Влияние ауторегуляторных факторов бактерий (алкилоксибензолов и гомосеринлактонов) на продукцию цитокинов мононуклеарами периферической крови человека

Химико-биологический факультет

Кафедра микробиологии

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

Влияние ауторегуляторных факторов бактерий (алкилоксибензолов и гомосеринлактонов) на продукцию цитокинов мононуклеарами периферической крови человека

Аннотация

Дипломная работа содержит 54 страницы, 11 рисунков, 8 таблиц.

Включает введение, три главы, заключение, список использованных источников.

Работа выполнена печатным способом с использованием 87 источников.

В работе продемонстрирована способность алкилоксибензолов – микробных аутоиндукторов анабиоза и гомосеринлактонов – регуляторных молекул системы кворума, изменять функциональные характеристики мононуклеаров (моноцитов и лимфоцитов), в частности эффективность продукции ими про- и противовоспалительных цитокинов.

Summary

The thesis will constrain 54 pages, 11 drawings, 8 tables. Includes the introduction, three heads, the conclusion, the list of the used sources.

Work is executed in the printing way with use of 87 sources.

In work ability alkylresorcinols – microbic autoinductors of anabiosis and homoserin lactones – autoinductors of quorum systems to change functional characteristics mononuclears (monocytes and lymphocytes), in particular efficiency of production them about - and anti-inflammatory cytokins.

Содержание

Введение. 7

Иммунная система. 8

1.1 Фагоцитирующие клетки. 9

1.2 Лимфоциты.. 11

1.3 Вспомогательные клетки. 13

1.4 Взаимодействие (кооперация) клеток при разных формах иммунного ответа. Цитокины.. 14

1.4.1 Провоспалительные цитокины.. 17

1.4.1.1 Интерлейкин -2. 17

1.4.1.2 Фактор некроза опухолей. 17

1.4.1.3 Интерферон – γ. 18

1.4.2 Противовоспалительные цитокины.. 19

1.4.2.1 Интерлейкин – 4. 19

1.4.2.2 Интерлейкин – 10. 19

1.4.2.3 Интерлейкин – 1. 20

1.5 Содержание цитокинов в биологических жидкостях организма человека и методы его диагностики. 21

1.6 Факторы, влияющие на уровень цитокинов в крови. Эффекты ауторегуляторных факторов на синтез цитокинов клетками иммунной системы.. 23

Материалы и методы.. 27

2.1 Химические аналоги алкилоксибензолов и гомосеринлактонов, приготовление образцов. 27

2.2 Мононуклеары периферической крови человека. 29

2.3 Исследование функциональной активности мононуклеаров периферической крови человека по продукции ими цитокинов. 29

2.4 Иммуноферментный анализ. 30

2.5 Оценка цитотоксичности ауторегуляторных факторов бактерий в тесте с трипановым синим. 31

2.6 Методы статистической обработки результатов. 32

Результаты.. 33

3.1 Закономерности влияния алкилоксибензолов и гомосеринлактонов на продукцию провоспалительнеых цитокинов моноцитами периферической крови человека. 33

3.2 Влияние алкилоксибензолов и гомосеринлактонов на продукцию противовоспалительных цитокинов лимфоцитами периферической крови человека 36

3.3 Оценка жизнеспособности клеток. 40

3.4 Статистическая оценка эффектов ауторегуляторных факторов АОБ и ГСЛ на продукцию цитокинов клетками моноцитов и лимфоцитов периферической крови человека. 41

Заключение. 43

Список использованных источников. 44

Приложение А Маркеры иммунных клеток. 53

Приложение Б Разнообразие аутоиндукторов. 55

Введение

К настоящему времени собрано достаточно доказательств существования у микроорганизмов специализированных ауторегуляторных систем, которые обеспечивают межклеточную и межвидовую коммуникацию и контролируют поведение микробной популяции в соответствии с изменяющимися условиями среды обитания или стрессорными воздействиями.

Особенностями этих веществ, называемых ауторегуляторами, являются выделение их в окружающую среду, проявление биологической активности уже при низких концентрациях (10^-9-10^{-12 М) и воздействие на клетки того же вида.}

Показано, что ауторегуляторная система сообщества бактерий “включается”, когда достигается определенная плотность микробной культуры. В связи с этим исследователями было сформулировано понятие “quorum sensing” (QS) – регуляция роста культуры бактерий ее плотностью [1].

Обязательными сигнальными метаболитами межклеточного взаимодействия являются эндогенные низкомолекулярные факторы различной химической природы или пептидной природы, не имеющие строгой видовой специфичности. Различающиеся по гидрофобности аутоиндукторы бактерий по-разному влияют на физико-химические свойства и функциональную активность клеток [2].

Присутствие ауторегуляторных факторов в биологических жидкостях человека может достигать микро и наномолярных концентраций, что является достаточным для появления некоторых эффектов подобных веществ в отношении молекул и клеток эукариот [3].

Большая часть научных работ по изучению данного вопроса посвящена изучению воздействия только одного из аналогов группы аутоиндукторов – С₁₂-оксо-ГСЛ на активность лимфоцитов и моноцитов. Изучено, что данный гомосеринлактон изменяет выработку в них таких цитокинов как ИЛ-8, ИЛ-1, α-ФНО, ИЛ-12 [4].

Изменение в процессах нормального развития иммунного ответа может приводить к более выраженному развитию инфекционных заболеваний, усложнять лечение, позволяя бактериальным популяциям, продуцирующим собственные ауторегуляторы эффективно поддерживать жизнедеятельность и ослаблять защитные механизмы со стороны иммунной системы хозяина. Понимание процессов воздействия ауторегуляторных факторов бактерий позволит корректировать состояния иммунодепрессии заболевших, а также даст полное представление о взаимодействиях бактерий и человека с точки зрения экологии микроорганизмов, что и определяет актуальность наших исследований [5].

В этой связи целью нашей работы стало изучить влияние ауторегуляторных факторов бактерий на продукцию цитокинов мононуклеарами периферической крови человека

Исходя из цели перед нами были поставлены следующие задачи:

1) изучить эффекты различных АОБ и ГСЛ на способность мононуклеаров к образованию и выбросу:

– провоспалительных цитокинов (ИЛ-2, α-ФНО, γ-ИНФ),

– противовоспалительных цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-1β, ИЛ-10);

2) Оценить влияние АОБ и ГСЛ на жизнеспособность мононуклеаров.

1 Иммунная система

Иммунная система – комплекс органов, тканей и клеток, организованных и взаимодействующих особым образом с целью защиты человека от болезней посредством уничтожения внешних и внутренних чужеродных для организма веществ. Основная функция иммунной системы – это поддержание антигенного гомеостаза (постоянства). При участии иммунной системы распознаются и разрушаются все генетически чужеродные структуры: вирусы, бактерии, грибы, паразиты, опухолевые клетки. В целом, любое вещество, чья белковая или белковоподобная структура отличается от структуры тканей человека, способно вызвать иммунный ответ. Вещества, вызывающие подобный ответ, названы антигенами [6].

Исходя из механизмов, задействованных в реализации, иммунный ответ может быть различным. Выделяется специфический и неспецифический иммунный ответ.

Неспецифический (врожденный, естественный) иммунитет – это первый этап борьбы с инфекцией. Он запускается сразу же после попадания микроба в организм. Неспецифический иммунный ответ практически одинаков для всех типов микробов и подразумевает первичное разрушение микроба и формирование очага воспаления и развитие воспалительной реакции. Воспалительная реакция – это универсальный защитный процесс, который направлен на предотвращение распространения микроба. Неспецифический иммунитет определяет общую сопротивляемость организма.

Специфический (приобретенный) иммунитет – это вторая фаза защитной реакции организма. Основной характеристикой специфического иммунного ответа является распознавание микробного агента и выработка факторов защиты, направленных специально против него [7].

Процессы неспецифического и специфического иммунного ответа пересекаются и во многом дополняют друг друга. В специфическом иммунном ответе принимают участие целый ряд клеток (клеточный иммунный ответ) и выделяемых ими гуморальных продуктов (гуморальный иммунный ответ). В качестве подобных гуморальных продуктов могут быть названы антитела (иммуноглобулины, Ig) – белковый продукт плазматических клеток, обладающий комплементарностью к специфическим антигенам, цитокины – растворимые полипептидные и гликопротеидные медиаторы относительно небольшого молекулярного веса, опосредующие на паракринной, юкстакринной, аутокринной, а в высоких концентрациях – и системной основе сигнальные взаимодействия между клетками иммунной системы и соматическими клетками, а так же внутри иммунной системы, некоторые другие растворимые медиаторы. На рисунке 1 перечислены основные клетки и молекулы, принимающие участие в иммунологических реакциях организма [8].

Клетки могут быть идентифицированы по морфологическим и функциональным критериям.

Моноклональная технология получения антител произвела революцию в этом вопросе, так как теперь многие клетки могут быть опознаны (а иногда разделены) по молекулам клеточной поверхности (маркерам), против которых можно получить моноклональные антитела.

Рисунок 1 - Основные компоненты иммунной системы. Клетки и синтезируемые ими медиаторы

Термин «маркер» применяется для обозначения клеточных антигенов, которые способны реагировать со специфическими антителами. Такие метки находятся на поверхности клетки, зависят от ее вида и зрелости (способности выполнять свои функции). Метки нумеруются по очереди в соответствии с тем, когда они были открыты: чем раньше был открыт кластер, тем меньше у него номер. Наиболее часто на поверхности иммунных клеток встречаются следующие кластеры: CD2, CD3, CD4, CD8, CD16, CD72 в соответствии с приложением А [9].

1.1 Фагоцитирующие клетки

Моноциты (мононуклеарные фагоциты) – крупные зрелые одноядерные лейкоциты группы агранулоцитов диаметром от 18 до 20 мкм с эксцентрично расположенным полиморфным ядром, имеющим рыхлую хроматиновую сеть, и азурофильной зернистостью в цитоплазме. Имеют несегментированное ядро. Моноцит – наиболее активный фагоцит периферической крови. В норме моноциты составляют от 3 % до 11 % общего количества лейкоцитов крови. Абсолютное их содержание составляет приблизительно 450 клеток в 1 мкл. Помимо крови, эти клетки всегда присутствуют в больших количествах в лимфатических узлах, стенках альвеол и синусах печени, селезенки и костного мозга [10].

Моноциты находятся в крови от 2 до 3 дней, затем они выходят в окружающие ткани, где, достигнув зрелости, превращаются в тканевые макрофаги. Моноциты также являются предшественниками клеток Лангерганса, клеток микроглии и других вспомогательных клеток, способных к переработке и представлению антигена.

Моноциты способны к активному амебоидному движению благодаря выростам цитоплазмы – псевдоподиям, к экстравазации (эмиграции за пределы кровеносных сосудов) и к хемотаксису (преимущественной миграции в места воспаления или повреждения тканей), но главным свойством моноцитов является способность к фагоцитозу. Моноциты способны фагоцитировать микробы в кислой среде, когда другие клетки не активны, а так же могут поглощать относительно крупные частицы или большое количество мелких частиц и, как правило, не погибают после фагоцитирования (возможна гибель моноцитов при наличии у фагоцитированного материала каких-либо цитотоксических для моноцита свойств). Фагоцитируя микробы, погибшие лейкоциты, поврежденные клетки тканей, моноциты очищают место воспаления и подготавливают его для регенерации. Активированные моноциты и тканевые макрофаги обеспечивают противоопухолевый, противовирусный, противомикробный и противопаразитарный иммунитет. Они принимают активное участие в регуляции гемопоэза. Макрофаги принимают участие в формировании специфического иммунного ответа организма. Они распознают антиген и переводят его в так называемую иммуногенную форму (презентация антигена). Моноциты продуцируют как факторы, усиливающие свертывание крови (тромбоксаны, тромбопластины), так и факторы, стимулирующие фибринолиз (активаторы плазминогена) [11].

Нейтрофилы – самая многочисленная группа лейкоцитов, названы так за то, что при окраске по Романовскому они интенсивно окрашиваются как кислым красителем эозином, так и основными красителями [7].

Зрелые нейтрофилы имеют сегментированное ядро, то есть относятся к полиморфноядерным лейкоцитам, или полиморфонуклеарам. Зрелые сегментоядерные нейтрофилы в норме являются основным видом лейкоцитов, циркулирующих в крови человека, составляя от 47 % до 72 % общего количества лейкоцитов крови, от 1 % до 5 % в норме составляют юные, функционально незрелые нейтрофилы, имеющие палочкообразное сплошное ядро и не имеющие характерной для зрелых нейтрофилов сегментации ядра – так называемые палочкоядерные нейтрофилы. Нейтрофилы способны к активному амёбоидному движению, к экстравазации, и к хемотаксису.

Нейтрофилы способны к фагоцитозу, причём являются микрофагами, то есть способны поглощать лишь относительно небольшие чужеродные частицы или клетки. После фагоцитирования чужеродных частиц нейтрофилы обычно погибают, высвобождая большое количество биологически активных веществ, повреждающих бактерии и грибы, усиливающих воспаление и хемотаксис иммунных клеток в очаг. Нейтрофилы содержат большое количество миелопероксидазы, фермента, который способен окислять анион хлора до гипохлорита – сильного антибактериального агента. Миелопероксидаза как гем-содержащий белок имеет зеленоватый цвет, что определяет зеленоватый оттенок самих нейтрофилов, цвет гноя и некоторых других выделений, богатых нейтрофилами. Погибшие нейтрофилы вместе с клеточным детритом из разрушенных воспалением тканей и гноеродными микроорганизмами, послужившими причиной воспаления, формируют массу, известную как гной.

Нейтрофилы играют очень важную роль в защите организма от бактериальных и грибковых инфекций, и сравнительно меньшую – в защите от вирусных инфекций. В противоопухолевой или антигельминтной защите нейтрофилы практически не играют роли.

Нейтрофильный ответ (инфильтрация очага воспаления нейтрофилами, повышение числа нейтрофилов в крови, сдвиг лейкоцитарной формулы влево с увеличением процента «юных» форм, указывающий на усиление продукции нейтрофилов костным мозгом) – самый первый ответ на бактериальные и многие другие инфекции. Нейтрофильный ответ при острых воспалениях и инфекциях всегда предшествует более специфическому лимфоцитарному. При хронических воспалениях и инфекциях роль нейтрофилов незначительна и преобладает лимфоцитарный ответ [12].

1.2 Лимфоциты

Лимфоциты – клетки иммунной системы, представляющие собой разновидность лейкоцитов группы агранулоцитов, белых кровяных клеток. Лимфоциты – главные клетки иммунной системы, обеспечивают гуморальный иммунитет и клеточный иммунитет, а также регулируют деятельность клеток других типов. В норме в крови взрослого человека на лимфоциты приходится от 20 % до 35 % всех белых клеток крови, или в абсолютном виде 1000-3000 кл/мкл. При этом в свободной циркуляции в крови находится около 2 % лимфоцитов, находящихся в организме, а остальные 98 % находятся в тканях [13].

По морфологическим признакам выделяют два типа лимфоцитов: большие гранулярные лимфоциты (чаще всего ими являются NK-клетки или, значительно реже, это активно делящиеся клетки лимфоидного ряда – лимфобласты и иммунобласты) и малые лимфоциты (T и B клетки) [5].

По функциональным признакам различают три типа лимфоцитов: B-клетки, T-клетки, NK-клетки. Содержание Т-лимфоцитов в крови составляет от 65 % до 80 % от общего количества лимфоцитов, В-лимфоцитов – от 8 % до 20 %, NK-лимфоцитов – от 5 % до 20 %.

NK-лимфоциты осуществляют контроль над качеством клеток организма. При этом NK-лимфоциты способны разрушать клетки, которые по своим свойствам отличаются от нормальных клеток, например, раковые клетки [10].

Т-лимфоциты проходят предварительную обработку в тимусе (вилочковой железе). После образования в костном мозге Т-лимфоциты сначала мигрируют к вилочковой железе. Здесь они быстро делятся, одновременно становясь чрезвычайно разнообразными, т.е. предназначенными для реакции против разных специфических антигенов. Это значит, что один лимфоцит, обработанный в тимусе, проявляет специфическую реактивность в отношении одного антигена. Следующий лимфоцит специфически реагирует на другой антиген. Это продолжается до тех пор, пока в тимусе не появятся тысячи разных типов лимфоцитов со специфической реактивностью в отношении тысяч разных антигенов. Эти разные типы предварительно обработанных Т-лимфоцитов оставляют тимус и распространяются кровью по всему телу, временно оседая в лимфоидной ткани [14].

Кроме того, благодаря обработке в тимусе любой оставляющий его Т-лимфоцит не реагирует с белками или другими антигенами собственных тканей организма (иначе Т-лимфоциты погубили бы собственное тело человека в течение всего нескольких дней). Тимус выбирает, какие Т-лимфоциты могут его покинуть, сначала смешивая их практически со всеми специфическими аутоантигенами собственных тканей тела. Если Т-лимфоцит реагирует, он разрушается и фагоцитируется, вместо того, чтобы выделяться. Это происходит с основной частью клеток (вплоть до 90 %). Таким образом, клетки, выделяющиеся из тимуса, не реагируют против собственных антигенов тела. Они реагируют лишь на антигены внешних источников, например бактерий, токсинов или тканей, пересаженных от другого человека [15, 16].

Основная часть предобработки Т-лимфоцитов в тимусе происходит перед рождением ребенка и в течение нескольких месяцев после рождения. Удаление вилочковой железы после этого периода ослабляет (но не исключает) Т-лимфоцитарную иммунную систему. Однако удаление тимуса за несколько месяцев до рождения может нарушить развитие всего клеточно-опосредованного иммунитета. Поскольку именно клеточный тип иммунитета в основном отвечает за отторжение трансплантированных органов, например сердца или почек, органы можно пересаживать с меньшей вероятностью отторжения, если у животного в соответствующее время до его рождения удалить тимус [17].

В-лимфоциты проходят предварительную обработку в печени и костном мозге. О деталях предварительной обработки В-лимфоцитов известно гораздо меньше, чем о предобработке Т-лимфоцитов. Известно, что у человека предварительная обработка В-лимфоцитов осуществляется в печени в середине внутриутробного периода развития, а также в костном мозге в конце внутриутробного периода и после рождения [5].

Существуют два важных различия между В- и Т-лимфоцитами. Во-первых, В-лимфоциты активно секретируют антитела, в отличие от Т-лимфоцитов, реагирующих с антигеном непосредственно. Во-вторых, разнообразие В-лимфоцитов выражено больше, чем у Т-лимфоцитов, т. е. формируются миллионы типов В-лимфоцитарных антител с разными специфическими реактивностями. После предобработки В-лимфоциты, как и Т-лимфоциты, мигрируют к лимфоидной ткани по всему телу, где временно располагаются рядом, но несколько обособленно от областей локализации Т-лимфоцитов [18].

1.3 Вспомогательные клетки

Кроме лимфоцитов и фагоцитов к компонентам иммунной системы относится ряд вспомогательных клеток. Это эозинофилы, базофилы, тромбоциты, тучные клетки, дендритные клетки. Основной их целью является привлечение лейкоцитов и растворимых медиаторов иммунитета к очагу инфекции. К вспомогательным клеткам относятся также антиген-презентирующие клетки (АПК) и эндотелиальные клетки и другие [19, 20].

От 0,5 % до 1 % всех лейкоцитов крови составляют базофилы (около 50 клеток в 1 мкл). Их диаметр в сухом мазке равен от 7 до 11 мкм. Крупные гранулы базофилов интенсивно окрашиваются основными красителями и содержат гепарин и гистамин в виде солеподобных соединений. Базофилы выделяют гепарин и, тем самым, активируют липолиз в сыворотке. Лейкоциты базофилы (базофильные сегментоядерные гранулоциты) заполнены гранулами, в которых содержатся различные медиаторы, вызывающие при высвобождении воспаление в окружающей ткани [21].

Эозинофилы или эозинофильные полиморфноядерные гранулоциты – специализированная популяция лейкоцитов, осуществляющая внеклеточное уничтожение и способная поражать крупные паразитические организмы, например, шистосомы. Как и все остальные типы цитотоксических клеток, эозинофилы поражают свои мишени, выделяя вблизи них содержимое внутриклеточных гранул и другие, не запасаемые в гранулах молекулы. Чтобы справиться с крупными паразитами типа гельминтов, на помощь приходят эозинофилы, осуществляющие внеклеточное уничтожение. По свойствам эозинофилы сходны с нейтрофилами, но обладают меньшей фагоцитарной активностью. Эозинофилы крови человека обычно содержат двухдольчатое ядро и множество цитоплазматических гранул. Гранулы зрелых эозинофилов – это окруженные мембранами клеточные органеллы с «кристалловидной» сердцевиной. Среди лейкоцитов крови здорового, не страдающего аллергией человека на эозинофилы приходится от 2 % до 5 % [22].

Дендритные клетки – данные клетки специализируются на представлении антигена в иммуногенной форме, что крайне важно для запуска специфического ответа [16].

Взаимодействие клеток иммунной системы является одним из важнейших механизмов, в сохранении постоянства внутренней среды организма и обеспечении нормального функционировании всех его систем. Межклеточная кооперация входит в число механизмов специфической регуляции иммунного ответа в организме. В ней принимают участие специфические взаимодействия между конкретными антигенами и соответствующими им структурами антител и клеточных рецепторов [10].

1.4 Взаимодействие (кооперация) клеток при разных формах иммунного ответа. Цитокины

Как следует из вышеизложенного, Т-лимфоциты реализуют клеточные формы иммунного ответа, В-лимфоциты обуславливают гуморальный ответ. Однако обе формы иммунологических реакций не могут состояться баз участия вспомогательных клеток, которые в дополнение к сигналу, получаемому антигенреактивными клетками от антигена, формируют второй, неспецифический, сигнал, без которого Т-лимфоцит не воспринимает антигенное воздействие, а В-лимфоцит не способен к пролиферации [23].

Клеточное взаимодействие при возникновении иммунного ответа состоит в том, что антиген может воздействовать на клетку только после его представления антиген-презентирующей клеткой АПК, которая производит предварительный отбор антигена, вступая во взаимодействие только с чужеродными антигенными субстратами, исключая тем самым возможность действия на лимфоцит собственных антигенов организма. Антиген сорбируется на её поверхности, затем подвергается эндоцитозу, в результате чего антиген фрагментируется и формирует комплекс с собственным белком [24].

Комплекс антиген-белок экспрессируется на поверхности антиген-презентующей клетки и становится доступным к контакту с рецептором Т-лимфоцита. Контакт осуществляется при прямом взаимодействии клеток либо передаче комплекса через межклеточную среду. Основой внутриклеточных событий также служит активация протеинкиназы С, обуславливающей стимуляцию генома клетки, начало пролиферации и дальнейшей дифференцировки с формированием клона клеток одинаковой специфичности, составляющих основу дальнейшего развития иммунного ответа. Одновременно с формированием протеинкиназы в цитозоле происходит повышение уровня свободного Са²⁺, активирующего эндонуклеазы клетки, что может привести к апоптозу – гибели клетки. Баланс этих антагонистических процессов определяет альтернативу возникновения позитивного иммунного ответа или толерантности [23, 25].

Т-лимфоциты-хелперы (CD4+) и цитотоксические Т-лимфоциты (CD8+) отличаются по строению рецепторов, воспринимающих комплексы антиген-белок. В ходе дальнейшей пролиферации и дифференцировки активированных Т-лимфоцитов формируются регуляторные клетки (хелперы, цитотоксические и супрессорные), долгоживущие клетки памяти и эффекторные клетки, которые обладают выраженной цитотоксической способностью. В случае повторного поступления антигена его представление происходит так же, как и при первичном воздействии, но попадает уже на клетки иммунологической памяти. Эти клетки уже прошли ранние стадии созревания и дифференцировки и готовы к быстрому формированию эффекторных цитотоксических клеток [26].

Формирование гуморального ответа определяется кооперацией В-лимфоцитов с другими клетками иммунной системы и в первую очередь с Т-лимфоцитами-хелперами, в стимуляции которых принимают участие и сами В-лимфоциты. В-лимфоцит воспринимает антиген путем прямого контакта рецепторов с антигеном. Антиген проходит тот же путь презентации, подвергается эндоцитозу, фрагментируется и экспрессируется на поверхности В-клетки в комплексе с белком. Этот комплекс воспринимается рецептором Т-лимфоцита и служит сигналом развития Т-клеточного ответа, так же как после стимуляции через другие антигенпрезентующие клетки. Одновременно Т-лимфоциты начинают функционировать как хелперы, обеспечивающие способность В-клетки, поглотившей антиген, пролиферировать и дать начало клону антителообразующих клеток, продуцирующих иммуноглобулинов [27].

Некоторые антигены (полисахариды, гликолипиды, нуклеиновые кислоты) способны индуцировать иммунный ответ без помощи Т-лимфоцитов, за что получили название Т-независимых антигенов. К таким антигенам относится полисахаридный антиген пневмококков и некоторых других микроорганизмов, флагеллин, декстраны. Характер иммунного ответа на Т-независимые антигены подчеркивает значение кооперации с Т-хелперами при гуморальном иммунном ответе. При осуществлении Т-независимого ответа продуцируются низкоаффинные (непрочно связывающиеся с антигеном) антитела. Эффективность Т-независимого ответа во много раз ниже, чем тимусзависимых реакций [28].

Подобная межклеточная кооперация, формирующая постоянную защиту от бактеий, вирусов и других чужеродных объектов постоянно регулируется с помощью небольших сигнальных молекул – цитокинов. Клетки, связанные друг с другом посредством цитокинов, образуют своеобразную сеть, которая служит для многоканальной передачи сигналов от клетки к клетке, обеспечивает восприятие этих сигналов и соответствующий ответ (рисунок 2).

В химическом отношении цитокины представляют собой группу полипептидных медиаторов с молекулярной массой от 8 до 80 кДа, участвующих в формировании и регуляции защитных реакций организма. Они вовлечены фактически в каждое звено иммунитета, включая дифференцировку предшественников клеток иммунной системы, представление антигена, клеточную активацию и пролиферацию, экспрессию молекул адгезии и острофазового ответа [29].

Действие цитокинов на клетки подразделяется на несколько типов:

1) аутокринно – на клетку, синтезирующую и секретирующую данный цитокин;

2) паракринно – на клетки, расположенные вблизи клетки-продуцента, например, в очаге воспаления или в лимфоидном органе;

3) эндокринно – дистанционно на клетки любых органов и тканей после попадания цитокина в циркуляцию [30].

Рисунок 2 - Цитокиновая сеть

Образование и высвобождение этих высокоактивных молекул обычно происходят кратковременно и жестко регулируются. Цитокины воздействуют на клетку, связываясь со специфическими рецепторами на цитоплазматической мембране, вызывая этим каскадную реакцию, ведущую к индукции, усилению или подавлению активности ряда регулируемых ими генов [31].

К цитокинам относятся интерлейкины (от ИЛ-1 до ИЛ-25), интерфероны (противовирусные пептиды – интерфероны (ИФ): интерферон-α, интерферон-β, интерферон-γ), колониестимулирующие факторы (колониестимулирующий фактор (КСФ), пептиды, вызывающие размножение и дифференцировку клеток-предшественников различных ростков гемопоэза на разных этапах их созревания), факторы некроза опухолей (ФНО), супрессорные факторы (анти-ИЛ-1) трансформирующие факторы роста и хемокины (хемотаксические цитокины, обеспечивающие активацию процессов миграции различных типов лейкоцитов и некоторых других клеток) [32].

Кроме того, все цитокины делятся на про- и противовспалительные.

Провоспалительные цитокины выполняет главную функцию в инициации и поддержании воспалительных реакций.

Провоспалительные цитокины (ИЛ-2, ФНО-α, ИФ-γ) синтезируются в очаге воспаления главным образом макрофагальными клетками, активированными компонентами клеточной стенки патогенов, а также в ответ на повреждение тканей. Каждый из этих цитокинов действует на гипоталамус, инициируя лихорадку. В период времени от 12 до 24 часов острофазного воспалительного ответа отмечается увеличение уровня провоспалительных цитокинов.

Контроль за эффектами провоспалительных цитокинов осуществляют противовоспалительные цитокины (ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-1β). Они способны подавлять транскрипцию генов провоспалительных цитокинов в клетках-продуцентах, индуцировать синтез рецепторных антагонистов интерлейкинов, усиливать образование растворимых рецепторов и посредством «down-регуляции» снижать плотность провоспалительных рецепторов на клетках [33].

1.4.1 Провоспалительные цитокины

1.4.1.1 Интерлейкин 2

ИЛ-2 представляет собой мономерный гликозилированный белок с молекулярной массой 15 кДа. Основными эндогенными продуцентами ИЛ-2 являются митоген- или антиген активированные Т-лимфоциты CD4+ и CD8+. ИЛ-2 запускает иммунный ответ и активирует факторы, участвующие как в противовирусной и противобактериальной, так и противоопухолевой защите [34].

ИЛ-2 улучшает распознаваемость чужеродных антигенов (в том числе и опухолевых). Стимулирует пролиферацию и активацию натуральных киллеров и цитотоксических лимфоцитов. Обладает выраженной способностью индуцировать активность практически всех клонов цитотоксических клеток, повышает цитологическую функцию Т-киллеров и NK-клеток. Увеличивает продукцию перфоринов и γ-интерферона Т-клетками и NK-клетками, а также активирует моноциты и макрофаги, которые повышают синтез и секрецию ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, гранулоцит-колониестимулирующего фактора [7, 30].

ИЛ-2 вызывает ускорение пролиферации Т- и В-лимфоцитов и восстанавливает резерв функциональных макрофагов.

1.4.1.2 Фактор некроза опухолей

ФНО – плеотропный провоспалительный цитокин с молекулярной массой 17 кДа. ФНО является эндогенным медиатором воспалительной реакции организма. ФНО известен в виде двух субтипов – ФНО-α (кахексин) и ФНО-β (лимфотоксин) [35].

Основными продуцентами ФНО являются моноциты (макрофаги) и лимфоциты, причем ФНО-β синтезируется только лимфоцитами, ФНО-α продуцируют также естественные киллеры, гранулоциты крови, тучные клетки, Т-лимфоцитарные клеточные линии [36].

Продукция их запускается только в ответ на действие индуктора. Мощным индуктором синтеза ФНО-α являются бактериальный липополисахарид и другие компоненты микроорганизмов. Индуцировать синтез могут ИЛ-1, ИЛ-2, ИФ-α, ИФ-β [37].

К основным функциям ФНО-α относятся: избирательная цитотоксичность в отношении некоторых опухолевых клеток, участие в регуляции иммунного ответа и воспаления. ФНО-α выполняет важнейшие функции в период запуска воспаления: активирует эндотелий, способствует адгезии лейкоцитов к эндотелию за счет индукции экспрессии на эндотелиальных клетках адгезионных молекул и последующей трансэндотелиальной миграции лейкоцитов в очаг воспаления, активирует лейкоциты (гранулоциты и моноциты), индуцирует продукцию других провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО- β, КСФ) [38].

ФНО-α оказывает иммуностимулирующее действие на Т- и В-лимфоциты, естественные киллеры, служит одним из факторов деструкции тканей, обычный при длительном, хроническом воспалении. Вместе с тем, способность ФНО-α стимулировать рост фибробластов делает возможным его участие в процессах репарации тканей [39].

ФНО-β (лимфотоксин), образуемый лимфоцитами, способен вызывать гибель или, по крайней мере, останавливать рост фибробластов и многих клеточных линий in vitro, но трансформированные клетки чувствительны к нему в еще большей степени. Способность клеток, продуцирующих лимфотоксин, к самоустранению и уничтожению других T-клеток указывает на его возможную роль в иммунорегуляции [38, 40].

1.4.1.3 Интерферон-γ

ИФ-γ представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 21 кДа. Ключевыми продуцентами ИФ-γ являются макрофаги, натуральные киллеры и Т-лимфоциты непосредственно после их активации вирусными, бактериальными, паразитарными и другими агентами [41].

ИФ-γ является одним из самых значимых провоспалительных цитокинов и характеризуется множеством эффектов действия.

ИФ-γ активирует эффекторные функции макрофагов: их микробо- и цитотоксичности, продукции ими цитокинов, супероксидных и нитроксидных радикалов, простагландинов, усиливает дифференцировку дендритных клеток.

Обладает большим спектром противовирусного, противопаразитарного и противоопухолевого действия. Имеет многочисленные иммуномодуляторные эффекты, повышает эффективность презентации антигенов и способствует их распознаванию Т-лимфоцитами. Усиливает цитотоксические реакции, опосредованные Т-лимфоцитами и NK-клетками. Оказывает необратимое цитотоксическое действие на трансформированные клетки, тогда как его цитотоксическое влияние на нормальные клетки обратимо. Селективно повышает резистентность нормальных клеток к цитопатическим эффектам NK-клеток. Участвует в обеспечении прочной адгезии лимфоцитов к эндотелиальным клеткам в посткапиллярных венах перед их выходом из сосудов. Повышает проницаемость эндотелия макромолекул. Индуцирует продукцию хемокинов. Для многих клеток является мягким ингибитором пролиферации. Стимулирует митоген-индуцированную пролиферацию Т-клеток. В некоторых случаях индуцирует апоптоз Т- и В-лимфоцитов. Подавляя образование Ig E, является антагонистом ИЛ-4 по влиянию на В-клетки, обладающие потенциальной способностью к синтезу Ig E [42 – 46].

1.4.2 Противовоспалительные цитокины

1.4.2.1 Интерлейкин 4

ИЛ-4 представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 15 кДа [31].

Особенность ИЛ-4, отличающая его от других цитокинов, состоит в наличии видовой специфичности. Источником ИЛ-4 являются Т-клетки, стимулированные митогеном, тучные клетки, неидентифицированные клетки стромы костного мозга.

По отношению к В-клеткам ИЛ-4 выступает в качестве костимулятора пролиферации. Он не оказывает какого-либо влияния на покоящиеся клетки, однако достаточно подействовать на них одним из специфических для данных клеток индуктором активации, чтобы проявилось биологическое действие ИЛ-4: резкое повышение пролиферации данного типа клеток. Известна также способность ИЛ-4 повышать уровень продукции иммуноглобулинов [8].

1.4.2.2 Интерлейкин 10

ИЛ-10 представляет собой димер с молекулярной массой 36 кДа [41]. ИЛ-10 является ключевым регулятором иммунного ответа. ИЛ-10 продуцируется активированными лимфоцитами, моноцитами, макрофагами, тучными клетками и кератиноцитами [41, 43]. ИЛ-10 обладает мощным противовоспалительным, иммуномодулирующим, иммуносупрессивным эффектом. Главная роль ИЛ-10 – это ингибирование избыточного синтеза провоспалительных цитокинов – ИЛ-1α, ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ФНО-α, ИФ-γ – активированными макрофагами и T-клетками. В то же время ИЛ-10 повышает активность T-клеток и синтез цитокинов – ИЛ-4, ИЛ-10, то есть вызывает регулирование иммунного ответа. ИЛ-10 обладает ауторегуляторной активностью и значительно ингибирует синтез ИЛ-10 мРНК.

Благодаря потенциальным иммуносупрессивным и противовоспалительным свойствам ИЛ-10 играет важную роль при воспалении, ангиогенезе и отторжении трансплантата [41, 44].

1.4.2.3 Интерлейкин 1

Одним из основных факторов, обеспечивающих пролиферацию культивируемых лимфоцитов, является ИЛ-1 [8].

ИЛ-1 является индуцибельным белком, синтез которого начинается в ответ на внедрение микроорганизмов или повреждение тканей. Необходим для развития воспаления и осуществления всего комплекса защитных реакций, именуемых острофазным ответом [47].

Выделяют два вида данного цитокина: ИЛ-1α и ИЛ-1β с молекулярной массой 18 кДа, которые контролируются самостоятельными неаллельными, близкосцепленными генами. В полипептидной части ИЛ-1α содержится 159 аминокислотных остатков, в ИЛ-1β – 153 таких остатка. Доминирующей формой у человека является ИЛ-1β, в то время как у мышей – ИЛ-1α [48].

Основными источниками продукции ИЛ-1 являются фагоцитирующие мононуклеары различной тканевой локализации: макрофаги и моноциты периферической крови и перитонеального экссудата, купферовские клетки печени, клетки Лангенгарса в эпидермисе, клетки микроглии нервной ткани. Активными продуцентами ИЛ-1 являются также эндотелиоциты. Кроме того, способностью секретировать данный цитокин обладают Т- и В-лимфоциты, фибробласты, NК-клетки, кератиноциты, нейтрофилы [8].

Одно из наиболее существенных свойств ИЛ-1 – это стимуляция пролиферации антигенчувствительных Т-лимфоцитов [49].

При внедрении патогена ИЛ-1 активирует местные защитные реакции: действует на клетки эндотелия сосудов, усиливая экспрессию на их поверхности молекул адгезии и повышая их прокоагулянтную активность, а также проницаемость капилляров. Так создаются условия для развития местной гиперемии, тромбозов, выхода жидкой части крови и форменных элементов в ткани с формированием отека и клеточных инфильтратов [50]. Являясь одним из немногих аутокринных цитокинов, действуя на гипоталамус, он вызывает развитие лихорадки, стимулируя клетки печени, обусловливает выработку белков острой фазы, проникая в костный мозг, усиливает гранулоцитопоэз, что проявляется в нейтрофильном лейкоцитозе и омоложении популяции нейтрофилов. Он известен своей способностью активировать синтез других цитокинов: ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ФНО-α, ФНО-β, ИФ-β [51].

ИЛ-1β представляет собой полипептид с молекулярной массой 17 кДа. ИЛ-1β продуцируется в основном макрофагами и фагоцитами, а также лимфоцитами, фибробластами, эпителиальными клетками [52].

ИЛ-1β повышает хемотаксис, фагоцитоз, гемопоэз, проницаемость сосудов стенки, цитотоксическую и бактерицидную активность. Запускает реакции воспалительно-регуляторного каскада. Стимулирует синтез коллагена. Играет важную роль в развитии местного воспалительного процесса. Участвует в формировании костной ткани, секреции инсулина, развитии лихорадки и является медиатором взаимодействий между иммунной и нервной системой [49, 53].

1.5 Содержание цитокинов в биологических жидкостях организма человека и методы его диагностики

Уровни цитокинов в сыворотке или других биологических жидкостях отражают текущее состояние работы иммунной системы, т.е. синтез цитокинов клетками организма in vivo. Определение уровней продукции цитокинов мононуклеарами периферической крови in vitro показывает функциональное состояние клеток. Спонтанная продукция цитокинов мононуклеарами в культуре свидетельствует, что клетки уже инактивированы. Индуцированный (различными стимуляторами, митогенами) синтез цитокинов отражает потенциальную, резервную способность клеток отвечать на антигенный стимул (в частности, на действие лекарственных препаратов). Сниженная индуцированная продукция цитокинов in vitro может служить одним из признаков иммунодефицитного состояния [54, 55].

Нормальные значения содержания цитокинов в крови имеют вполне определенные величины (таблица 1) [56, 57].

Таблица 1. Нормальное содержание цитокинов в крови

Цитокин	Количество исследованных образцов	Диапазон (пг/мл)	Отклонения от нормы, %
ФНО-альфа	280	Не более 2,5	2,8
Гамма-ИНФ	160	Не более 25	6,4
ИЛ-4	184	6 -24	23,92
ИЛ-8	142	0-34	-
ИЛ-1 бета	107	0-78	7,5
ИЛ-6	104	0-70	3,5
Альфа-ИНФ	152	0-86	19,7
ИЛ-18	203	75-1000	7,2

В настоящее время разработаны большое количество различных методов оценки системы цитокинов, которые дают разноплановую информацию об этой системе. Оценивать цитокины биологических средах можно по специфической активности, или определять их количественно. У каждого метода есть свои недостатки и свои достоинства, своя разрешающая способность и точность определения [58]. Подобные методы можно разделить на несколько типов (таблица 2).

Таблица 2. Методы определения цитокинов

Методы	Принцип метода	Разновидности
Внутриклеточные	Выявление цитокинов с помощью флюориметра	Метод проточной флюориметри/ цитофлюориметрии
Внеклеточные	Использование меченых антител с последующей визуализацией	Электрохеми-люминесцентный метод (ЭХЛ); Иммуноверментный анализ (ИФА)
На уровне тканей (гистохимические)	Определение продукции цитокинов in situ	С использованием меченых моноклональных антител
По мРНК	Использование специфических или олигонуклеотидных зондов	Гибридизация зондов с пробами РНК; гибридизация in situ; ПЦР; метод обратного реверсирования

Методы определения цитокинов с помощью специфических антител являются сегодня самыми распространенными системами детекции этих белков. Они основаны на визуализации нерастворимых продуктов ферментативной реакции, поглощающих свет с известной длиной волны, в количествах, эквивалентных концентрации определяемого вещества. Для связывания измеряемых веществ используются антитела, нанесенные на твердую полимерную основу, а для визуализации – антитела, конъюгированные с ферментами, как правило, щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена. Достоинствами внеклеточных методов является высокая точность определения при стандартизованных условиях хранения реактивов и выполнения процедур, количественный анализ, воспроизводимость. К недостаткам можно отнести ограниченный диапазон определяемых концентраций, в результате чего все концентрации, превышающие определенный порог, считаются равными ему [59].

Внутриклеточные методы позволяют одновременно оценивать в образце до сотни белков, фенотипически охарактеризовать популяцию клеток-продуцентов цитокина и/или определить спектр продуцируемых цитокинов отдельными клетками, при этом имеется возможность относительной количественной характеристики этой продукции. Но данные методы требуют подбора оптимальных условий и определение большого количества белков одномоментно не всегда информативно [60].

Преимуществом гистохимических методов является определение продукции цитокинов непосредственно в тканях in situ. Однако данные методы достаточно трудоемки и не дают точных количественных данных [61].

Оценку содержания мРНК можно проводить разными способами. Распространенным подходом является гибридизация специфических зондов с пробами РНК, однако чувствительность методики может ограничиваться типом используемых зондов и меток и количеством анализируемой РНК. Гибридизация in situ относится к наиболее прямым и чувствительным подходам к оценке наличия мРНК цитокинов в тканях и отдельных клетках [62]. Метод обратного реверсирования и полимеразной цепной реакции обладает рядом преимуществ: высокой чувствительностью, высокой специфичностью и возможностью анализа целого спектра, высокой воспроизводимостью и быстротой получения результатов, позволяет изучать механизмы регуляции экспрессии генов цитокинов [63].

Действие цитокинов тесно связано с физиологическими и патофизиологическими реакциями организма. При этом происходит модуляция как локальных, так и системных механизмов защиты, продукция определённых цитокинов воспаления или факторов, стимулирующих рост лимфоцитов, может лежать в основе некоторых заболеваний. В то же время снижение уровня ряда цитокинов также способно провоцировать заболевание. Так, ФНО играет ведущую роль в нормальном гемопоэзе, и уменьшение его продукции нарушает механизмы защиты против инфекций. При нарушении гемопоэза стимулируется продукция таких цитокинов как ФНО-α, ИЛ-1β и ИЛ-6, при ревматоидном артрите индуцируется синтез ФНО-α, ИЛ-1 и ИЛ-8. Имеются веские доказательства в пользу того, что повышенная продукция ФНО является причиной развития неврологического синдрома у больных малярией, поскольку его уровень в крови коррелирует со степенью коматозного состояния, гипогликемии и гиперпаразитемии [64].

1.6 Факторы, влияющие на уровень цитокинов в крови. Эффекты ауторегуляторных факторов на синтез цитокинов клетками иммунной системы

В настоящее время широко известны факторы, изменяющие биологическую активность клеток иммунной системы и синтез цитокинов. К ним прежде всего относят глюкокортикоиды и простагландины. Из экзогенных факторов следует указать на циклоспорин А, снижающий синтез ИЛ-1, ИЛ-2 и ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-6 и ИФ-γ. Циклоспорин А представляет собой циклический полипептид, выделенный из грибков Toiypocladium inflatum и Cylindrocarpon lucidum. Проникнув в клетку путем простой диффузии, циклоспорин А специфически связывается с внутриклеточными белками – циклофиллинами, участвующими в регуляции белкового синтеза, и с кальцийсвязывающим белком кальмодулином и кальциневрином. Есть также данные о связывании циклоспорина А с некоторыми ядерными белками, имеющими отношение к транскрипции генов. В результате отмеченного взаимодействия циклоспорина А с белками нарушается функционирование генов, кодирующих синтез цитокинов, продукция его снижается, в связи с чем происходит угнетение преимущественно Т-клеточных иммунных реакций. Торможение активности В-клеток происходит преимущественно вторично за счет ингибирования Т-клеточного звена, хотя имеются отдельные наблюдения относительно первичного влияния препарата на В-клетки [65-67].

Кроме того, существует большое количество малоизученных низкомолекулярных химических веществ, действие которых на продукцию цитокинов может быть различно.

К таким низкомолекулярным веществам относятся ауторегуляторные факторы – обширная группа химических соединений, выделяемых микроорганизмами в околоклеточную среду и при достижении определенных пороговых концентраций оказывающих выраженное воздействие на их физиологическое состояние и репродуктивные способности. В химическом отношении подобные молекулы чаще всего являются производными жирных кислот или ацилированных лактонов, имеют амфифильное строение и незначительную молекулярную массу [68].

Считается, что поскольку бактерии сожительствуют в природных экосистемах со многими другими организмами, их межклеточные сигналы могут модулировать поведение последних, способами, выгодными для бактериального выживания. В свою очередь, высшие организмы регулируют работу симбионтов производя имитаторы их сигнала, посредством действия цитокинов, выработки ингибиторов, или через ферментативную инактивацию подобных веществ. [33, 34, 69]

Возможность проявления эффектов в отношении клеток эукариот обеспечивается в первую очередь постоянным поступлением ауторегуляторов во внутреннюю среду организма млекопитающих, поскольку сами вещества и продукты их метаболизма синтезируются автохтонной и патогенной микрофлорой симбионтов, а так же поступают с пищей [5, 10, 50]. Кроме того, необходимость накапливать ауторегуляторные факторы для реализации плотностнозависимых механизмов регуляции у микроорганизмов способствовала формированию свойств низкой метаболизируемости [69, 70].

Наиболее многочисленными группами среди ауторегуляторов микробного происхождения являются семейства алкилоксибензолов или резорцинов и гомосеринлактонов. Гомосеринлактоны (ГСЛ) обуславливают плотностнозависимую индукцию генов биолюминесценции, антибиотикопродукции и вирулентности, контролируя процессы, названные чувство кворума или (QS) [40, 52, 68]. Алкилоксибензолы выполняют функции индукторов перехода бактериальных клеток в анабиотическое состояние [71].

Эффекты ауторегуляторных факторов бактерий уже описаны в отношении ряда клеток грибов, растений и животных. При формировании тесных симбиозов с высшими эукариотами одними из первых в контакт с ауторегуляторами вступают макрофаги, моноциты, нейтрофилы, тучные клетки и другие иммуннокомпетентные клетки с развитием различных эффектов изменения их морфологического и функционального состояния [72- 74].

К настоящему времени выявлены принципы воздействия АОБ на рост культуры таких клеток высших эукариот как тимоциты. Известно, что АОБ оказывают как цитотоксическое, так и стабилизирующее действие на мононуклеарные клетки человека и эритроциты барана. Под влиянием АОБ наблюдается изменение розеткообразующей активности Т-лимфоцитов. Наиболее выраженный эффект на формирование «активных» и «общих» розеток оказывает С₁₂-АОБ. Выявлено выраженное стимулирующее влияние алкилоксибензолов на фагоцитарную активность нейтрофилов. При этом наибольший эффект на изменение фагоцитарной активности оказывает С₁₂-АОБ [75].

Анализ иммуномодулирующих эффектов гомосеринлактонов на клетки иммунной системы в большей степени проведён относительно действия одного из гомологов – С₁₂-оксо-ГСЛ, а также частично описывает влияние на клетки иммунной системы гомосеринлактонов, продуцируемых Pseudomonas aeruginosa Описано цитотоксическое воздействие высоких концентраций данного ауторегулятора на клетки нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов, связанное с направленным изменением их жизненного цикла по пути апоптоза. Оценено модифицирующее его воздействие на процессы хемотаксиса. Описаны некоторые внутриклеточные механизмы подобных явлений, связанные с изменением цитоплазмотической концентрации ионов Са²⁺ и другие [76-79].

Большое внимание при анализе иммунорегуляторных эффектов С₁₂-оксо-ГСЛ уделяется оценке их влияния на пролиферацию клеток, способных синтезировать цитокины, однако полученные экспериментальные результаты часто оказываются противоречивыми и несистематизированными.

In vitro эффекты 3-оксо-C₁₂-ГСЛ, как правило, делятся на две категории: иммуносупрессорные или противовоспалительные эффекты, проявляющиеся в концентрации ниже 10 мм, и провоспалительные, описанные при концентрациях от 20 мм и выше. Показано, что в концентрации ниже 10 мм данный ауторегулятор может уменьшать индуцированную продукцию цитокинов IL-12, ИЛ-2, ИЛ-10, ИЛ-8, α-ФНО, γ-ИФ, ИЛ-1β и других. Такое торможение синтеза цитокинов будет оказывать угнетающее действие на неспецифический иммунитет, а также изменять представление антигена Т-клеткам моноцитами. Также изучено, что 3-оксо-C₁₂-ГСЛ тормозит митоген-индуцированную и спонтанную пролиферацию лимфоцитов. Предлагается, что это непосредственно тормозит иммунные реакции, обеспечивающиеся данным типом клеток. Кроме того, доказано, что С₁₂-оксо-ГСЛ может модулировать производство антител В-лимфоцитами.

В последние 5-6 лет значительные достижения были сделаны в выяснении механизмов действия 3-оксо-C₁₂-ГСЛ на клетки млекопитающих. Выявлено, что ауторегулятор свободно диффундирует во внутриклеточное пространство, где трансформирует активацию сигнального компонента NFkB. Транскрипцио́нный фактор NF-kB (ядерный фактор «каппа-би») – универсальный фактор транскрипции, контролирующий экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза и клеточного цикла. Нарушение регуляции NF-kB вызывает воспаление, аутоиммунные заболевания, а также развитие вирусных инфекций и рака. В норме, NF-kB активируется целым рядом стимулов, включая цитокины (такие как ФНО, ИЛ-1), T- и B-клеточные митогены. Также активация возможна бактериальными и вирусными продуктами, например, липополисахаридом или двухцепочечной вируснуй РНК, стрессовыми факторами, такими как реактивные формы кислорода или ультрафиолет. В цитоплазме клетки NF-kB находится в неактивном состоянии в комплексе с ингибиторным белком. Стимулирующий агент приводит к тому, что данный белок фосфорилируется под действием специальной киназы. При этом NF-kB высвобождается от ингибирующего комплекса, транслоцируется в ядро и активирует транскрипцию контролируемых генов [80].

Кроме того, показано, что описанный механизм связывания 3-оксо-С₁₂-ГСЛ с иммунокомпетентными клетками не является универсальным. Существуют данные, о том, что ауторегуляторы данного класса изменяют активность TLR4 (толл-подобный рецепторов 4, CD284) – мембранных белков, участвующих во врождённом иммунитете. Сигнал, передающийся в клетку через этот рецептор, функционально близок к рецептору интерлейкина-1 и является одним из древнейших в системе антибактериальной защиты организма.

Возможно так же прямое влияние ГСЛ на антиген-презентирующие дендритные клетки, что так же косвенно тормозит иммунный ответ, препятствуя нормальной презентации антигена Т-лимфоцитам.

Комплексно механизмы иммуномодуляции ауторегуляторных факторов описаны не были [81].

Исходя из вышеизложенных фактов, можно сказать, что ауторегуляторные факторы активно влияют на развитие иммунного ответа.

Изменение в процессах нормального развития иммунного ответа может приводить к более выраженному развитию инфекционных заболеваний, усложнять лечение, позволяя бактериальным популяциям, продуцирующим собственные ауторегуляторы эффективно поддерживать жизнедеятельность и ослаблять защитные механизмы со стороны иммунной системы хозяина. Понимание процессов воздействия ауторегуляторных факторов бактерий позволит корректировать состояния иммунодепрессии заболевших, а также даст полное представление о взаимодействиях бактерий и человека с точки зрения экологии микроорганизмов, что делает тему исследования иммуномодулирующих эффекторов ауторегуляторных факторов в отношении клеток высших организмов актуальной и востребованной в современных научных сообществах [82].

2 Материалы и методы

2.1 Химические аналоги алкилоксибензолов и гомосеринлактонов, приготовление образцов

При проведении исследований использовались химические аналоги ГСЛ и АОБ микробного происхождения со степенью очистки 99,9%, различающиеся длиной боковых углеводородных цепей. Подобным образом устроенные гомологи ГСЛ были представлены коммерчески доступным препаратом L-гомосеринлактона гидрохлоридом (Sigma, США), в дальнейшем обозначаемым как ГСЛ (HCl), а также N-гексаноил-DL-гомосеринлактоном (С₆-ГСЛ) и N-додеканоил-DL-гомосеринлактоном (С₁₂-ГСЛ) производства Fluka, Гемания. В свою очередь ряд гомологов АОБ состоял из метилоксибензола (С₁-АОБ) и гексилоксибензола (С₆-АОБ) производства Sigma, США, а также вновь синтезированного (Enamine, Украина) препарата додецилоксибензола (С₁₂-АОБ) (рисунок 5).

Обозначения: х – связь в молекуле ГСЛ (HCl) отсутствует; y – углеводородная цепь в молекуле С6-АОБ находится в 4-пара-положении.

Рисунок 3 – Структурные формулы использованных гомологов ГСЛ (а) и АОБ (б), где n=0, 4 или 10, а m=0, 5 или 11.

Молекулы алкилоксибензолов амфифильны благодаря наличию полярной головки и неполярного алкильного хвоста, что является важным аспектом при анализе их метаболизма и биологической активности [81]. Данные вещества при внесении их в культуру микроорганизмов вызывают в целом сходные со всеми вызываемыми естественными ауторегуляторными факторами эффекты. Однако, из-за различий в гидрофобности молекул, сила выраженности их влияния могла варьировать [82].

Особым свойством длинноцепочечных АОБ является то, что благодаря своей гидрофобности при достижении критической концентрации они способны образовывать мицеллы в водных растворах. Так, С₆-АОБ образует истинный раствор, когда присутствует в 5 процентном водно-спиртовом растворе в концентрациях меньше 0,09 процента (4,5 мМ), а стабильный раствор – в интервале концентраций до 0,05 процента (3,5 мМ). При превышении концентрации 0,09 процента (4,5 мМ) начинается образование мицелл. Последняя из перечисленных концентраций является критической концентрацией мицеллообразования. Ей соответствует точка излома на изотерме поверхностного натяжения, а также появление статистически достоверной разницы между величинами экстинкции в исходных растворах фактора в 5 процентном этаноле и супернатантах, полученных после ультрацентрифугирования растворов при 180000 оборотах. При повышении концентрации АОБ до 0,1 процента (5 мМ) в водных растворах образовываются стабильные мицеллы размером 100 мкм [83].

Молекула гомосеринлактонов также являются амфифильными, распределение заряда в них имеет схожий характер. Присутствие в качестве заместителя высокоэлетроотрицательного атома кислорода в структуре гетероцикла и дополнитльные карбоксильные группировки –С=О формируют слабый отрицательный заряд в зоне гидрофобного фрагмента молекулы. Углеводородный заместитель аналогичен по химическому строению и физикохимическим свойствам с радикалом описанных ранее ауторегуляторов группы алкилокибензолов и несёт слабоположительный заряд формируя гидрофобных хвостик молекулы [84].

Непосредственно перед проведением экспериментов готовили серии водных растворов данных веществ (в случае ГСЛ и С₁₂-АОБ растворов в 5 % этаноле) с концентрациями 1·10^-3, 1·10^-4, 1·10^-5, 1·10^-6, 1·10^-7, 1·10^{-8 М.}

2.2 Мононуклеары периферической крови человека

Клетки мононуклеаров выделяли из образцов из периферической крови условно здоровых доноров мужчин в возрасте от 20 до 24 лет в двойном градиенте плотности фиколл-верографина. Фракция мононуклеаров формировала единую группу по принципу общности молекулярной массы входящих в ее состав клеток – лимфоцитов и моноцитов.

Гепаринизированную периферическую кровь из локтевой вены в объеме от 8 до 10 мл отстаивали при 37 °С в течение двух часов. После чего в специальные силиконизированные центрифужные пробирки пипеткой последовательно наслаивали градиентные растворы фиколл-верографина с плотностями 1,098 и 1,077 г/см³, поверх которых аккуратно вносили лейкоцитообогащенную плазму после отстаивания.

После этого пробирки центрифугировали в течение 45 минут со скоростью 1500 оборотов. При этом в пробирках образовывалось шесть фракций: первая (нижняя) – осадок эритроцитов и мертвых клеток; вторая – раствор фиколл-верографина (1,098 г/см³); третья – кольцо, содержащее нейтрофилы (от 98 % до 100 %); четвертая – раствор фиколл-верографина (1,077 г/см³); пятая – кольцо, содержащее мононуклеары; шестая – остатки плазмы (рисунок 6).

Рисунок 4 – Схема разделения крови на отдельные фракции при центрифугировании в двойном градиенте плотности фиколл-верографина.

Кольцо, содержащее мононуклеары, осторожно переносили в чистую силиконизированную пробирку и отмывали в холодном физиологическом растворе 10 минут при 3000 оборотах.

В полученный осадок мононуклеаров добавляли 10 мл 199 среды до концентрации 1·10⁷ мл.

Все манипуляции при проведении разделения клеток крови проводились в стерильных условиях.

2.3 Исследование функциональной активности мононуклеаров периферической крови человека по продукции ими цитокинов

Надёжным показателем функциональной активности мононуклеаров является анализ их способности к продукции цитокинов. Изучалась спонтанная и митогениндуцированная продукция провоспалительных (ИЛ-2, α-ФНО, ИФ-γ) цитокинов и противовоспалительных (ИЛ-4, ИЛ-1β, ИЛ-10) цитокинов у интактных клеток и клеток, предварительно обработанных ауторегуляторными факторами ГСЛ и АОБ. В качестве митогенов использовались фитогемагглютинин Р (Sigma, США), активирующий синтез цитокинов ИЛ-2, ИЛ-4, ИФ-γ моноцитами в концентрации 500 мкг/мл в NaCl и липополисахарид Escherichia coli (Sigma, США) в концентрации 300 мкг/мл в NaCl, активирующий синтез цитокинов α-ФНО, ИЛ-1β, ИЛ-10 лимфоцитами.

Выделенная фракция мононуклеаров обрабатывалась различными АОБ и ГСЛ, разведенными в стерильных растворителях в конечных концентрациях 1·10^-4, 1·10^-5, 1·10^-6, 1·10^-7, 1·10^-8, 1·10^-9М.

Суспензию мононуклеаров в 199 среде, в объеме 800 мкл инкубировали со 100 мкл АОБ или ГСЛ в течение часа при 37 °С для достижения равновесия в системе «клетка-ауторегулятор». Затем в образцы добавлялись митогены и проводилась дальнейшая инкубация в течение 24 часов в эксикаторе при 37 °С в атмосфере 5 % углекислого газа [85-87].

После инкубации производили отбор супернатанта для исследования количественного содержания цитокинов.

2.4. Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (ИФА) – лабораторное исследование, основанное на высокой избирательности и специфичности иммунологических реакций «антиген-антитело». Присоединение к антителам ферментной метки позволяет учитывать результат реакции по появлению ферментативной активности или по изменению ее уровня [85]. Для проведения диагностики используются полистирольные планшеты, на стенках ячеек которых заранее адсорбируется антиген. Исследуемая сыворотка вносится в ячейку планшета. При этом гомологичные антигену антитела прикрепляются к нему. Не прикрепившиеся антитела удаляются. Далее в ячейки вносят антитела против иммуноглобулинов (антител) человека, меченые ферментом. Если в исследуемой сыворотке присутствовали определяемые антитела, то они на этом этапе выступят в роли антигенов, с которыми прореагируют антитела. Добавление после промывки хромогенного вещества (красителя) позволяет учитывать реакцию по развивающемуся окрашиванию в ячейках. Интенсивность окраски при этом пропорциональна количеству фермента, а следовательно, количеству антител. При измерении оптическую плотности жидкости в ячейке и сравнивании ее с контрольным образцом подсчитывается концентрация антител в единицах объема [87].

Исследование супернатанта в работе производили методом иммуноферментного анализа по стандартной методике с использованием наборов для ИФА-анализа «Вектор – Бест». Краткая схема анализа представлена на рисунке 7.

На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубируются в лунках с иммобилизованными антителами к исследуемым цитокинам в течение 2 часов в шейкере при 37 °С и 700 оборотов в минуту.

Далее образцы промывали и не связавшийся материал удаляли отмывкой. После этого в лунки добавляли биотинилированные антитела к исследуемому цитокину, далее проводили инкубацию на шейкере в течение 1 часа в тех же условиях, после чего образцы вновь промывали.

На следующем этапе в каждую лунку вносили раствор стрептовидин-пероксидазы хрена, с последующей инкубацией на шейкере в течение 30 минут.

Рисунок 5 - Краткая схема иммуноферментного анализа

Образцы повторно промывали, после чего в каждую лунку вносили раствор тетраметилбензидина и проводили окончательная инкубация при 18-25 °С в течение 25 минут.

На конечной стадии во все лунки вносили стоп-реагент и измеряли оптическую плотность при 450 нм.

2.5 Оценка цитотоксичности ауторегуляторных факторов бактрий в тесте с трипановым синим

Цитотоксичность ауторегуляторных факторов по отношению к мононуклеарам оценивали в тесте с трипановым синим (ТС). Для исследования брали исходные образцы для ИФА, осадок которых предварительно равномерно распределяли по объему пробы и отбирали на оценку жизнеспособности.

Подсчитывали количество жизнеспособных клеток в 25 больших квадратах камеры Горяева, сетка которой была разграфлена на 225 больших квадратов – 15 по горизонтали и 15 по вертикали. Часть больших квадратов (через два на третий) разделена на 16 малых квадратов. Размеры малых квадратов камеры составляли 0,05 мм, а больших – 0,2 мм. Объем жидкости над квадратом, образованным большими делениями сетки Горяева, составлял 0,004 мкл. Подсчет производили под малым увеличением микроскопа (увеличение окуляра равно 10), конденсор опущен, а диафрагма закрыта. Для того, чтобы дважды не сосчитать одни и те же клетки, лежащие на пограничных линиях, пользовались следующими правилами: к данному квадрату принадлежали клетки, находящиеся большей своей половиной внутри него; клетки, разделенные пограничной линией пополам, считали только на верхней и левой границе квадрата; клетки же, лежащие большей своей половиной вне данного квадрата не подсчитывали. Подсчет числа жизнеспособных клеток проводили по формуле:

где К – общее число клеток,

К_о– число неокрашенных клеток.

2.6 Методы статистической обработки результатов

Все эксперименты выполнены минимум в трех повторностях.

Полученные результаты обработывали методами вариационной статистики с использованием компьютерной программы «Statistica 6.0» и пакета программ «Microsoft Excel».

При определении достоверности различий между анализируемыми выборками вычисляли среднюю арифметическую ряда абсолютных или относительных единиц, среднее квадратичное отклонение, среднюю ошибку средней величины, критерий значимости Стьюдента. Выводы об уровне значимости различий делали исходя из полученной величины коэффициента Стьюдента и количества наблюдений в анализируемых выборках.

Для оценки относительной силы влияния отдельных факторов и анализа механизмов действия АОБ и ГСЛ на продукцию цитокинов мононуклеарами периферической крови человека использовали двухфакторный дисперсионный анализ, с помощью которого был рассчитан коэффициент детерминации R² характеризующий долю дисперсии объясненной зависимой переменной, вклад факторов в изменение переменной величины продукции цитокинов.

3 Результаты

3.1. Закономерности влияния алкилоксибензолов и гомосеринлактонов на продукцию провоспалительных цитокинов моноцитами периферической крови человека

На первом этапе исследований была дана оценка продукции провоспалительных цитокинов – αФНО, ИЛ-1β и ИЛ-10 у моноцитов периферической крови человека, предварительно обработанных ауторегуляторными факторами из групп алкилоксибензолов и гомосеринлактонов в концентрациях от 10^-9 до 10^-4 моль. Контролем служили интактные моноциты. При проведении анализа учитывался как спонтанный синтез указанных цитокинов, так и проводилась дополнительная стимуляция клеток липополисахаридом E.coli. Таким образом, спонтанная продукция цитокинов свидетельствовала об активности клеток в условно «покоящемся» состоянии, а индуцированная продукция цитокинов давала возможность in vitro оценить уровень активации клеток и их работу при непосредственном запуске иммунного ответа. Оценку результатов вели с учетом соответствия выявленных концентраций цитокинов в контролях средним нормам продукции у здоровых доноров. Показано, что значения продукции основных провоспалительных цитокинов в контрольных пробах соответствовало нормам (таблица 3).

Таблица 3 – реально зафиксированные значения выявленной концентрации цитокинов в контрольных пробах

В пикограммах на миллилитр

Тип цитокина	Выявляемая концентрация цитокина в супернтантах моноцитов
Спонтання продукция
αФНО	(130±10)
ИЛ-1β	(450±20)
ИЛ-10	(190±10)
Митогениндуцированная продукция
αФНО	(6500±200)
ИЛ-1β	(560±20)
ИЛ-10	(2350±150)

Анализ влияния АОБ и ГСЛ на клетки проводился по трём основным параметрам: концентрационным эффектам, влиянию природы ауторегулятора, т.е. принадлежности его к группам АОБ или ГСЛ, а так же в зависимости от длины углеводородного радикала в его молекуле.

В ходе экспериментов было показано общее ингибирующее влияние на пролиферацию всех провоспалительных цитокинов клетками моноцитов.

Влияние АОБ и ГСЛ на спонтанную продукцию α-ФНО моноцитами было дозозависимо, т.е. возрастало с увеличением концентрации действующего вещества, а так же усиливалось с увеличением длины углеводородного радикала в молекуле ауторегулятора. Так, спонтанный синтез α-ФНО от 120 пг/мл в свободной от АОБ и ГСЛ пробе уменьшился до 84,8 пг/мл при использовании С₁-АОБ в дозе 10^-4 моль, что составляло 70,7 % от контрольных значений. После предварительной обработки клеток С₁₂-АОБ в максимальной концентрации 10^-4 моль итоговое содержание цитокина в супернатантах клеток не привышало 11,5 пг/мл (7,6 % от контроля). При этом принадлежность к типу ауторегуляторного фактора и отношение его к группам АОБ или ГСЛ играло значительно менее выраженное значение. Выявлено, что предварительная обработка моноцитов С₁₂-ГСЛ в ранее указанном концентрационном диапазоне, снижала продукцию α-ФНО до уровня 6,55 пг/мл, что на 94,7 % ниже контрольных значений (рисунок 6 а).

Сходные эффекты были установлены и при анализе влияния АОБ и ГСЛ на индуцированную продукцию α-ФНО моноцитами периферической крови человека, при общем увеличении силы выраженности эффекта. Так, при обработке мононуклеаров ауторегуляторыми С₁-АОБ и С₁-ГСЛ в концентрации 10^-4 моль, содержание цитокина в супернатантах клеточных культур снижалось до 75,6 и 45,2 пг/мл соответственно, что составляло уже 98,65 % и 99,2 % от контрольных значений. Сила влияния длинноцепочечных гомологов при использовании их в максимальной дозе воздействия составляла 99,6 % для С₁₂-АОБ и 99,92 % для С₁₂-ГСЛ, что соответствовало конечной концентрации образовавшегося α-ФНО в супернатантах клеточных культур . (рисунок 6 б)

С, %

Обозначения: С₁-АОБ, С₆-АОБ, С₁₂-АОБ, С₁-ГСЛ, С₆-ГСЛ, С₁₂-ГСЛ; А – спонтанная продукция, Б – митогениндуцированная продукция; по оси абсцисс – концентрация ауторегуляторных факторов, по оси ординат – концентрация цитокина.

Рисунок 6 – Продукция α-ФНО моноцитами периферической крови человека

Анализ влияния АОБ и ГСЛ на синтез ИЛ-1β показал аналогичную супрессивную направленность воздействия ауторегуляторов на клетки моноцитов. Однако важным действующим фактором при описании эффектов стал тип ауторегулятора и его принадлежность к группе гомологов. Молекулы класса ГСЛ практически не изменяли пролиферативную активность клеток при отсутствии индукции. Ни одна из используемых концентраций С₁-ГСЛ или С₆-ГСЛ значимо не снижала содержание цитокинов в опытном супернатанте. Исключение составил только длинноцепочечный гомолог C₁₂-ГСЛ, вызвавший снижение пролиферативной активности моноцитов в концентрациях 10^-5, 10^-4 моль и до уровня 76,6 % от контрольных значений при отсутствии в опытной смеси липополисахарида. Эффекты АОБ на спонтанную продукцию ИЛ-1β были выражены значительно сильнее, так же были дозозависимы и увеличивались в соответствие с ростом радикала в молекуле. С₁-АОБ уменьшал синтез цитокина на 87 % от контрольных значений, что составляло 55,4 пг/мл (рисунок 7 а).

С, %

Синтез цитокина ИЛ-1β при индукции моноцитов, предварительно обработанных ауторегуляторными факторами так же был угнетен, а эффект воздействия проявлялся ярче. При этом только С₁-ГСЛ не показал значимого эффекта на моноциты, как и в случае со спонтанной продукцией, итоговые концентрации интерлейкина в супернатанте клеточных структур составлял 99,9 пг/мл при контакте их с ауторегулятором в концентрации 10^-8, 109,4 пг/мл в концентрации 10^-6 и 100,5 пг/мл в концентрации 10^-4. Итоговые значения содержания цитокинов, синтезированных индуцированными моноцитами и обработанных ауторегуляторами класса АОБ в максимальной концентрации 10^-4 составляли всего 54 % от контроля для С₁-АОБ, 50 % для С₆-АОБ и 59 % от контроля для С₁₂-АОБ (рисунок 7 б).

Рисунок 7 – Продукция ИЛ-1β моноцитами периферической крови человека

Эффекты ауторегуляторных факторов бактерий АОБ и ГСЛ на спонтанную и митогениндуцированую продукцию ИЛ-10 были сонаправлены, дозозависимы, определялись типом модификатора микробной природы, длиной углеводородного гидрофобного фрагмента в его молекуле и отражали общую тенденцию уменьшения клеточной активности как при наличии, так и при отсутствии индукции. Алкилоксибензолы оказывали более выраженное действие, чем соответствующие им по длине углеводородного фрагмента в молекуле гомосеринлактоны. Однако, предварительное инкубирование моноцитов в присутствие индуктора активности с С1-ГСЛ привело так же к ингибированию пролиферации клеток и снижению выработки ИЛ-10 в пробах до 70,3 пг/мл для концентрации ауторегулятора 10^-6 и 48,2 пг/мл для концентрации ауторегулятора 10^-4 моль, что соответствовало уменьшению на 70,3 % и 48,2 % от контрольных данных (рисунок 18 а и 8 б).

С, %

10^-5

10^-7

10^-5

10^-7

10^-9

Рисунок 8 –продукция ИЛ – 10 моноцитами периферической крови человека

3.2. Влияние алкилоксибензолов и гомосеринлактонов на продукцию противовоспалительных цитокинов лимфоцитами периферической крови человека

На следующем этапе работы была проведена оценка влияния ауторегуляторных факторов на продукцию противовоспалительных цитокинов - ИЛ-2, ИН-4, ИФ-γ лимфоцитами периферической крови в соответствие с описанными ранее принципами анализа активности клеток при синтезе провоспалительных цитокинов, т. е. учитывая эффект принадлежности модифицирующего фактора к группе ауторегулятора, его характеристики как молекулы в ряду гомологов и степень выраженности влияния в зависимости от концентрации. Оценивался как спонтанный синтез цитокинов, так и индуцированная его продукция, после обработки клеток фитогемагглютинином-Р. Нормы продукции цитокинов в контрольных пробах так же соответствовали литературно описанным выявленным концентрациям цитокинов у здоровых доноров и представлены в таблице 4.

Таблица 4 – Реально зафиксированные значения выявленной концентрации цитокинов в контрольных пробах

В пикограммах на миллилитр

Тип цитокина	Выявляемая концентрация цитокина в супернтантах моноцитов
Спонтання продукция
ИЛ-2	(13±10)
ИН-4	(0,9±0,1)
ИФ-γ	(42±10)
Митогениндуцированная продукция
ИЛ-2	(290±10)
ИН-4	(6,5±0,2)
ИФ-γ	(230±10)

Общей тенденцией при анализе эффектов АОБ и ГСЛ на пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови человека явилось угнетение их активности, связанное со снижением уровня синтеза ИЛ-2, ИН-4, ИФ-γ. Однако выраженность эффектов, по сравнению с таковыми на клетки моноцитов, резко выросла, что может быть связано с особенностями структурной клеточной организацией лимфоцитов, имеющих значительно более хрупкий каркас цитоскелета, не способных к фагоцитозу и мигрирации в тканевое русло как моноциты.

При анализе влияния АОБ и ГСЛ на продукцию ИЛ – 2 лимфоцитами периферической крови человека были получены следующие результаты.

С₁-АОБ и С₆-АОБ не оказывали своего действия на спонтанную продукцию ИЛ – 2. Концентрация цитокина в супернатанте клеток при использовании данных ауторегуляторов как в низких концентрациях (10^-9), так и при их повышении (10^-4), значимо не отличалась от контроля и составляла 14,209 и 13,087 пг/мл соответственно. В данном варианте постановки эксперимента только С₁₂-АОБ и все ГСЛ показали проявления ингибиторной активности в отношении клеток и привели к уменьшению продукции ИЛ-2. Причем, В ряду гомологов ГСЛ сохранялась зависимость степени развития супрессорного влияния от длины углеводородного фрагмента в молекуле ауторегулятора. С₆-ГСЛ и С₁₂-ГСЛ снижали продукцию цитокина от 20 % до 25 % от контрольных значений уже при внесении их в рекционную смесь с неиндуцированными клетками уже в концентрации 10^-8, 10^-7 (рисунок 9 а).

При внесении в систему фактора индукции ответ клеток на супрессорное воздействие АОБ и ГСЛ был так же увеличен. Эффект был дозозависим. Продукция цитокинов у клеток, обработанных С₁-АОБ, С₆-АОБ и С₁₂-АОБ в концентрации 10^-4 моль уменьшилась до 63 %, 41% и 1,2% от контрольных значений, что оставляло 152,3, 52,66 и 2,95 пг/мл соответственно. Концентрации С₁-ГСЛ выше 10^-6 моль, а для С₆-ГСЛ и С₁₂-ГСЛ выше 10^-8 моль снижали содержание ИЛ-10 в супернатанте клеток до 0 значений (рисунок 9 б).

С, %

Рисунок 9 – Продукция ИЛ – 2 лимфоцитами периферической крови человека

Синтез γ-ИФ клетками лимфоцитов так же угнетался после их предварительной предынкубации с различными концентрациями АОБ и ГСЛ.

Внесение С1-АОБ, С6-АОБ, С12-АОБ, С1-ГСЛ, С6-ГСЛ и С12-ГСЛ в концентрации 10^-9 моль снижало содержание интерферона в анализируемых пробах без индукции до 36, 25,5, 14,6, 20,5, 15, 14,67 пг/мл и до 123, 82, 26,6, 16,1, 5,56, 1,84 пг/мл при дополнительной стимуляции. При обработке клеток АОБ и ГСЛ в концентрации выше или равной 10^-8 продукция γ-ИФ в реакционную смесь клетками лимфоцитов прекращалась полностью (рисунок 10 а и б).

Направленность эффектов всех ауторегуляторных факторов как на спонтанную, так и на митогениндуцированную продукцию ИЛ-4 лимфоцитами периферической крове человека соответствовала общим тенденциям. В концентрациях от 10^-9 моль и выше все гомологи АОБ и ГСЛ кроме С₁-АОБ и С₆-АОБ полностью блокировали синтез цитокина лимфоцитами как в случае наличия индукции, так и при её отсутствии. С₁-АОБ и С₆-АОБ не оказали влияния на спонтанный синтез ИЛ-4. Содержание его в пробах достоверно не отличалось от контроля ни в одной из используемых концентраций и составляло в среднем 1,1 пг/мл, что соответствовало фиксированным нами контрольным значениям продукции цитокина (рисунок 11 а и б).

Рисунок 10 – Продукция ИФ – γ лимфоцитами периферической крови человека

С, %

Рисунок 11 – Продукция ИЛ-4 лимфоцитами периферической крови человека

3.3 Оценка жизнеспособности клеток

Полученный результат явился основанием для постановки ряда вопроса о механизмах ингибирующего действия АОБ и ГСЛ на изменение уровня пролиферации лимфоцитов и моноцитов, наиболее очевидным из которых было возможное прямое цитотоксичекое действие исследуемых соединений.

Проведенный с этой целью тест с красителем трипановым синим (ТС), селективно окрашивающим мертвые клетки, показал, что контакт мононуклеаров с ГСЛ и АОБ во всех из использованных концентрациях не сопровождался появлением большого количества ТС с добавлением клеток (таблица 5). Максимальная гибель клеток составляла не более 20% от контроля.

В частности, воздействие отдельных гомологов АОБ приводило к гибели от (10±5) % (P<0,01) до (18±5) % (P<0,001) обработанных ими в наибольшей концентрации 10^-4 моль лимфоцитов и от (10±5) % (P<0,01) до (20±5) % (P<0,001) моноцитов. В то же время снижение действующих концентраций гомологов ГСЛ от 10^{-5 М и выше приводило к отсутствию достоверного эффекта на жизнеспособность клеток, за исключением действия одного из гомологов С}₁₂-ГСЛ, где концентрация ауторегулятора 10^-5 моль так же приводила к гибели 10 % клеток лимфоцитов и 15 % клеток моноцитов. При этом гибель клеток не наблюдалась как в случае отсутствия индукции, так и в случае дополнительной обработки клеток митогенами.

Таблица 5 – Показатели жизнеспособности моноцитов и лимфоцитов, обработанных ауторегуляторными факторами АОБ и ГСЛ

В процентах

Спонтанная продукция цитокинов
	С₁-АОБ	С₆-АОБ	С₁₂-АОБ	С₁-ГСЛ	С₆-ГСЛ	С₁₂-ГСЛ
10^-9	(90±2)	(90±5)	(89±2)	(89±5)	(90±6)	(86±5)
10^-8	(89±5)	(89±3)	(87±7)	(87±7)	(87±7)	(89±7)
10^-7	(90±3)	(89±8)	(85±5)	(82±5)	(90±8)	(87±8)
10^-6	(87±7)	(87±5)	(90±8)	(84±8)	(85±2)	(81±3)
10^-5	(87±7)	(88±6)	(85±6)	(89±3)	(87±3)	(80±4)
10^-4	(86±8)	(85±8)	(86±4)	(87±7)	(84±7)	(84±8)
Продукция цитокинов индуцированная липополисахаридом
10^-9	(90±8)	(88±3)	(88±5)	(90±8)	(89±4)	(90±7)
10^-8	(87±6)	(85±5)	(90±6)	(86±6)	(85±7)	(86±5)
10^-7	(87±4)	(89±8)	(82±2)	(86±7)	(88±5)	(87±2)
10^-6	(81±8)	(84±6)	(89±5)	(89±7)	(86±6)	(90±8)
10^-5	(89±3)	(87±7)	(85±6)	(85±5)	(84±2)	(89±6)
10^-4	(80±5)	(83±5)	(80±4)	(80±3)	(81±5)	(85±3)
Продукция цитокинов индуцированная фитогемагглютинином
10^-9	(90±6)	(89±5)	(90±3)	(90±6)	(89±6)	(87±4)
10^-8	(88±7)	(90±8)	(87±5)	(86±5)	(88±2)	(90±7)
10^-7	(89±5)	(87±3)	(85±7)	(84±8)	(82±8)	(85±6)
10^-6	(84±3)	(87±4)	(89±8)	(87±2)	(86±2)	(83±6)
10^-5	(82±6)	(83±5)	(84±6)	(82±5)	(84±5)	(83±4)
10^-4	(80±6)	(81±2)	(83±2)	(82±4)	(80±4)	(84±2)

3.4 Статистическая оценка эффектов ауторегуляторных факторов АОБ и ГСЛ на продукцию цитокинов клетками моноцитов и лимфоцитов периферической крови человека

Полученные результаты послужил основой для проведения комплексного дисперсионного анализа и сравнительной оценки коэффициентов детерминации, отражающих эффекты ауторегуляторных факторов бактерий на продукцию цитокинов клетками лимфоцитов и моноцитов в зависимости от различного рода воздействующих факторов.

В качестве анализируемых факторов были выбраны: фактор влияния концентрации АОБ и ГСЛ, фактор дополнительной стимуляции их митогенами, а так же фактор принадлежности ауторегулятора к группе АОБ или ГСЛ и фактор типа клеток.

Показано, что при обработке моноцитов ауторугуляторами класса АОБ развитие эффекта в большей степени определяется концентрацией данного вещества, а следовательно и его природой. Вклад фактора, определяющего природу уторегулятора на продукцию ИЛ-10 и ИЛ-1β ниже для ГСЛ, чем для АОБ. Изменение продукции цитокинов γ-ИН, ИЛ-2, и ИЛ-4 лимфоцитами, обработанными ауторегуляторами, так же в большей степени определяется повышением концентрации воздействующих веществ или их природой (таблица 6).

Таблица 6 – Сравнительная оценка эффектов ауторегуляторов (АОБ и ГСЛ) на клетки лимфоцитов и моноцитов в зависимости от концентрации и дополнительной стимуляции продукции цитокинов митогенами.

В процентах

С₁-АОБ

С₆-АОБ

С₁₂-АОБ

С₁-ГСЛ

С₆-ГСЛ

С₁₂-ГСЛ

Моноциты

α-ФНО

0,11

(0,72)

0,11

(0,73)

0,14

(0,72)

0,47

(0,38)

0,24

(0,72)

0,00031

(0,99)

ИЛ-1β

0,13

(0,75)

0,02

(0,96)

0,0002

(0,96)

0,02

(0,56)

0,37

(0,26)

0,61

(0,15)

ИЛ-10

0,23

(0,59)

0,39

(0,49)

0,11

(0,69)

0,63

(0,19)

0,69

(0,17)

0,65

(0,24)

Лимфоциты

ИЛ-2

0,19

(0,73)

0,03

(0,95)

0,004

(0,97)

0,09

(0,81)

0,05

(0,87)

0,43

(0,93)

γ-ИФ

0,69

(0,14)

0,62

(0,18)

0,26

(0,58)

0,58

(0,26)

0,16

(0,75)

0,21

(0,75)

ИЛ-4

0,76

(0,11)

0,72

(0,16)

3,2*10-5

(0,99)

8,4*10^-5

(0,99)

3,81*10^-5

(0,99)

6,07*10^-5

(0,99)

Пояснения к таблице: оценка влияния индукции, (оценка влияния концентрации)

Также нами была проедена сравнительная оценка коэффициентов детерминации, отражающих эффекты ауторегуляторных факторов бактерийна продукцию цитокинов в зависимости от класса воздействующих на них молекул (АОБ или ГСЛ) и типа клеток (лимфоциты или моноциты), которая показала, что оценивая влияние АОБ на лимфоциты можно сделать вывод о преимущественном влиянии фактора типа клеток как в случае отсутствия, так и в случае присутствия индуктора.

Эффекты АОБ на моноциты в большей степени связаны с типом ауторегулятора. ГСЛ, в отличие от АОБ оказывали воздействие на лимфоциты и моноциты определяющиеся значительным вкладом в эффект фактора природы ауторегулятора. Однако в случае с моноцитами эффект был менее выражен (таблица 7).

Таблица 7 – Коэффициент детерминации влияния АОБ и ГСЛ на индуцированную и неиндуцированную продукцию цитокинов, %.

Тип

клеток

Влия

ние

индук

ции

Концентрация АОБ

Концентрация ГСЛ

10^-8

10^-7

10^-6

10^-5

10^-4

10^-8

10^-7

10^-6

10^-5

10^-4

Моно

циты

н/и

(54)

(50)

(33)

(28)

(32)

(0,8)

(2)

(1)

(0,8)

(8)

(0,5)

(14)

(16)

(18)

(13)

(14)

(18)

(25)

Лимфо

циты

н/и

(67)

0,4

(50)

0,5

(41)

0,2

(33)

0,09

(27)

(29)

(23)

(21)

(57)

(55)

(64)

(57)

(56)

(36)

(34)

(35)

(26)

Пояснения к таблице: коэффициент детерминации, рассчитанный в зависимости от типа ауторегулятора; коэффициент детерминации, рассчитанный в зависимости от (типа клеток); н/и – неиндуцированная продукция цитокина, и – индуцированная продукция цитокина

Заключение

Одним из перспективных направлений в микробиологии и прикладных областях медицины является исследование аутоиндукторов микроорганизмов.

В современных научных сообществах вопрос изучения влияния ауторегуляторных факторов бактерий является актуальным и востребованным. Результаты подобных исследований могут существенно раскрыть параметры действия ауторегуляторов и оказать содействие в изучении ряда заболеваний и облегчить их диагностику и лечение.

Широко известны исследования, описывающие действие ауторегуляторов на клетки эукариот. Выявлено, что ауторегуляторные факторы относящиеся к группам алкилоксибензолов и гомосеринлактонов могут синтезироваться представителями микробиоценоза и инфекционными патогенами, а их присутствие в биологических жидкостях и тканях тела человека в микрo- и наномолярных концентрациях, являюется достаточными для проявления биологических эффектов данных соединений в отношении молекул и клеток эукариот.

Исходя из вышесказанного на первом этапе исследований было выявлено, что бактериальные ауторегуляторные факторы класса алкилоксибензолов и гомосеринлактонов вызывают подавление продукции про- и противовоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, α-ФНО, ИЛ-1β, γ-ИФ.

Выявленные эффекты действия ауторегуляторных факторов являются дозозависимыми, а также вбольшинстве случаев определяются длиной алкильного радикала молекулы. Так, для короткоцепочечных ауторегуляторов выявленное действие являлось менее выраженным, в то время как длинноцепочечные аналоги показывали более эффективное действие.

Полученный результат явился основанием для постановки ряда вопроса о механизмах ингибирующего действия АОБ и ГСЛ на изменение уровня пролиферации лимфоцитов и моноцитов, наиболее очевидным из которых было возможное прямое цитотоксическое действие исследуемых соединений.

Данное действие ауторегуляторных факторов проявляется вне зависимости от природы используемого митогена (фитогемагглютинина или липополисахарида), добавленного в систему.

На основании полученных данных был проведен комплексный дисперсионный анализ и сравнительная оценка коэффициентов детерминации, отражающих эффекты ауторегуляторных факторов бактерий на продукцию цитокинов клетками лимфоцитов и моноцитов в зависимости от различного рода воздействующих факторов.

Эффекты АОБ на моноциты в большей степени связаны с типом ауторегулятора. ГСЛ, в отличие от АОБ оказывали воздействие на лимфоциты и моноциты, определяющиеся значительным вкладом в эффект фактора природы ауторегулятора. Однако в случае с моноцитами эффект был менее выражен.

В целом, проведенные исследования свидетельствуют о наличии регулятивных эффектов малых микробных молекул из групп алкилоксибензолов и гомосеринлактонов на активность лимфоцитов и моноцитов периферической крови человека и частично позволяют раскрыть механизмы взаимодействия «микроорганизм – макроорганизм», а указанные вещества рассматриваются как новый класс иммуномодуляторных молекул.

Список использованных источников

Николаев, Ю.А. Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов / Ю.А. Николаев, А. Л. Мулюкин, И. Ю. Степаненко, Г. И. Эль-Регистан // Микробиология. – 2008. – Т. 75, №4. – С.489-496.
Хмель И.А.QUORUM-SENSING регуляция экспрессии генов: фундаментальные и прикладные аспекты, роль в коммуникации бактерий / И. А. Хмель // Микробиология. – 2006. – Т. 75, №4. – С.457-464.
Шпаков А.О. Системы сигнальной трансдукции прокариот /А. О. Шпаков, М. Н. Перцева / Журнал эволюционной биохимии физиологии. – 2008. – Т. 44, №2. – С.113-130.
Шпаков А.О. Сигнальные молекулы бактерий пептидной природыQS-типа /А. О. Шпаков // Микробиология. – 2009. – Т. 78, № 2. – С.163-175.
Абелев Г.И Основы иммунитета / Г. И Абелев // Сорос.образовательный журнал. – 1996. – Т.5.
Шмагель К.В, Черешнев В.А Клетки врожденного иммунитета. – 2011
Janeway Ch., Travers P // Immunobiologi. L., 1994.
Галактионов В.Г. Иммунология: учеб. Для студ. Вузов / В.Г Галактионов. - М.: Издательский центр «Академия». – 2004.
Ярилин А.А. Основы иммунологии.-М.: Медицина. – 1999.
Abbas A.K., Lichtman A.H. Cellular and Molekular Immunology. 5 th ed. // Philadelphia: W.B. Saunders Co. – 2003.
Abbas A.K., Lichtman A.H. Basic Immunologi: Funktions and Disorbes of the Immune System. // Philadelphia: W.B. Saunders Co, 2001.
Ройт А. Основы иммунологии. – М.: Мир. – 1991. – 328 С.
Abbas A.K., Lichtman A.H. Cellular and Molecular Immunology. 5 th ed. // Philadelphia: W.B. Saunders Co – 2003.
Janeway C.A., Travers P., Walport M., Shlomchik M. Immunobiology. 5 th ed. // Edinburgh: Chur-chill Livingstone –
Kaufmann S.H.E., Sher A., Ahmed R., eds. Immunology of Infektious Diseases. // Washington, DS: ASM Press. – 2002.
Paul W.E., ed. Fundamental Immunology. 4 th ed. // Philadelphia: Lippincott-Raven. – 1999.
Фрейдлин И.С. Система мононуклеарных фагоцитов. / М.: Медицина. – 1984. – 272 С.
George A.J.T., Urch C.E., eds. Diagnostic and Therapeutic Antibodies. Totowa, NJ: Humana Hress. – 2000.
Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев А.А. Эндогенные иммуномодуляторы. / СПб.: Гиппократ. – 1992. – 256 С.
Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. / Новосибирск: Наука. – 1989. – 340 С.
Галактионов В.Г. Иммунология — М.: Изд-во МГУ. – 1998. — 480 С.
Gol-Winker, R. Parakrine action of transforming growth factors \R. Gol-Winker\\Clinikal Endocrinologi. – 1996. – V.15.
К.В Шмагель, В.А Черешнев Гуморальные факторы иммунной системы.
Долгушин И.И, Бухарин О.В Нейтрофилы и гемопоэз / Екатеринбург: УрО РАН. – 2001.
Фрейдлин И.С. Ключевая позиция макрофагов в цитокиновой регуляторной сети / И.С Фрейдлин// Иммунология. – 1995. – №3.
Лазорева., Д. М. Стимуляторы иммунитета / Д.М Лазорева, Е.К Алехин.-М.: Медицина. – 1985.
Janeway Ch., Travers P/ Immunobiologi. L. – 1994.
Абелев Г.И. Воспаление//Сорос. Образ. Журнал. – 1996. – Т.10.
Кубанова, А.А. Уровень сывороточного фактора нектоза опухоли альфа при различных дерматозах / А.А Кубанова // Иммунология. – 1998. – №2.
Pennika, D. Human tumor ntcrosis factor: precursor, structure, expression and homology to lymphotoxin / D Pennika, G. Nedwin // Nature. – 1984. – V.312. – №5996. – P.724-729.
Thomson, A. The Cytocine Handbook / A. Thomson.-London: Academic Press. – 1992. – P.418.
Aggarwal, B. Cytocines: from clone to clinic / B. Aggarwal, E. Pocsic // Immunjlogy. – 1992. – V.292. – P.335-345.
Bona, C. Textbook of immunology, second ed / C. Bona, F. Bonilla.-Amsterdam: Harwood Acad. Publ. – 1996 – 406.
Westwick, T. Novel neutrophil-stimulating peptide / T. Westwick, S.W. Li, R.D. Camp // Immunology Todey. – 1989. – V.10 – №5.
Журнал Цитокины // ЗОА «Вектор-Бест».
Lanzavecchia A. Mechanisms of antigen uptake for presentation // Current Opinion in immunology / A. Lanzavecchia. – 1996. – P.348-354.
Baron, S. The interferons: mechanisms of action and clinical applications / S.Baron, S.Tyring // Immunology. – 1991. – V.2. – P.175-184.
Powrie, F. Cytokine regulation of T cell function: potential for therapeutic intervention / F.Powrie, R.Coffman // Immunology Today. – 1993. – V.14. – P.270-275.
Benjamini, E. Immunology, a short course / E.Benjamini, G.Sunshine, S.Leskowitz.-New York:WILEYLISS. – 1996. – P.451.
Цитокины и аллергия, опосредованная Ig E / Н.В. Медуницын [и др.]// Иммунология. – 1993 – №5. – С.11-18.
Sauder, D.N. Langerhans cell production of interleukin-1/ D.N Sauder, C.A Dinarello, V.B Morhenn// Immunology. – 1984. – V.82.
Kronheim, S.R. Human interleukin-1. Purification to homogeneity / S.R Kronheim, C.J March//Experimential Medicine. – 1985. – V.161. – №3.
Симбирцев, А.С. Биология семейства интерлейкина-1 человека/ А. С Симбирцев// Иммунология. – 1998. – №3.
Фрейдлин, И.С. Ключевая позиция макрофагов в цитокиновой регуляторной сети / И.С. Фрейдлин // Иммунология. – 1995. – №3.
Лазорева., Д. М. Стимуляторы иммунитета / Д.М Лазорева, Е.К Алехин.-М.: Медицина. – 1985.
Sauder, D.N. Langerhans cell production of interleukin-1/ D.N Sauder, C.A Dinarello, V.B Morhenn// Immunology. – 1984. – V.82.
Kronheim, S.R. Human interleukin-1. Purification to homogeneity / S.R Kronheim, C.J March//Experimential Medicine. – 1985. – V.161. – №3.
Вядро, М.М. Цитокины и их роль в патогенезе и терапии инфекций / М.М. Вядро // Антибиотики и химиотерапия. – 1990. – Т.35. – №9. – С.12-14.
Giglia J.S., Ovak G.M., Yoshida M.A. et al. Isolation of mouse T-cell lymphoma lines from different long3term interleukin 2-dependent cultures // Cancer Res. — 1985. — Vol. 45. — P. 5027–5034.
Журнал «Цитокины и воспаление», 2004,№4;
Журнал «Медицинские науки», 2011, №3
Бендиксен Дж., Бендцен К., Клаузен Ж.Е. и др. Лимфоциты: выделение, фракционирование и характеристика / Ред. Дж. Б. Натвиг, П. Перлманн, Х. Вигзел. — М.: Медицина, 1980. — С. 264-277.
Kitamura T., Tange T., Terasawa T. et al. Establishment and characterization of a unique human cell line that proliferates dependently on GM-CSF, IL-3, or erythropoietin // J. Cell. Physiol. — 1989. — Vol. 140. — P. 323–334.
Хамблин А., O’Гарра А. Лимфоциты. Методы / Ред. Дж. Клаус. — М.: Мир. – 1990. — С. 310-338.
Kellar K.L., Douglass J.P. Multiplexed microsphere-based flow cytometric immunoassays for human cytokines // J. Immunol. Meth. — 2003. — Vol. 279. —P. 277–285.
Czerkinsky C.C., Tarkowski A., Nilsson L.A. et al. Reverse enzyme-linked immunospot assay (RELISPOT) for the detection of cells secreting immunoreactiven substances // J. Immunol. Meth. — 1984. — Vol. 72. — P. 489–496.
Stirling D. Qualitative and quantitative PCR: a technical overview //Methods Mol. — 2003. — Vol. 226. — P. 181–184.
Журнал «Медицинские новости» №8. – 1995.
Сигидин Я.А., Усова С.Б. Циклоспорин в терапии ревматоидного артрита. Клин. фармакол. Терапия. – 1994.
Rauova L., et al. Cellular and humoral immunity in patients with rheumatoid arthritis treated with consupren // Rheumatol. in Europe - 1995 – №3 – 233 P.
Bensen W., et al. Combination therapy of ciclosporin with methotrexate and gold in rheumatoid arthritis //J. Rheumatol. -1994 – Vol. 21 – 2034 P.
Telford, The Pseudomonas aeruginosa Quorum-Sensing Signal Molecule N-(3-Oxododecanoyl)-L-Homoserine Lactone Has Immunomodulatory Activity / G. Telford, D. Wheeler, G. Williams // Infection and Immunity. – 1998. – Р. 36-42.;
J. Ritchie, A. Jansson, J. Stallberg et al, The Pseudomonas aeruginosa Quorum-Sensing Molecule N-3-(Oxododecanoyl)-L-Homoserine Lactone Inhibits T-Cell Differentiation and Cytokine Production by a Mechanism Involving an Early Step in T-Cell Activation.// Infection and immunity. – 2005. – V.73.- ьNо3. – P.1648-1655.
Gomi,T. Kikuchi, Y.Tokue et al, Mouse and Human Cell Activation by N-Dodecanoyl-DL-Homoserine Lactone, a Chromobacterium violaceum Autoinduce // Infection and immunity. – 2006/ - V.74/m – Nо12. – P.7029-7031.
Telford, D.Wheeler, P. Williams, P. Tomkins, The Pseudomonas aeruginosa Quorum-Sensing Signal Molecule N-(3-Oxododecanoyl)-L-Homoserine Lactone Has Immunomodulatory Activity // Infection and immunity. – 1998. – V.66. – No1. – P.36-42.
Tateda, Y.Ishii, M.orikawa, Tetsuya et al, The Pseudomonas aeruginosa Autoinduce N-3-Oxododecanoyl Homoserine Lactone Accelerates Apoptosis in Macrophages and Neutrophils // Infection and immunity. – 2003. – V.71. – Nо10. – P.5785-5793.
Smith, R. S. The Pseudomonas Autoinducer N-(3-Oxododecanoyl)-L-Homoserine Lactone Induces Cyclooxygenase-2 and Prostaglandin E₂ Production in Human Lung Fibroblasts: Implications for Inflammation / R. S. Smith, R. Р. Kelly, H. I. Barbara, R. P. Phipps // Infection and Immunity. – 2006. – Р. 5665-5679.
Lawrence, R. N. The Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing signal molecule, N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone, inhibits porcine arterial smooth muscle contraction / R. N. Lawrence, W. R. Dunn, B. B. Bycroft // British Journal of Pharmacology. – 1999. – V. 128. – Р. 845-848.
Ильинская, О. И. Влияние мембраноактивных микробных ауторегуляторов на рост культуры клеток ras-трансформированных фибробластов / О. И. Ильинская, A. И. Колпаков, А. Л. Мулюкин // Прикладная биохимия и микробиология. – 2000. – Т. 36. − № 5. − С. 549-554.
Biarnsholt, T. Quorum Sensing and Virulence of Pseudomonas aeruginosa during Lung Infection of Cystic Fibrosis Patients / T. Biarnsholt, P. Jensen, T. Jakobsen, R. Phipps, A. Nielsen // Molec. Microbiol. Biotechnol. − 2010. − V. 5. − Р. 145-161.
Algirdas, J. Compromised Host Defense on Pseudomonas aeruginosa Biofilms: Characterization of Neutrophil and Biofilm Interactions / J. Algirdas, J. Michael, F. Berglund, M. Sasaki // Immunology. − 2003. − V. 171 − P. 4329-4339.
Erin, K. Interkingdom signaling: Deciphering the language of acylhomoserine lactones / K. Erin, А. Shiner, P. Kendra // Microbiology Reviews. – 2005. – V. 29. – P. 935–947.
Ritchie, A. J. The Pseudomonas aeruginosa Quorum-Sensing Molecule N-3-(Oxododecanoyl)-L-Homoserine Lactone Inhibits T-Cell Differentiation and Cytokine Production by a Mechanism Involving an Early Step in T-Cell Activation / A. J. Ritchie, A. Р. Jansson, J. Р. Stallberg, P. А. Nilsson, P. M. Lysaght, M. A. Cooley // Infection and immunity. – 2005. – V. 45. – Р. 1648-1655.
Ильинская, О.Н. Роль бактериальных ауторегуляторов роста группы алкилоксибензолов в ответе стафилококков на стрессовые воздействия / О.Н. Ильинская // Микробиология. – – Т. 71. – № 1. – С. 23-29
Грузина, В. Д. Коммуникативные сигналы бактерий / В. Д. Грузина // Антибиотики и химиотерапия. − 2003. − Т. 48. − № 10 − С. 32-39.
Зурочка В. А Влияние иммуномодулятора бестим in vitro на спонтанную и индуцированную продукцию цитокинов IFN-γ, IL-1β, IL-4, IL-8, IL-10 иммунокомпетентными клетками крови условно здоровых лиц // В. А. Зурочка, И.И. Долгушин, А.С. Симбирцев / Цитокины и воспаление. – 2007. - №1.
Рудник Д. В. Методы изучения процесса фагоцитоза и функционально-метаболического состояния фагоцитирующих клеток // Д. В. Рудник, Е.И. Тихомирова /Саратов: издательство Саратовского Университета. – 2006. - С.64-65
Smith, R. S., E. R. Fedyk, T. A. Springer et al. IL-8 production in human lung fibroblasts and epithelial cells activated by the Pseudomonas autoinducer N-3-oxododecanoyl homoserine lactone is transcriptionally regulated by NF-_B and activator protein- 2 // J. Immunol – – Р. 366–374.
Tateda, K., Y. Ishii, M. Horikawa et al.. The Pseudomonas aeruginosa autoinducer N-3-oxododecanoyl homoserine lactone accelerates apoptosis in macrophages and neutrophils // Infect. Immun. – 2001. – Р. 5785–5793.
Gardiner, S. M., S. R. Chhabra, C. Harty et al. Haemodynamic effects of the bacterial quorum sensing signal molecule, N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone, in conscious, normal and endotoxaemic rats // Br. J. Pharmacol. – – Р. 1047–1054.
Lawrence, R. N., W. R. Dunn, B. Bycroft, et al. The Pseudomonas aeruginosa quorumsensing signal molecule, N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone, inhibits porcine arterial smooth muscle contraction // Br. J. Pharmacol. – – Р. 845–848.
Tateda, K., Y. Ishii, M. Horikawa et al. The Pseudomonas aeruginosa autoinducer N-3-oxododecanoyl homoserine lactone accelerates apoptosis in macrophages and neutrophils // Infect. Immun. – – Р. 5785–5793.
Telford, G., D. Wheeler, P. Williams, P. T. et al. The Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing signal molecule N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone has immunomodulatory activity. // Infect. Immun. – 1998. – Р. 36–42.
Chhabra, S. R., C. Harty, D. S. Hooi et al. Synthetic analogues of the bacterial signal (quorum sensing) molecule N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone as immune modulators. // J. Med. Chem. – – Р. 97–104.
Ritchie, A. J., A. O. Yam, K. M. Tanabe et al. Modification of in vivo and in vitro T- and B-cell-mediated immune responses by the Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing molecule N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone.// Infect. Immun. – 2003. – Р. 4421–4431.
Smith, R. S., S. G. Harris, R. Phipps, and B. Iglewski. The Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing molecule N-(3-oxododecanoyl)homoserine lactone contributes to virulence and induces inflammation in vivo // J. – 2002. – Р. 1132–1139.
Егоров А. М. Теория и практика иммуноферментного анализа // Егоров А. М., Осипов А. П., Дзантиев Б. Б., Гаврилова Е. М. – 1991.

Приложение А

(обязательное)

Маркеры иммунных клеток

Таблица А 1 Поверхностные антигены иммунных клеток и выполняемые ими функции

Антиген	Лиганд	Клетки, несущие антиген	Функции антигена
Маркеры Тлимфоцитов
CD 1	–	Тлимфоциты коркового вещества тимуса	Связан с бета₂микроглобулином, участвует в представлении антигена незрелым Тлимфоцитам
CD 2	LFA –3	Т и NKлимфоциты	Рецептор к эритроцитам барана, участвует в активации Тлимфоцитов
CD 3	–	Тлимфоциты	Связан с антигенраспознающим рецептором Тлимфоцитов, участвует в их активации
CD 4	HLA класса II	Тлимфоциты, моноциты	Присутствует на Тхелперах, обеспечивает их взаимодействие с макрофагами
CD 5	CD 72	Т и Влимфоциты	Присутствует на зрелых Тлимфоцитах в незначительной части Влимфоцитов, появляется на лейкозных Влимфоцитах при хроническом лимфолейкозе
CD 7	–	Тлимфоциты	Присутствует на костномозговых предшественниках Тлимфоцитов и зрелых Тлимфоцитах
CD 8	HLA класса I	Т и NKлимфоциты	Присутствует на цитотоксических Тлимфоцитах, обеспечивает их взаимодействие с клеткамимишенями
CD 25	Интерлейкин 2	Т, В и NKлимфоциты, моноциты	Альфацепь рецептора к интерлейкину2 (р55), маркер активированных Т и Влимфоцитов
CD 28	CD 80	Тлимфоциты	Участвует в активации Тлимфоцитов
CD 29	Фибронектин	Тлимфоциты	Обеспечивает адгезию к внеклеточному матриксу
CD 38	–	Т и Влимфоциты	Присутствует на Тлимфоцитах коркового вещества тимуса, активированных Тлимфоцитах, незрелых Влимфоцитах и плазматических клетках, участвует в регуляции функций Влимфоцитов
CD 43	ICAM1	Т и Влимфоциты, гранулоциты, моноциты	Участвует в активации Тлимфоцитов
CD 45	–	Все лейкоциты	Участвует в активации лимфоцитов, внутриклеточная часть рецептора является тирозинкиназой
CD 45 RA	–	Все лейкоциты	Маркер девственных лимфоцитов CD 4

Продолжение таблицы А 1

Антиген	Лиганд	Клетки, несущие антиген	Функции антигена
CD 45 RO	–	Т и Влимфоциты, гранулоциты, моноциты	Маркер клеток памяти (лимфоцитов CD 4)
СD 71	Трансферрин	Тлимфоциты, моноциты	Рецептор трансферрина, маркер активированных Т-лимфоцитов
Маркеры Влимфоцитов
Поверх ностные иммуно глобули- ны	Антиген	Влимфоциты	Присутствуют только на зрелых Влимфоцитах
CD 10	–	Влимфоциты	Присутствует на незрелых Влимфоцитах, появляется на лейкозныхклетках при остром лимфолейкозе
CD19	–	Влимфоциты	Присутствует на преВлимфоцитах и на зрелых Влимфоцитах, участвует в активации Влимфоцитов
CD 20	–	Влимфоциты	Присутствует на всех В-лимфоцитах
CD 21	C3d, CD 23	Влимфоциты	Рецептор к комплементу и вирусу ЭпштейнаБарр
CD 23	IgE	В и Тлимфоциты, моноциты, эозинофилы	Низкоаффинный рецептор к Fcфрагменту IgЕ
CD 32	IgG	Влимфоциты. гранулоциты	Стимулирует пролиферацию Влимфоцитов, по строению сходен с CD27 и рецептором фактора некроза опухолей
CD 40	Gp39	Влимфоциты	Появляется на костномозговых предшественниках Влимфоцитов, участвует в их дифференцировке
CD 72	CD 5	Влимфоциты	Антиген HLA класса II, участвует в представлении антигена Тхелперам и их активации, маркер активированных Тлимфоцитов
HLADR	Антиген, CD 4	Т и Влимфоциты, моноциты
Маркеры моноцитов и макрофагов
CD 11a	ICAM1	Все лейкоциты	Альфацепь LFA1, участвует в межклеточной адгезии
CD 11b	С3bi, фибронектин	Моноциты, гранулоциты, NKлимфоциты	Альфацепь CR3, участвует в межклеточной адгезии
CD 11c	С3bi	Моноциты, Гранулоциты, В и NK лимфоциты	Альфацепь CR4, участвует в межклеточной адгезии

Продолжение таблицы А 1

CD 18	–	Все лейкоциты	Бета – цепь рецепторов CD 11a/CD 18, CD 11b/CD 18, CD 11c/CD 18, участвуют в межклеточной адгезии
Маркеры NK – лимфоцитов
CD 16	Fc-фрагмент IgG	NKлимфоциты моноциты, гранулоциты	Низкоаффинный рецептор IgG
CD 56	-	NK и Т- лимфоциты	Присутствует на части Т-лимфоцитов, участвует в межклеточной адгезии
CD 57	-	NK и Т- лимфоциты	Присутствует на части лимфоцитов CD 8, при некоторых ,вирусных инфекциях увеличивается число лимфоцитов, несущих одновременно СD 8 и CD 57

Приложение Б

(обязательное)

Разнообразие аутоиндукторов

Таблица 2 Б Ауторегуляторные факторы бактерий

Скачать: Diplomnaya-rabota.doc
titl-list1.doc

Категория: Дипломные работы / Дипломные работы по биологии

Уважаемый посетитель, Вы зашли на сайт как незарегистрированный пользователь.
Мы рекомендуем Вам зарегистрироваться либо войти на сайт под своим именем.

Привет студент