособие / Р.В. Петров. – М.: Высш. шк., 1991. – 144 с. - ISBN 5-06-000647-6.
• Поздеев, О. К. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В. И. Покровского. - М.: Гэотар-мед, 2001. – 736 с. - ISBN 2-70620-022-1.
• Поляков, В. А. Теоретические и практические аспекты развития спиртовой, ликероводочной, ферментной, дрожжевой и уксусной отраслей промышленности / В. А. Поляков, Л. В. Римарева. – М.: ВНИИПБТ, 2006. – 307 с.
• Ревин, В.В. Биофизика: учебник / В.В. Ревин. – Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2002 с. – 156 с. - ISBN 5-7103-0719-Х.
• Ремизов, А. Н. Медицинская и биологическая физика: учеб. для вузов / А. Н. Ремизов. – М.: Дрофа, 2005. – 558 с. - ISBN 5-7107-9844-4.
• Родионов, А.Н. Грибковые заболевания кожи / А. Н. Родионов. - СПб.: Питер, 1998. – 230 с.
• Рубин, А.Б. Биофизика: учебник в 2 ч. / А. Б. Рубин. - М.: Высш. школа, 1987. - Ч. 2: Биофизика клеточных процессов. - 303 с. – ISBN 5-17-0132-6.
• Савельев, И. В. Курс общей физики: в 3 т. / И. В. Савельев. – М.: Наука, 1987. – Т. 2: Механика, молекулярная физика. – 504 с. - ISBN 5-11-0538-2.
• Самцов, А. В. Кожные и венерические болезни / А. В. Самцов. - СПб. : Элби, 2002. – 365 с.
• Саришвии, Н. Г. Микробиологические основы технологии шампанизации вина / Н. Г. Саришвии, Б. Б. Рейтблат. – М.: Пищевая промышленность, 2000. – 364 с. - ISBN 5-89703-025-1.
• Сергеев, А. Ю. Грибковые инфекции: рук-во для врачей / А. Ю. Сергеев, Ю. В. Сергеев. – М.: Бином, 2004. – 185 с.
• Сивухин, Д. В. Общий курс физики: в 5 т. / Д. В. Сивухин. – М.: Наука, 2005. – Т. 2: Термодинамика и молекулярная физика.– 576 с. - ISBN 5-09-1133-3.
• Скрипкин, Ю.К. Кожные и венерические болезни: руководство для врачей / Ю. К. Скрипкин. – М.: Медицина, 1999. – 295 с.
• Смирнов, К. К. Исследование поверхностной гетерогенности популяций энтеробактерий: дис. … канд. биол. наук. – Иваново, 1984. – 232 с.
• Смирнова В. В. Стафилококк: биологически активные субстанции, иммунный ответ на антигены / В. В. Смирнова, А. Е. Вершигор. – Киев: Hаукова думка, 1988. – 248 с.
• Соболев, А. В. Роль грибов Malassezia furfur при атопическом дерматозе / А. В. Соболев. // Микробиология. – 2001. - №3. – С. 112-115.
• Суколин, Г. И. История и эпидемиология основных видов гриба рода Candida / Г. И. Суколин. // Успехи медицинской микологии. – М.: Нац. академия микологии. – 2006. – С. 13-15.
• Теппер, Е. З. Практикум по микробиологии / Е. З. Теппер,          В. К. Шильникова. – М.: Колос, 1979. – 216 с. - ISBN 5-901705-08-4.
• Фельдман, Ю. М. Количественное определение бактерий в клинических материалах / Ю. М. Фельдман, Л. Г. Маханева, А. В. Шапиро. // Лаб. дело. – 1984. – №10. – С. 616 - 619.
• Фримель, Г. Иммунологические методы / Г. Фримель. – М.: Медицина, 1987. – 472 с.
• Ханис, А. Ю. Иммуномодулирующие свойства натриевой соли    рибонуклеиновой кислоты, получаемой из дрожжей Saccharomyces cerevisiae / А. Ю. Ханис. // Успехи медицинской микологии. – М.: Нац. академия микологии, 2006. – С. 59-61.
• Шлегель, Г. Общая микробиология: пер. с нем. / Г. Шлегель. - М.: Мир, 1987. - 567с.
• Яровенко, В. Л. Технология спирта / В. Л. Яровенко, В. А. Маринченко, В. А. Смирнов. – М.: Колос, 2002. – 465 с. - ISBN 5-10-003574-9.
• Absolom, D. R. Surface thermodynamics of Phagocytic ingestion of non-opsonized bacteria by granulocytes in liquids of different surface tensions / D. R. Absolom, C. J Van Oss, W. Zingg, A. W. Neumann. // Cell biophysics. - 1982. - Vol. 31. - P. 59-70.
• Monger, B. C. Feeding selection of heterotrophic marine nanoflagellates based on the surface hydrophobicity of their picoplankton prey / C. Monger. // Limnol. oceanogr. – 1999. - Vol. 44. – P. 1917–1927.
• Otterstedt, K. Switching the mode of metabolism in the yeast Saccharomyces cerevisiae / K. Otterstedt, C. Larsson. // EMBO reports. – 2004. – Vol. 5. – P. 532-537.
• Zara, S. FLO11-based model for air-liquid interfacial biofilm formation by Saccharomyces cerevisiae / S. Zara, G. Zara, A. T. Bakalinsky. // Applied and environmental microbiology. – 2005. - 72. – P. 2934-2939.

 

 

1) Адгезия - способность сцепления двух разнородных тел на молекулярном уровне.

2) Фагоцитоз - процесс активного захватывания и поглощения живых и неживых частиц одноклеточными организмами или особыми клетками (фагоцитами) многоклеточных животных организмов.

3) Прокариоты (от греч. pro — перед, и karyon — ядро), одноклеточные живые организмы, не обладающие (в отличие от эукариот) оформленным клеточным ядром (безъядерные).

4) Эукариоты (от греч. eu — хорошо, полностью и karyon — ядро), организмы, клетки которых содержат оформленные ядра (ядерные).

1) Агрегация (лат. aggregatio — присоединение) — процесс объединения элементов в одну систему.

2) Сольватация (от лат. solvo — растворяю) — электростатическое взаимодействие между частицами (ионами, молекулами) растворенного вещества и растворителя. 

1) salting-out - высаливание.

1) Ингибиторы (от лат. inhibeo — останавливаю, сдерживаю) в биологии и медицине - природные и синтетические вещества, угнетающие активность ферментов (как в живом организме, так и в бесклеточных системах).

1) Совокупность организмов – популяций растений, животных, грибов, микроорганизмов, населяющих однородный участок суши или водоёма и характеризующихся определёнными взаимоотношениями (пищевые цепи, симбиоз и т. д.) и приспособленностью к условиям окружающей среды.

2) Чистая культура определенного вида микроорганизма, у которого изучены морфологические и физиологические особенности.

1) Персистенция — (от лат. persistere — оставаться, упорствовать) способность патогенных видов микроорганизмов к длительному выживанию в организме хозяина.

1) Агар - продукт (смесь полисахаридов агарозы и агаропектина), получаемый путем экстрагирования из красных (филофора) и бурых водорослей и образующий в водных растворах плотный студень.

1) Супернатант - жидкая фаза, остающаяся после того, как нерастворимые вещества осаждаются в процессе центрифугирования или осаждения.

1) Флоккуляция (от лат. flocculi – клочья, хлопья), вид коагуляции, при которой мелкие частицы, находящиеся во взвешенном состоянии в жидкой или газовой среде, образуют рыхлые хлопьевидные скопления (флоккулы).

2) Преципитация (лат. praecipilo, praecipitatum - стремительно падать) — осаждение, выпадение в осадок.

1) Хаотропные агенты - вещества, разрушающие трехмерную структуру клеточных макромолекул.

1) Агглютинаты - осадок, образующийся в процессе агглютинации (склеивание и выпадение в осадок микробов, эритроцитов и др. клеточных элементов).

1) Гликокаликс - обогащенная углеводами периферическая зона на поверхности большинства эукариотических клеток (клеточная оболочка).

1) Аэробы - (от греч. аer – воздух и bios — жизнь), организмы, обладающие аэробным типом дыхания, т. е. способные жить и развиваться только при наличии свободного кислорода.

1) Ассимиляция (от латинского assimilatio) - усвоение питательных веществ живыми организмами, их превращение в результате биохимической реакций в структурные части клеток и тканей.

2) Тропизм (от греч. tropos — поворот, направление) - реакция ориентирования клетки, то есть направление роста или движения клеток относительно раздражителя (химического, светового и др.).

 

Скачать: gotovyy-diplom.docx