ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

Эффективность комплексного применения антибиотиков и пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus при лечении экспериментальной инфекции

 

Содержание

Введение…………………………………………………………………………...6

1 Возможности антибиотико- и пробиотикотерапии инфекционных заболеваний желудочно-кишечного тракта ……………………………7

• Общие представления о сальмонеллезной инфекции………………………7

1.1.1 Этиология и эпидемиология сальмонеллезной инфекции

1.1.2 Патогенез

1.1.3 Клинические признаки

1.1.4 Диагностика сальмонеллеза

1.2 Применение антибиотиков при инфекционных заболеваниях. 10

1.3 Применение пробиотиков при профилактике и лечении инфекционных заболеваний  14

1.4 Эффективность и перспективы совместного применения антибиотиков и пробиотиков  20

2. Материалы и методы исследований……………………………………………24

2.1 Микроорганизмы, используемые в экспериментах. 24

2.2 Органы и ткани лабораторных крыс, используемые в эксперименте in vivo. 27

2.3 Методы определения антибиотикорезистентности бактерий рода Bacillus, входящих в состав пробиотиков

2.3.1 Метод определения антибиотикорезистентности бактерий рода Bacillus с применением тест-систем «Bio Merieux». 27

2.3.2 Диско-диффузионный метод определения антибиотикорезистентности бактерий рода Bacillus 28

2.3.3 Метод последовательных разведений. 29

2.4 Методы определения влияния комплексного применения антибиотиков и пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus на течение сальмонеллезной инфекции in vivo. 30

2.4.1 Определение колонии образующих единиц. 30

2.4.2 Методы общего морфологического и биохимического анализа крови. 31

2.4.3 Гистологический метод исследования органов и тканей лабораторных крыс  32

2.5 Схема исследования эффективности совместного применения пробиотиков с антибиотиками при лечении сальмонеллеза. 32

3 Результаты изучения эффективности совместного применения пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus с антибиотиками при лечении сальмонеллезной инфекции……………………………………………............33

3.1 Изучение антибиотикорезистентности бактерий рода Bacillus 33

3.2 Определение антибиотикорезистентности бактерий рода Bacillus диско-диффузионным методом. 41

3.3 Определение колонии образующих единиц в экскрементах лабораторных животных. 44

3.4 Морфологический и биохимический анализ крови лабораторных животных ……………………………………………………………………….47

3.5 Гистологическое исследование органов - мишеней лабораторных крыс

Заключение

Список использованных источников…………………………………………...49

Приложение А ………………………….……...……………………53

Приложение Б Диаметр гемокаппиляров крипт и ворсинок тонкого отдела кишечника лабораторных крыс …….…..………… ……………54

Приложение В Диаметр ворсинок и энтероцитов ворсинок тонкого отдела кишечника лабораторных крыс…………………………………

Приложение Г Диаметр ядер энтероцитов ворсинок и крипт тонкого отдела кишечника лабораторных крыс…………………………………………………

Приложение Д Диаметр энтероцитов крипт и ядер энтероцитов крипт……

Приложение Е Отношение красной пульпы к белой и диаметр мальпигиевых тел селезенки………………………………………………………………………

Приложение Ж Диаметр трабекулы и эксцентричной артерии селезенки лабораторных крыс………………………………………………………………

Приложение З Толщина капсулы селезенки лабораторных крыс……………

 

 

Аннотация

 

 

Дипломная работа состоит из 72 страниц печатного текста, включая 9 таблиц, 12 рисунков, 8 приложений. При написании было использовано 52 источника литературы.

Работа соответствует логике изложения научного материала и состоит из введения, трех глав, заключения и списка использованных источников.

В данной работе рассмотрен вопрос об антибиотикочувствительности бактерий рода Bacillus, входящих в состав пробиотиков, в условиях in vitro и эффективность комплексного применения антибиотиков и пробиотиков in vivo.

Установлены группы антибиотиков, к которым изучаемые бактерии рода Bacillus, а также тест-организм Salmonella interitidis обладают чувствительностью и устойчивостью. Определены комплексы антибиотиков с пробиотиками, которые могут эффективно применяться для лечения сальмонеллезной инфекции in vivo.

 

 

 

 

The summary

 

 

The thesis consists of 72 pages of the printing text, including 9 tables, 12 drawings, 8 appendices. At a writing 52 sources of the literature have been used.

Work corresponds to logic of a statement of a scientific material and consists of the introduction, three heads, the conclusion and the list of the used sources.

In the given work the question on sensitivity to antibiotics of bacteria of sort Bacillus which is a part probiotik, in conditions in vitro and efficiency of complex application of antibiotics and probiotik in vivo is considered.

Groups of antibiotics to which studied bacteria of sort Bacillus, and also test organism Salmonella interitidis possess sensitivity and stability are established. Complexes of antibiotics with probiotik which can effectively be applied to treatment of the infection caused Sallmonella interitidis in vivo are defined.

 

 

Введение

 

На протяжении многих столетий инфекционные заболевания занимали основное место в патологии людей и нередко приводили к массовой гибели населения. В дореволюционной России миллионы людей ежегодно заболевали разными инфекционными болезнями, не было года, свободного от эпидемий. Инфекционные болезни являлись главной причиной детской смертности и общей смертности населения, наносили огромный ущерб населению, экономике страны тем, что часто оставляли тяжелые и необратимые последствия. Десятки тысяч людей становились слепыми после натуральной оспы, глухими, глухонемыми после скарлатины, имели стойкие парезы и параличи после менингита и полиомиелита [1, 2].

Возбудители инфекционных заболеваний под воздействием многочисленных факторов подверглись эволюции, в результате чего появлялись новые формы инфекционных заболеваний, с изменением этиологии, особенности патогенеза и клиники.

Инфекционные болезни – это обширная группа заболеваний, вызываемых патогенным возбудителем. В отличие от других заболеваний инфекционные болезни могут передаваться от зараженного человека или животного здоровому (контагиозность), характерна специфичностью возбудителя, цикличность течения и формирование в процессе болезни иммунитета. Инфекционные заболевания способны к массовому (эпидемическому) распространению [3].

Особое место занимают инфекционные поражения желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Инфекционные заболевания ЖКТ вызываются главным образом различными патогенными или условно-патогенными микроорганизмами, вирулентные и токсигенные свойства которых определяют особенности патогенеза. Кроме того, поражение ЖКТ может быть вызвано некоторыми протозоа и вирусами. Общим для этой группы инфекций является орально-фекальный путь заражения (через пищу, воду, контактно-бытовым путем – “болезни грязных рук”). Входные ворота инфекции – ЖКТ, основные формы заболевания – гастроэнтерит, энтероколит, колит, гастроэнтероколит или гастрит. При тяжелых формах инфекции (в том числе на фоне иммунодефицитных состояний) могут иметь место токсинемия или бактериемия, реже – септицемия или септикопиемия. Учитывая особенности возбудителей инфекций, патогенез, характер течения и тяжесть процесса, определяющие тактику терапии, каждое заболевание в зависимости от этиологии следует рассматривать отдельно. К кишечным инфекциям, учитывая путь инфицирования и поражение тонкой кишки, обычно относят брюшной тиф и паратифы. При этих заболеваниях на фоне поражения кишечника и инвазии в кровь возбудителя развивается тяжелый генерализованный инфекционный процесс с бактериемией и интоксикацией. Высвобождающийся после гибели сальмонелл эндотоксин оказывает нейротропное действие, вызывает дистрофические изменения в миокарде, повреждает костный мозг. Генерализация процесса с поражением внутренних органов происходит при осложненных формах амебной дизентерии (амебный гепатит, абсцесс печени, поражение центральной нервной системы) [4-6].

В настоящее время антибактериальные средства являются одной из наиболее широко применяемых групп препаратов в химиотерапии инфекционных заболеваний. Они являются главным классом лекарственных средств, но с появлением резистентных штаммов микроорганизмов активность многих антибиотиков снижается, либо не оказывает никакого влияния. В этой связи альтернативным подходом является использование не самих антибиотиков, а их штаммов-продуцентов – пробиотиков, препаратов из живых микробных культур, проявляющих собственно антагонистическую активность против микроорганизмов. Пробиотики стали активно применяться в конце ХХ века. Широкое распространение получили пробиотические препараты бацилл, обладающие антагонистической активностью в отношении широкого круга патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

В связи со снижением эффективности антибиотиков и химиопрепаратов, а также невысокой эффективности действия пробиотиков в настоящее время чрезвычайно актуальным является сочетанное применение антибиотических и пробиотических препаратов.

Исходя из выше перечисленного перед нами была поставлена следующая цель исследования: определение эффективности совместного применения пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus с антибиотиками при лечении сальмонеллезной инфекции.

Для достижения поставленной цели нами были определены следующие задачи:

1) Изучить антибиотикорезистентность бактерий рода Bacillus и Salmonella enteritidis, используемой в качестве лабораторной инфекции in vitro.

2) Определить эффективность лечения сальмонеллезной инфекции с применением антибиотика, пробиотика и комплекса «антибиотик + пробиотик» на основании микробиологического исследования экскрементов.

3) Определить эффективность лечения сальмонеллезной инфекции с применением антибиотика, пробиотика и комплекса «антибиотик + пробиотик» на основании морфологических, гематологических, биохимических, иммунологических показателей крови, а также гистологического исследования органов-мишеней экспериментальных животных.

1 Возможности антибиотико- и пробиотикотерапии инфекционных заболеваний желудочно-кишечного тракта

 

• Общие представления о сальмонеллезной инфекции

 

Сальмонеллез – кишечное зооантропонозное заболевание, вызываемое микроорганизмами рода сальмонелл, характеризующийся при манифестном течении отчетливо выраженной интоксикационной и гастроинтестинальной симптоматикой, а также возможностью развития в некоторых случаях генерализованной формы [7].

 

1.1.1 Этиология и эпидемиология сальмонеллезной инфекции

 

Заболевание, эпидемически и клинически подобное сальмонеллезу, известно врачам давно. В 1885 г. Д. Сальмон и Т. Смит выделили возбудителя чумы свиней. В 1888 г. А. Гертнер обнаружил микроб в организме умершего человека и мясе коровы; впоследствии этот микроорганизм был назван его именем. В дальнейшем стали появляться сообщения о выделении бактерий, сходных по морфологическим и биохимическим свойствам с бактериями Сальмона и Гертнера. Все они были объединены в группу паразитарных микробов и в 1934 г. получили название сальмонелл.

Сальмонеллы – это грамотрицательные палочки размером от 2 мкм до 4 мкм в длину и 0,5 мкм в ширину, подвижные благодаря наличию жгутиков, факультативные анаэробы. Спор и капсул не образуют. Растут на обычных питательных средах. Сальмонеллы устойчивы во внешней среде, в воде живут до 120 дней, в фекалиях – от 80 дней до 4 лет.

В некоторых продуктах (молоко, мясо) сальмонеллы могут даже размножаться. Низкую температуру переносят хорошо, при высокой – погибают мгновенно. Сальмонеллы способны продуцировать экзотоксины: энтеротоксины (термолабильный и термостабильный), усиливающие секрецию жидкости и солей в просвет кишечника, и цитотоксин, нарушающий белково-синтетические процессы в клетках слизистой оболочки кишечника и воздействующий на цитомембраны. При разрушении бактерий выделяется эндотоксин, с которым связано развитие интоксикационного синдрома [8].

Антигенная структура сальмонелл сложна: они содержат О- и Н-антигены. Антигенная структура сальмонелл положена в основу Международной серологической классификации сальмонелл (схема Кауфмана-Уайта). Различия в строении О-антигена позволили выделить серологические группы А, В, С, Д, Е и другие. Внутри каждой серологической группы по Н-антигену различают серологические варианты. В настоящее время описано более 2300 сероваров сальмонелл, из них у человека их более 700. Сальмонеллез может встречаться как в виде отдельных спорадических случаев, так и в виде вспышек. В настоящее время заболеваемость сальмонеллезом остается относительно высокой в течение всего года с некоторым подъемом в теплое время. Источником инфекции могут быть животные и люди, причем роль животных в эпидемиологии является основной. Сальмонеллез у животных встречается в формах клинически выраженного заболевания и бактерионосительства. Будучи внешне здоровыми, бактерионосители могут выделять возбудителей с мочой, калом, молоком, носовой слизью, слюной. Наибольшую эпидемиологическую опасность представляет инфицирование крупного рогатого скота, свиней, овец, кошек, домовых грызунов (мышей и крыс). Сальмонеллы обнаруживаются у многих видов диких животных: лис, бобров, волков, песцов, медведей, тюленей, обезьян. Значительное место в эпидемиологии сальмонеллеза занимают птицы, особенно водоплавающие. Сальмонеллы обнаруживают не только в мясе и внутренних органах животных и птиц, но и в яйцах [9].

Основной путь заражения при сальмонеллезе – алиментарный, а факторами передачи инфекции являются различные пищевые продукты (мясо животных, рыб, лягушек, устриц, крабов, яйца и яичные продукты, молоко и молочные продукты, блюда из овощей). В качестве прямого фактора передачи инфекции нередко выступает вода. Описаны случаи воздушно-капельного заражения в детских коллективах. Известны случаи непосредственного заражения людей от больных животных при уходе за ними. Источниками сальмонеллеза могут быть больные сальмонеллезом люди или бактериовыделители. У детей раннего возраста преимущественно является контактный путь передачи инфекции, факторами передачи служат руки персонала, а также предметы ухода и пеленальные столики. Сальмонеллез регистрируется в течение всего года, но чаще в летние месяцы, что можно объяснить ухудшением условий хранения пищевых продуктов [10].

Заболеваемость сальмонеллезом в целом возросла. Причина этого явления, по мнению большинства исследователей, связана с интенсификацией животноводства на промышленной основе, изменившимся характером и масштабами реализации пищевых продуктов, значительным увеличением экспортно-импортных связей между странами, интенсификацией миграционных процессов и др.

Другой эпидемиологической особенностью сальмонеллеза в настоящее время является преимущественно спорадический характер его распространения. Установлено, что спорадическая заболеваемость по существу является следствием возникновения вспышек сальмонеллеза, характер которых изменился, вследствие чего эпидемиологическая расшифровка их затруднена. Они возникают преимущественно в результате поступления в торговую сеть различных пищевых продуктов, инфицированных сальмонеллами.

Описаны водные вспышки сальмонеллеза. Дискутируется воздушно-пылевой путь передачи инфекции. Воздушно-капельный путь передачи не узаконен, но все чаще встречаются вспышки, имеющие гриппоподобный тип течения инфекционного процесса. Возможно инфицирование ребенка во время родов, допускается трансплацентарная передача инфекции.

Одной из важных проблем современной медицины становится сальмонеллез как нозокомиальная (внутрибольничная, госпитальная) инфекция. Сальмонеллы, вызывающие внутрибольничные заболевания, получили название госпитальных штаммов, так как считается, что их биологические особенности (отсутствие чувствительности к типовым бактериофагам, множественная лекарственная устойчивость и др.) формируются в стационаре. Внутрибольничные вспышки характеризуются высокой контагиозностью, быстрым распространением и тяжестью клинического течения.

К наиболее часто высеваемым от человека сальмонеллам относятся: S.enteritidis, S.typhimurium, S.heidelberg, S.panama, S.infantis, S.newport, S.agona, S.derby, S.london [11].

 

1.1.2 Патогенез

В настоящее время доказано, что основное значение в развитии заболевания имеют живые микробы и в значительно меньшей степени продукты их жизнедеятельности. Тщательная термическая обработка инфицированной пищи делает ее безвредной, несмотря на наличие термостабильных эндотоксинов. Живые микробы проникают вместе с пищей в желудочно-кишечный тракт, где наряду с размножением происходит их массивное разрушение. Поражение слизистой оболочки тонких, а у некоторых больных и толстых кишок наблюдается у большинства больных сальмонеллезом.

Характерным признаком данной инфекции является инвазия возбудителя в мезентериальные лимфатические узлы и ранняя бактериемия с разрушением некоторых микробов в крови. Эндотоксины играют роль сенсибилизаторов, способствуя более быстрому проникновению сальмонелл в лимфу и кровеносную систему. Бактериальные эндотоксины, являющиеся по своему составу глицидолипоидополипептидным комплексом, вызывают нарушение терморегуляции, генерализованный паралич вазомоторов путем воздействия на сосудисто-нервный аппарат и непосредственно на нервные центры, а также серозное воспаление паренхиматозных органов.

Восприимчивость к сальмонеллезной инфекции повышается при подавлении нормальной флоры кишечника. Заражающей дозой для иммунокомпетентного человека является доза 10⁷ бактерий. Для развития заболевания у иммунокомпрометированных лиц инфицирующая доза может быть значительно меньшей.

Для развития манифестных форм болезни обязательно проникновение в желудочно-кишечный тракт не только токсинов сальмонелл, но и живых возбудителей. Массивное поступление живых бактерий (при алиментарном пути заражения) сопровождается разрушением их в верхних отделах желудочно-кишечного тракта (в желудке и преимущественно в кишечнике), в результате чего высвобождается большое количество эндотоксина, который, всасываясь в кровь, обусловливает возникновение эндотоксического синдрома, определяющего клиническую картину начального периода заболевания. Выраженность токсемии зависит как от инфицирующей дозы, так и от бактерицидных свойств желудочно-кишечного тракта. На этой стадии инфекционный процесс может закончиться. Клинически заболевание будет протекать по типу токсикоинфекции (гастроэнтеритическоя форма).

Если интенсивность бактериолиза недостаточна, специфический иммунитет отсутствует, а факторы неспецифической защиты желудочно-кишечного тракта несовершенны, сальмонеллы преодолевают эпителиальный барьер тонкой кишки и проникают в толщу тканей (в энтероциты и собственный слой слизистой оболочки кишечника), где захватываются (фагоцитируются) нейтрофилами и макрофагами. Возникает воспалительный процесс во всех отделах желудочно-кишечного тракта (гастроэнтероколитическая форма) [12].

В зависимости от состояния иммунной системы организма возникает либо только местный процесс, либо происходит прорыв кишечного и лимфатического барьеров и возникает следующий этап инфекционного процесса – бактериемия.

Внутри макрофагов микробы не только размножаются, но и частично погибают с освобождением эндотоксина, проникающего в нервно-сосудистый аппарат кишечника и повышающего проницаемость клеточных мембран. Это способствует дальнейшему распространению сальмонелл по лимфатическим путям и занесению их мезентериальные лимфатические узлы и далее в кровь - происходит генерализация инфекции. При этом микробы с кровью разносятся в различные органы и ткани, размножаются в печени и селезенке. Этот процесс в значительной степени облегчается способностью сальмонелл к паразитированию и размножению в цитоплазме макрофагов. Сальмонеллы, попадая с током крови в различные органы и ткани, размножаются с формированием септических очагов поражения (септическая форма) [13].

Процесс накопления сальмонелл в организме одновременно сопровождается интенсивной их гибелью и распадом, а следовательно, и значительным выбросом токсинов, что знаменует конец инкубационного периода и обозначает начало синдрома интоксикации. Результатом совокупного действия эндотоксина и бактериальных тел на энтероциты является диарейный синдром.

Внутриклеточное паразитирование в макрофагах является основным способом существования сальмонелл в организме человека. Оно определяет возможность их длительного персистирования с возникновением обострений и рецидивов, а также формированием хронического носительства. Микробы, паразитирующие в макрофагах, отличаются от бактерий, размножающихся вне клеток: они становятся более тонкими, окраска их более бледная. Моноциты и гистиоциты, в которых размножаются сальмонеллы, сохраняются в культуре тканей жизнеспособными от 2 до 7 дней. Микробы, находящиеся в клетках, защищены от действия антител и различных лекарственных препаратов, что объясняет причину недостаточной эффективности антибиотикотерапии у заболевших и при экспериментальных инфекциях.

Местная реакция заключается в развитии энтерита. Воспалительные явления в слизистой оболочке возникают после того, как сальмонеллы проходят через эпителиальный барьер и захватываются макрофагами и лейкоцитами. В результате происходит гибель не только возбудителя, но и части фагоцитов и других клеток под действием эндотоксина и продуктов метаболизма сальмонелл, а также освобождение дополнительных порций токсинов, гистамина и прочих биологически активных веществ: серотонина, катехоламинов, кининов и пр. Токсины сальмонелл вызывают активацию синтеза простогландинов и циклических нуклеотидов, что приводит к резкому усилению секреции жидкости и ионов калия и натрия в просвет желудочно-кишечного тракта. Развивается диарея с последующими нарушениями водно-электронного баланса. Общая реакция организма на эндотоксины характеризуется нарушением функционально- адаптивных процессов во многих органах и системах [14, 15].

Большие потери жидкости приводят к сокращению объема циркулирующей крови, понижению артериального давления, компенсаторному спазму периферических сосудов и развитию гипоксии. Гипоксия в свою очередь приводит к развитию ацидоза. Дальнейшее усиление интоксикации происходит в основном вследствие нарушения обменных процессов, что обусловливает повышение в крови недоокисленных продуктов и уровня гистаминоподобных веществ и в конечном счете ведет к расширению капилляров, блокируя их реакцию на адреналин. В результате энтерита нарушаются процессы переваривания и всасывания в кишечнике, возникает дефицит липазы и лактазы, который сохраняется около 4 недель после исчезновения клинических проявлений болезни. Нередко нарушается состав микрофлоры кишечника и развивается дисбактериоз.

При генерализованных формах накопление и размножение сальмонелл происходит во внутренних органах и лимфатических образованиях. В этих случаях болезнь протекает по тифоподобному варианту или развивается септикопиемия.

 

1.1.3 Клинические признаки

 

Инкубационный период при сальмонеллезе составляет от 12 до 24 часов. Иногда он укорачивается до 6 часов или удлиняется до 2 дней.

Выделяют следующие формы и варианты течения сальмонеллезной инфекции.

1. Гастроинтестинальная форма:

а) гастритический вариант;

б) энтеритический вариант;

в) гастроэнтеритический вариант;

г) энтероколитический вариант;

д) колитический вариант;

е) гастроэнтероколитический вариант.

2. Генерализованная форма:

а) тифоподобный вариант;

б) септикопиемический вариант.

3. Атипичные формы:

а) стертая;

б) субклиническая.

Чаще всего регистрируется гастроинтестинальная форма сальмонеллеза, которая может протекать по указанным вариантам, а по тяжести подразделяется на легкое, среднетяжелое и тяжелое течение. Тяжесть течения болезни устанавливается по степени обезвоживания и выраженности интоксикации. Бактериовыделение может быть острым (до 1 месяца), затяжным (до 3 месяцев), хроническим (свыше 3 месяцев) и транзиторным.

 

1.1.4 Диагностика сальмонеллеза

 

Для подтверждения клинического диагноза необходимы бактериологическое и серологическое исследования. Бактериологическому исследованию подвергаются испражнения больных, рвотные массы, промывные воды желудка, моча, кровь, желчь, подозреваемые продукты. Для подтверждения «госпитальных» свойств сальмонелл тифимуриум рекомендуется определять их антибиограмму.

Серологические методы исследования при сальмонеллезах при клинической диагностике и эпидемиологических исследованиях являются вспомогательными. Серологические методы могут преследовать две цели: выявление антител с помощью известных антигенов или поиск антигена с помощью известных антител.

В настоящее время широкое применение имеют методы выявления в сыворотке крови антител. Чаще с этой целью используют реакцию пассивной гемагглютинации, в которой антигенами служат эритроциты, сенсибилизированные О-антигенами сальмонелл основных О-групп.

Более совершенным методом обнаружения антител является реакция пассивной гемагглютинации с цистеиновой пробой, позволяющая определить антитела класса IgG, имеющие важное диагностическое значение. Для обнаружения антител разных классов применяются также различные модификации иммуноферментного метода.

Для выявления антигенов сальмонелл предложены два метода: агрегат-гемагглютинации и иммуноферментный. Перспективным является метод обнаружения антигена в моче с помощью иммуноферментной реакции [7].

 

1.2 Применение антибиотиков при инфекционных заболеваниях

 

Современную медицину невозможно представить без множества лекарств, о которых мы даже не задумываемся, – они для нас всегда были, есть и будут. В первую очередь, это касается антибиотиков. Антибиотики – это вещества, оказывающие повреждающее или губительное действие на бактерии.

Еще до открытия антибиотиков (веществ естественного происхождения) врачи пытались искусственно создать антибактериальные препараты. Сначала немецкий микробиолог Роберт Кох выделил так называемый туберкулин – стерильную жидкость, содержащую вещества, вырабатываемые бациллой туберкулеза в ходе роста. Но данный препарат оказалось невозможным применить для лечения туберкулеза в силу его токсичности. Вместе с тем туберкулин стали использовать для диагностики этого заболевания. Несколько позднее также немецкий ученый Пауль Эрлих, много лет работая над проблемой лечения инфекционных заболеваний, получил вещество, избирательно действовавшее на возбудителя сонной болезни – трипаносому. Оно представляло собой соединение мышьяка и получило название «сальварсан» (от лат. salvare – спасать и arsenicum – мышьяк). В 1906 году, после открытия возбудителя сифилиса – бледной спирохеты, сальварсан стал использоваться как лекарство против этого заболевания. Так, еще до появления антибиотиков были созданы вещества для борьбы с инфекциями. А в 1929 году британским ученым Александром Флемингом был открыт первый антибиотик – пенициллин. Флеминг работал в одной из лондонских больниц и проводил эксперименты с бактериальными культурами. Он заметил, что плесень, попавшая в чашку Петри, как бы растворила культуру бактерий. В результате проведения серии опытов ученый выяснил, что плесневые грибы действительно убивают многие микроорганизмы, выделяя при этом специфическое вещество. Это вещество А. Флеминг назвал пенициллином (от лат. penicillium – плесень). А после продолжительной совместной работы Эрнеста Чейна и Хоуарда Флори был выделен чистый пенициллин, устойчивый во внешней среде. Это открытие положило начало эре антибиотиков. За пенициллином последовало получение стрептомицина, тетрациклинов, эритромицина и ряда других антибактериальных препаратов. В шестидесятых годах появились первые полусинтетические, а затем и синтетические антибиотики. В связи с таким разнообразием источников получения утратило точность классическое определение создателя стрептомицина Зельмана Ваксмана, согласно которому антибиотики – это вещества, образуемые микроорганизмами и обладающие антимикробными свойствами [16, 17].

В настоящее время в медицине используют несколько десятков антибиотиков разных по химической структуре: β-лактамы (пенициллины, цефалоспорины), макролиды (эритромицин, олеандомицин, азитромицин), аминогликозиды (гентамицин, амикацин), тетрациклины, линкосамиды (линкомицин, клиндамицин), гликопептиды (ванкомицин, ристомицин), амфениколы (левомицетин), рифамицины (рифампицин), противогрибковые (нистатин, леворин, амфотерицин В). Отдельный класс составляют противоопухолевые антибиотики. Существование большого числа разнообразных по свойствам и химическому строению антибиотиков требует определенной и хорошо продуманной их классификации.

При классификации антибиотиков используют разные принципы. Прежде всего, антибиотики по типу действия делят на бактерицидные (β-лактамные, аминогликозиды, полимиксины) и бактериостатические (макролиды, тетрациклины, левомицетин). В результате бактерицидного действия микробы гибнут, бактериостатического – только теряют способность делиться. В этом случае организм окончательно избавляется от возбудителя с помощью факторов иммунитета. Поэтому бактерицидные антибиотики более выгодны, особенно в условиях неполноценного функционирования системы иммунитета [18, 19].

Спектр противомикробной активности в значительной мере определяется составом клеточной оболочки бактерий. В зависимости от количества видов возбудителя, на которые они способны влиять, различают антибиотики широкого и узкого спектра действия. Широкий спектр – у тетрациклинов, левомицетина, препаратов последних поколений пенициллинов, цефалоспоринов, макролидов, аминогликозидов. Чем шире спектр действия, тем легче не промахнуться в ситуациях, когда возбудитель заболевания почему-либо не идентифицирован. Однако антибиотики широкого спектра нередко вызывают гибель полезных бактерий, обитающих в кишечнике, которые сдерживают размножение патогенных бактерий и грибов, снабжают организм некоторыми важными витаминами.

По способу получения антибиотики делят на природные, полусинтетические, синтетические. По механизму действия различают антибиотики, вызывающие у бактерий:

а) нарушение синтеза клеточной стенки (пенициллины, цефалоспорины, ванкомицин);

б) нарушение синтеза белка (левомицетин, аминогликозиды, тетрациклины, макролиды, линкосамиды, амфениколы);

в) повреждение цитоплазматической мембраны (полиеновые, полимиксины, грамицидин);

г) нарушение синтеза нуклеиновых кислот (рифамицины, противоопухолевые антибиотики).

Антибиотики, нарушающие синтез клеточной стенки бактерий представлены препаратами, содержащими в молекуле β-лактамное кольцо (пенициллины, цефалоспорины). β-лактамные антибиотики (БЛА) – самая многочисленная группа среди антимикробных средств, занимающая ведущее место в лечении большинства инфекционных заболеваний [20].

Антибиотики различных групп наряду со специфическим противомикробным действием характеризуются иммуномодулирующими эффектами, а также обладают выраженным регуляторным действием на функции клеток-эффекторов воспаления и различных медиаторов межклеточных взаимодействий [21].

Одним из наиболее тяжелых осложнений для организма при инфекционной патологии является сепсис, на примере которого становятся очевидными разнообразие и сложность взаимодействий клеточных и гуморальных факторов, участвующих в воспалительном процессе. В качестве главных факторов воспаления выступают система клеток моноцитарного ряда, нейтрофилы, система комплемента, факторы свертывания крови, , фактор активации тромбоцитов, цитокины (противовоспалительные: интерлейкины-1, 6 и 8, γ-интерферон, фактор некроза опухоли и обладающие противовоспалительным действием интерлейкины-4 и 10, β-трансформирующий ростовой фактор).

Фундаментальной характеристикой действия антибиотиков на клетки макроорганизма и, в частности, на многие из указанных звеньев воспалительного процесса является наличие определенной дозозависимости эффекта (активации нейтрофилов, макрофагов, лимфоцитов) от концентрации, который, как правило, возрастает до определенного максимального уровня, а затем по мере увеличения концентрации препарата снижается и может, в ряде случаев, измениться на противоположный (колоколообразная зависимость). С другой стороны, действие антибиотика на клетки макроорганизма во многом зависит от их исходного функционального состояния на той или иной стадии воспалительного процесса. Таким образом, конечный результат действия антибиотика на клетки определяется как локальной концентрацией препарата в очаге воспаления и в клетке, так и стадией функционального состояния клетки – эффектора.

Несмотря на указанные методологические трудности, к настоящему времени получены данные о важной регуляторной роли антибиотиков в воспалительных реакциях организма. Так, представитель группы цефалоспориновых антибиотиков цефодизим, обладающий рядом ценных иммуностимулирующих свойств, не увеличивает образование цитокинов, но оказывает модулирующий эффект в случае избыточного выделения фактора некроза опухоли и интерлейкина-1 при воспалительных процессах. Другие цефалоспорины – цефаклор, цефетамет усиливают фагоцитоз, внутриклеточный киллинг микроорганизмов и оказывают регулирующее действие на высвобождение медиаторов, участвующих в воспалительных реакциях.

Макролидные антибиотики обладают рядом ценных фармакологических эффектов, направленных на модуляцию медиаторов воспаления, синтезируемых макрофагами, нейтрофилами и другими клетками. Наряду с иммуномодулирующими свойствами цефалоспорины характеризуются важным модулирующим противовоспалительным эффектом при различных инфекционных заболеваниях в том числе и сальмонеллезе [22].

Приведенные данные о противовоспалительном действии антибиотиков различных групп позволяет ученым сделать вывод о том, что наряду со специфическим противомикробным действием современные антибиотики (беталактамы, макролиды, азалиды, рифамицины и другие) являются эффективными регуляторами отдельных этапов и звеньев воспалительных реакций при инфекционном процессе.

Таким образом, антибиотики как специфические ингибиторы определенных реакций широко применяются в научных исследованиях в качестве веществ, используемых при изучении отдельных сторон метаболизма организмов, расшифровке тонких молекулярных механизмов биосинтеза белка, механизма функционирования мембран и других биохимических превращений. Некоторые антибиотики используют в качестве ингибиторов ферментов, инактивирующих практически ценные антибиотические препараты, а также антибиотиков – иммуномодуляторов [18].

 

1.3 Применение пробиотиков при профилактике и лечении инфекционных заболеваний

 

Нормальная микрофлора человека представлена разнообразными микроорганизмами, которые заселяют различные отделы желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), обитают в ротовой полости, носоглотке, мочеполовых путях, на кожных покровах. Все микроорганизмы находятся в состоянии динамического равновесия друг с другом и с макроорганизмом. Организм человека обеспечивает микрофлору питательными веществами, необходимыми для ее жизнедеятельности, а микрофлора синтезирует биологически активные вещества, которые не образуются в организме человека, и защищает его от внедрения патогенных микроорганизмов.

Такое явление как нарушение подвижного равновесия микрофлоры, в норме заселяющей нестерильные полости и кожные покровы человека носит название дисбактериоз. При дисбактериозе нормальная микрофлора не подавляет активность патогенных и гнилостных микроорганизмов; нарушаются процессы пищеварения и усвоения питательных веществ, перистальтика кишечника; ухудшается синтез витаминов; снижается иммунитет. Причины дисбактериоза разнообразны: нарушение рациона питания, длительное применение лекарственных средств (противомикробных и др.), лучевая и химиотерапия, попадание в организм токсинов из окружающей среды (свинец, кадмий, ртуть и др.), стрессовые состояния, кишечные инфекции, оперативные вмешательства, заболевания ЖКТ и др. Нарушение равновесия микрофлоры возникшее в ротовой полости, кишечнике, половых и мочевыводящих органах, на коже проявляются соответствующими симптомами. Напротив, дисбактериоз приводит к заболеваниям ЖКТ, ротовой полости, урогенитального тракта, аллергическим болезням, повышает риск развития злокачественных новообразований [23].

Почти 80% клеток, производящих антитела, находятся в стенке кишечника. Это идеальное место, так как большая часть возбудителей болезней попадает в организм через желудочно-кишечный тракт с пищей. Половина возбудителей болезней уничтожается в желудке, остальные проникают в тонкий кишечник с множеством лимфофоликул прямо под слизистой. Эти скопления клеток поглощают чужеродные, опасные для организма инфекционные вещества (антигены). С помощью этих антигенов они побуждают различные белые кровяные тельца нашей иммунной системы к активации, благодаря этому и возникает неспецифические и специфические защитные иммунные реакции [24].

С тех пор, как было открыто свойство различных микробных культур подавлять рост других микроорганизмов и особенно патогенных, виднейшие естествоиспытатели работали над проблемой практического использования явления антагонизма микробов (Л. Пастер, И.И. Мечников, Н.Ф. Гамалея и др.). Широкое признание и отражение в трудах многих биологов и врачей нашли идеи И.И. Мечникова, предложившего использовать для борьбы с инфекцией, преждевременным старением и другими недугами штаммы живых микробов - антагонистов. На современном этапе, в области медицинской микробиологии, такую целенаправленную коррекцию нарушенных биохимических и физиологических процессов за счет введения нужных бактерий-сапрофитов, продуцирующих биологически активные вещества (БАВ), предлагается назвать «микробной сапрофитной фармакотерапией».

В настоящее время большое внимание уделяется изучению механизмов действия штаммов микроорганизмов, входящих в состав пробиотических препаратов. К таким микроорганизмам относятся симбионты кишечного тракта: лактобациллы, бифидобактерии и нерезидентные сапрофиты, в том числе спорообразующие бациллы [25].

Пробиотики – это живые микроорганизмы и вещества микробного происхождения, оказывающие при естественном пути введения положительный эффект через регуляцию микрофлоры кишечника [26].

Пробиотики по своему составу являются гетерогенной группой лекарственных средств. При их классификации учитывается видовая принадлежность и количество штаммов содержащихся бактерий.

По составу выделяют следующие группы пробиотиков:

• Монопробиотики — препараты, содержащие микроорганизмы одного вида и штамма. В свою очередь они подразделяются на бифидосодержащие, колисодержащие, лактосодержащие, бациллярные и сахаромицетосодержащие препараты.
• Полипробиотики содержат бактерии одного вида, но разных штаммов. По составу они могут быть бифидосодержащими, лактосодержащими и бациллярными.
• Комбинированные пробиотики содержат микроорганизмы разных видов. Они представляют собой сочетания бифидо- и лактобактерий, бифидобактерий и апатогенных штаммов сoli, бифидобактерий, лактобактерий и апатогенных энтерококков [27].

Лечебно-профилактические свойства пробиотических препаратов обусловлены высокой концентрацией бактерий, играющих существенную роль в нормализации белкового, липидного и минерального обмена организма за счет продукции большого количества различных ферментов, в том числе внеклеточных и клеточно-связанных протеиназ, полисахаридов, гликопротеинов и других биологически активных соединений. Механизмы действия пробиотиков включают поддержание колонизационной резистентности, подавление роста патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, а также регуляцию иммунной системы ЖКТ [28].

Впервые термин «пробиотик» был предложен M. Lilli и O. Stilber в 1965 г. как антоним антибиотика для обозначения микробных метаболитов, обладающих способностью стимулировать рост микроорганизмов [29].

Пробиотики – это живые микроорганизмы и вещества микробного происхождения, оказывающие при естественном пути введения положительный эффект через регуляцию микрофлоры кишечника.

Чтобы быть включенными в группу пробиотиков микроорганизмы должны соответствовать следующим критериям:

а) выживать при пассировании через желудочный тракт, что предполагает их резистентность к кислоте и желчи;

б) адгезироваться на эпителиальных клетках кишечника с последующей колонизацией;

в) стабилизировать кишечную микрофлору;

г) не иметь признаков патогенности;

д) сохранять жизнеспособность, как в пищевых продуктах, так и в процессе получения фармакопейных лиофилизированных препаратов;

е) быстро размножаться, колонизируя кишечный тракт;

ж) персистировать с проявлением родовых свойств пробиотиков;

з) при совместном использовании с антибактериальными средствами в лечении кишечных инфекций или для профилактики вызванной антибиотиками диареи микроорганизмы должны обладать устойчивостью к антибиотикам.

Указанным критериям в наибольшей степени соответствует автохтонная группа содружественных микроорганизмов, включающая таких постоянных обитателей кишечной экосистемы, как лакто- и бифидобактерии, кишечная палочка [30, 31].

Современным представлением механизма положительного действия пробиотиков является их многогранность, ассоциированная с подавлением патогенных и условно-патогенных микроорганизмов за счет продукции биологически активных веществ, конкуренции за лимитируемые нутриенты и сайты адгезии на кишечной стенке, влиянии на ферментативную активность желудочно-кишечного тракта и стимуляции иммунной системы организма хозяина [27].

Антагонистическое действие пробиотических бактерий связано с продукцией органических кислот, бактериоцинов и ингибиторных протеинов, в том числе термолабильных и термостабильных высоко- и низкомолекулярных антибактериальных субстанций и антибиотиков. Органические кислоты являются конечными продуктами метаболизма, которые экскретируются в окружающую среду. Это молочная, уксусная, масляная, пропионовая, изомасляная, изовалериановая, муравьиная, сукциниловая, янтарная и др. кислоты [32].

Среди биопрепаратов важное место занимает использование пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus, обладающих антимикробной активностью. Бактерии рода Bacillus проявляют разнообразную антимикробную активность, связанную, в первую очередь, с продукцией почти 200 антибиотиков [33]. Наиболее известными их продуцентами являются B.sublilis, B.licheniformis, B.pumilus, B.polymyxa, B.circulans, B.laterosporus, B.cereits, B.brevis и другие. Продуцируемые антибиотики – это полимиксины, бацитрацин, тиротрициновый комплекс, грамицидин С, субтилин, эдеин, микробациллин и др. В связи с токсичностью лишь часть из них допущена к применению в клинике. Вторую обширную группу антагонистически активных веществ составляют бактериоцины.

Бактерии рода Bacillus продуцируют антибиотики с различным механизмом антибактериального действия. Их условно можно разделить на 4 основных класса:

а) циклические олигопептиды, такие как бацитрацин, ингибирующие синтез клеточной стенки;

б) линейные или циклические олигопептиды, такие как грамицидин и полимиксин, действующие на мембранные функции;

в) основные пептиды, такие как эдеины, ингибирующие образование комплекса инициации на малой субъединице рибосом;

г) аминоглюкозидные антибиотики – бутирозин, действующие на функцию рибосом. Последний вызывает особый интерес, поскольку он является первым антибиотиком аминогликозидной природы, продуцируемый микроорганизмами порядка Eubacteriales. Бутирозин отличается широким спектром антибактериального действия и малой токсичностью, что создает перспективу для его использования. Большой интерес вызывают исследования, посвященные изучению спектра и механизмов антибиотического действия бациллярных антибиотиков на клетки микроорганизмов и формированию устойчивости к ним. В них большое внимание отводится структуре антибиотика. Например, входящий в состав биоспорина штамм В.subtilis 3 одновременно образует два пептида с молекулярной массой от 400 до 600 и от 1500 до 1800 дальтон, спектры антибиотического действия которых существенно различаются между собой. Благодаря тому, что эти пептиды сходны по базовой структуре, но отличаются по концевым группировкам, антибиотическое действие их оказывается разнообразным, а формирование устойчивых вариантов замедленным [34].

Среди различных видов бактерий рода Bacillus наиболее продуктивными являются В.subtilis. Он является продуцентом наибольшего числа антибиотиков, полученных из бактерий одного и того же вида. Описано более 70 различных антибиотиков, образуемых бактериями этого вида. Большинство бактериальных антибиотиков в очищенном состоянии токсичны для макроорганизмов, поэтому лишь немногие из них нашли практическое применение. Ряд вырабатываемых спорообразующими аэробными бактериями антибиотиков применяется в медицине (грамицидин С, полимиксины, бацитрацины), другие используются в пищевой и консервной промышленности, в сельском хозяйстве (субтилин, низины). Многие антибиотики находятся в стадии изучения [35].

Пробиотики из бактерий рода Bacillus широко представлены препаратами для перорального применения.

Препарат «Бактисубтил», хорошо известный уже в течение нескольких десятилетий. В состав лекарственного препарата входят споры бактерий Bacillus cereus IP 5832 из коллекции Пастеровского института.

Сразу же после попадания в организм осуществляется интенсивный процесс прорастания спор, которые устойчивы к действию желудочного сока. Бациллы, входящие в «Бактисубтил», синтезируют несколько пептидов, которые схожи по базовой структуре, но отличаются концевыми группировками. Вследствие этого антибиотическое действие лекарственного препарата оказывается различным, а формирование устойчивых вариантов патогенной и условно-патогенной микрофлоры – замедленным. В процессе размножения штамма B.cereus IP 5832 его антагонистическое действие определяется высокой конкурентоспособностью к бактериям рода Proteus, энтеропатогеных E.coli, S.aureus, что и обусловливает высокую эффективность применения «Бактисубтила» при лечении дисбактериозов протейной и стафилококковой этиологии.

В результате расщепления выделившимися энзимами белков, жиров, углеводов образуется кислая среда, препятствующая процессам гниения и избыточного газообразования. «Бактисубтил» способствует поддержанию синтеза витаминов группы B и P в кишечнике, улучшает поступление витаминов E и К в кровь, стимулирует репаративные процессы в кишечнике. Кроме того, за счет активации макрофагов препарат эффективно воздействует на иммунный статус организма и обладает антитоксическим действием.

При применении препарата значительно сокращается время нормализации микрофлоры при дисбактериозах, а также потенцируется эффект при последующем проведении заместительной терапии бифидо- и лактобактериями.

Кроме этого, препарат рекомендован для профилактического применения с целью предупреждения нарушений нормального биоценоза кишечника при проведении антибиотикотерапии воспалительных заболеваний других органов и систем.

Таким образом, «Бактисубтил» является одновременно антибактериальным препаратом биологического происхождения и средством для восстановления нормальной микрофлоры кишечника.

На основе другого штамма В.subtilis 534, выделенного из негнойной раны больного, был создан препарат «Споробактерин». Его использовали для лечения гнойных ран, остеомелита, сепсиса, пиелонефрита, пневмонии у 276 человек. Полное излечение без применения антибиотиков отмечено у 197 (71,4%) больных, улучшение состояния у 57 человек (20,7%) и только у 22 больных из-за отсутствия положительного эффекта применены другие способы лечения.

«Споробактерин» – это живая культура Bacillus subtilis штамма 534. Штамм и препарат защищены патентами СССР, США, Австралии, европатентом № 0363491 ВI (Австрия, Бельгия, Швейцария, Германия, Англия, Италия, Лихтенштейн, Люксембург, Нидерланды, Швеция).

С декабря 1992 года препарат приказом № 353 МЗ РФ разрешен для клинического применения. «Споробактерин» в опытах in vitro подавляет от 80 до 100% штаммов: патогенной Е.соli, Рrоteus, Staphylococcus, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa и т.д.

Штаммы В.subtilis совершенно безвредны для человека и животных. Отсутствие патогенности у штаммов В.subtilis и всех других близкородственных им бактерий послужило основанием для присвоения им Управлением по контролю за качеством продовольственных и лекарственных средств США статуса CRAS (generally regarded as safe) – вполне безопасных организмов.

Бактерии сенной палочки, составляющие основу препарата «Споробактерин», выделяют во внешнюю среду антибиотик белковой природы. Последний в опытах in vitro подавлял рост 47 из 50 исследованных штаммов стафилококка, 11 из 12 штаммов стрептококка, 19 из 24 штаммов кишечной палочки, 14 из 15 штаммов шигелл, 10 из 10 штаммов сальмонелл, 9 из 9 штаммов протея, 12 из 20 штаммов псевдомонад, 4 из 4 штаммов дрожжевых грибков, 2 из 2 штаммов возбудителей газовой гангрены, 1 из 1 штамма столбнячной палочки. Кроме того, бактерии продуцируют:

- набор ферментов, расщепляющих белки, жиры, углеводы, клетчатку, чем способствуют улучшению переваривания и усвоения пищи;

- ряд аминокислот, в том числе незаменимых (лейцин, изолейцин, цистин, аспарагиновая, глутаминовая и др.);

- иммуномодулятор, усиливающий выработку антител, повышающий активность фагоцитоза и оказывающий умеренное антиаллергическое действие.

Штамм обладает очень низкой токсичностью. Выявить LD50 в опытах на лабораторных мышах не удалось, так как эти животные остались живы даже после внутривенного введения 150 млрд. живых бактерий сенной палочки штамма 534.

Другой препарат «Биоспорин» представляет собой живые бактерии B.subtilis 3 и В.licheniformis 31, лиофильно высушенные в сахарозо-желатиновой среде. Препарат применяют:

1) В гастроэнтерологической практике:

– при острых кишечных инфекциях (ОКИ), вызванных патогенными и условно-патогенными микроорганизмами (Salmonella, Shigella, энтеропагогенные Е.соli, Рrоteus, Staphylococcus, а также Candida), в том числе и антибиотикоустойчивыми, при заболеваниях легкой и средней степени тяжести; при тяжелых формах у лиц с противопоказаниями к антибиотикам;

– для лиц, перенесших ОКИ, в случаях выделения патогенных и условно патогенных микроорганизмов или при дисфункции кишечника;

– при дисбактериозах кишечника различной этиологии, в том числе возникающих в результате антибиотикотерапии;

2) В хирургической практике:

– для профилактики гнойно-септических осложнений в послеоперационном периоде;

3) В гинекологической практике:

– для лечения бактериального вагиноза (назначают после окончания курса антибактериальной терапии с целью реабилитации) [36].

Бактерии B.subtilis и B.licheniformis не являются элементами нормофлоры в микробных сообществах человека и животных, но обладают свойствами, которые обеспечивают организму возможность поддерживать микробоциноз на уровне экологически естественного, оптимизируют обмен веществ и снабжение организма биологически активными и строительными веществами, обеспечивают качественное переваривание пищи. В природных условиях бактерии этих видов всегда попадали из окружающей среды в желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), на кожу и её поврежденные участки, слизистые оболочки человека и животных с пылью, при съедании растительной пищи, с питьевой водой. В настоящее время известно более 3000 бактерий этих видов. Промышленные штаммы бактерий B.subtilis и B.licheniformis выбраны из многообразия бактерий этих видов по признаку максимальной полезности для организма человека и животных. В процессе наработки бактерий в технологическом цикле эти свойства контролируются и поддерживаются на неизменном уровне [37, 38].

При попадании бактерий в ЖКТ они живут в нём не более 30 дней, после чего выводятся естественным путём. В желудке бактерии этого вида не погибают, поскольку в споровом виде обладают высокой устойчивостью к воздействию желудочного сока. Во рту, тонком и толстом отделе кишечника они трансформируются в вегетативную форму, размножаются и продуцируют в окружающую среду биологически активные вещества, под воздействием которых подавляется рост и развитие гнилостной, патогенной и условно-патогенной микрофлоры, восстанавливается численность популяций лакто- и бифидобактерий, кишечной палочки и других микроорганизмов, составляющих нормофлору ЖКТ и обеспечивающих его оптимальное функционирование. Способность подавлять рост и развитие сторонней для ЖКТ микрофлоры бактерии этих видов реализуют преимущественно за счёт способности нарабатывать полиеновые антибиотики – бацитрацины и лихениформины. Подавление реализуется путем прямого антагонизма относительно инфекционных агентов и опосредованно через оптимизацию функционирования иммунитета человека и животных. Зарегистрировано наличие прямого антагонизма относительно большей части представителей инфекционных микроорганизмов человека и животных: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella sp., Salmonella eholeraesuis, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Candida albicans, Klebsiella pneumonia, Citrobacter freundii, Morganella morganii, Yersinia enterocolitica, Shigella sonnei, Enterobacter agglomerans [39].

Кроме прямого антагонизма относительно патогенной, условно-патогенной и гнилостной микрофлоры бактерии B.subtilis и B.licheniformis обладают способностью оптимизировать функции иммунной системы человека и животных. Этот эффект реализуется в результате их взаимодействия с микробным сообществом в ЖКТ, иммунными органеллами в тонком отделе ЖКТ и иммунными клетками в крови человека и животных. Нами установлено, что в споровом виде микроорганизмы этих видов способны проникать через стенки ЖКТ и попадать в кровоток. Опыты, выполненные на животных, говорят о том, что при непосредственном введении указанных выше штаммов внутривенно реализуется мощный иммунный отклик, стимулируется функциональная активность гуморального и клеточного звена иммунитета. При этом температура тела животного остаётся неизменной.

Кроме того, бактерии B.subtilis и B.licheniformis являются природными индукторами интерферонов, то есть активно стимулируют в организме образование собственных эндогенных интерферонов (а-, b-, g- и других типов). Этот путь более естественен, чем введение искусственных интерферонов любым способом, и соответствует природному. Например, на попадание вирусов, а это происходит постоянно, здоровый организм отвечает образованием интерферонов и как бы запрещает последующее развитие инфекции. Способ введения интерферона и стимуляции наработки эндогенных интерферонов, основанный на введении в организм указанных выше микроорганизмов, позволяет обеспечить пролонгированное, на срок жизни колонии микроорганизмов в ЖКТ (либо ином органе организма), воздействие на организм интерферонов и, как следствие, добиться положительного эффекта при лечении и профилактике широкого спектра различных болезней [40].

 

1.4 Эффективность и перспективы совместного применения антибиотиков и пробиотиков

 

Многочисленный микробиоценоз кишечника человека представлен более 500 видов микроорганизмов, причем в различных отделах желудочно-кишечного тракта количество их неодинаково и колеблется в широком диапозоне. Наиболее многочисленными представителями микробного сообщества кишечника человека являются Bifidobacterium sp., E.coli, Lactobacillus sp., Bacterioides sp., анаэробные стрептококки, Clostridium sp. и многие другие. Микроорганизмы желудочно-кишечного тракта обеспечивают процессы переваривания и всасывания, трофику кишечника, антиинфекционную защиту, синтез витаминов [41, 42].

Различные факторы внешней и внутренней среды могут существенно влиять на состав кишечной микрофлоры, что может не только нарушать нормальное течение физиологических процессов, но даже приводить к тяжелым патологическим состояниям. Качественное и/или количественное изменение состава кишечной микрофлоры называют дисбактериозом кишечника. Дисбактериоз всегда вторичен. Наиболее частой причиной развития дисбактериоза кишечника - применение антибиотиков, прямо подавляющих жизнедеятельность кишечных микроорганизмов и существенно меняющих «микробный пейзаж» желудочно-кишечного тракта.

Поэтому при лечении антибиотиками и другими противомикробными препаратами рациональным считается назначение пробиотиков во время курса антибактериальной химиотерапии.

По мере расширения применения двух групп препаратов с противоположными эффектами – антимикробных средств и пробиотиков – в сознании ряда медицинских специалистов отчетливо сформировалось противопоставление антибиотиков и бактериопрепаратов. В основу этого конфликта была положена концепция гибели микроорганизмов, входящих в состав бактерийного препарата, при совместном назначении с антибиотиком. Причиной негативного отношения к комбинации антибиотик и пробиотик является неправильное определение целей назначения такой терапии. Традиционно живые микроорганизмы назначались для увеличения численности популяции полезной микрофлоры ЖКТ и замещения утраченных по разным причинам функций естественной нормофлоры. При такой постановке вопроса становятся вполне уместными возражения противников пробиотической терапии, указывающих на несоответствие пробиотических штаммов нормальной микрофлоре конкретного пациента, короткий период жизни пробиотических штаммов в кишечнике человека, неполное восстановление микробиоценоза, и вполне закономерная гибель части популяции экзогенных бактерий под влиянием применяющегося антимикробного препарата (АМП). Следует признать, что с расширением объема знаний о сложности и многообразии микробных экосистем кишечника концепция применения пробиотиков как факторов длительной колонизации находит все меньше сторонников. Однако современные пробиотики могут решать существенно более широкий круг задач, среди которых:

а) селективная стимуляция иммунной системы (активация или супрессия, например, за счет поляризации наивных Т-лимфоцитов по про- или противовоспалительному пути, селективной индукции выработки дефенсинов и т.д.);

б) воздействие на ключевое звено (звенья) патогенеза болезни (токсины, адгезию, инвазию, транслокацию);

в) влияние на какой-то ключевой механизм действия основного лекарственного препарата (например, улучшение антимикробного эффекта действия антибиотиков при антихеликобактерной терапии);

г) дополнение эффектов основного препарата (например, гиполипидемические средства, антигистаминные препараты и регуляторы моторики при синдроме раздраженного кишечника и другие);

д) «переключение» ответа макроорганизма на воздействие патогенетического фактора (воспалительные заболевания кишечника – ВЗК, иммунозависимые состояния) [43];

е) профилактика реинфекции.

Залогом успешного одновременного применения антибиотика и пробиотика является субпороговая (субэффективная) концентрация АМП в ЖКТ и/или определенная устойчивость пробиотика к АМП. Так, не все антибиотики, особенно назначаемые парентерально, создают эффективные концентрации в кишечнике, прежде всего в просвете и в пристеночном слое слизи. При пероральном приеме АМП возможно использование временного интервала, что позволяет назначать пробиотик после того как концентрация антибиотика в просвете кишечника снизится до минимальной. И, наконец, можно использовать сведения об устойчивости пробиотических штаммов к АМП [44-46].

Чувствительность штаммов бактерий нормофлоры, входящих в пробиотики, неодинакова. Наибольшей устойчивостью к антибиотикам обладают сахаромицеты. Чаще всего применяются Saccharomyces boulardii, однако следует учитывать, что они чувствительны к противогрибковым препаратам. Определенным уровнем устойчивости к действию антимикробных препаратов обладают пробиотические штаммы бацилл.

Все лактобациллы и бифидобактерии фактически не чувствительны к антибиотикам - аминогликозидам и общераспространенным фторхинолонам. Лактобациллы, содержащиеся в лактобактерине, не чувствительны к метронидазолу, пенициллину, цефалоспоринам, слабо чувствительны к макролидам и ванкомицину. Лактобациллы, содержащиеся в линексе устойчивы к линкомицину. В линексе и бифиформе также содержатся энтерококки, обладающие более высокой резистентностью к антибиотикам, чем лактобациллы и, тем более, бифидобактерии. С другой стороны, бифидобактерии из препаратов бифидумбактерина форте и пробифора защищены от антибиотика своей формой, т.к. к сорбированным в несколько слоев бифидобактериям антибиотику сложнее проникнуть. Как правило, пробиотические штаммы лактобацилл устойчивы к двум и более антимикробным препаратам [47-48].

Антагонистическая активность пробиотиков к разным микроорганизмам может реализовываться посредством разных механизмов. Известно, что факторами адгезии E.coli O157:H7 являются некоторые поверхностные белки (Surfacelayer proteins, Slps), синтез которых зависит от активности генов, экспрессию которых в свою очередь способны регулировать как гормоны нашего организма [49], так и другие микроорганизмы [50].

Сегодня сложно найти человека, который бы хоть раз в жизни не применял бы антибиотики. Благодаря высокой эффективности антибиотики вошли в медицинскую практику как золотой стандарт лечения инфекционных заболеваний. Эти препараты спасли жизни многим больным. Однако существует и обратная сторона медали – осложнения и отдаленные последствия: ослабление иммунитета, развитие атопических заболеваний, кандидозной суперинфекции, дизбиоза кишечника и антибиотикассоциированной диареи [51]. Комплексное применение антибактериальных препаратов и пробиотиков защищает нормальную микрофлору кишечника в период проведения этиотропной терапии, «нейтрализует» побочные эффекты антибиотикотерапии (гастрит, острые кигшечные инфекции – ОКИ), усиливает санирующий эффект антимикробных препаратов, сокращает продолжительность основных симптомов заболевания (ОКИ), предупреждает реинфицирование, снижает вероятность формирования полимикробных ассоциаций и модифицирует иммунный ответ по основному заболеванию. Принципиально важным условием успешного совместного применения антибиотиков и пробиотиков является постоянное «обновление» популяции пробиотических штаммов за счет повторного поступления с новыми дозами препарата, учет иммунологического статуса и микрофлоры пациента с подбором конкретного препарата – пробиотика в соответствии с состоянием больного [52].

Следует учитывать, что эффективность комплексной терапии будет выше, если и пробиотик, и антибиотик будут синергистами, так как их совместное действие снижает частоту появления побочных эффектов этиотропной терапии и повышает эффективность эрадикационной. Таким образом, совместное применение пробиотиков с антибиотиками позволяет снизить риск ассоциированного с антибиотиками дисбактериоза или уменьшить его тяжесть.

2. Материалы и методы исследований

 

2.1 Микроорганизмы, используемые в экспериментах

 

В качестве объектов исследования использовались чистые культуры микроорганизмов: Bacillus subtilis 534 (из биопрепарата «Споробактерин»), Васillus сеrеus IР 5832 (из биопрепарата «Бактисубтил»), а также были получены отдельные чистые культуры Васillus subtilis 3 и Васillus licheniformis 31, входящие в состав «Биоспорин». Для выделения чистых культур использован метод непосредственного пересева.

B.subtilis (бактерия, входящая в состав и «Споробактерина», и «Биоспорина») – грамположительная, спорообразующая аэробная почвенная бактерия, размером от 3 до 5 мкм в длину и в ширину 0,6 мкм. Растет на мясо-пептонном агаре (МПА), мясо-пептонном бульоне (МПБ), а также на средах, содержащих растительные остатки, простых синтетических питательных средах для гетеротрофов. Многоклеточные агрегаты B.subtilis, образующиеся в результате сложного коллективного поведения, порой напоминают «снежинки» (рисунок 1). На МПБ культура образует гомогенную муть и придонный осадок, пленки не образует. Является хемоорганогетеротрофом, аммонифицирует белки, расщепляет крахмал, гликоген, ферментирует глюкозу, сахарозу, мальтозу.

 

 

Рисунок 1 – Внешний вид бактерии Bacillus subtilis

 

Культурально-морфологические и биохимические свойства штамма B.licheniformis: бактерия является грамположительной палочкой, относится к аэробам, способным образовывать споры. Размеры вегетативных клеток от 0,5 до 0,8 мкм в ширину и от 1,5 до 3 мкм в длину, иногда достигают размера до 5 мкм. Споры эллиптические, преимущественно расположены центрально.

Вегетативные клетки B.licheniformis хорошо растут на богатых питательных средах (МПА и МПБ) при температуре от 37 ºC до 40 ºC. На МПБ через 48 часов инкубации при температуре 37 ºC образует помутнение среды, а на поверхности – сухую пленку.

 

 

Рисунок 2 – Внешний вид бактерии Bacillus licheniformis

 

Bacillus cereus – грамположительная, спорообразующая бактерия (рисунок 3). Хемоорганогетеротроф, факультативный анаэроб, способен к нитратредукции. Растет на простых питательных средах, на плотных питательных средах обрузует плоские, мелкобугристые, слегка вогнутые, матовые колонии. Край волнистый. Клетки крупные в длину от 3 до 4 мкм, эндоспоры расположены центрально, не превышают размер клетки. Жгутики расположены перитрихиально.

 

 

Рисунок 3 – Внешний вид бактерии Bacillus cereus

 

В качестве тест-организмов нами использовались условно-патогенный микроорганизм – Salmonella enteritidis. S.enteritidis лишена болезнетворных свойств и не вызывают инфекционных заболеваний у здорового человека. Нередко колонизируют кожу и слизистые оболочки, но способна и к длительному существованию во внешней среде.

S.enteritidis – грамотрицательная палочка, размером в длину от 2,5 до 3 мкм и от 0,7 до 1,5 мкм в ширину, ни спор, ни капсул сальмонеллы не образуют. Они факультативные анаэробы, хемоорганотрофы, оксидаза и каталаза отрицательные, имеют жгутики, подвижны, хорошо растут на обычных питательных средах при температуре от + 6 ºC до + 46 ºC, оптимум роста + 37 ºC (рисунок 4).

 

 

Рисунок 4 – Внешний вид бактерии Salmonella enteritidis

 

2.2 Органы и ткани лабораторных крыс, используемые в эксперименте in vivo

 

Крысы являются одними из основных экспериментальных систем в биологических и медицинских исследованиях. За долгие годы были выведены специальные лабораторные крысы. Благодаря быстрому метаболизму, неприхотливости, неагрессивности они до сих пор остаются одним из основных объектов во многих отраслях биологии.

Количество лабораторных экспериментов проводимых в различных научных областях на подопытных крысах бесчисленно.

Крысы относятся к роду Rattus, семейство мышевидных Muridae.

Крысы обладают практически теми же свойствами, что и мыши, которые делают их столь необходимыми для научных исследований. Крысы отличаются более крупными размерами, чем мыши, что требует известной осторожности при работе с ними.

Область использования: токсикологические исследования, изучение вопросов питания,  стандартизация гормональных препаратов, различные исследования, а также изучение опухолей и инфекционных заболеваний.

Биологические характеристики:
Половая зрелость в возрасте  – 60-70 дней
Физиологическая зрелость – 80-90  дней
Продолжительность охоты – 20-27 часов
Продолжительность жизни – 2-3 года
Продолжительность беременности – 16-23 (18) дня
Плодовитость – 5-9 крысят в помете
Продолжительность лактации – 28-35 дней 
Масса новорожденных крысят – 3-6 г
Возраст прозревания крысят – 14-17 дней
Возраст отсадки молодняка – 21-35 дней
Масса тела взрослого животного – 200-400 г

Таким образом, белые лабораторные крысы широко используются в качестве лабораторных животных в вивариях научно-исследовательских институтов и др. Важное преимущество белых крыс как лабораторных животных заключается в том, что они довольно устойчивы к инфекционным заболеваниям и дают большой приплод. Вес белых крыс небольшой, разводить их и содержать в условиях вивария несложно, и это позволяет проводить над ними массовые опыты.

Тонкий кишечник (лат. intestinum tenue) – отдел кишечника у позвоночных животных, располагающийся между желудком и толстым кишечником. Тонкий кишечник осуществляет основную функцию всасывания питательных веществ из химуса в организме животных. Относительная длина и особенности строения тонкого кишечника в значительной степени зависят от типа питания животного.

Тонкий кишечник делится на двенадцатиперстный (лат. duodenum), тощий (лат. jejunum) и подвздошный отдел (лат. ilium), причем тощая образует 2/5, a подвздошная 3/5 всей длины тонкого кишечника, достигающей 7 – 8 м (от 472 см до 1055, а в среднем 641,3 см). Двенадцатиперстный кишечник переходит в тощий и подвздошный, разграничить которые между собой в сущности невозможно. Эта часть тонкого кишечника образует многочисленные извилины и загибы, выполняя среднюю и нижнюю часть брюшной полости и спускаясь вниз в полость таза, Верхняя часть ее шире, а нижняя уже и с более тонкими стенками. Стенка тонкого кишечника образована серозным слоем, мышечным, состоящим из наружных продольных волокон и внутренних поперечных; и слизистой оболочки, соединяющейся посредством рыхлого подслизистого слоя с мышечным. Для слизистой оболочки характерны особые поперечные складки (valvulae conviventes Kerckringii), которых, однако, нет в верхней части двенадцатиперстного и в нижней части тонкого кишечника. Эти складки более часты в верхней части кишки, и каждая тянется приблизительно на половину окружности кишки. В нисходящей части двенадцатиперстного кишечника имеется продольная складка на задней стенке. На нижней части этой складки на плоском сосочке открываются протоки поджелудочной железы и печени. Слизистая оболочка тонкого кишечника имеет бархатистую поверхность, так как покрыта густо сидящими ворсинками (villi intestinales). В стенке залегают либеркюновы железы (glandulae Lieberkuehnianae), открывающиеся парами между ворсинками на всем протяжении кишечника. В двенадцатиперстном кишечнике находится Бруннеровы железы, особенно многочисленные в ее верхней части. По всей кишке разбросаны одиночные лимфатические узлы и скопления их – Пейеровы бляшки, наиболее многочисленные в нижнем отделе тонкого кишечника. Внутри ворсинки находится сеть кровеносных капилляров и один или несколько лимфатических сосудов. Эпителий цилиндрический и содержит бокаловидные клетки.

Кишечник состоит из тонкого и толстого отдела. Кишечник крыс в 5-9 раз превышает длину туловища и составляет в среднем около 1,5 м. При этом длина тонкого отдела больше длины толстого в 4-5 раз. Толстый отдел кишечника в конечной части называется прямой кишкой, которая оканчивается анальным отверстием.

Селезёнка – самый крупный лимфоидный орган, имеющий овальную уплощенную форму, похожий на железу и расположенный в левой верхней части брюшной полости, позади желудка. Она соприкасается с диафрагмой, поджелудочной железой, толстой кишкой и левой почкой.

Наружная поверхность селезёнки покрыта капсулой из плотной соединительной ткани, к наружной поверхности которой прирастает серозная оболочка (брюшина). От капсулы внутрь селезёнки отходят трабекулы (балки), образованные плотной соединительной тканью. В капсуле и трабекулах также присутствуют гладкие мышечные клетки, количество которых увеличено у животных, селёзенка которых выполняет выраженную депонирующую функцию (лошадь, тюлень). При сокращении мышечных элементов капсулы и трабекул депонированная в селезёнке кровь выбрасывается в общий кровоток. Трабекулы образуют внутренний каркас органа. В крупных трабекулах проходят артерии и вены. Внутреннее содержимое селезёнки получило название пульпы (мякоти). В пульпе селезёнки различают две основные зоны: красную и белую пульпу.

Красная пульпа селезенки включает венозные синусы и пульпарные тяжи. Пульпарные тяжи – это часть красной пульпы, расположенная между синусами, называется селезеночными, или пульпарными, тяжами (chordae splenicae) Бильрота. Это форменные элементы крови, макрофаги, плазматические клетки лежащие в петлях ретикулярной соединительной ткани. Здесь по аналогии с мозговыми тяжами лимфатических узлов заканчивают свою дифференцировку и секретируют антитела плазмоциты, предшественники которых перемещаются сюда из белой пульпы. В пульпарных тяжах встречаются скопления В- и Т-лимфоцитов, которые могут формировать новые узелки белой пульпы. В красной пульпе задерживаются моноциты, которые дифференцируются в макрофаги.

Селезенка считается «кладбищем эритроцитов» в связи с тем, что обладает способностью понижать осмотическую устойчивость старых или поврежденных эритроцитов. Такие эритроциты не способны выйти в венозные синусы и подвергаются разрушению и поглощаются макрофагами красной пульпы.

В результате расщепления гемоглобина поглощенных макрофагами эритроцитов образуются и выделяются в кровоток билирубин и содержащий железо трансферрин. Билирубин переносится в печень, где войдет в состав желчи. Трансферрин из кровотока захватывается макрофагами костного мозга, которые снабжают железом вновь развивающиеся эритроциты.

В селезенке депонируется кровь и скапливаются тромбоциты. Старые тромбоциты также подвергаются здесь разрушению.

Синусы красной пульпы, расположенные между селезеночными тяжами, представляют собой часть сложной сосудистой системы селезенки. Это широкие тонкостенные сосуды неправильной формы, выстланы эндотелиальными клетками необычной веретеновидной формы с узкими щелями между ними, через которые в просвет синусов из окружающих тяжей мигрируют форменные элементы. Базальная мембрана прерывиста, ее дополняют ретикулярные волокна и отростки ретикулярных клеток.

Белая пульпа селезёнки имеет вид беловато-сероватых вкраплений вытянутой или эллипсоидной формы, цвет которых обусловлен скоплениями лимфоцитов, одной из разновидностей лейкоцитов – белых кровяных телец.

Представляет собой совокупность скоплений лимфоидной ткани (телец Мальпиги), которые образуются и располагаются вдоль артериальных сосудов. Строму белой пульпы также образует ретикулярная соединительная ткань. Кроме ретикулярных клеток к стромальным элементам относят также некоторые разновидности макрофагов, дендритные и интердигитирующие клетки, которые выполняют функции антигенной презентации.

Непосредственно вдоль артерий пульпы в наружной оболочке их стенки формируются скопления лимфоцитов (периартериальные лимфоидные муфты — PALS). В этих образованиях накапливаются T-лимфоциты. Эти периартериальные зоны рассматриваются как тимусзависимые зоны селезёнки, в которых T-лимфоциты проходят антигензависимую пролиферацию и дифференцировку. Специфическими элементами микроокружения этой зоны являются интердигитирующие клетки.

С краю от периартериальных зон развиваются лимфатические узелки (лимфоидные фолликулы). Окраска этих образований на гистологических препаратах неоднородна.

Центральная часть узелка выглядит более светлой. В этой зоне происходит антигензависимая пролиферация и дифференцировка B-лимфоцитов. Данная часть узелка рассматривается как бурсазависимая зона, и называется герминативным (зародышевым) центром узелка. Специфическими элементами микроокружения этой зоны являются дендритные клетки.

Периферическая зона узелка (мантийная зона) содержит мелкие лимфоциты, зажатые между циркулярными ретикулярными волокнами. Мантийная зона на препаратах интенсивно окрашена, выглядит более темной по сравнению с герминативным центром.

На границе между белой и красной пульпой располагается маргинальная (краевая) зона лимфатического узелка. Для этой зоны характерно наличие специфических макрофагов, которые по ряду свойств отличаются от других макрофагов белой и красной пульпы. Эти клетки принимают участие в антибактериальной защите организма. В маргинальной зоне накапливаются продуцирующие антитела плазматические клетки, которые образуются при дифференцировке B-лимфоцитов. В маргинальной зоне в отличие от других зон белой пульпы обнаруживаются эритроциты, которые выходят через перфорированную стенку краевого синуса, лежащего на границе маргинальной и мантийной зоны. Таким образом, селезёнка представляет собой орган, который имеет сложное строение и принимает активное участие в иммунной защите организма и в клиренсе крови.

Кровь – жидкая соединительная ткань, наполняющая сердечно-сосудистую систему позвоночных животных, в том числе человека, некоторых беспозвоночных. Состоит из жидкой части плазмы и форменных элементов: клеток лейкоцитов и постклеточных структур эритроцитов, и тромбоцитов. Циркулирует по системе сосудов под действием силы ритмически сокращающегося сердца и непосредственно с другими тканями тела не сообщается ввиду наличия гистогематических барьеров. У всех позвоночных кровь имеет чаще красный цвет (от бледно- до тёмно-красного), которым она обязана гемоглобину, содержащемуся в эритроцитах. У некоторых моллюсков и членистоногих кровь имеет голубой цвет, благодаря гемоцианину.

Кровь состоит из двух основных компонентов – плазмы и взвешенных в ней форменных элементов. У взрослого человека форменные элементы крови составляют около 40-48 %, а плазма – 52-60 %. Это соотношение называется гематокритное число. Кровь также подразделяется на периферическая кровь, находящуюся в русле сосудов и кровь, находящуюся в кроветворных органах и сердце.

Плазма крови содержит воду и растворённые в ней вещества – белки и другие органические и минеральные соединения. Основными белками плазмы являются альбумины, глобулины и фибриноген. Около 90 % плазмы – вода. Неорганические вещества составляют около 1 %, это катионы (Na⁺, K⁺, Mg²⁺, Ca²⁺) и анионы (HCO₃^-, Cl^-, фосфаты, сульфаты). Органические вещества (около 9 %) подразделяются на азотсодержащие (белки, аминокислоты, мочевина, креатинин, аммиак, продукты обмена пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов) и безазотистые (глюкоза, жирные кислоты, пируват, лактат, фосфолипиды, триацилглицеролы, холестерин. Содержатся в плазме и газы, в частности кислород и углекислый газ. В плазме крови растворены также биологически активные вещества гормоны, витамины, ферменты и медиаторы.

Форменные элементы крови представлены эритроцитами, тромбоцитами и лейкоцитами.

Красные кровяные тельца (эритроциты) – самые многочисленные из форменных элементов. Зрелые эритроциты не содержат ядра и имеют форму двояковогнутых дисков. Циркулируют 120 дней и разрушаются в печени и селезенке. Эритроциты имеют железосодержащий белок – гемоглобин, который обеспечивает главную функцию эритроцитов – транспорт газов, в первую очередь – кислорода. Именно гемоглобин придаёт крови красную окраску. В лёгких гемоглобин связывает кислород, превращаясь в оксигемоглобин, он имеет светло-красный цвет. В тканях кислород освобождается из связи, снова образуется гемоглобин, и кровь темнеет. Кроме кислорода, гемоглобин в форме карбогемоглобина переносит из тканей в лёгкие и небольшое количество углекислого газа.

Кровяные пластинки (тромбоциты) представляют собой ограниченные клеточной мембраной фрагменты цитоплазмы гигантских клеток костного мозга мегакариоцитов. Совместно с белками плазмы крови (например, фибриногеном) они обеспечивают свёртывание крови, вытекающей из повреждённого сосуда, приводя к остановке кровотечения и тем самым защищая организм от опасной для жизни кровопотери.

Белые клетки крови (лейкоциты) являются частью иммунной системы организма. Все они способны к выходу за пределы кровяного русла в ткани. Главная функция лейкоцитов – защита. Они участвуют в иммунных реакциях, выделяя при этом Т-клетки, распознающие вирусы и всевозможные вредные вещества, В-клетки, вырабатывающие антитела, макрофаги, которые уничтожают эти вещества. В норме лейкоцитов в крови намного меньше, чем других форменных элементов.

Кровь относится к быстро обновляющимся тканям. Физиологическая регенерация форменных элементов крови осуществляется за счёт разрушения старых клеток и образования новых органами кроветворения. Главным из них у человека и других млекопитающих является костный мозг. У человека красный, или кроветворный, костный мозг расположен в основном в тазовых костях и в длинных трубчатых костях. Основным фильтром крови является селезёнка (красная пульпа), осуществляющая в том числе и иммунологический её контроль (белая пульпа).

 

2.3 Методы определения антибиотикорезистентности бактерий рода Bacillus, входящих в состав пробиотиков

 

2.3.1 Метод определения антибиотикорезистентности бактерий рода Bacillus с применением тест-систем «Bio Merieux»

 

В этом методе нами использовались тест-системы «Bio Merieux» (Франция), предназначенные для определения антибиотикорезистентности в течение от 18 до 24 ч. Они состоят из прозрачной полимерной пластинки, на каждой имеются по 20 микропробирок объемом 0,25 мл, содержащих разные антибиотики различной концентрации. Схема проведения эксперимента выглядит следующим образом.

В жидкую питательную среду добавили 50 мкл инокулюма, затем во все микропробирки внесли по 135 мкл суспензии бактерий. Посевы инкубировали при температуре 37 ºС в течение от 18 до 24 ч. Результаты учитывали визуально, сравнивали с контрольными лунками, заполняли бланки с кодами цифрового профиля.

 

 

Инокулят

 

Физиологический раствор

                                                                         50 мкл

Питательный бульон

                                                                          по 135 мкл в каждую лунку

Тест-системы

 

 

2.3.2 Диско-диффузионный метод определения антибиотикорезистентности бактерий рода Bacillus

 

Диско-диффузионный метод (ДДМ) определения чувствительности основан на способности антибиотика диффундировать из стандартных дисков, пропитанных антибиотиками в питательную среду, угнетая рост микрооганизмов, посеянных на поверхность агара [14].

При использовании этого метода в стерильные чашки Петри диаметром 100 мм, расположенные на горизонтальной поверхности, наливают по 20 мл расплавленного питательного агара. Перед посевом поверхность среды должна быть подсушена для того, чтобы посевной материал мог ровно распределиться и легко впитаться. В качестве посевного материала используется суточная культура тест-организма, приготовленная с агаровой культуры. 100 мкл бактериальной взвеси наносится на поверхность агара и равномерно распределяется шпателем. Затем на поверхность засеянной среды стерильным пинцетом накладывают диски, пропитанные различными антибиотиками. В каждой чашке может быть испытано действие нескольких антибиотиков (до 5 или 6). Непосредственно после аппликации дисков чашки Петри помещают в термостат кверху дном и инкубируют при температуре 37 ºС в течение от 18 до 24 часов.

Оценка результатов ведется по наличию зон задержки роста микробов вокруг дисков, что свидетельствует либо о чувствительности возбудителя к препарату, либо об его устойчивости к данному антибиотику (рисунок 7).

Отсутствие роста тест-организма на расстоянии более 10 мм от диска с антибиотиком будет указывать на чувствительность штамма. Если же тест-микроорганизм развивается в непосредственной близости от диска, пропитанного антибиотиком, то это означает, что данный микроорганизм устойчив к действию антибиотика. Диаметр зон задержки роста с учетом диаметра самого диска измеряют с точностью до 1 мм (рисунок 5).

 

                                       1        2       3                        4

 

 

 

                                                                                                 5

А

                                   

 

1 – тест-организм, посеянный «газоном»; 2 – стандартные диски, содержащие антибиотики; 3 – устойчивость тест-организма;

4 – чувствительность тест-организма; 5 – плотная питательная среда,

благоприятная для роста тест-организма

Рисунок 5 – Схема определения антибиотикорезистентности

диско-диффузионным методом

 

2.3.3 Метод последовательных разведений

 

Данный метод используется для определения количества антибиотика в культуральных жидкостях, растворах или экстрактах. Для работы подготавливаем питательный бульон, пригодный для развития выбранного тест-организма. Непременное условие – бульон должен быть прозрачным. Одновременно с этим подготавливаем и культуру тест-организма. Стерильный питательный бульон разливаем в чистые стерильные пробирки. Количество бульона должно обеспечивать нужную степень разведения изучаемого антибиотика (рисунок 6).

                     1:1    1:2    1:4    1:8    1:16  1:32  1:64  1:128 1:256 1:512

 

5мл сброс

Рабочий раствор антибиотика

                    

 

Рисунок 6 – Алгоритм определения чувствительности одной исследуемой культуры к одному АБП методом разведений

в жидкой питательной среде.

 

Подготавливаем ряд пробирок с питательным бульоном (по 5 мл). В первую пробирку вносим 5 мл испытуемого раствора антибиотика (разведение 1:1), тщательно перемешиваем и 5 мл смеси переносим во вторую пробирку (разведение 1:2). Затем 5 мл смеси последовательно переносим в 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9 и 10 пробирку в результате получая разведения 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128; 1:256; 1:512 как показано на рисунке 6. Из последней пробирки 5 мл бульона удаляем.

В полученный ряд разведений антибиотического вещества в каждую пробирку вносим по 50 мкл клеток тест-организмов. Затем пробирки помещаем в термостат продолжительностью от 20 до 24 часов при температуре 37 ºС. После этого в пробирках определяем визуально наличие или отсутствие роста тест-организма по сравнению с контролями. В опыте используются три контроля: контроль среды, контроль антибиотика, контроль микроорганизма. Наличие роста микроорганизма в бульоне (помутнение бульона) или на поверхности агара свидетельствует о том, что данная концентрация антибиотика недостаточна, чтобы подавить его жизнеспособность. По мере увеличения концентрации антибиотика рост микроорганизма ухудшается. Первую наименьшую концентрацию антибиотика (из серии последовательных разведений), где визуально не определяется бактериальный рост принято считать минимальной подавляющей концентрацией (МПК).

На основании получаемых количественных данных (диаметра зоны подавления роста антибиотика или значения МПК) микроорганизмы подразделяют на чувствительные, умеренно чувствительные и резистентные. Затем мы отбираем те антибиотики, к которым условно-патогенные микроорганизмы оказались умеренно чувствительными, а бактерии рода Bacillus – устойчивы, для дальнейшего совместного использования антибиотика и пробиотика.

На основании полученных данных была проведена статистическая обработка. Были посчитаны средние значения с ошибкой средней, достоверность результатов. Для обработки данных использовалось программное обеспечение Microsoft Office Excel, которое является модулем программного обеспечения анализа и обработки данных AtteStat.

 

2.4 Методы определения влияния комплексного применения антибиотиков и пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus на течение сальмонеллезной инфекции in vivo

 

2.4.1 Определение колонии образующих единиц

 

Для выделения Bacillus из экскрементов применялся мясопептонный агар. Исходя из того, что Bacillus являются спорообразующими микроорганизмами, то для их выделения необходимо было провести предварительную термическую обработку с целью уничтожения других форм микроорганизмов. Навеску (0,5 г) разводят в NaCl, проводят десятикратное разведение. В первую пробирку вносим 0,5 г экскрементов и 5 мл NaCl (разведение 1:1), перемешиваем и перносим 5 мл смеси во вторую пробирку (разведение 1:2). Затем 5 мл смеси последовательно переносим в 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9 и 10 пробирку в результате получая разведения 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128; 1:256; 1:512. Затем исследуемый материал подвергался термической обработке – кипячение в течение 10 минут при 100ºC. Затем из каждой пробирки забирается по 30 мкл суспензии и   засевается на чашку Петри. Посевы инкубируют при (36 ± 1) ºС в течение 24 ч. После этого производят учет результатов выросших колоний.

Для выделения Salmonella enteritidis использовалась среда ВСА (висмут-сульфит агар). Метод выделения Salmonella enteritidis основан на высеве определенной массы (количества) экскрементов на среду висмут-сульфит агар, инкубировании посевов, учете результатов.

Схема опыта такова: навеску (0,5 г) разводят в NaCl, проводят десятикратное разведение. В первую пробирку вносим 0,5 г экскрементов и 5 мл NaCl (разведение 1:1), тщательно перемешиваем и 5 мл смеси переносим во вторую пробирку (разведение 1:2). Затем 5 мл смеси последовательно переносим в 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9 и 10 пробирку в результате получая разведения 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128; 1:256; 1:512. Затем из каждой пробирки забирается по 30 мкл суспензии и   засевается на чашку Петри. Посевы инкубируют при (36 ± 1) ºС в течение 24 ч. После этого производят учет результатов выросших колоний.

На висмут-сульфит агаре – колонии черные с характерным металлическим блеском, а также зеленоватые с темно-зеленым ободком и с пигментированием среды под колонией.

 

2.4.2 Методы общего морфологического и биохимического анализа крови

 

Морфологический анализ крови включал определение концентрации лейкоцитов, эритроцитов, гемоглобина, скорости оседания эритроцитов, и изменения происходящие в лейкоцитарном профиле проводили с использованием традиционных методик (Карпуть И.М., 1986).

Биохимические исследования включали в себя уровень содержания:

- общего, прямого и непрямого билирубина по методу Йендрашика-Клеггорна-Грофа;

- общего белка в сыворотке (плазме) крови биуретовым методом (методом Кингслея-Вейксельбаума);

- альбумина в сыворотке крови методом, основанным на биуретовой реакции (Случкий Л.И., 1964);

- мочевины в сыворотке крови по цветной реакции с диацетилмонооксимом;

- креатинина в сыворотке крови по цветной реакции Яффе (метод Поппера);

- холестерина в сыворотке крови прямым методом, основанном на реакции Лимберман-Бурхард (метод Илька);

- щелочной фосфотазы в сыворотке крови по гидролизу п-нитрофенилфосфата;

Для определения иммунологического статуса сыворотку крови от экспериментальных животных исследовали на лизоцимную и бета-литическую активность.

Бета-литическая активность определялась по О.В. Бухарину(1971), лизоцимная активность сыворотки определялась по О.В. Бухарину (1971) с применением суточной культуры Microccocus Lisodeicticus (штамм 2665 ГКИ им. Л.А. Тарасевича);

Результаты исследований, полученные в ходе работы, были обработаны на IBM совместимом персональном компьютере с помощью программы «Biostat».

На первом этапе провели общестатистическую оценку показателей крови животных, а именно определяли: Х – среднюю арифметическую, s - ошибку средней арифметической. Проверку принятой гипотезы, осуществляли через степень различия между изучаемыми объектами с помощью критерия Стьюдента (t-критерий).

 

2.4.3 Гистологический метод исследования органов и тканей лабораторных крыс

 

Гистологические методы исследования применяются для изучения строения и функции клеток и тканей человека, животных и растительных организмов в норме, патологии и эксперименте. Основой гистологического метода исследования является гистологическая техника — комплекс методических приемов, используемых при изготовлении препаратов клеток и тканей для их микроскопического исследования. Микроскопическое изучение клеток и тканей может проводиться двумя основными путями в зависимости от состояния исследуемого объекта: исследование живых клеток и тканей, исследование неживых клеток и тканей, сохраняющих структуру благодаря специальным приемам фиксации. Для нас больше интересен второй вариант микроскопического изучения, а именно метод исследования фиксированных объектов. Он применяется в основном  в медицинских исследованиях, особенно в практике патолого-анатомических лабораторий.

Цель фиксации сохранить прижизненную структуру клеток и тканей путем быстрого воздействия на них химическими агентами, предотвращающими развитие посмертных изменений. Выбор метода фиксации зависит от задач исследования и особенностей фиксируемого материала. Универсальным фиксатором является формальдегид, применяемый в виде 10% раствора формалина. Чтобы фиксация была равномерной и полной, кусочки ткани должны быть небольшими, а объем фиксирующей жидкости — во много раз превосходить объем фиксируемого материала. По окончании фиксации кусочки обычно промывают в воде или спирте. Твердые компоненты тканей (например, отложения солей кальция) удаляют с помощью методов декальцинации.

Кусочки тканей, как правило, заливают в уплотняющие среды – парафин или целлоидин. Фиксированную ткань обезвоживают в спиртах возрастающей крепости, проводят через промежуточный растворитель (ксилол или толуол для парафина, спирт-эфир для целлоидина) и пропитывают парафином или целлоидином. Заливка в парафин позволяет получить более тонкие срезы (от 5-8 до 1-2 мкм), чем заливка в целлоидин. Далее срезы (толщиной от 90-100 до 5-15 нм), необходимые для электронно-микроскопических исследований, готовят на ультратоме. Ультратомы используют и в световой микроскопии для получения полутонких срезов. Приготовленные срезы окрашивают для четкого выделения структур клеток и тканей основным красителем, а именно гематоксилином. Он окрашивает так называемые базофильные структуры (ядра клеток, основное вещество соединительной ткани).

Приготовление гистологического препарата завершается заключением его в среды, обеспечивающие сохранность структур объекта, его окраски и прозрачности. Наиболее часто для этих целей применяют органические смолы, например канадский бальзам.

Обработка данных включала в себя получение цифровых версий микрофотографий на микроскопе MICROS (Австрия, ув. ´ 1500) и цифровой видеокамеры, которые затем подвергали морфометрической обработке с использованием программы Test-morfo 2,8. После этого проводили общестатистическую оценку полученных данных лабораторных животных, а именно определяли: Х – среднюю арифметическую, s – ошибку средней арифметической. Проверку принятой гипотезы, осуществляли через степень различия между изучаемыми объектами с помощью критерия Стьюдента (t-критерий).

 

2.5 Схема исследования эффективности совместного применения пробиотиков с антибиотиками при лечении сальмонеллеза.

 

Эксперимент выполнялся с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации и в соответствии с требованиями правил проведения работ с использованием экспериментальных животных. В качестве биологического тест-объекта использовали белых половозрелых крыс массой 180-200 грамм. Длительность эксперимента составила 10 дней. В соответствии с поставленными задачами животные разбивались на 14 групп (Приложение А).

Были сформированы контрольные группы:

- общий контроль, где был обычный рацион и условия содержания

- группа в которых оценивали действие пробиотиков (биоспорин, в состав которого входят (B.subtilis+B.licheniformis), споробактерин (B.subtilis),бактисубтилл (B.cereus) на лабораторных крыс.

- группа в которой оценивали действие лабораторной инфекции на организм животных без проведения лечения.

В опытных группах сравнивалась эффективность лечения инфекции антибиотиками, а также комплексное использование антибиотиков и пробиотиков.

Убой животных проводился в количестве трех голов на каждой точке исследований для определения эффективности применения исследуемых препаратов. В качестве точек исследования были установлены следующие сроки: фоновое исследование перед применением препаратов, на пятый и на 10 день после начала эксперимента. Заражение лабораторных животных проводилось однократно перорально. по 0,2 мл смыва суточной агаровой культуры возбудителя сальмонеллеза Salmonella interitidis, содержащей 1,5×10⁶ микробных тел. Введение пробиотиков и антибиотиков проводилось в соответствии с анатацией к препарату. Введение препаратов в опытных группах проводилось через 12 часов с момента заражения, утром задавались антибиотики, вечером пробиотики.

От исследуемых лабораторных животных брались кровь на биохимический, морфологический анализ и определение лизоцимной и бета-литической активности; экскременты для выделения бацилл и сальмонелл, органы – мишени (кишечник и селезенка) на гистологическое исследование.

 

 

 

 

 

 

 

3 Результаты изучения эффективности совместного применения пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus с антибиотиками при лечении сальмонеллезной инфекции.

 

В коррекции микроэкологических нарушений кишечника, развившихся на фоне антибиотикотерапии, наиболее изученным направлением в настоящее время является применение пробиотиков – биологических препаратов на основе представителей нормальной микрофлоры человека. Целесообразность одновременного применения пробиотиков с большинством используемых в клинической практике антибиотиков в настоящий момент является предметом дискуссии, поскольку пробиотические микроорганизмы чувствительны ко многим антимикробным препаратам. Установлено, что антибиотикорезистентность бактерий существенно отличается у различных штаммов. Данные по антибиотикорезистентности необходимо обязательно учитывать при отборе штаммов для конструирования пробиотических препаратов.

 

3.1 Антибиотикорезистентность бактерий рода Bacillus

 

Первоначальным этапом нашего исследования было определение антибиотикорезистентности пробиотических препаратов («Споробактерин», «Бактисубтил», «Биоспорин») на основе бактерий рода Bacillus с применением тест-систем «Bio Merieux» и диско-диффузионного метода.

Критерием отбора антибиотиков для диско-диффузионного метода к которым исследуемые штаммы микроорганизмов проявляли резистентность послужило определение антибиотикочувствительности с использованием тест-систем «Bio Merieux» чтобы отобрать антибиотики, к которым бактерии рода Bacillus устойчивы, а тест-организмы – умеренно-чувствительны. Сравнительные данные по обоим методам приведены в таблицах 1 и 2.

 

Таблица 1 – Сравнительная таблица по антибиотикорезистентности бактерий рода Bacillus, с применением тест-систем «Bio Merieux»

Антибиотики	Исследуемые тест-организмы
	B.subtillis 534	B.cereus 5832	B.lichenoformis 31	B.subtillis 3	S.еnteritidis
1	2	3	4	5	6
Penicilline	R	R	R	R	I
Ampicilline	S	I	R	I	S
Oxacilline	R	R	R	R	S
Amoxicilline	S	S	I	S	S
Piperacilline	S	S	S	S	S
Ticarcilline	R	R	R	R	R
Mezlocilline	S	S	S	R	S
Mecillinam	R	R	R	R	R
Streptomycine	I	I	I	I	I
1	2	3	4	5	6
Kanamycine	S	S	S	S	I
Gentamicine	S	S	S	S	I
Netilmicine	S	S	S	S	I
Cefalotine	I	S	R	I	S
Cefotaxime	I	R	R	R	I
Ceftazidime	R	R	R	R	R
Cefactor	S	S	S	S	S
Cefsulodine	R	R	R	R	R
Cefamandole	S	S	R	R	S
Cefotetan	I	S	R	R	S
Cefoxitine	R	S	I	R	I
Cefoperazone	S	S	S	S	I
Latamoxef	S	S	I	S	S
Imipeneme	R	R	R	R	R
Aztreonam	R	R	R	R	R
Erythromycine	I	I	I	R	S
Pristinamycine	S	R	R	R	I
Tetracycline	R	S	S	R	S
Minocycline	I	S	S	R	S
Vancomycine	S	S	S	S	S
Teicoplanine	S	S	S	S	S
Lincomycine	R	R	R	R	S
Clindomycine	S	S	R	R	R
Chloramphenikol	R	I	I	R	I
Colistine	R	R	R	R	S

 

В таблице 1 представлены антибиотики из тест-систем «Bio Merieux». Ко всем антибиотикам из группы аминогликозидов бактерии рода Bacillus чувствительны. Все 4 штамма бактерии рода Bacillus оказались устойчивы к пенициллину, оксациллину, тикарциллину, мециллинаму (из группы пенициллинов), к цефуроксиму, цефтазидиму, цефлулодину, цефиксиму, цефотаксиму (из группы цефалоспоринов), к имипенему (из группы карбопенемов), к линкомицину (из группы линкозамидов), к хлорамфениколу (из группы левомицетинов), к азтреонаму (из группы монобактамов) и к колистину (из группы полимиксинов). Эти антибиотики нам необходимы в дальнейших исследованиях определениях антибиотикорезистентности диско-диффузионным методом.

Из условно-патогенных микроорганизмов S.еnteritidis умеренно-чувствительна к пенициллину, ко всем антибиотикам из группы аминогликозидов, к цефуроксиму, цефокситину, цефоперазону, цефиксиму, цефотаксиму (цефалоспорины), к хлорамфениколу (левомиценины).

 

3.2 Определение антибиотикорезистентности бактерий рода Bacillus диско-диффузионным методом

 

Антибиотикорезистентность проверяли также диско-диффузионным методом при использовании стандартных дисков, содержащих антибиотики.

 

Таблица 2 – Сравнительная таблица по антибиотикорезистентности бактерий рода Bacillus, входящих в состав пробиотиков, с применением диско-диффузионного метода

Антибиотики	Исследуемые тест-организмы
	B.subtillis 534	B.cereus 5832	B.lichenoformis 31	B.subtillis 3	S. еnteritidis
1	2	3	4	5	8
Penicilline	25,0±0,58	R	R	21,7±0,33**	20,7±0,67**
Ampicilline	26,0±0,58	17,7±0,33***	30,7±0,67	24,3±0,33*	25,7±0,67
Oxacilline	30,3±0,33	14,7±0,33***	26,0±0,58**	22,0±0,58***	R
Streptomycine	25,3±0,33	34,0±0,58	32,0±0,58	32,0±0,58	18,3±0,33***
Kanamycine	27,0±0,58	20,7±0,67**	25,0±0,58	25,0±0,58	22,0±0,58**
Gentamicine	35,0±0,58	30,3±0,88*	29,7±0,33**	29,3±0,33**	23,7±0,33***
Netilmicine	33,3±0,33	34,0±0,58	26,0±0,58***	32,3±0,88	21,3±0,67***
Cefalexine	35,0±0,58	29,7±0,33**	29,7±0,33**	32,3±0,67*	29,3±0,33**
Cefotaxime	36,3±0,67	20,0±0,58***	R	R	12±0,33***
Cefasoline	30,7±0,67	32,7±0,33	32,3±0,33	30,3±0,88	32,0±1,00
Cefixime	20,0±0,58	R	R	15,0±0,58**	29±1.76
Меропенем	34,0±0,58	32,0±0,58	29,3±0,67	35,3±0,33	30,0±0,58**
Imipeneme	45,7±0,67	38,0±1,15**	41,3±0,67*	41,0±0,58**	22,0±0,58***
Aztreonam	R	R	R	R	R
Vancomycine	21,3±0,88	17,7±0,33*	18,7±0,67	16,7±0,67*	22,7±0,33
Tetracycline	25,3±0,33	21,3±0,33**	22,7±0,33**	26,3±0,33	22,0±1,15*
Lincomycine	20,0±0,58	18,0±0,58	21,0±0,58	25,7±0,67	13,3±0,67**
Clindomycine	26,7±0,67	29,3±0,67	27,0±0,58	28,0±0,58	R
Erythromycine	33,0±0,58	28,3±0,88*	26,0±0,58**	30,3±0,33*	R
Chlorampheni-kol	R	22±0,91	24±0,58	27±0,17	13±0,21
Colistine	R	R	R	R	16,7±0,67
Примечание: R – устойчивость к антибиотикам; * Р < 0,05; ** Р < 0,01; *** Р < 0,001.

 

По результатам ДДМ Bacillus licheniformis и Bacillus subtilis оказались устойчивыми к цефотаксиму (цефалоспорины), азтреонаму (монобактамы), а B.cereus и B.licheniformis еще и к пенициллину (пенициллины), а B.subtillis 534 устойчив к хлорамфениколу (левомицетины). Все 4 штамма бактерии рода Bacillus проявили чувствительность к аминогликозидам, тетрациклинам, линкозамидам, макролидам.

Наиболее устойчивым является штамм B.cereus 5832 – он дает наименьшие зоны подавление антибиотиками, а B.subtillis 534 более чувствителен к антибиотикам, так как для него характерны наибольшие зоны подавления роста. S.еnteritidis как тест-организмом является устойчивой ко многим антибиотикам.

Исходя из проведенных предварительных исследований, нами были отобраны те антибиотики, к которым бактерии рода Bacillus оказались устойчивыми, а S.еnteritidis умеренно чувствительна. Это необходимо нам для того, чтобы в дальнейшем применять сочетано антибиотики и пробиотики для лечения экспериментально созданной инфекции, в частности сальмонеллеза. Наибольший интерес для дальнейших исследований представили следующие антибиотики:

- пенициллин (группа пенициллинов) для сочетанного применения с бактисубтилом;

- цефотаксим (группа цефалоспоринов) с биоспорином;

- хлорамфеникол (группа левомицитинов) с споробактерином.

Для проведения дальнейших исследований нам необходимо было определить минимально подавляющие концентрации (МПК) изучаемых антибиотиков на рост исследуемых микроорганизмов. Для определения МПК использовали метод последовательных разведений.

 

Таблица 3 – Определение минимальной подавляющей концентрации пенициллина, цефотаксима, хлорамфеникола методом последовательных разведений

Исследуемые объекты	Антибиотик	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Разведение		1:1	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256	1:512
Концентрация в ЕД		1 млн	500 тыс	250 тыс	125 тыс	62,5 тыс	31,25 тыс	15,63 тыс	7,81 тыс	3,9 тыс	1,95 тыс
B.cereus	Пенициллин	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+
S.etnteritidis		-	-	-	-	-	-	-	-	+	+
Концентрация в г.		5	2,5	1,25	0,63	0,32	0,16	0,08	0,04	0,02	0,01
B.licheniformis 3	Цефотаксим	-	-	-	-	-	+	+	+	+	+
B.subtilis 31		-	-	-	-	-	-	+	+	+	+
S.etnteritidis		-	-	-	-	-	-	-	-	+	+
B.subtilis 534	Хлорамфеникол	-	-	-	-	+	+	+	+	+	+
S.etnteritidis		-	-	-	-	-	-	-	+	+	+

 

Анализ ряда разведений растворов антибиотиков, позволил определить концентрации, которые оказывают бактерицидное и бактериостатическое действие на исследуемые микроорганизмы, а также концентрации, которые не оказывают влияния на рост.

Для определения наличия роста исследуемых микроорганизмов пробирки с посевами просматривают в проходящем свете. Рост культуры в присутствии антибиотика сравнивают с контрольной пробиркой, содержащей исходный инокулюм и хранившейся в холодильнике. МПК определяют по наименьшей концентрации антибиотика, которая подавляет видимый рост микроорганизма.

Следующим этапом проводимых исследований было изучение эффективности совместного применения пробиотиков и антибиотиков при лечении лабораторной инфекции.

Исследования направленные на изученпие эффективности комплексного применения антибиотиков и пробиотиков при лечении лабораторной инфекции проводились на лабораторных животных, а именно белых крысах.

 

3.3 Определение колонии образующих единиц в экскрементах лабораторных животных

 

Для выделения Bacillus из экскрементов применялась среда МПА (мясопептонный агар). Предварительно исследуемый материал подвергался термической обработке – кипячение в течение 10 минут при 100ºC. Для выделения Salmonella enteritidis использовалась среда ВСА (висмут-сульфит агар).

Таблица 4 – Результаты подсчета колонии образующих единиц Bacillus в экскрементах лабораторных животных

Исследуемые группы	Сроки исследования (2-10 день исследования от начала эксперимента)
	2	3	4	5	6	7	8	9	10
К2	30	50	100	170	220	240	260	310	380
К3	24	31	67	82	131	157	204	260	301
К4	21	42	56	78	64	119	147	181	210
О4	31	44	74	107	138	202	240	290	320
О5	19	33	51	84	120	165	201	231	270
О6	17	34	42	57	91	110	136	181	201
О7	22	32	41	87	101	119	131	153	172
О8	18	25	39	43	62	94	118	131	141
О9	15	29	39	54	74	83	91	102	136

 

Из таблицы 4 видно, что наибольшее КОЕ Bacillus отмечалось в контрольных группах, где применялся биоспорин и споробактерин, а также в группе О₄, где производилось заражение и задавался биоспорин.

 

Таблица 5 – Результаты подсчета колонии образующих единиц Salmonella interitidis в экскрементах лабораторных животных

Исследуемые Группы	Сроки исследования (2-10 день исследования от начала эксперимента)
	2	3	4	5	6	7	8	9	10
К1	31	43	57	87	96	150	212	261	286
О1	19	36	41	28	13	0	0	0	0
О2	28	37	48	31	22	8	0	0	0
О3	26	34	51	42	19	10	0	0	0
О4	23	29	49	33	18	7	0	0	0
О5	24	37	45	39	26	11	0	0	0
О6	22	29	44	51	31	22	9	0	0
О7	27	31	37	26	12	0	0	0	0
О8	25	33	42	29	23	14	0	0	0
О9	24	35	45	37	20	7	0	0	0

 

Наибольшее КОЕ наблюдается в контрольной группе, где проводилось только заражение. Что касается остальных групп, то КОЕ на 2 и 3 день во всех группах примерно одинаковое, а затем происходит подъем КОЕ в группе О1 (споробактерин+заражение). К 6-9 дню КОЕ уменьшаются в опытных группах.

 

3.4 Морфологический и биохимический анализ крови лабораторных животных

 

От исследуемых лабораторных животных производили забор крови для гематологических, морфологических исследований и сыворотки крови для биохимических и иммунологических исследований.

В ходе проведенных исследований было установлено, что наиболее значимые изменения отмечаются со стороны таких морфологических показателей как лимфоциты, моноциты, лейкоциты, эритроциты.

 

Таблица 6 – Динамика изменения концентрации лимфоцитов, моноцитов, лейкоцитов в крови лабораторных животных

Исследуемые группы	Ед.измерения	Сроки исследования
		Фоновое	Через 5 суток	Через 10 суток
1	2	3	4	5
Лимфоциты
К0	%	63,43±0,698	58,40±1,193*	58,43±1,822
К1	%	62,23±1,078	77,00±1,155	78.07±1,157
К2	%	59,90±1,498	60,60±2,023	63,80±2,318
К3	%	59,57±2,022	62,90±1,735	65,40±1,833
К4	%	66,20±0,871	67,30±0,906	68,53±0,636
1	2	3	4	5
О1	%	64,33±2,028	76,73±0,897	71,50±1,323
О2	%	59,43±1,822	77.33±0,881	73,00±2,082
О3	%	66,83±0,898	73,67±1,581	73,03±1,605
О4	%	63,77±1,748	76,33±0,881	73,67±1,014
О5	%	60,23±1,748	75,67±1,453	73,97±1,517
О6	%	67,57±1,185	76,13±1,141	73,60±1,955
О7	%	61,80±1,744	74,33±1,453	65.47±2,021
О8	%	60,90±2,108	76,00±1,732	71.67±1.965
О9	%	66.77±1,320	72,30±2,259	73,67±1,260
Моноциты
К0	%	3,63±0,233	3,43±0,338	3,00±0,513
К1	%	2,66±0,441	5,66±0,881	7,33±0,441
К2	%	3,10±0,321	3,43±0,348	3,13±0,296
К3	%	3,26±0,348	3,10±0,264	3,30±0,360
К4	%	2,80±0,173	3,16±0,145	3,10±0,288
О1	%	2,46±0,371	3,90±0,115	4,23±0,145
О2	%	2,73±0,318	3,86±0,233	4,16±0,176
О3	%	2,26±0,240	4,06±0,240	4,10±0,173
О4	%	2.73±0,233	3,86±0,233	3,93±0,318
О5	%	3,20±0,251	5,33±1,764	5,46±0,484
О6	%	2,17±0,202	6,66±1,453	4,53±0,318
О7	%	3,00±0,763	4,66±0,284	4,43±0,120
О8	%	3,56±0,145	5,00±1,155	4.56±0,240
О9	%	3,10±0,173	7,00±1,155	5,80±0,458
Лейкоциты
К0	109/л	8,23±0,1453	9,36±0,240	10,20±0,264
К1	109/л	10,57±0,375	15,40±0,305	17,50±0,513
К2	109/л	11,68±0,574	12,30±0,692	10.65±0,431
К3	109/л	9,64±0,7021	11,40±0,416	11,40±0,608
К4	109/л	10,60±0,461	11,97±0,589	12,03±0,348
О1	109/л	10,57±0,547	14,40±0,264	13,33±0,272
О2	109/л	10,00±0,435	14,77±0,176	13,83±0,185
О3	109/л	11,50±0,346	15,90±1,464	14,30±0,346
О4	109/л	10,33±0,202	15,03±0,145	14,43±0,202
О5	109/л	11,13±0,176	15,23±0,176	13,60±0,152
О6	109/л	10,73±0,497	16,13±1,920	14,00±0,208
О7	109/л	10,33±0,523	13,03±0,917	13,53±0,260
О8	109/л	10,95±1,041	14,63±0,272	13,47±0,296
О9	109/л	10,63±0,463	14,50±0,360	14,00±0,208
Примечание: R – устойчивость к антибиотикам; * Р < 0,05; ** Р < 0,01; *** Р < 0,001.

 

Из таблицы 6 видно, что при фоновом исследовании концентрация исследуемых показателей находится в пределах физиологической нормы во всех группах экспериментальных животных.

Через пять дней исследования регистрируются повышение концентрации лимфоцитов в группах К₁ (23,73 %), О₂ (30,12 %) с выходом значений за пределы физиологической нормы. В группах О₁, О₄, О₅,О₆, О₇, О₈ на пятый день концентрация лимфоцитов не превышала верхней границы нормы. На 10 день исследования только в группе К₁ (25,45 %) исследуемое значение превышает показатели физиологической нормы.

Концентрация моноцитов через пять дней исследования в группах К₁ (112,78 %), О₅ (66,56 %), О₆ (206,91 %), О₇ (53,33 %), О₈ (40,45 %), О₉ (125,81 %) превышает значения физиологической нормы, а в группах О₁, О₂, О₃, О₄ аналогичный показатель находится в верхней границе нормы. Высокие значения моноцитов на 10 день исследования регистрировались в группах К₁ (175,56 %), О₅ (70,63 %) и О₉ (87,09 %).

Уровень лейкоцитов к пятому дню исследования в группах К₁, О₃, О₄, О₅, О₆ превышал значения физиологической нормы и фонового исследования на 45,69 %, 38,26 %, 45,49 %, 36,84 % и 50,33 %, соответственно. На 10 день в только в группе К₁ регистрировалось превышение физиологических значений, данный показатель по отношению к фоновому исследованию был выше на 65,56 %, а в группах О₃, О₄, О₆, О₉ в пределах верхней границы физиологической нормы. В остальных экспериментальных группах и на пятый, и на 10 день уровень лейкоцитов находился пределах в нормы.

 

Таблица 7 – Динамика изменения концентрации эритроцитов в крови лабораторных животных

Исследуемые группы	Ед.измерения	Сроки исследования
		Фоновое	Через 5 суток	Через 10 суток
Эритроциты
К0	1012/л	9,00±0,152	8,66±0,202*	8,43±0,233
К1	1012/л	8,73±0,120	8,46±0,260	7,56±0,145**
К2	1012/л	8,66±0,233	8,33±0,240	7,83±0,176*
К3	1012/л	8,73±0,318	8,43±0,371	8,30±0,230
К4	1012/л	8,56±0,348	8,30±0,230	8,56±0,352
О1	1012/л	8,33±0,240	7,76±0,145	8,16±0,202
О2	1012/л	8,76±0,296	8,00±0,321	8,03±0,328
О3	1012/л	8,76±0,328	7,83±0,348*	7,76±0,044**
О4	1012/л	8,76±0,260	8,26±0,088	7,86±0,145*
О5	1012/л	8,83±0,088	8,46±0,145	7,46±0,120***
О6	1012/л	8,73±0,328	8,73±0,318	7,86±0,202**
О7	1012/л	8,70±0,305	7,76±0,218	7,66±0,290
О8	1012/л	5,90±2,610	7,93±0,218	7,60±0,173
О9	1012/л	8,40±0,288	8,03±0,393	7,70±0,321**
Примечание: R – устойчивость к антибиотикам; * Р < 0,05; ** Р < 0,01; *** Р < 0,001.

Из таблицы 7 видно, что концентрация эритроцитов на всех сроках исследования во всех группах находилась в пределах нормы.

Для полноты картины происходящих в организме изменений и эффективности комплексного лечения экспериментальной инфекции нами оценивались гематологические показатели крови лабораторных животных, такие как скорость оседания эритроцитов и гемоглобин. Наиболее значимые изменения регистрировались при изучении СОЭ.

 

Таблица 8 – Динамика изменения концентрации СОЭ и гемоглобина в сыворотке крови лабораторных животных

Исследуемые группы	Ед.измерения	Сроки исследования
		Фоновое		Через 5 суток		Через 10 суток
Скорость оседания эритроцитов
К0	мм/час		2,53±0,202		2,96±0,260	2,73±0,290
К1	мм/час		3,06±0,348		4,53±0,375	6,26±0,393
К2	мм/час		2,70±0,230		3,13±0,233	2,70±0,264
К3	мм/час		2,90±0,264		2,80±0,360	2,66±0,272
К4	мм/час		3,26±0,185		3,00±0,208**	2,83±0,176
О1	мм/час		2,86±0,202		4,36±0,240	4,23±0,338
О2	мм/час		2,60±0,321		5,10±0,264	4,83±0,272
О3	мм/час		2,56±0,176		4,70±0,305	4,10±0,378
О4	мм/час		3,16±0,185		5,20±0,264	4,60±0,264
О5	мм/час		2,63±0,202		5,40±0,264	5,06±0,145
О6	мм/час		2,43±0,145		5,33±0,318	5,06±0,272
О7	мм/час		3,46±0,318		4,40±0,264	3,80±0,208
О8	мм/час		3,03±0,318		4,56±0,260	4,23±0,409
О9	мм/час		2,30±0,173		4,76±0,290	4,23±0,504
Гемоглобин
К0	г/л	118,80±0,841		121,00±0,895		124,80±0,871
К1	г/л	121,80±2,210		119,20±0,898		118,60±2,055
К2	г/л	119,30±1,968		123,50±0,814		124,40±0,445
К3	г/л	118,30±1,202		123,40±0,537		124,80±0,700
К4	г/л	119,00±2,082		120,30±2,603		123,10±0,889
О1	г/л	125,20±0,841		119,60±1,332*		120,30±0,811*
О2	г/л	123,30±0,751		120,70±0,926		121,60±0,787
О3	г/л	122,70±0,435		120,50±1,162*		123,60±0,560
О4	г/л	123,50±0,655		127,50±0,622		124,80±1,417
О5	г/л	124,50±0,351		124,90±1,675		120,40±1,312*
О6	г/л	118,00±0,949		121,60±0,440		122,70±1,099
О7	г/л	123,60±1,885		119,90±1,705		119,30±1,996
О8	г/л	125,60±1,320		120,30±1,328*		121,60±1,502
О9	г/л	121,00±0,990		121,70±0,896		124,20±0,788
Примечание: R – устойчивость к антибиотикам; * Р < 0,05; ** Р < 0,01; *** Р < 0,001.

 

При фоновом исследовании СОЭ находилась в пределах нормы во всех группах. На 5 день исследования показатели СОЭ превышали значения фонового исследования в группах К₁ и всех опытных (О₁-О₉) на 48,04 %, 52,45 %, 96,15 %, 83,59 %, 64,56 %, 105,32 %, 119,34 %, 27,17 %, 50,49 %, 106,96 %, соответственно. К 10 дню исследования данный показатель превышал значения физиологической нормы и фоновые значения в группах К₁, О₂, О₄, О₅, О₆ на 104,58 %, 85,77 %, 45,57 %, 92,39 %, 108,23 %, соответственно. СОЭ в группах О₁, О₃, О₇, О₈, О₉ снижается и до пределов верхней границы физиологической нормы.

Гемоглобин во всех исследуемых группах находится в пределах нормы на всех сроках исследования.

При изучении изменений происходящих со стороны биохимических показателей сыворотки крови достоверных и значимых изменений зарегистрировано не было.

Для оценки эффективности влияния пробиотических штаммов бактерий рода Bacillus на показатели неспецифического иммунитета нами исследовались такие показатели, как лизоцимная и бета-литическая активность сыворотки крови (т).

 

Таблица 9 – Лизоцимная и бета-литическая активность сыворотки крови лабораторных животных

Исследуемые группы	Ед.измерения	Сроки исследования
		Фоновое	Через 5 суток	Через 10 суток
Лизоцим
К0	мкг/мл	5,22±0,520	2,70±0,458*	3,533±0,203*
К1	мкг/мл	4,83±0,549	12,27±0,644	14,3±0,603
К2	мкг/мл	2,52±0,754	12,03±0,841	14,27±0,617
К3	мкг/мл	3,033±0,353	15,08±0,549	17,33±0,569
К4	мкг/мл	4,20±0,871	14,30±0,906	16,53±0,636
О1	мкг/мл	4,38±0,565	8,47±0,537	8,20±0,625
О2	мкг/мл	4,18±0,524	9,60±0,404	9,23±0,722
О3	мкг/мл	6,83±0,898	11,67±0,581	13,03±1,605
О4	мкг/мл	6,17±2,23	10,87±0,90	12,53±0,783
О5	мкг/мл	5,13±0,578	10,23±0,775	11,40±0,656
О6	мкг/мл	4,57±0,185	10,13±0,141	13,60±0,955
О7	мкг/мл	5,60±0,322	8,633±0,348	8,533±0,376
О8	мкг/мл	6,68±0,696	7,77±0,353	5,53±0,67
О9	мкг/мл	5,74±0,320	9,24±0,259	8,89±0,267
Бета-лизин
К0	%	26,81±0,941	22,71±1,158	23,53±0,803
К1	%	28,25±1,05	34,80±1,079	36,13±1,147
К2	%	29,23±0,924	38,22±1,197	39,99±0,963
К3	%	28,40±1,601	29,82±1,116	33,25±0,925
К4	%	27,80±0,173	37,16±0,145	38,10±0,288
О1	%	29,23±0,769	30,00±0,954	31,50±0,569
О2	%	30,27±0,845	30,31±1,343	30,23±0,962
О3	%	28,26±0,240	36,06±0,240	40,10±0,173
О4	%	31,00±0,781	32,93±1,392	33,93±1,487
О5	%	29,13±0,982	32,53±0,593	33,23±1,519
О6	%	2,717±0,202	33,66±1,453	37,53±0,318
О7	%	27,07±0,987	28,33±1,017	29,93±1,415
О8	%	28,76±1,074	29,57±2,092	30,20±1,905
О9	%	25,10±0,173	30,06±1,155	33,00±0,458
Примечание: R – устойчивость к антибиотикам; * Р < 0,05; ** Р < 0,01; *** Р < 0,001.

Из таблицы 9 можно сделать вывод, что применение пробиотических препаратов способствует активации показателей неспецифической резистентности, таких как лизоцим и бета-лизин. Вскоре после приема исследуемых пробиотических препаратов начинают выделяться биологически активные вещества и функционировать системы микробных клеток, оказывающие как прямое действие на патогенные и условно патогенные микроорганизмы, так и опосредованное - путем активации специфических и неспецифических систем защиты макроорганизма. Эффект при применении биоспорина значительно выше в сравнении со споробактерином и бактисубтилом. Это достигается тем, что в состав биоспорина которого (пожалуй, единственного из пробиотиков на основе бацилл) входят не один, а два штамма – B.subtilis и В.licheniformis. Они дополняют друг друга по спектру антагонистической активности, продукции ферментов и аминокислот и, что очень важно, не подавляют при этом резидентные микроорганизмы. При этом B.subtilis 3 является генно-модифицированным и способен продуцировать интерферон α, который является фактором неспецифической резистентности.

 

3.5 Гистологическое исследование органов-мишеней лабораторных крыс

 

Для гистологического исследования производили отбор образцов тонкого отдела кишечника и селезенки. Обработка гистоматериала, получение и окрашивание гистопрепаратов производили по традиционной методике.

При исследовании фоновых значений тонкого отдела кишечника было установлено, что во всех исследуемых группах признаки патологических изменений слизистой оболочки отсутствовали. Сосудистая реакция сводилась к полнокровию сосудов (венул) поверхностных слоев слизистой оболочки, чаще в области ворсинок. Расщепление верхушек последних обеспечивает увеличение поверхности всасывания слизистой оболочки (рис.7 А).

Рисунок 7 – Тонкий кишечник крысы. Общий контроль (окрашивание гематоксилином). А – ув.×150 ворсинки и крипты;

Б – ув.×1500 крипта

 

Крипты без изменений, слабо инфильтрованы лимфоцитами. Малодифференцированные энтероциты донной части крипт митотически активны, имеют выраженную базофилию ядра. В криптах хорошо выражено формирование бокаловидных клеток (рис.7Б).

На пятый день исследования в группе К₁ на всем протяжении слизистой оболочки кишечника выражены: гиперемия, кровоизлияния и периваскулярные отеки. Хорошо просматривалось лимфоидные образования в подслизистом слое, в которых имеются точечные кровоизлияния и переваскулярные отеки.

Ворсинки укороченные, их основа истончается, нарушается микроцеркуляция. Выражена вакуолизация эпителия ворсинок (рис.8А). Видна мелкоклеточная инфильтрация основы ворсинок и местами формирование лимфоидных узелков. Крипты укороченные с расширенными просветами, вокруг крипт гемокапилляры расширены. В энтероцитах крипт наблюдалась слабая базофилия (рис.8Б), митотическая активность снижена, происходит дезорганизация крипто-ворсиночного комплекса. Наблюдался также и лизис мембран энтероцитов. Ядра энтероцитов прозрачные, ядрышки разрушены (рис.8Б). Видны «цепочки» мигрирующих лимфоцитов между криптами. В отдельных криптах можно было увидеть фигуры митоза, как следствие включения адаптивно-приспособительных механизмов.

 

 

Рисунок 8 – Тонкий кишечник крысы в группе К1(заражение). (окрашивание гематоксилином). А – ворсинки; Б – крипта, ув.× 1500

 

В группах К₂, К₃, К₄ признаки патологии отсутствовали. Сосудистая реакция сводится к полнокровию сосудов поверхностных слоев слизистой оболочки. Сохраняется целостность ворсинок, в которых хорошо развита соединительно-тканная основа и микрососуды.

В эпителии основания ворсинок увеличено содержание бокаловидных энтероцитов (рисунок 9А) Крипты нормально удлинённой формы, имеют четко выраженные просветы без признаков отёчности (рисунок 9Б).

 

Рисунок 9 – Тонкий кишечник крысы в группах К₂, К₃, К_4. (окрашивание гематоксилином). А – ворсинки; Б – крипта, ув.× 1500

 

В опытных группах О₄ изменения в слизистой оболочке кишечника минимальны. Сосудистая реакция сводится к полнокровию сосудов (венул) в области основания ворсинок. Сосуды паретически расширены, с тромбами. Ворсинки сохраняют нормальную структуру, численность бокаловидных энтероцитов в эпителии также в пределах нормы. Крипты не имеют изменений: границы, ядро и ядрышки энтероцитов хорошо выражены.

В опытных группах О₅, О₆, О₃ патологические изменения минимальны и сводятся к отёку стромы. Ворсинки сохраняют свою целостность, имеют характерную для физиологической нормы высоту, хорошо развита соединительнотканная основа ворсинок и микрососуды. Крипты удлинённой формы с незначительными периваскулярными отёками.

В опытных группах О₁, О₂ на всем протяжении слизистой оболочки выражены: отёки, кровоизлияния, гиперемия, поверхностный некроз и изъязвления слизистой оболочки (рис.10А). Лимфоидные образования слизистой хорошо выражены, полнокровны, имеют набухший вид. В области крипт повышенная секреция, слущивание эпителия, который скапливается в их расширенных частях (рис.10Б) вместе со слизью и лейкоцитами, видна мелкоклеточная инфильтрация.

 

Рисунок 10 – Тонкий кишечник крысы в группах О₁, О_2. (окрашивание гематоксилином). А – ворсинки ув.× 600; Б – крипта, ув.× 1500

 

В группах О₇, О₈, О₉ изменения в слизистой оболочке минимальны. Сосудистая реакция сводится к полнокровию сосудов (венул) поверхностных слоев слизистой оболочки, чаще в области ворсинок. Последние имеют правильную структуру, все виды энтероцитов без признаков патологии. Крипты правильно удлинённой формы, имеют просветы. Признаков отёчности не наблюдается.

На 10 день исследования в группе К₀ изменений не происходило. В группе К₁ на всем протяжении слизистой оболочки кишечника отёк, кровоизлияния, гиперемия, поверхностный некроз и изъязвления слизистой оболочки. Лимфоидные образования слизистой хорошо выражены, имеют набухший вид, полнокровные сосуды, имеются точечные кровоизлияния (рис.11А). Ворсинки укороченные, основа их истончена. Регистриртровалась массовая вакуолизация эпителия ворсинок и лизис мембран энтероцитов крипт. Наблюдалась слабая базофилия и выраженная вакуолизация энтероцитов крипт. В комплексе ворсинка-крипта нарушена регенерация эпителия.

В группах К₂, К₃, К₄. признаки патологии отсутствовали. Сосудистая реакция сводится к полнокровию сосудов поверхностных слоёв слизистой оболочки. Целостность ворсинок сохраняется, хорошо развита соединительнотканная основа ворсинок и микрососуды (рисунок 11Б). Микрососуды имеют нормальную структуру и степень наполнённости.

 

          

 

Рисунок 11 – Тонкий кишечник крысы в группах О₁, О_2. (окрашивание гематоксилином). А – лимфоидное образование ув.× 600; Б – ворсинки

 

В группах О₄,О₅,О₆ патологические изменения в слизистой оболочке минимальны, сосудистая реакция сводится к полнокровию ее сосудов. Подслизистая основа слизистой оболочки инфильтрируется лимфоцитами, скопление которых происходит преимущественно вокруг сосудов. Строение ворсинок и крипт в норме.

В группах О₁, О₂ местами наблюдалась отёк и кровоизлияния. Повышенная секреция эпителия крипт, массовое слущивание эпителия, который скапливается в расширениях желез вместе со слизью и лейкоцитами. Местами наблюдается вакуолизация энтероцитов крипт. Ворсинки имеют характерное для нормы строение. В группе О₃ изменения в слизистой минимальны. Сосудистая реакция сводится к полнокровию сосудов поверхностных слоёв слизистой оболочки, чаще в области ворсинок. В группе О₇ изменения в слизистой минимальны. Признаки патологии отсутствовали. Целостность ворсинок сохранена. Крипты удлинённой формы без признаков отечности. Микрососуды имеют нормальные структуры и степень наполненности. В группе О₈,О₉ изменения в слизистой минимальны. Признаки патологии отсутствовали, имелся небольшой отёк стромы. Крипты незначительно расширены. Ворсинки имели нормальные размеры.

В тонком кишечнике производились следующие замеры: диаметр гемокапиляров крипт и ворсинок (приложение Б), высота ворсинок, диаметр энтероцитов ворсинок (приложение В), диаметр ядер энтероцитов ворсинок, диаметр крипт (приложение Г), диаметр энтероцитов крипт, диаметр ядер энтероцитов крипт (приложение Д). Все данные представленые ввиде таблиц, подтверждают вышеизложенное описание. Значения изменяются достоверно внутри группы относительно фонового значения.

На всех сроках исследования во всех исследуемых группах изменения в гистологии селезенки не были выявлены (рисунок 12 А, Б). Во всех случаях селезенка полнокровна на всем поле препарата.

 

 

 

Рисунок 12 – Селезенка (окрашивание гематоксилином). А – тельце Мальпиги ув.× 600; Б – мышечная тробекула

 

Возможно изменения можно было бы увидеть, если бы прошел более длительный срок. Лимфоидные элементы образующиеся в селезенке реагируют контактно с кишечником. Можно сказать, что иммунная реакция была, но местная – в тонком кишечнике.

В селезенке проводились замеры: диаметра мальпигиевых телец, отношении красной пульпы к белой (приложение Е), диаметр тробекулы, диаметр эксцентричной артерии (приложение Ж), толщина капсулы (приложение З). Данные представлены также в виде таблиц. Значения изменяются достоверно внутри группы относительно фонового значения.

При экспериментально созданной лабораторной инфекции в частности сальмонеллезе, патоморфологические изменения в слизистой оболочке кишечника крыс эффективно снимает: применение пробиотика биоспорина и его сочетания с антибиотиком цефотаксимом. Менее эффективно патоморфологические изменения в слизистой оболочке кишечника крыс снимает: применение пробиотика споробактерина и его сочетание с хлорамфениколом. Наименьший эффект оказывает: применение пробиотика бактисубтила и его сочетания с пенициллином.

Заключение

 

Широкое распространение резистентных форм патогенных и условно-патогенных микроорганизмов является результатом неэффективности или снижением эффективности ряда антибиотиков. Это в свою очередь требует создания и разработки новых антибактериальных препаратов с улучшенными свойствами, либо поиска новых продуцентов антибиотических веществ. Способностью вырабатывать антибиотики обладают не все микроорганизмы, а лишь некоторые штаммы отдельных видов. Многие ученые изучали способность вырабатывать антибиотикоподобные вещества пробиотическими препаратами на основе штаммов спорообразующих бактерий рода Bacillus. Антагонистические свойства этих бактерий привлекают к себе внимание многих разработчиков. В ходе экспериментов была установлена наиболее выраженная антагонистическая активность бактерий рода Bacillus по отношению к условно-патогенному микроорганизму Salmonella interitidis.

Применение антибактериальных препаратов приводит к нежелательным последствиям, нарушает состав и активность нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта. К сожалению, в настоящее время нельзя полностью отказаться от использования антибактериальных препаратов в клинической практике. Это обусловливает необходимость поиска эффективных мер профилактики их негативного влияния на микроэкологическую среду организма человека. Накопленные научные данные подтверждают эффективность совместного использования антибиотиков и пробиотиков. А именно, что комплексное применение пробиотика с антибиотиком может не только предотвратить развитие дисбактериоза, но и усилить эффект подавления патогенной и условно-патогенной микрофлоры, путем выработки пробиотиком антибиотикоподобных веществ, которые оказывают влияние на другую мишень действия.

В наших исследованиях в качестве объектов для изучения были выбраны штаммы бактерий, входящих в состав пробиотических препаратов «Споробактерин», «Бактисубтил», «Биоспорин».

Проведенные исследования позволили сделать следующие выводы:

1) установлена родовая устойчивость бактерий рода Bacillus к цефтазидиму, азтреонаму, колистину и видовая устойчивость B.cereus к пенициллину, B.subtilis 534 к хлорамфениколу; B.licheniformis 31 и B.subtilis 3 к цефотаксиму.

2) в отношении сальмонеллезной инфекции оказалось эффективным совместное применение B.subtilis 534 с пенициллином, а также B.licheniformis 31 и B.subtilis 3 с цефотаксимом, по отношению к S.aureus, B.cereus с пенициллином;

4) установлено, что на основании подсчета КОЕ Salmonella enteritidis при исследовании экскрементов от экспериментальных животных установлено, что наиболее эффективным является совместное применения биоспорина с цефотаксимом;

5) на основании исследования морфологических и гематологических показателей крови было установлено, что комплексное применение антибиотиков и пробиотиков при лечении кишечной инфекции, вызванной Salmonella enteritidis, является эффективным, так как во всех опытных группах исследуемые показатели к 10 дню имеют значения в переделах нормы в отличие от контрольной группы заражения;

6) установлено стимулирующее действие исследуемых пробиотических штаммов на бета-литическую и лизоцимную активность сыворотки крови.

7) на основании гистологического исследования органов мишеней установлено, что применение пробиотиков при лечении кишечной инфекции вызванной Salmonella enteritidis является эффективным, так как предотвращает развитие патологических изменений.

 

 

            

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список использованных источников

 

1 Рахманова, А.Г. Кишечные инфекции (стратегия и тактика лечения) / А. Г. Рахманова, В. А. Неверов, В. К. Пригожина// Лечащий врач. – 2001. – № 12. – С. 53-56.

2 Покровский, В. И. Руководство по клинике, диагностике и лечению опасных инфекционных болезней ред. Покровский В.И., Иванов К.С. // Москва: Медикас, 2003. – 221 с.

3 Шувалова, Е. П. Кишечные инфекции и инвазии / Е. П. Шувалова // Инфекционные болезни. – Ростов-на-Дону, 2001 – 960 с.

4 Ющук, Н.Д. Лекции по инфекционным болезням: учеб. для вузов / Н. Д. Ющук, Ю. Я. Венгеров //. – М., 1999.

5 Сидорчук, А. А Инфекционные болезни животных / А. А. Сидорчук, Б. Ф. Бессарабов, Е. С. Воронин// – Москва: КолосС, 2007. – 671 с.

6 Кузнецов, А. Ф. Справочник ветеринарного врача/ А.Ф Кузнецов //. – Москва: Лань, 2002. – 896 с.

7 Бойченко, М.Н. Сальмонеллез: Распространение возбудителя в организме / М. Н. Бойченко // Журнал микробиологии и эпидемиологии. – 2000. – № 5. – С. 9-13.

8 Cheigton, W.D., Circulationg immunecomplexes in infections diseases / P. H. Zambent, P. A. Mischer // Jmmunologie. – 1993. – V. 111. – № 11. – P. 1219-1227.

9 Гавриш, В.Г. Сальмонеллезная инфекция у животных / В. Г. Гавриш // Справочник ветеринарного врача. – Ростов-на-Дону: Феникс, 2003. – 576 с.

10 Мельников, В.И. Ферменты патогенности и токсины бактерий / В. И. Мельников, М. Г. Гимранов //– М.: Медицина, 2001. – 252 с.

11 Покровский, В.И. Инфекционные болезни и эпидемиология / В.И. Покровский, С.Г. Пак, Н.И. Брико, Б.К. Данилкин // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. – Москва. – 2004. – 816 с.

12 Webster, D. M. Antibody – antigen interactions / D. M. Webster // Curr. Opinion struct. Biol. – 2002. – № 1. – P. 123–129.

13.Schimuzu, T. A method for the detection of Medium – sized molecules / Т. Schimuzu, R. Kondo //Anch. Biochem. – 1998. – V. 206. – P. 271–276.

14 Bannet, E.V. Restivo C. et al. – peptides of the “middlemolecules” group / Е. V. Bannet, D. Chia // Analyt. Biochem. – 1999. – V. 86. – P.271–278.

15 Anderson, D., Phillips B.T. Schemere P. The effect of variovus

antioxidants and other modifying agents on oxygen radical generated DNA

famage in human lymphucytes in the comet assay / D. Anderson, В. Т. Phillips, Р. Schemere // Environ. and Mol. Mutagenes. – 2001. – V. 23. – P. 2–8.

16 Городецкий, О. И. Антибиотики: жизнь против жизни [Электронный ресурс] / О. И. Городецкий. – Режим доступа: http://www.health-ua.com/articles/1156.html (дата обращения: 10.10.2009).

17 Kenneth, T. Bacterial Resistance to Antibiotics. / T. Kenneth // Science Magazine. – 2004. – V. 304. – № 12. – Р. 1421–1433.

18 Егоров, Н. С. Что такое антибиотики / Н. С. Егоров // Основы учения об антибиотиках. – Москва. – 2004. – с.528.

19 Guardabassi, L. Antibiotics: Mode of action and mechanisms of resistance / L. Guardabassi, P. Courvalin // American Society for Microbiology. – Washington. – 2003. – № 11. – P. 1–18.

20 Ныс, П. С. Беталактамные соединения. Взаимосвязь структуры и биологической активности / П. С. Ныс, В. Б. Курочкина, А. В. Скляренко, Г. А. Вейнберг // Антибиотики и химиотерапия. – 2000. – № 11. – С.36–42.

21 Пинегин, Б. В. Современные представления о стимуляции антиинфекционного иммунитета с помощью иммуномодулирующих препаратов / Б.В. Пинегин // Антибиотики и химиотерапия. – 2000. – № 12. – С.3–8.

22 Никитин, А. В. Антибиотики как регуляторы механизмов воспалительных реакций организма при инфекционном процессе / А. В. Никитин // Антибиотики и химиотерапия. – 1997. – № 9. – С.2–4.

23 Jin, L. Z. Probiotics in poultry: modes of action / L. Z. Jin, Y. W. Ho, N. Abdullah, S. Jalaludin // Worlds Poultry Sc. – 2003. – V. 53 – P. 351–367.

24 Mohan, B. Effect of probiotic supplementation on growth, nitrogen utilization and serum cholesterol in broilers / B. Mohan // British Poultry Science. – 2001. – V. 3. – P. 396–401.

25 Мелентьев, А. И. Применение бацилл-антагонистов против грибов, разрушающих сырую древесину / А. И. Мелентьев, П. Хелисто, Л. Ю. Кузьмина, Н. Ф. Галимзянова, Г. Э. Актуганов, Т. Корпела // Микробиология. – 2006. – № 1. – С. 70–75.

26 Бондаренко, В.М. Микроэкологические изменения кишечника и их коррекция с помощью лечебно-профилактических препаратов / В. М. Бондаренко, Н. М. Грачева, Т. В. Мацулевич, А. А. Воробьев // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колонопроктологии. – 2003. – № 20. – С. 66–76.

27 Бондаренко, В. М. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией / В. М. Бондаренко, А. А Воробьев // Микробиология. – 2004. – № 1. –С. 84–92.

28 Шендеров, Б.А. Медико-физиологическое обоснование создания композиций синбиотиков для различных возрастных групп населения / Б.А. Шендеров // Материалы научно–практической конференции «Новые пробиотические препараты в комплексной терапии больных с дисбактериозом кишечника».–Москва. – 2003. – С.6–8.

29 Holzapfel, W. H. Introduction to pre- and probiotics / W. H. Holzapfel, U. Shillinger // Food Research International. – 2002. – V. 35. – № 2. – P. 109–116.

30 Gibson, G. R. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics / G. R. Gibson, М. В. Roberfroid // J Nutr. – 2000. – V. 125. – № 4 – Р. 1401–1412.

31 Fuller, R. Probiotics and prebiotics: microflora management for improved gut health / R. Fuller, G. R. Gibson // Clin. Microbiol. and Infect. – 1998. – V. 4. – P. 477–480.

32 Collins, M. D. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut / M. D. Collins, G. R. Gibson // Am J Clin Nutr. – 1999. – V. 69. – № 5. – Р. 1052–1057.

33 Осипова, И. Г. Споровые пробиотики / И. Г. Осипова, Н. А. Михайлова, И. Б. Сорокулова, Е. А. Васильева, А. А. Гайдеров // Журнал микробиология. – 2003. – № 3. – С. 113–119.

34 Новик, Г. И. Биологическая активность микроорганизмов-пробиотиков / Г. И. Мелентьев, А. А. Самарцев, Н. И. Астапович, М. А. Каврус, А. Н. Михалюк // Микробиология. – 2006. – № 2. – С. 187–194.

35 Мелентьев, А. И. Применение бацилл-антагонистов против грибов, разрушающих сырую древесину / А. И. Мелентьев, П. Хелисто, Л. Ю. Кузьмина, Н. Ф. Галимзянова, Г. Э. Актуганов, Т. Корпела // Микробиология. – 2006. – № 1. – С. 70–75.

36 Литусов, Н.В. Перспективы использования эубиотика «Биоспорин» в практике здравоохранения и военно -медицинской службы / Н. В. Литусов, И. А. Поберий // Екатеринбург. – 2000. – С. 6–10.

37 Лобзин, Ю.В. Дисбактериозы при острых кишечных инфекциях / Ю. В. Лобзин, А. Л. Позняк, В. М. Добрынин, С. М. Захаренко // Антибиотики и химиотерапия. – 2003. – № 14. – С. 17–24.

38 Тендеров, Б.А. Нормальная микрофлора кишечника и некоторые вопросы микроэкологической токсикологии / Б.А. Тендеров // Антибиотики и медицинская биотехнология. – 2001. – № 3. – С. 164–170.

39 Jin, L. Z. Influence of dried Bacillus subtilis and lactobacillus cultures on intestinal microflora and performance in broilers / L. Z. Jin, Y. W. Ho // Asian-Australasian Journal of Animal Science. – 2001. – V. 9. – P. 397–404.

40 Reid, G. Probiotics to Prevent the Need For, and Augment the Use Of, Antibiotics / G. Reid // Can J Infect Dis Med Microbiol. – 2006. – V. 17. – № 5. – Р. 291–295.

41 Saarela, M. Gut bacteria and Health foods-the European perspective / M. Saarela, S. Crittenden, N. Salminen, T. Mattila-Sandholm // International J. Food Microbiology. – 2002. – V. 78. – № 5. – P. 99–117.

42 Бондаренко, В. М. Механизм действия пробиотических препаратов / В.М. Бондаренко, Р.П. Чупринина, М.А. Воробьева // БИОпрепараты. – 2003. – № 3. – С. 2–5.

43 Воробьев, А. А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства и защитные функции / А.А. Воробьев, Е.А. Лыкова // Журнал микробиология. – 2001. – № 6. – С. 102–105.

44 Ellermeier, C. D. A Three-protein Signaling Pathway Governing Immunity to a bacterial cannibalism toxin / C.D. Ellermeier, E. C. Hobbs, J. E. Gonzalez-Pastor, R. Losick // Cell. – 2006. – V. 124. – № 10. – P. 549–559.

45 Захаренко, С. М. Антибиотики, пробиотики, пребиотики: друзья или враги? / С. М. Захаренко, А. Н. Суворов // Consilium Medicum. – 2009. – № 8 – С. 21–29.

46 Weizman, Z. Effect of a probiotic infant formula on infections in child care centers: comparison of two probiotic agents / Z. Weizman, G. Asli, A. Alsheikh // Pediatrics. – 2005. –V. 115. – № 1. – Р. 5–9.

47 Temmerman, R. Identification and antibiotic susceptibility of bacterial isolates from probiotic products / R. Temmerman, В. Pot, G. Huys, J. Swings // Int J Food Microbiol. – 2003. – V. 81. – Р. 1–10.

48 Salminen, M. K. Lactobacillus bacteremia, species identification, and antimicrobial susceptibility of 85 blood isolates / М. К. Salminen, Н. Rautelin, S. Tynkkynen //Clin Infect Dis. – 2006. – V. 42. – Р. 36–44.

49 Clarke, M. B. Events at the Host-Microbial Interface of the Gastrointestinal Tract III. Cell-to-cell signaling among microbial flora, host, and pathogens: there is a whole lot of talking going on / М. В. Clarke, V. Sperandio // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. – 2005. – V. 288. – Р. 1105–1109.

50 Medellin, M. J. Probiotics Affect Virulence-Related Gene Expression in Escherichia coli O157:H7 / M. J. Medellin, Н. Wang, R. Johnson // Appl Environ Microbiol. – 2007. – V. 73. – Р. 259–267.

51 Гришель, А. И. Пробиотики и их современная роль в медицине / А. И. Гришель, Е. П. Кишкурно // Вестник фармации. – 2009. – № 1. – С. 21–27.

52 Sheu, B. S. Pre-treatment with Lactobacillus and Bifidobacteria-containing Yogurt can improve the efficacy of quadruple therapy for the residual H.pylori infection after the failed triple therapy / В. S. Sheu // Am J Clin Nutr. – 2006. – V. 83. – № 15. – Р. 864–869.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Приложение А

(обязательное)

 

К₀-обычный рацион

К₁-заражение

К₂-биспорин

К₃-споробактерин

К₄-бактисубтил

О₁-заражение+хлорамфеникол

О₂-заражение+цефотаксим

О₃-заражение+пенициллин

О₄-заражение+биоспорин

О₅-заражение+споробактерин

О₆-заражение+бактисубтил

О₇-заражение+биспорин+цефотаксим

О₈-заражение+споробактерин+хлорамфеникол

О₉-заражение+бактисубтил+пенициллин

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Приложение Б

(обязательное)

Диаметр гемокаппиляров крипт и ворсинок тонкого отдела кишечника лабораторных крыс (Ув.1500)

 

Исследуемые группы	Ед.измерения	Сроки исследования
		Фоновое	Через 5 суток	Через 10 суток
Диаметр гемокаппиляров крипт
К0	нм	43,07±3,675	46,08±1,274	44,57±0,841
К1	нм	43,33±1,584	60,90±0,908	64,42±0,332
К2	нм	37,95±0,787	40,45±0,814	41,73±1,440
К3	нм	46,63±1,502	39,88±1,386*	40,83±1,084*
К4	нм	41,64±0,714	42,30±1,300*	44,59±0,437
О1	нм	38,24±0,369	45,66±0,429	43,61±0,629
О2	нм	36,63±0,561	45,57±1,625	45,36±1,453
О3	нм	37,39±0,517	41,77±1,256	46,39±0,560
О4	нм	35,12±0,709	46,13±2,31	45,60±0,732
О5	нм	33,47±1,334	46,37±1,782	46,13±1,357
О6	нм	35,32±0,280	48,47±0,481	47,85±1,143
О7	нм	35,90±1,266	41,50±1,559	45,05±0,715
О8	нм	37,39±0,436	39,21±1,208	44,07±0,691
О9	нм	35,39±0,427	40,49±1,737	43,31±1,609
Диаметр гемокаппиляров ворсинок
К0	нм	32,92±1,866	35,27±0,491	37,40±0,608
К1	нм	30,37±0,629	49,70±2,401	54,90±2,594
К2	нм	30,85±1,431	35,41±0,815	34,14±0,954
К3	нм	32,61±1,264	35,90±1,372	35,65±0,664
К4	нм	29,23±1,058	29,40±0,551	26,20±1,058
О1	нм	34,51±0,575	41,93±2,215	42,60±1,900
О2	нм	28,23±1,090	42,77±1,010	44,43±0,933
О3	нм	31,17±1,468	42,81±2,439	43,23±1,878
О4	нм	29,53±0,891	42,63±2,797	47,38±0,650
О5	нм	34,22±0,546	44,91±2,834	44,47±1,977
О6	нм	30,80±0,961	40,88±1,670	44,84±0,956
О7	нм	32,06±0,718	43,17±1,052	43,95±1,792
О8	нм	32,14±0,908	44,35±0,842	43,75±1,534
О9	нм	32,83±0,711	43,40±1,973	42,42±0,953
Примечание: R – устойчивость к антибиотикам; * Р < 0,05; ** Р < 0,01; *** Р < 0,001.

 

 

 

 

 

 

 

 

Приложение В

(обязательное)

Диаметр ворсинок и энтероцитов ворсинок тонкого отдела кишечника лабораторных крыс.

 

Исследуемые группы	Ед.измерения	Сроки исследования
		Фоновое	Через 5 суток	Через 10 суток
Длина ворсинок (ув.150)
К0	Нм	458,70±2,964	455,3±4,841	461,9±1,020
К1	Нм	458,00±2,309	253,3±5,901***	240,3±1,856***
К2	Нм	452,70±1,765	465,30±1,762	442,30±6,691
К3	нм	368,30±7,838	427,30±1,451	449,00±2,646
К4	нм	461,60±1,284	460,20±2,016	460,30±0,879
О1	нм	440,70±3,712	440,30±1,649	442,70±2,329
О2	нм	461,30±2,962	457,70±3,181**	456,50±2,839*
О3	нм	454,00±7,095	440,90±1,821	453,70±2,334
О4	нм	464,30±2,728	461,70±2,604	460,70±3,481
О5	нм	401,00±5,686	399,70±3,757	406,70±6,010
О6	нм	405,00±3,606	406,30±3,265	409,60±1,716
О7	нм	457,30±2,905	456,10±3,524	453,90±2,724*
О8	нм	465,70±1,857	465,00±1,155	460,30±1,962**
О9	нм	450,70±2,334	442,30±1,684*	450,90±1,459
Диаметр энтероцитов ворсинок (ув.1500)
К0	мкм3	800,30±2,026	796,40±4,052	798,30±2,588
К1	мкм3	710,90±1,859	904,81±1,662	1352,00±1,869
К2	мкм3	873,60±2,246	794,10±2,155***	724,20±2,254***
К3	мкм3	721,70±1,716	622,10±2,375***	608,90±4,211***
К4	мкм3	741,70±2,283	725,30±2,782***	711,40±2,095***
О1	мкм3	752,70±1,777	787,20±1,700	776,60±1,942
О2	мкм3	731,80±2,559	745,80±2,968	743,00±1,401
О3	мкм3	792,40±1,833	803,90±2,078	783,30±1,575*
О4	мкм3	761,90±1,803	832,30±1,493	807,50±1,797
О5	мкм3	862,90±2,109	780,10±1,873***	704,50±3,153***
О6	мкм3	772,60±6,344	816,60±2,817	758,60±1,256
О7	мкм3	800,40±2,101	811,40±2,022	794,20±2,156***
О8	мкм3	768,20±2,437	787,60±1,634	764,80±3,172
О9	мкм3	788,50±3,943	797,10±1,505	783,10±1,935
Примечание: R – устойчивость к антибиотикам; * Р < 0,05; ** Р < 0,01; *** Р < 0,001.

                                                                

Расчет диаметра энтероцитов ворсинок

Объем для круглых ядер: V=π*d³/6

Объем для овальных ядер: V=π*(L+B)³∕² ,

                                                       6

где L-наибольший d (диаметр),

B-наименьший d (диаметр)

Приложение Г

(обязательное)

Диаметр ядер энтероцитов ворсинок и крипт тонкого отдела кишечника лабораторных крыс

 

Исследуемые группы	Ед.измерения	Сроки исследования
		Фоновое	Через 5 суток	Через 10 суток
Диаметр ядер энтероцитов ворсинок (ув.1500)
К0	мкм3	482,60±1,865	458,20±2,748	483,80±1,079
К1	мкм3	502,60±1,381	272,10±1,290***	188,70±1,601***
К2	мкм3	391,50±1,823	343,40±1,717***	357,70±5,365**
К3	мкм3	606,10±2,093	585,40±2,765**	338,00±4,726***
К4	мкм3	441,90±1,849	442,30±2,386	427,80±2,654
О1	мкм3	482,60±1,761	249,10±1,176***	273,10±5,452
О2	мкм3	400,70±2,766	267,80±4,360	285,70±1,824***
О3	мкм3	422,30±1,909	281,10±2,646	302,40±3,324
О4	мкм3	475,60±2,796	552,80±2,759	462,80±1,248*
О5	мкм3	412,20±4,478	497,60±1,375	480,00±2,823
О6	мкм3	445,60±2,798	507,40±4,658	472,80±5,236
О7	мкм3	436,10±4,558	388,50±1,326***	376,30±1,993
О8	мкм3	392,60±1,564	354,60±3,236***	339,00±1,058***
О9	мкм3	404,10±1,481	382,70±1,858**	372,70±1,639***
Диаметр крипт (ув.600)
К0	мкм3	162,30±1,582	160,30±1,328	160,80±2,255
К1	мкм3	182,30±5,341	194,30±1,662	196,10±1,198
К2	мкм3	156,10±2,268	141,00±1,882*	136,50±1,153**
К3	мкм3	152,00±4,080	137,60±0,722*	138,00±1,049*
К4	мкм3	143,00±2,075	138,10±1,272*	141,50±1,073
О1	мкм3	153,30±3,480	151,20±5,482	147,70±5,079
О2	мкм3	153,10±3,550	158,70±1,082	158,80±0,868
О3	мкм3	149,90±1,602	149,30±2,743	150,80±1,281
О4	мкм3	154,20±2,110	131,30±2,042***	115,40±1,713***
О5	мкм3	153,90±2,418	130,60±0,925**	134,10±0,291**
О6	мкм3	149,60±2,119	133,30±1,827*	143,00±1,732
О7	мкм3	152,10±1,541	150,30±0,933	140,30±0,655***
О8	мкм3	155,70±2,069	150,30±0,699*	140,90±2,073***
О9	мкм3	150,30±1,912	149,10±1,650	142,20±2,232**
Примечание: R – устойчивость к антибиотикам; * Р < 0,05; ** Р < 0,01; *** Р < 0,001.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Приложение Д

(обязательное)

Диаметр энтероцитов крипт и ядер энтероцитов крипт

 

Исследуемые группы	Ед.измерения	Сроки исследования
		Фоновое	Через 5 суток	Через 10 суток
Диаметр энтероцитов крипт (ув.1500)
К0	мкм3	299,60±2,152	294,30±1,781	299,10±1,671
К1	мкм3	375,70±3,371	321,10±2,075***	244,50±1,303***
К2	мкм3	475,80±1,916	468,60±1,249**	475,40±1,943
К3	мкм3	280,80±1,582	282,60±1,435	281,20±0,9918
К4	мкм3	383,60±1,618	380,10±2,124	376,90±1,139*
О1	мкм3	351,10±2,888	348,90±0,874	348,70±1,979
О2	мкм3	451,40±1,527	446,80±1,842***	448,60±1,338***
О3	мкм3	392,90±1,706	387,10±1,535**	393,80±1,262
О4	мкм3	335,20±2,606	329,40±2,201***	332,60±2,553
О5	мкм3	302,50±1,701	260,70±1,587	276,20±2,445***
О6	мкм3	270,70±1,113	304,20±3,489	282,20±1,757
О7	мкм3	382,60±1,845	377,90±0,989*	382,60±1,314
О8	мкм3	354,80±2,777	348,50±1,285*	350,80±1,03
О9	мкм3	387,90±2,212	378,80±1,179	383,60±1,183
Диаметр ядер энтероцитов крипт (ув.600)
К0	мкм3	216,40±1,260	214,20±2,020	211,30±2,583
К1	мкм3	205,00±3,000	205,90±1,434	214,00±1,455
К2	мкм3	171,90±1,842	168,80±0,776	157,60±0,956***
К3	мкм3	170,10±0,869	171,60±1,314	159,70±0,889**
К4	мкм3	198,60±1,420	176,40±1,446***	174,70±0,864***
О1	мкм3	198,90±1,386	194,90±1,722	188,40±1,225***
О2	мкм3	199,10±2,352	203,60±1,334	194,70±2,616
О3	мкм3	219,30±2,775	225,80±0,235	206,50±1,991*
О4	мкм3	161,30±1,517	156,70±1,676***	157,30±1,483
О5	мкм3	152,30±1,281	148,70±1,457***	142,90±1,027
О6	мкм3	141,80±1,448	137,80±0,999**	136,00±1,656***
О7	мкм3	193,90±1,691	196,80±1,502	186,70±1,457***
О8	мкм3	187,30±1,333**	180,00±0,345	175,50±0,598***
О9	мкм3	173,60±1,400	165,80±1,925*	158,80±1,186**
Примечание: R – устойчивость к антибиотикам; * Р < 0,05; ** Р < 0,01; *** Р < 0,001.

 

Объем для круглых ядер: V=π*d³/6

Объем для овальных ядер: V=π*(L+B)³∕² ,

                                                          6

где L-наибольший d (диаметр),

B-наименьший d (диаметр)

 

 

 

Приложение Е

(обязательное)

Отношение красной пульпы к белой и диаметр мальпигиевых тел селезенки.

 

Исследуемые группы	Ед.измерения	Сроки исследования
		Фоновое	Через 5 суток	Через 10 суток
Отношение красной пульпы к белой (3 поля зрения)
К0	-	1,50±0,288	1,66±0,441*	1,70±0,173**
К1	-	2,47±0,318	2,40±0,458	2,50±0,404
К2	-	1,50±0,288	1,73±0,393	2,33±0,441
К3	-	1,47±0,290	2,06±0,233	1,93±0,470
К4	-	1,60±0,321	1,66±0,441**	1,67±0,296
О1	-	1,77±0,145	2,10±0,208*	1,96±0,202
О2	-	1,47±0,088	1,43±0,202	2,33±0,176
О3	-	1,53±0,290	2,50±0,288	2,00±0,115**
О4	-	1,33±0,441	1,56±0,233	2,10±0,208
О5	-	1,30±0,458	1,83±0,145	2,06±0,318
О6	-	1,73±0,176	1,46±0,260	1,90±0,208
О7	-	1,80±0,230	1,60±0,378**	2,16±0,218
О8	-	1,23±0,185	1,92±0,145	2,30±0,173
О9	-	1,67±0,441	2,36±0,202*	2,16±0,218*
Диаметр мальпигиевых тел (ув.600)
К0	мкм3	1025,00±111,200	958,40±77,780	1091,00±131,100
К1	мкм3	1030,00±51,310	1053,00±45,780**	1430,00±44,880
К2	мкм3	989,40±18,280	1065,00±19,120	962,90±17,780***
К3	мкм3	984,80±9,268	929,80±8,946***	1026,00±6,116
К4	мкм3	974,20±16,890	992,60±9,421	947,10±7,640*
О1	мкм3	981,40±12,910	11,34±7,836	1199,00±1,181
О2	мкм3	996,90±6,855	1012,00±4,583	1000,00±1,732***
О3	мкм3	991,70±6,551	1027,00±14,910***	1056,00±16,050
О4	мкм3	986,50±18,780	998,20±8,967	987,40±7,798
О5	мкм3	947,30±21,840	1107,00±14,530	1157,00±23,320
О6	мкм3	989,90±39,490	1128,00±14,190	1166,00±16,290
О7	мкм3	1007,00±2,023	1011,00±10,990	1096,00±11,970*
О8	мкм3	1005,00±4,163	1036,00±5,815**	1116,00±9,246
О9	мкм3	1007,00±1,770	1026,00±5,611	1095,00±2,887***
Примечание: R – устойчивость к антибиотикам; * Р < 0,05; ** Р < 0,01; *** Р < 0,001.

 

Объем для круглых ядер: V=π*d³/6

Объем для овальных ядер: V=π*(L+B)³∕² ,

                                                           6

где L-наибольший d (диаметр),

B-наименьший d (диаметр)

 

 

 

Приложение Ж

(обязательное)

Диаметр трабекулы и эксцентричной артерии селезенки лабораторных крыс

 

Исследуемые группы	Ед.измерения	Сроки исследования
		Фоновое	Через 5 суток	Через 10 суток
Диаметр трабекулы (Ув.600)
К0	нм	42,65±1,916	41,33±1,157	42,67±0,421
К1	нм	41,64±1,146	37,66±1,682	42,63±1,167
К2	нм	43,30±1,553	39,77±0,784	43,16±1,377
К3	нм	42,46±1,391	50,41±0,462	56,03±0,864
К4	нм	39,36±1,227	36,61±2,066	38,94±0,821
О1	нм	40,54±0,454	49,73±1,108	41,60±1,188
О2	нм	40,47±1,438	48,12±1,040	42,62±1,349
О3	нм	43,39±0,573	48,30±0,768	42,71±1,267
О4	нм	42,60±1,056	47,40±0,912	48,64±1,301
О5	нм	40,64±0,574	49,50±0,643	41,78±1,918
О6	нм	39,16±0,916	51,00±0,717	41,60±0,942
О7	нм	40,17±0,885	48,30±0,713	41,49±0,552
О8	нм	41,71±1,594	49,51±0,583	38,76±0,797
О9	нм	41,02±1,953	49,62±0,684	38,66±0,922
Диаметр эксцентричной артерии (Ув.600)
К0	нм	28,06±0,782	20,62±0,564***	22,51±1,085***
К1	нм	21,22±1,813	34,02±0,794	38,23±0,616
К2	нм	22,03±0,837	23,11±0,981	24,68±0,967
К3	нм	25,96±0,970	26,64±0,427	27,01±0,629
К4	нм	21,02±0,661	21,73±0,829	24,36±0,485
О1	нм	26,09±0,703	26,05±0,702	28,08±0,635
О2	нм	27,83±0,697	28,63±0,404	28,08±0,635
О3	нм	27,15±0,678	26,32±0,845	27,28±0,633**
О4	нм	22,62±0,956	25,32±0,620	24,23±1,029**
О5	нм	24,44±0,729	25,17±1,121	23,86±0,953
О6	нм	23,35±0,790	24,54±0,696	25,26±0,728
О7	нм	24,21±0,841	26,89±0,633	25,04±1,008
О8	нм	20,73±0,445	22,11±0,907	23,28±0,829
О9	нм	21,73±0,694	23,45±1,449	24,31±0,607
Примечание: R – устойчивость к антибиотикам; * Р < 0,05; ** Р < 0,01; *** Р < 0,001.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Приложение З

(обязательное)

Толщина капсулы селезенки лабораторных крыс

 

Исследуемые группы	Ед.измерения	Сроки исследования
		Фоновое	Через 5 суток	Через 10 суток
Толщина капсулы (Ув.600)
К0	нм	28,33±0,621	28,36±0,639*	28,87±1,007***
К1	нм	22,08±1,496	20,08±0,964	19,50±0,625*
К2	нм	21,45±1,739	20,70±1,950**	19,37±0,934
К3	нм	23,25±1,332	23,11±1,516	24,59±1,964**
К4	нм	27,82±1,465	27,90±0,822	30,25±0,478
О1	нм	27,98±1,463	27,68±0,899	20,94±0,780*
О2	нм	27,10±1,393	21,87±1,109**	23,78±1,569***
О3	нм	25,60±1,164	20,89±0,796	26,66±1,393*
О4	нм	27,54±0,658	26,15±1,104*	18,69±0,457
О5	нм	27,16±1,111	26,50±0,832	20,08±0,575**
О6	нм	25,67±1,678	22,70±1,652	20,35±0,400*
О7	нм	23,15±1,334	23,13±1,142*	20,64±0,615
О8	нм	25,07±1,675	27,02±1,865	22,32±1,251**
О9	нм	27,44±1,783	26,78±0,839*	21,30±0,561**
Примечание: R – устойчивость к антибиотикам; * Р < 0,05; ** Р < 0,01; *** Р < 0,001.

 

Скачать: Annotaciya.doc
predvar-diplom.doc
soderzhanie.docx