Поиск потенциальных ингибиторов «чувства кворума» растительного происхождения

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

Поиск потенциальных ингибиторов «чувства кворума» растительного происхождения

Аннотация

В данной выпускной квалификационной работе рассматривается такое явление в жизнедеятельности микроорганизмов как «чувство кворума» – особый тип регуляции экспрессии генов бактерий, зависящий от плотности их популяции, при этом раскрываются возможности использования регуляции «чувства кворума» в качестве перспективной мишени для борьбы с бактериальными инфекциями и в других прикладных аспектах, в частности практическая часть работы посвящена поиску потенциальных ингибиторов «чувства кворума» растительного происхождения в тестах ингибирования биосинтеза виолацеина Chromobacterium violaceum и биолюминесценции Escherichia coli. Поставленные цели и задачи в ходе данной работы были достигнуты.

Работа выполнена печатным способом на 61 странице с использованием 63 источников, содержит 7 таблиц, 23 рисунка, 2 приложения.

Abstract

In the given final qualifying work such phenomenon in ability to live of microorganisms as «quorum sensing» – special type of regulation of an expression of genes of the bacteria is considered, depending on density of their population, possibilities of use of regulation of «quorum sensing» as a perspective target for extirpation with bacterial infections and in other applied aspects thus reveal, in particular the practical part of work is devoted search of potential inhibitors of «quorum sensing» phytogenesis in tests of inhibition of biosynthesis violacein Chromobacterium violaceum and bioluminescences Escherichia coli. Objects in view and problems during the given work have been reached.

Work is executed in the printing way on 61 pages with use of 63 sources, contains 7 tables, 23 drawings, 2 appendixes.

Содержание

Введение...................................................................................................................6

1 luxI-luxR подобные системы Quorum sensing.....................................................8

1.1 Пути биокоммуникации микроорганизмов………………….........................8

1.2 История открытия системы Quorum sensing………………...........................9

1.3 Эффект Quorum sensing и механизм его реализации...................................10

1.4 Quorum sensing зависимые системы с лактонами гомосерина как агентами межклеточной коммуникации (системы типа «luxI-luxR»)...............................12

1.5 Структурные особенности АГЛ и механизм его взаимодействия с LuxR-подобными белками…………………………………….......................................17

1.6 Методы исследования luxI-luxR подобных систем Quorum sensing...........19

1.6.1 Бактериальные биосенсоры АГЛ................................................................19

1.6.2 Положительные и отрицательные стороны применения биосенсоров...22

1.7 Пути ингибирования системы Quorum sensing.............................................24

1.7.1 Подавление синтеза аутоиндукторов системы Quorum sensing ……......24

1.7.2 Деградация аутоиндукторов системы Quorum sensing специфическими ферментами………………....................................................................................24

1.7.3 Ингибирование связывания аутоиндукторов с соответствующими рецепторными белками………......................................................…...................27

2 Материалы и методы..........................................................................................32

2.1 Бактериальные штаммы и условия их культивирования.............................32

2.1.1 Виолацеинпродуцирующие биосенсоры....................................................32

2.1.2 Люминесцирующий биосенсор...................................................................33

2.3 Растительные материалы – лекарственные растения...................................35

2.4 Виолацеин-анализ............................................................................................38

2.4.1 Качественная оценка ингибирования Quorum sensing..............................38

2.4.2 Количественная оценка ингибирования Quorum sensing..........................39

2.5 Биолюминесцентный анализ...........................................................................41

2.6 Корреляционный анализ.................................................................................41

3 Результаты и обсуждение..................................................................................43

Заключение………………………………..........………………….......................53

Список используемой литературы.......................................................................54

Приложение А Типы Quorum sensing системы...................................................59

Приложение Б Сведения об опубликованных материалах исследования.......61

Введение

Последние 20 лет внимание многочисленных исследователей, работающих с микроорганизмами в различных областях биологии и медицины, обращено на явление получившее название «чувство кворума» (Quorum sensing, QS). QS – особый тип регуляции экспрессии генов, зависящей от плотности популяции бактерий; он основан на действии низкомолекулярных сигнальных молекул различной природы, аутоиндукторов (АИ), которые накапливаются в культуре при высоких плотностях популяции бактерий [1, 2, 3]. С помощью аутоиндукторов осуществляется коммуникация бактерий – передача информации между клетками бактерий, принадлежащих к одному и тому же или к разным видам, родам, и даже семействам [5, 6, 7]. Примером аутоиндукторов грамотрицательных бактерий являются ацил-гомосеринлактоны (АГЛ).

Благодаря QS регуляции бактерии получают возможность координировано контролировать экспрессию генов во всем сообществе. Передача информации от клетки к клетке с использованием QS-систем, которая приводит к индукции специализированных наборов генов, способствует быстрой адаптации популяций бактерий к меняющимся условиям и их выживанию в среде [1, 3].

Регуляторные системы типа QS участвуют во взаимодействии бактерий с высшими организмами – животными и растениями, в регуляции вирулентности, формировании биопленок, регуляции экспрессии генов, связанных с синтезом различных экзоферментов, токсинов, антибиотиков и других вторичных метаболитов, в конъюгации и другое. Исследование QS систем регуляции, их роли в метаболизме и взаимодействии бактерий определяет новый подход к изучению поведения бактерий в природных условиях [1-6].

Данный факт обусловил появление нового направления, связанного с использованием QS регуляции в качестве потенциальной мишени для борьбы с инфекционными заболеваниями [3-6].

Последнее обстоятельство определило интерес к исследованию возможных механизмов регуляции «чувства кворума», потенциально востребованных при борьбе с возбудителями заболеваний растений, животных и человека. По существующим представлениям подобная задача может быть достигнута путем: 1) подавления синтеза АИ; 2) деградации АИ специфическими ферментами; 3) ингибирования связывания АИ с соответствующими рецепторными белками. При этом ожидаемыми преимуществами названных воздействий являются отсутствие влияния на представителей нормальной микрофлоры, а также малая вероятность развития устойчивости к ним у патогенных микроорганизмов.

При поиске антагонистов АИ, нарушающих их связывание с молекулами рецепторных белков, значительное внимание уделяется молекулам растительного происхождения. Первым из подобных примеров стали галогенизированные фураноны, образуемые австралийской водорослью Delisea pulchra. Однако исследование соединений фураноновой природы заставило констатировать их существенную токсичность для человека и животных, что явилось препятствием для их использования в медицинской и ветеринарной практике. В то же время сам подход, ориентированный на поиск потенциальных регуляторов АИ в продуктах растительного происхождения, по-прежнему рассматривается как актуальный и перспективный.

Все вышесказанное обуславливает цель исследования – поиск потенциальных ингибиторов «чувства кворума» растительного происхождения в тестах ингибирования биосинтеза виолацеина Chromobacterium violaceum и биолюминесценции Escherichia coli.

Объект исследования – процесс «чувства кворума» и пути его ингибирования растительными вытяжками.

Предмет исследования – биосенсорные виолацеинпродуцирующие и биолюминесцирующие тест-системы.

В соответствии с поставленной целью, объектом и предметом были определены следующие задачи:

тестирование растительных вытяжек в тестах индукции «чувства кворума» у виолацеинпродуцирующих штаммов Chromobacterium violaceum;
исследование биологической активности растительных вытяжек на рекомбинантном штамме Escherichia coli pAL 103;
статистический анализ эффектов ингибирования растительными вытяжками роста и пигментообразования биосенсорных моделей Chromobacterium violaceum 026 и АТСС 31532 и биолюминесценции Escherichia coli pAL
комбинирование растительных вытяжек с целью выявить наиболее эффективные комбинации растительных ингибиторов «чувства кворума».

Экспериментальная часть исследования осуществлялась на базе микробиологической лаборатории химико-биологического факультета ОГУ.

В данной работе большой акцент был сделан на отбор растительного материала, который должен адекватно отвечал предъявляемым требованиям – ингибированию «чувства кворума». Нами было отобрано и протестировано более 20 лекарственных растений на способность подавлять «чувство кворума» у виолацеинпродуцирующих штаммов Chromobacterium violaceum и биолюминесцирующего штамма Escherichia coli pAL 103.

При выполнении отдельных задач работы были использованы такие методы как: биолюминесцентный анализ для репортерной клеточной тест-системы Escherichia coli JLD271, pAL103; luxR+ luxI luxCDABE; TetR p15A, чашечный метод посева культуры «газоном» и метод серийных разведений, используемые для анализа «чувства кворума» тест-систем C.violaceum NCTC 13274 и C.violaceum ATCC 31532.

Структура работы: дипломная работа состоит из введения, трех глав, заключения, списка литературы и приложений.

1 luxI-luxR подобные системы Quorum sensing

1.1 Пути биокоммуникации микроорганизмов

В последнее десятилетие неуклонно расширяется список изученных микробных процессов, реализуемых только при наличии достаточной плотности популяции. Эти исследования продолжают начатые уже около 100 лет тому назад изыскания. Уже тогда исследовался, например, вопрос о том, почему культивирование бактерий часто не удается, если взята слишком низкая плотность инокулята. В 1988 г. Дж. Шапиро [7] также писал, что споры миксобактерий прорастают только при достаточно высокой их концентрации в среде. Уже в начале 80-х годов, как известно, изучением плотностно-зависимых процессов в микробных популяциях активно занимались В.И. Дуда, Г.И. Эль-Регистан и другие. [8, 9]. Была исследована природа некоторых химических факторов (ауторегуляторов), накапливающихся в культуре и вызывающих те или иные эффекты, например, автолиз клеток (фактор d₂ жирнокислотной природы [9]).

Среди изучаемых каналов коммуникации между живыми организмами, три канала коммуникации являются наиболее эволюционно-консервативными и в полной мере функционируют уже у одноклеточных форм жизни [3, 10]. Речь идёт о передаче информации несколькими путями:

1) непосредственного (механического) контакта между организмами;

2) генерации тех или иных физических полей;

3) выработки диффундирующих в среде химических агентов.

Все три канала коммуникации, вероятно, принимают участие в «эффектах кворума».

Механический путь коммуникации микроорганизмов необходим при коммуникации посредством поверхностных органелл, таких как, например, пили, и компонентов экзополимерного матрикса, покрывающего отдельные клетки, их группы, всю колонию в целом. В частности, процесс агрегации и споруляции у M.xanthus зависит от пилей типа IV (гомологи пилей типа IV есть у патогенных бактерий Pseudomonas aeruginosa и Neisseria gonorhoeae, где они также обусловливают социально координированные клеточные движения [12]), от полисахаридно-белковых фибрилл и от липополисахаридного О-антигена внешнего слоя наружной мембраны [12, 13]. Все эти поверхностные клеточные структуры синтезируются с помощью так называемых S (social) генов, ответственных за коллективные, координированные перемещения клеток и формирование структур надклеточного уровня. Им противопоставляют также имеющиеся у миксобактерий А (adventurous) гены, позволяющие клеткам покидать край растущей колонии [12].

Своего рода промежуточное положение между недиффундирующими и свободно диффундирующими агентами коммуникации у миксобактерий занимают тяжи (trails) из биополимеров матрикса, которые отделяются от образовавшей их клетки, тем самым пролагая путь другим клеткам-«путешественницам», дающим начало дочерним колониям [13].

В литературе накапливаются данные о взаимовлиянии микробных колоний в ситуации, когда невозможен обмен химическими сигналами. Так, гибнущая под воздействием хлорамфеникола культура Vibrio costicola посылает сигнал, стимулирующий рост другой культуры, отделенной от неё слоем стекла [14]. В ряде случаев предполагается синергидное действие различных каналов межклеточной коммуникации, а именно химических сигналов и физических полей; это вытекает из опытов по влиянию одной бактериальной колонии на адгезивные свойства другой [14, 15]. В качестве конкретных физических факторов гипотетически предлагаются: электромагнитные волны [14] (по аналогии с эукариотическими клетками, где эффекты ультрафиолетовых лучей установлены – это митогенетический эффект А. Гурвича) и ультразвук [14, 15].

Необходимо признать, что физические факторы дистантной коммуникации микробных клеток и их роль в плотностно-зависимых процессах пока ещё находятся в стадии «первоначального накопления» эмпирических данных [16].

Но наибольшую роль в образовании коммуникативных каналов, как уже упоминалось раньше, играют диффундирующие в среде химические агенты. В роли химических агентов выступают различные вещества, выполняющие роль, как правило, активаторов транскрипции генов-мишеней [3, 4, 17].

В качестве аутоиндукторов QS микроорганизмы используют широкий спектр химических сигнальных молекул:

а) ацилированные лактоны гомосерина, регулирующие широкий круг плотностно-зависимых коллективных процессов у грамотрицательных бактерий (Vibrio fischeri; Vibrio harveyi, Pseudomonas aeruginosa и др.) [3, 17];

б) пептиды, регулирующие конъюгативный плазмидный перенос у Enterococcus, развитие воздушного мицелия у Streptomyces, споруляцию у Bacillus и др.[18];

в) аминокислоты и сходные с ними аминные соединения (2-гептил-З-гидрокси-4-хинолон – PQS), регулирующие агрегацию бактериальных клеток (E.coli, Salmonella typhimurium, Myxococcus xanthus) и формирование швермеров у Proteus [3, 17].

Механизмы синтеза этих агентов, а так же функции структур, с которыми они взаимодействуют для запуска системы «чувства кворума», хорошо изучены.

1.2 История открытия системы Quorum sensing

Первое открытие в области социальной жизни бактерий было сделано в начале 60-х годов прошлого столетия и касалось колонии светящихся бактерий Vibrio fischeri. Эти бактерии поселяются в теле кальмаров, живущих на отмелях вокруг Гавайских островов. В течение жаркого дня кальмар отдыхает, зарывшись в песок морского дна, а ночью отправляется на охоту. В лунном свете тёмное тело кальмара становится заметным для хищников, однако бактерии, покрывающие кожу кальмара, продуцируют голубоватое свечение, похожее на лунный свет. Это своего рода маскировка [3].

Микробиолог Вудланд Хастингс (Woodland Hastings) заметил удивительную вещь. Колония Vibrio fischeri в стенах лаборатории удваивала свою численность каждые двадцать минут, однако количество светящегося пигмента – люциферазы – оставалось на заданном уровне в течение многих часов. Таким образом, интенсивность свечения не зависима от численности. Только когда колония бактерий слишком разрасталась, количество люциферазы начинало слабо расти [3].

Учёному стало очевидно, что бактерии в состоянии оценить количество членов колонии и действовать исходя из этого. Это умение бактерий действовать коллективно было названо «чувством кворума» (Quorum sensing). Доктор Хастингс недооценил своё открытие, полагая, что «чувство кворума» присуще только морским бактериям, возможно только Vibrio fischeri. [3].

Таким образом, эффект кворума был впервые обнаружен у морских биолюминесцирующих бактерий V.fischeri и V.harveyi. В 1970 году студент Хастингса Кеннет Нилсон (Kenneth Nealson) с соавторами [5] сообщили, что V.fischeri продуцирует внеклеточный фактор, аутоиндуктор, который регулирует продукцию люциферазы – отвечающего за биолюминесценцию фермента. В 1981 г. было продемонстрировано [6], что аутоиндуктором является N-3-(оксогексаноил)-L-гомосеринлактон (оксоС₆-ГСЛ).

Дальнейшее обнаружение QS-систем, основанных на действии АГЛ, у условно патогенных для человека бактерий Pseudomonas aeruginosa и у растительных патогенов Erwinia carotovora и Agrobacterium tumefaciens позволило считать, что данное явление распространено более широко. В настоящее время обнаружено более пятисот видов микроорганизмов, продуцирующих АГЛ. Очень часто регулируемые с помощью АГЛ гены связаны с взаимодействием с эукариотическим хозяином [6].

1.3 Эффект системы Quorum sensing и механизм его реализации

Прокариоты используют сложные сигнальные механизмы для адаптации к изменениям окружающей среды, в том числе к изменению кислотности, температуры, осмотического давления и доступности питательных веществ [3, 20]. Такие сигнальные молекулы позволяют индивидуальным бактериальным клеткам начать совместное действие только тогда, когда будет достигнута пороговая плотность бактериальной популяции или кворум. Для описания способности определенных бактерий отслеживать собственную популяционную плотность и модулировать экспрессию соответствующих генов был предложен термин QS [2, 20, 21].

Кворумные регуляторные системы основаны на действии двух основных компонентов: низкомолекулярной диффузионной сигнальной молекулы – аутоиндуктора (АИ), концентрация которой увеличивается в соответствии с ростом популяции, и белкового фактора транскрипции, который при взаимодействии с сигнальной молекулой активирует транскрипцию соответствующих генов [3].

Механизмы реакций чувства кворума различаются у грамположительных и грамотрицательных бактерий, общие данные этих систем приведены в приложении А.

Грамположительные бактерии обычно осуществляют коммуникации, используя олигопептидные сигнальные молекулы (рисунок 1). Передача сигналов в большинстве случаев включает двухкомпонентный механизм фосфорилирования. Как правило, состояние кворума достигается при переходе популяции бактериальных клеток в стационарную фазу роста. Именно в это время обнаруживаются сигнальные молекулы, при помощи которых клетки контактируют друг с другом [22].

предшественник

Р – олигопептид-АИ, попавший в клетку, RR – белковый фактор транскрипции.

Рисунок 1 – Экспрессия генов системы QS грамположительных бактерий: синтез белка-предшественника, его модификация и экскреция клетками-экспортерами (а), распознавание и передача сигнала киназой в клетку и экспрессия гена-мишени (б)

Общую схему коммуникаций грамположительных бактерий можно представить следующим образом: сначала в клетке синтезируется предшественник, который, модифицируясь, превращается в зрелый олигопептид. Последний экскретируется наружу клетки экспортером. Молекулы олигопептида накапливаются в межклеточном пространстве по мере того, как растёт плотность бактериальных клеток. Двухкомпонентная сенсорная киназа, пронизывающая мембрану, распознает сигнал и осуществляет его передачу в клетку в процессе каскадного фосфорилирования. В клетке олигопептидная молекула взаимодействует с целевым геном (генами) [21, 22].

Более чем у 450 видов грамотрицательных бактерий обнаружены кворум-зависимые системы, в которых сигнальными молекулами служат различные ацилгомосеринлактоны. Общую схему коммуникаций грамотрицательных бактерий можно представить следующим образом (рисунок 2).

Рисунок 2 – Экспрессия генов системы QS грамотрицательных бактерий: продукция АИ-АГЛ (а), экспрессия генов-мишеней (б)

В системе QS грамотрицательных бактерий белки семейства Luxl являются аутоиндукторными синтазами и катализируют формирование специфических ацилгомосеринлактонных аутоиндукторных молекул. АИ свободно диффундируют через мембрану и аккумулируются по мере увеличения плотности клеток. Белки семейства LuxR связывают родственные им АИ при достижении достаточно высокой концентрации сигнальных молекул. Комплекс LuxR – АИ связывается с промотором целевых генов, запуская их транскрипцию [18, 23].

1.4 Quorum sensing зависимые системы с лактонами гомосерина как агентами межклеточной коммуникации (системы типа «luxI-luxR»)

Рассмотрим пример QS-системы грамотрицательных бактерий с ацильными производными ГСЛ. Такой тип QS-системы называется luxI-luxR типа, широко распространен среди грамотрицательных микроорганизмов (таблица 1) [1-4, 21, 22, 23].

Многолетние исследования в этом направлении позволили констировать типичность ауторегуляторных систем типа luxI-luxR, а также многообразие контролируемых ими функций более чем у 70 видов уже нелюминесцирующих грамотрицательных бактерий: Serratia marcescens, Citrobacter freundii, Enterobacter agglomerans, Proteus mirabilis, Erwinia herbicola и другие, что свидетельствует о «чувстве кворума» как явлении, чрезвычайно широко распространенном в микромире (таблица 1). При этом за подобные взаимодействия у отдельных видов наиболее часто также ответственны различные производные гомосеринлактонов, представленные десятками различных вариантов с длиной ацильного радикала от 4 до 14 атомов углерода и замещением в положении 3 на кето- или оксигруппы [16]. При достижении высокой плотности бактериальной популяции данные молекулы накапливаются в среде до критических уровней, после чего связываются с соответствующими рецепторными молекулами и ведут к индукции регулируемых ими генов

Таблица 1 – QS-система типа «luxI-luxR» для некоторых микроорганизмов

Микроорганизм	Функция	Аутоиндукторы	Генная система
V.fischeri	биолюминесценция	N-(3-оксогексаноил)-L-лактон гомосерина	luxI-luxR
V.fischeri	биолюминесценция	N-октаноил-L-лактон гомосерина	ainS-ainR
V.harveyi	биолюминесценция	N-(3-оксибутаноил)-L-лактон гомосерина	luxL, luxM; luxR, luxN
V.harveyi	биолюминесценция	AI-2	luxS-luxQ
Erwinia carotovora	синтез внеклеточных гидролитических ферментов	N-(3-оксогексаноил)-L-лактон гомосерина	ecaI (expI)-ecaR (expR) carI - carR
Erwinia carotovora	синтез антибиотика карбапенема	N-(3-оксогексаноил)-L-лактон гомосерина	ecaI (expI)-ecaR (expR) carI - carR
Pseudomonas aeruginosa	синтез факторов вирулентности	N-(3-оксододеканоил)-L-лактон гомосерина	lasI-lasR
Pseudomonas aeruginosa	синтез факторов вирулентности	N-бутаноил-L-лактон гомосерина	vsmI-vsmR, или rhlI-rhlR
Agrobacterium tumefaciens	конъюгативный перенос Ti-плазмид	N-3-(оксо-октаноил)-L-лактон гомосерина	traR-traI
Serratia liquefaciens	стимуляция движения клеток-швермеров по агару	N-бутаноил-L-лактон гомосерина	swr
Streptomyces griseus	синтез стрептомицина, развитие воздушного мицелия, споруляция.	2-изокапроил-3-оксиметил-γ-бутиролактон гомосерина	отличаются от типичной системы «luxI-luxR»

Впервые система QS типа luxI-luxR была описанный для V.fischeri [1, 2, 22, 23]. Система включает 2 основных блока генов. Один из этих блоков –оперон luxICDABEG, чьи гены имеют следующие функции:

Ген luxI кодирует белок (LuxI, 193 аминокислоты), который по всей вероятности функционирует как синтаза химического агента межклеточной коммуникации, чьё накопление в среде сигнализирует клеткам V.fischeri о достижении пороговой плотности (кворума) для биолюминесценции. Агент коммуникации синтезируется из S-аденозилметионина и 3-оксогексаноил-кофермента А и представляет собой N-(3-оксогексаноил)-L-лактон гомосерина (3-ОГЛГ).

Гены luxA и luxB кодируют, соответственно, субъединицы a и b люциферазы (ферментного комплекса, ответственного за биолюминесценцию).

Гены lux C, D, E кодируют редуктазу жирных кислот (один из окисляемых субстратов в ходе люциферазной реакции, приводящей к испусканию кванта света).

Ген lux G кодирует редуктазу флавинмононуклеотида (другой субстрат, также окисляемый в люциферазной реакции) (рисунок 3).

Рисунок 3 – Структурные гены биолюминесценции и порядок их расположения на бактериальной хромосоме

Другой генный блок включает ген luxR, чей белковый продукт LuxR (250 аминокислот) связывает фактор 3-ОГЛГ. Комплекс LuxR-3-ОГЛГ связывается с промоторным участком оперона luxICDABEG и активирует его транскрипцию. В отсутствие 3-ОГЛГ оперон luxICDABEG экспрессируется на низком «базовом» уровне. Белок LuxR в отсутствие 3-ОГЛГ функционирует как репрессор, в частности, гена luxR, кодирующего сам этот белок. По мере повышения концентрации клеток V.fischeri накапливающийся в среде 3-ОГЛГ начинает выступать как «аутоиндуктор»: наряду со структурными генами его комплекс с LuxR активирует и транскрипцию luxI, то есть синтез самого 3-ОГЛГ [16, 25], активирующего в комплексе с LuxR транскрипцию оперона lux в новых и новых клетках V.fischeri. Поэтому лавинообразно нарастает синтез всех компонентов люциферазной системы и начинается интенсивное свечение бактерий [24, 25].

Помимо LuxI-синтазы у V.fischeri идентифицирован белок AinS, который не гомологичен LuxI, но имеет 34 % гомологию с С-терминальным доменом LuxM-белка V.harveyi, который осуществляет позитивную регуляцию биолюминесценции у данного микроорганизма [26]. Продуктом LuxM-синтазы является гидроксигексаноил-ГСЛ.

AinS-синтаза отвечает за продукцию октаноил-ГСЛ [27]. В настоящее время показано [27], что обе кворумные системы последовательно индуцируют биолюминесценцию и необходимы для успешной колонизации световых органов моллюсков (рисунок 4). На ранних стадиях процесса колонизации LuxO-белок репрессирует экспрессию генов, ответственных за биолюминесценцию. LuxO ингибирует транскрипцию litR-гена, кодирующего активатор транскрипции lux-оперона и luxR-гена. При достижении плотности 1·10^-8клеток на миллилитр синтезируемый с помощью AinS сигнал оказывает двойной эффект: во-первых, индуцирует биолюминесценцию в результате прямого связывания с LuxR и инактивирует LuxO, и, во-вторых, усиливает транскрипцию lихR-гена. В свою очередь, LitR-белок позитивно влияет на транскрипцию luxR, что при увеличении плотности популяции усиливает биолюминесценцию, регулируемую кворумной сенсорной системой LuxI-LuxR [27, 28].

Рисунок 4 – Иерархический ауторегуляторный каскад Vibrio fischeri

Другой пример использования в качестве сигнальных молекул гомосеринлактонов показан для Pseudomonas aeruginosa – патогена для животных. Патогенность у Р.aeruginosa обусловлена широким арсеналом факторов вирулентности [26, 29]. Одни из них ассоциированы с клеткой (пили, адгезины, липополисахариды), другие секретируются (протеазы, рамнолипиды, экзофермент S, экзотоксин А, антибиотик пиоцианин и т. д.).

Образование многих из внеклеточных факторов вирулентности контролируется системами межклеточного взаимодействия. Центральными компонентами таких взаимодействий служат las- и rhl-системы QS-системы, активирующие экспрессию генов в зависимости от величины плотности клеток микроорганизма. Каждая система представлена двумя генами: один кодирует фермент, при помощи которого синтезируется специфический аутоиндуктор – ацилированный гомосеринлактон (lasl/rhll); другой кодирует активатор транскрипции, с которым связывается соответствующий аутоиндуктор (lasR/rhIR) (рисунок 5).

АИ систем las и rhi является N-(3-оксододеканоил)-L-гомосеринлактон (З-оксо-С₁₂-ГСЛ, для экспорта которого из клетки служит специальная система, получившая название MexEF-OprN-помпа и N-бутирил-L-гомосеринлактон (C₄-ГСЛ) соответственно [16].

Система las контролирует экспрессию генов, кодирующих такие факторы вирулентности, как эластазы А, В, а также щелочную протеазу; система rhi – ферменты биосинтеза рамнолипидов, пиоцианина. [30]. Было продемонстрировано, что LasR/LasI и RhlR/RhlI регуляторные системы взаимодействуют между собой по принципу каскадной иерархии [31]. Кроме того, P.aeruginosa использует эффект «чувства кворума» для контроля образования биопленок. Формирование биопленок, как считается, защищает входящие в них микроорганизмы от фагоцитов и системы комплемента организма хозяина и обеспечивает повышенную устойчивость к антибиотикам. Показано, что синтез оксододеканоил-ГСЛ ферментом LasI является обязательным для нормального формирования биопленки [30, 31].

Рисунок 5 – Сетевая ауторегуляторная система Pseudomonas aeruginosa

Недавно была обнаружена третья сигнальная молекула, принимающая участие в реакциях QS у P.aeruginosa – 2-гептил-З-гидрокси-4-хинолон (PQS). Эта сигнальная молекула может контролировать уровень экспрессии las В, кодирующего эластазу Las В, а также уровень экспрессии rhil, кодирующего синтазу C₄-ГСЛ.

Особенности АГЛ и механизм его взаимодействия с

LuxR-подобными белками

Все АГЛ имеют в составе молекулы гомосеринлактоновое кольцо, однако ацилированные боковые цепи различных АГЛ значительно отличаются по длине, степени замещенности и насыщенности (рисунок 6).

Общая гидрофобность молекулы представляет собой баланс между некоторой гидрофильностью гомосеринлактонового кольца и гидрофобностью боковой цепи. Такая амфипатическая структура, возможно, позволяет АГЛ проникать через фосфолипидный бислой мембраны и, кроме того, существовать во внутри- и внеклеточных водных средах.

Все идентифицированные АГЛ имеют в боковой цепи от 4 до 14 атомов углерода и количество их кратно двум (С₆, С₈, С₁₂). В целом именно длина боковой цепи и химическая модификация в β-позиции обеспечивают высокую специфичность QS систем [22].

а – оксогексаноил-ГСЛ (оксо-С₆-ГСЛ); б – бутаноил-ГСЛ (С₄-ГСЛ); в – гидроксибутаноил-ГСЛ (гидрокси-С₄-ГСЛ); г – гексаноил-ГСЛ (С₆-ГСЛ); д – оксооктаноил-ГСЛ (оксо-С₈-ГСЛ); е – оксодеканоил-ГСЛ (оксо-С₁₀-ГСЛ); ж – оксододеканоил-ГСЛ (оксо-С₁₂-ГСЛ).

Рисунок 6 – Структурные формулы АГЛ

АГЛ имеют общую структуру алифатической цепочки различной длины, присоединенной через амидную связь к лактонизированному остатку гомосерина. Выяснено, что аминоконцевой домен молекулы является высококонсервативным и содержит 10 аминокислотных остатков, полностью гомологичных у различных белков LuxI-типа. Среди этих десяти консервативных аминокислот семь является заряженными. Исходя из данных, что карбоксиконцевой домен является более вариабельным у различных представителей LuxI-белков, сделано предположение, что именно он обеспечивает распознавание различных ацилированных цепочек [37, 38].

Анализ нескольких мутантных белков LuxI-типа позволил идентифицировать положение аминокислотных остатков, имеющих существенное значение для функциональной активности белка [2, 23]. Так, мутации, приводящие к полному отсутствию функциональной активности LuxI-белков, затрагивают область с 25 по 70 аминокислотный остаток; на основании чего можно сделать вывод о том, что эта область отвечает за ферментативную активность белка, а именно за формирование амидных связей. Анализ точечных мутантов показал, что по всей длине молекулы белка имеются консервативные остатки. С помощью сайт-направленного мутагенеза было продемонстрировано [22], что остатки цистеина не имеют значения в LuxI-белке для его функциональной активности, но важны для проявления функциональной активности у TraI-белка Agrobacterium tumefaciens и RhlI-белка Р.aeruginosa [22].

Все белки LuxR-типа имеют от 18 % до 23 % гомологии. В белке можно выделить два четких кластера – домена, которые характеризуются высокой консервативностью: область, отвечающая за взаимодействие с АГЛ – это N-концевой домен и ДНК-связывающую последовательность – С-концевой домен.

Ответная реакция на АГЛ реализуется белками LuxR-типа в несколько этапов:

а) специфичное связывание с соответствующей молекулой АГЛ;

б) конформационные изменения либо мультимеризация;

в) присоединение к или освобождение специфической регуляторной последовательности, находящейся перед геном-мишенью;

г) как правило, активация транскрипции [2].

В настоящее время механизм взаимодействия молекулы АГЛ и связывающего ее домена не достаточно хорошо изучен, но при использовании аналогов АГЛ удалось показать, что белки LuxR-типа распознают характерные особенности как гомосеринлактона, так и ацильной цепи [9].

Считается, что гомологи LuxR должны формировать димер для лучшего связывания дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), а именно lux-бокса, обладающего двойной симметрией. lux-бокс – это последовательность ДНК в 20 пар оснований, представленная инвертированными повторами. Активация транскрипции LuxR-белком зависит от расположения lux-бокса относительно промотора. Кроме того, для активации необходимо, чтобы с LuxR-белком взаимодействовали обе части двойного повтора [21].

1.6 Методы исследования luxI-luxR подобных систем QS

В познании принципов QS большую роль сыграли простые методы обнаружения АГЛ с использованием бактериальных биосенсоров за счет фенотипических проявлений в них после контакта с экзогенными АГЛ. Рассмотрим более подробно методы и бактериальные биосенсоры, которые используются в настоящее время для обнаружения различных АГЛ [37].

1.6.1 Бактериальные биосенсоры АГЛ

Очень большое количество АГЛ системы QS были определены в основном за счет использования бактериальных биосенсоров, которые детектируют присутствие АГЛ. Эти биосенсоры не продуцируют АГЛ, но содержат функциональные белки семейства LuxR, гены которых клонированные вместе с соответствующим промотором (как правило, промотором родственным luxI), что положительно регулирует транскрипцию гена-репортера (например, биолюминесценции, продукции β-галактозидазы, зеленого -флуоресцентного белка и violacein пигмента [37].

Первым шагом в обнаружении системы luxI-luxR QS служит проверка тестируемого штамма на производство АГЛ. Каждый биосенсор содержит конкретный ген, семейства luxR, демонстрируя тем самым специфичность к определенному АГЛ. Для определения узкого диапазона АГЛ при тестировании штамма на производство АГЛ важно использовать несколько биосенсоров, отвечающих на АГЛ с различными структурными особенностями [37].

Штаммы-биосенсоры могут быть использованы по-разному:

1) тестируемые штаммы могут быть выращены на плотной питательной среде в виде полоски вблизи биосенсора, располагаясь перпендикулярно друг к другу в виде буквы «Т». Фенотипическое изменение на стыке этих штаммов объясняется экзогенным выделением АГЛ тестируемым штаммом. Могут использоваться и модификации метода. Данный метод носит название «чашечный метод» (ЧМ);

2) АГЛ могут быть извлечены из супернатанта тестируемого штамма, отобранного в конце экспоненциальной фазы роста, и протестированы методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на вращающейся С₁₈-фазовой пластинке. Супернатант во много раз увеличивает чувствительность биосенсора на восприятие АГЛ. АГЛ выделяют органическим растворителем, который затем удаляют путем сушки [38]. Тестируемые образцы и контроли помещают в ТСХ-пластины, и после хроматографии, поверх пластин помещают биосенсорные штаммы. Каждый АГЛ мигрирует с характерной ему скоростью, в зависимости от длины цепи, формируя в конце пути фигуру определенной формы, выявляемую с помощью репортерного штамма – биосенсора. С₃-оксо-ГСЛ формируют пятна в виде капель, а алканоил-ГСЛ и С₃-гидрокси-ГСЛ – в виде круга [38, 39]. Разделение с помощью ТХС в сочетании с АГЛ-биосенсором дает быстрый и прямой визуальный результат. Но АГЛ не могут быть однозначно определены этим методом, а только позволяет предварительно предположить структуру молекулы. Более точные результаты дает спектроскопический метод [40];

3) некоторые АГЛ-биосенсоры могут быть использованы для количественного определения АГЛ (количественный метод, КМ) путем измерения активность репортерной системы, отвечающей за биолюминесценцию, продукцию β-галактозидазы, зеленого флуоресцентного белка и пигмента виолацеина и другое, в штамме-биосенсоре. Это полезно для изучения регуляции синтеза АГЛ и для определения различия уровня производства АГЛ. Для количественного метода нужно точно определить, используя синтетические АГЛ, минимальное количество АГЛ, требуемое для ответа системы, и максимальное количество насыщения, чтобы правильно подбирать дозы [37];

4) фиксацию зеленого флуоресцентного белка можно проводить и с помощью флуоресцентного микроскопа (ФМ).

Некоторые АГЛ биосенсоров были построены на основе нескольких белков семейства LuxR, которые способны обнаруживать АГЛ, имеющие ацильную цепи С₄ до C₈в длину. Обычно используется биосенсор на основе Chromobacterium violaceum, производящий антибактериальный фиолетовый пигмент виолацеин. C.violaceum регулирует violacein-производство через cviI/R QS-систему, продуцирующую и отвечающую на C₆-АГЛ. Был получен методами генной инженерии мутантный штамм C.violaceum 026 (СV026), который имеет инактивированный ген синтазы АГЛ, что приводит к неспособности синтезировать АГЛ и образовать пигмент [39]. Образование виолацеина индуцируется путем экзогенного внесения в среду культивирования АГЛ.

Неудивительно, что наиболее активным АИ для CV026 является C₆-АГЛ, также система достаточно хорошо отвечает на C₆-3-оксо-АГЛ и C₈-АГЛ (оба в шесть раз менее активны, чем C₆-AГЛ), С₈-3-оксо-АГЛ (в 11 раз менее активен) и C₄-АГЛ (в 30 раз менее активен). Штамм CV026 реагирует очень плохо на С₄-3-оксо-AГЛ, а АГЛ с ацильными цепочками, с C₁₀и большей цепью имеют слабо или вообще не выраженное действие. Кроме того, штамм абсолютно не отвечает на все 3-гидрокси-AГЛ. Этот штамм хорошо подходит для тестов на твердых средах, а также метода TСХ с техникой наложения пластин с биосенсорами [37, 39].

Другие биосенсоры были получены путем внедрения плазмид, несущих гены luxCDABE оперона Photorhabdus luminescens, в результате в качестве репортерной системы выступает система биолюминесценции [41, 42]. Эти плазмиды, как правило, внедряют в E.coli, которая не производит АГЛ. Плазмиды pSB401 и pHV200I ^- основаны на luxR из V.fischeri и родственныx luxI промотерах контроля выражения luxCDABE [41]. Они наиболее чувствительны к родственным C₆-3-оксо-AГЛ и хорошо чувствительны к C₆-AГЛ, С₈-3-оксо-АГЛ и C₈-АГЛ. Эффект слабо наблюдался при тестировании C₄-АГЛ, С₁₀-и других длинноцепочечных AГЛ. Наличие AГЛ вызывает биолюминесценцию E.coli, которая, в анализе TСХ может быть обнаружена путем использовании подложки биосенсора на авторадиографической бумаге, чаще учет биолюминесценции ведется с помощью биолюминометра [37]. Эти два LuxR биосенсора, E.coli (pSB401) и E.coli (pHV200I^-), могут быть использованы для количественной оценки АГЛ, так как они особенно чувствительны к низкой концентрации АГЛ, однако для этого необходимо использовать биолюминометр. Плазмиды pSB403 содержит те же гены, ответственные за биолюминесценцию, что и pSB401, но имеет более широкий круг хозяев. Наконец, биосенсором чувствительным к C₄-AГЛ является E.coli (pSB536); данная плазмида pSB536 построена с использованием гена ahyR из Aeromonas hydrophyla и промотора гена ahyI, связанного с luxCDABE [37]. Похожим биосенсором является E.сoli pAL101, отвечающая на С₄-AГЛ, она состоит из rhlR и родственного промотора rhlI сшитого с luxCDABE. RhiI-R QS система относится к Р.aeruginosa [43, 45]. Важно, что это биосенсоры работает лучше, если в рекомбинантном штамме E.сoli присутствует ген sdiA. SdiA является аналогом белка семейства LuxR, которые могут активировать промотор rhlI , таким образом, они помогают обнаружить С₄-AГЛ, при этом E.сoli не имеет белки аналогичные белкам семейства LuxI- синтазы и, поэтому не синтезируют AГЛ [37].

Биосенсоры для обнаружения С₁₀-АГЛ, С₁₂-АГЛ и их 3-оксо производных основаны на LasI-R системе QS Р.aeruginosa, которая производит и отвечает на С₁₂-3-оксо-АГЛ. Плазмиды биосенсора pSB1075 содержат ген lasR и ген промотора контроля выражения luxCDABE. Эта плазмида может быть встроена в штамм E.сoli, который удобно использовать в ТСХ для обнаружения С₁₂-3-оксо-AГЛ, С₁₀-3-оксо-АГЛ и С₁₂-АГЛ [42]. Другой биосенсор E.сoli, несущий плазмиду pKDT17, также основан на LasI-R системе, но эта плазмида содержит lasR под контролем промотора lasB:LacZ, поэтому ответ на экзогенные АГЛ обнаруживаются с помощью β-галактозидазы. Ген lasB кодирует эластазы, и регулируется lasI-R системой QS [43]. E.сoli (pKDT17) - биосенсор может быть использован при анализе ТСХ на обнаружение таких АГЛ как: С₁₀-АГЛ, С₁₂-АГЛ и их 3-оксо производных. Оба биосенсора могут быть использованы для количественной оценки АГЛ, pSB1075 – с помощью люменометра, и pKDT17 через стандартный методы определения β-галактозидазы [37].

Применение биосенсоров ограничено специфичностью рецепторного белка к определенным АГЛ. Биосенсоры на основе traI-R QS системы Agrobacterium tumefaciens обнаруживают широкий спектр АГЛ и обладают высокой чувствительностью к этим соединениям. Система генов traI-R QS локализованы в Ti-плазмиде, она производит и отвечает на С₈-3-оксо-АГЛ. QS-система А.tumefaciens участвует в регуляции коньюгативной передачи многих плазмиды [44]. Из всех АГЛ-биосенсоров, построенных до сих пор, А.tumefaciens отображает широкий спектр чувствительности к AГЛ в самой низкой концентрации. Биосенсоры, продуцирующие β-галактозидазы, особенно хорошо подходит для анализа TСХ. Она настолько чувствительна ко многим АГЛ, что требует лишь небольших объемов экстрактов, выделенных из супернатанта тестируемой культуры.

Также данный биосенсор АГЛ может исследоваться чашечным методом, при этом культуру выращивают в подходящей среде, содержащей X-Гал. После инкубации в течение ночи, внесение АГЛ приведет к формированию синей зоне вокруг места применения [37, 44]. Этот биосенсор обнаруживает 3-оксо-замещенные АГЛ, производные АГЛ с длиной цепи от 4 до 12 атомов углерода, а также 3-незамещенные-АГЛ, за исключением C₄-АГЛ. Важно отметить, что этот датчик может обнаружить 3-гидрокси производные, точнее C₆-3-, С₈-3- и С₁₀-3-гидрокси-АГЛ [37].

Применяются и другие биосенсоры на основе А.tumefaciens такие как WCF47 (pCF218) (pCF372), штамм WCF47 имеет мутацию в гене traI и, следовательно, не производит АГЛ. Плазмиды pCF218 содержит traR, который сшит с промотором tetR, а плазмида pCF372 содержит промотор traI транскрипционно сшитого с lacZ. Как и в других случаях биосенсор A.tumefaciens может быть использован в ТСХ и количественном анализе АГЛ. Проводят различные модификации биосенсоров с целью повысить их чувствительность и расширить диапазон восприятия АГЛ [37, 44].

1.6.2 Положительные и отрицательные стороны применения биосенсоров

Большинство биосенсоров АГЛ, описанных в данном обзоре, приведены в таблице 2. Технологии использования биосенсоров АГЛ играют важную роль в быстром выделении и изучении АГЛ системы-QS в грамотрицательных бактериях. Одной из причин является то, что стандартная технология гибридизации ДНК, а также ПЦР-стратегии не могут быть использованы для анализа АГЛ QS-систем из-за отсутствия сходства нуклеотидных последовательностей между luxI и luxR гомологами [37].

Существуют определенные ограничения, и нужно быть осторожными в интерпретации данных, полученных с использованием биосенсоров АГЛ. Полученные экстракт могут содержать не АГЛ соединения, а иные вещества, которые могут ингибировать или активировать ответ биосенсоров. Кроме того, результаты с отрицательной реакцией поиска АГЛ биосенсором, нельзя точно интерпретировать как то, что тестируемый бактериальный штамм не производит АГЛ. АГЛ, как правило, активны в очень низких концентрациях, и технологии биосенсоров позволяет количественно учитывать АГЛ. Различные гомологи LuxR имеют разнообразные сходства с различными АГЛ, это ведет к неточным результатам сравнения активности одного АГЛ с ответом, полученным от других АГЛ [37].

Разработка и использование технологии биосенсоров АГЛ будет играть важную роль в будущих исследованиях, которые могут включать взаимодействие и общение прокариот с эукариотами, обнаружение АГЛ в пробах окружающей среды и бактериальных межвидовых и межродовых отношениях.

Таблица 2 – Клеточные тест-системы, позволяющие проводить качественную детекцию и количественное определение различных типов гомосеринлактонов

Сенсорная система (плазмида, штамм)	Хозяйский штамм	Cистема оценки «чувства кворума»	Репортерная система	Детектируемый гомосеринлактон
pSB401	E.coli	luxI-luxR (V.fisheri)	luxCDABEG	N-(3-оксогексаноил)-L-гомосеринлактон
pHV200I−	E.coli	luxI-luxR (V.fisheri)	luxCDABEG	N-(3-оксогексаноил)-L-гомосеринлактон
pAL103	E.coli (sdiA мутант)	luxI-luxR (V.fisheri)	luxCDABEG	N-(3-оксогексаноил)- L- гомосеринлактон
pSB1075	E. coli	lasI-lasR (P.aeruginosa)	luxCDABEG	N-(3-оксододеканоил)-L-гомосеринлактон
C.violaceum CV026	C.violaceum	cviI-cviR (C.violaceum)	Пигмент виолацеин	N-гексаноил-L-гомосеринлактон
pKDT17	E.coli	lasI-lasR (P.aeruginosa)	Бета-галактозидаза	N-(3-оксододеканоил) L-гомосеринлактон
M71LZ	P.aerugi-nosa	lasI-lasR (P.aeruginosa)	Бета-галактозидаза	N-(3-оксододеканоил)-L-гомосеринлактон
pJBA-132	широкий круг хозяев	luxI-luxR (V.fisheri)	Зеленый флюоресцирую-щий протеин (gfp)	N-(3-оксогексаноил)- L-гомосеринлактон

1.7 Пути ингибирования системы Quorum sensing

Исследования QS-регуляции, проведенные в последние годы, показали, что использование QS-систем может иметь огромное значение для практики. В настоящее время во многих микробиологических, иммунолог и биотехнологических лабораториях занимаются разработкой нового подхода в борьбе с инфекционными заболеваниями, формированием биопленок на основе ингибирования QS-систем [4].

Так как QS-системы играют важную роль в регуляции вирулентности бактерий, ингибирование QS приводит к подавлению синтеза факторов вирулентности у бактерий. Лекарственные средства, направленные на подавление QS-систем предложено называть «ядами патогенности», так как они предназначаются именно для подавления патогенности бактерий [4, 5]. В отличие от классических антимикробных лекарств (прежде всего антибиотиков), они не должны обладать бактерицидным или бактериостатическим эффектом. Важное следствие этого – отсутствие селективного давления, ведущего к быстрому образованию резистентных к антибактериальным веществам форм патогенных бактерий. Образование и широкое распространение бактериальных возбудителей, устойчивых к традиционным лекарственным препаратам, является в настоящее время одной из важнейших проблем современной медицины [4, 5].

Еще одной серьезной проблемой антимикробной терапии является способность патогенных бактерий формировать биопленки. Биоплёнки – высокоупорядоченные бактериальные сообщества, которые позволяют бактериям жить в прикреплённом состоянии. Способность бактерий образовывать биоплёнки интересна ввиду того, что представители патогенных для человека и животных возбудителей проявляют устойчивость к действию антимикробных веществ, дезинфектантов, действию иммунной защиты организма хозяина. Поэтому лекарства, основанные на подавлении QS, перспективны для подавления образования биопленок бактерий [4, 5, 50]

Ингибирование функционирования QS-систем может быть достигнуто несколькими способами [4, 5]:

подавление синтеза АИ QS-систем,
деградация АИ QS-систем специфическими ферментами,
ингибирование связывания АИ с соответствующими рецепторными белками.

1.7.1 Подавление синтеза аутоиндукторов системы Quorum sensing

Известно, что субстратом для синтеза аутоиндукторов АГЛ и АИ-2 является S-аденозилметионин (SAM). Большинство работ по подавлению синтеза АГЛ связаны с изучением действия различных аналогов SAM. Показано, что аналоги SAM, например, S-аденозилгомоцистеин, S-аденозил-цистеин действуют как сильные ингибиторы синтеза АГЛ у Pseudomonas aeruginosa [49] (рисунок 7).

Рисунок 7 – сравнение S-аденозилметионина и аденозилгомоцистеина

Показано, что некоторые антибиотики – макролиды, ингибиторы синтеза белка на рибосомальном уровне – в концентрациях, не ингибирующих рост бактерий, подавляют синтез АГЛ и некоторых факторов вирулентности. Например, субингибирующие концентрации эритромицина (рисунок 8) подавляли синтез AГЛ и факторов вирулентности – гемолизина, протеаз, гемагглютининов – у P.aeruginosa.

Бактерии, подвергнутые действию антибиотика, были менее вирулентны для мышей. Эти данные согласуются с результатами клинических наблюдений, показавших эффективность применения низких доз эритромицина и других макролидов при инфекциях, вызванных штаммами P.aeruginosa, устойчивых к этим антибиотикам [50, 51].

Азитромицин в концентрации 2 мкг/мл, не ингибирующей рост P.aeruginosa, подавлял синтез AГЛ, а также продукцию факторов вирулентности эластазы и рамнолипидов. При этом добавление в культуру АГЛ экзогенно приводило к восстановлению продукции этих факторов вирулентности, показывая, что именно синтез AГЛ является первичной мишенью действия антибиотика. Механизм действия макролидных антибиотиков на синтез АГЛ остается в настоящее время неясным [49, 50, 51, 52].

1.7.2 Деградация аутоиндукторов системы Quorum sensing специфическими ферментами

Деградация АИ QS-систем – один из перспективных путей борьбы с бактериальными инфекциями. Разложение АГЛ может быть следствием действия специфических ферментов бактерий и высших организмов, высоких pH, повышенной температуры культивирования бактерий, они могут также подвергаться щелочному гидролизу [53]. В настоящее время проводится активный скрининг ферментов, деградирующих АГЛ, в первую очередь, лактоназ, разрушающих гомосеринлактонное кольцо (рисунок 9).

Рисунок 9 – Пути деградации молекулы АГЛ лактоназой (Lactonaza) и ацилазой (Acylaza)

Лактоназы, гидролизующие АГЛ, были найдены у бацилл (белок AiiA) [56]. Введение клонированного гена aiiA в клетки фитопатогенной бактерии Erwinia carotovora снижало синтез АГЛ и в результате уменьшало активность пектолитических ферментов и проявление других симптомов заболевания растений [55, 56]. Присутствие этого фермента в клетках бактерий в значительной степени определяет их способность к подавлению фитопатогенных бактерий, у которых вирулентность регулируется QS-системами с участием АГЛ, что открывает новые возможности при разработке эффективных бактериальных препаратов для биологической борьбы с заболеваниями растений [56, 55]. Получены трансгенные растения, экспрессирующие введенный в их геном бактериальный ген aiiA; эти растения были существенно менее чувствительны к инфекции E.carotovora [55].

Изучается также способность АГЛ-ацилаз, продуцируемых бактериями, деградировать АГЛ [56, 57].

Высшие организмы также обнаруживают механизмы специфической деградации АГЛ. Большой интерес представляют данные о том, что клетки эпителия дыхательных путей человека способны инактивировать АГЛ P.aeruginosa – 3OC₁₂-ГСЛ, но не C₄-ГСЛ. Эта инактивация имеет, по- видимому, ферментативную природу. Деградации подвергаются и другие АГЛ, например, C₆-ГСЛ. Способность к деградации АГЛ обнаружена у некоторых клеток млекопитающих [60]. Эта находка открывает новую область исследований и позволяет надеяться, что человеческий организм имеет еще одну линию защиты от бактериальных инфекций – через взаимодействие с QS-регуляцией вирулентности бактерий.

1.7.3 Ингибирование связывания аутоиндукторов с соответствующими рецепторными белками

Осуществляется с помощью молекул антагонистов АИ, которые мешают связыванию АИ с молекулами рецепторных белков (рисунок 10).

Рисунок 10 – Действие антагонистов

Подавление функционирования QS-систем регуляции может быть достигнуто при помощи антагонистов АИ, которые мешают связыванию аутоиндуктора с молекулами рецепторных белков. Показано, что такие ингибиторы могут конкурировать с АГЛ – в этом случае они структурно близки сигнальной молекуле АИ и взаимодействуют с участком связывания АГЛ в рецепторном белке, но не активируют этот белок. Неконкурентные ингибиторы могут иметь слабое сходство с АГЛ, или вообще не быть сходными с ним. Эти соединения связываются с различными участками рецепторного белка. Подобные ингибиторы активно изучаются, поиск конкурентных ингибиторов проводится с использованием компьютерного дизайна [49]. Получены данные о подавлении QS-регуляции аналогами АГЛ, несущими модификации в различных частях молекулы – в ацильных цепях и гомосеринлактонном кольце. Длина ацильной цепи имеет существенное значение для активности АГЛ. Аналоги АГЛ с более длинными, чем у нативных АГЛ, ацильными цепями могли быть ингибиторами активности QS-систем [49, 39]. Замена 3-оксо- групп на 3-гидроксильные или метильные, введение ненасыщенных связей в ацильные цепи приводит к значительному снижению активности АГЛ [59].

Модификации в гомосеринлактонном кольце молекул АГЛ существен-но влияют на их активность. Природные АГЛ являются L-изомерами. D-изомеры, в основном, биологической активностью не обладают [49]. Ацильная цепь, по-видимому, необходима для биологической активности АГЛ. Замена гомосеринлактонного кольца на гомоцистеинлактонное уменьшало активность АИ на порядок, а замена на гомосеринлактамное кольцо приводило к отсутствию активирующих или антагонистических свойств. Однако, молекулы, в которых гомосеринлактон заменен на гомосеринтиолактон, могут сохранять активность при функционировании некоторых QS-систем [49, 50, 51].

Изучении действия аналогов АГЛ Las-системы P.aeruginosa с заменами в гомосеринлактонном кольце показало, что эти замены по-разному влияют на взаимодействие аналогов с белками RhlR и LasR . Этот факт может свидетельствовать о том, что два рецепторных белка P.aeruginosa различаются в участках связывания с АГЛ [32].

Все больше внимания уделяется природным антагонистам АИ QS, производным фуранонов, в том числе галогенизированным, производные пенициллиновой кислоты, патулина (рисунок 11). Обнаружено, что австралийская красная водоросль Delisea pulchra синтезирует различные галогенизированные фураноны, препятствующие колонизации этой водоросли морскими бактериями, у которых QS-система участвует в регуляции метаболических процессов, и, таким образом, защищает растения от действия бактерий. Фураноны D.pulchra содержат фурановое кольцо с замещенной в положении C-3 ацильной цепью и атомами брома в положении C-4. Замещения в положении C-5 могут варьировать [51]. Фураноны из природных источников галогенизированы в различных положениях атомами брома, йода или хлора [39, 49, 50].

После обнаружения эффекта фуранонов, образуемых D.pulchra, в различных лабораториях провели широкий скрининг природных соединений и химически синтезировали производные фуранонов, ингибиторов QS, в том числе производные фуранонов с ацильными цепями различной длины. Оказалось, что даже производные фуранонов без ацильной цепи с двумя атомами брома ингибировало QS-систему P.aeruginosa [49]. Обнаружено, что производные фуранонов продуцируются различными организмами: морскими зелеными, красными и бурыми водорослями, грибами, асцидиями, актиномицетами и другими.

Рисунок 11 – Природные ингибиторы

Изучение механизма действия этих веществ на QS-системы показало, что соединения фураноновой природы конкурируют с АГЛ за участок связывания с рецепторными белками LuxR типа. Связывание фуранонов с рецептором влияет на стабильность комплекса белок-лиганд, приводя к быстрому расщеплению рецепторного белка [62].

Действие фуранонов приводило к подавлению различных клеточных процессов, регулируемых QS: биолюминесценции V.fischeri; продукции факторов вирулентности у P.aeruginosa, E.carotovora; образования биопленок [49, 62]. Многие химически синтезированные фураноны были значительно эффективнее, чем природные [49]. Большой интерес представляет тот факт, что синтетические фураноны были активны против бактерий в составе биопленок в тех же концентрациях, что и против QS-регуляции планктонно размножающихся бактерий. Для подавления инфекций, вызванных P.aeruginosa, растущих в биопленках, требуются существенно более высокие дозы антибиотиков [49].

Использование биологических микрочипов позволило установить, что соединения фураноновой природы влияют на экспрессию 93 генов P.aeruginosa PAO1; функционирование 80 % этих генов, например, генов эластазы, протеазы LasA, участвующих в синтезе рамнолипидов, феназинов, цианида, хитиназы регулировалось с участием QS-систем [49].

Показано, что (5Z)-4-бромо-5-(бромометилен)-3-бутил-2(5H)-фуранон, продуцируемое водорослью D.pulchra производное фуранона, ингибирует QS в клетках E.coli с участием АИ-2; это соединение подавляло также формирование биопленки и вызывало репрессию 56 генов E.coli, 79 % которых индуцировалось АИ-2. Под действием указанного соединения внеклеточная концентрация АИ-2 уменьшалась вдвое. Предполагается, что этот эффект осуществлялся на посттранскрипционном уровне [61].

Патулин – это поликетидный лактон, продуцируемый некоторыми грибами родов Penicillium, Aspergillus и Byssochlamys, растущими на соках, включая яблочный, грушевый и виноградный. Патулин впервые был выделен в 1940 г. Патулин можно изолировать в виде бесцветных или белых кристаллов. Он растворим в воде, метаноле, этаноле, ацетонитриле и менее растворим в диэтиловом эфире и бензоле

Патулин действует как антибиотик широкого спектра действия, и проверен на эффективность при общих простудных заболеваниях, также была отмечена его активность в подавлении образовании биопленок P.aeruginosa

Приведенные данные показывают, что производные фуранонов, патулина, пенициллиновой кислоты перспективны для получения на их основе терапевтических агентов, направленных против патогенности бактерий. Однако, испытанные к настоящему времени соединения, способные подавлять QS-регуляцию, токсичны для человека [49]. Актуальную задачу представляет их модификация и поиски новых, нетоксичных веществ, пригодных для клинического применения.

Много работ по поиску ингибиторов QS направлены на изучение растительных экстрактов и вытяжек. Иммунная система растений устроена по иному, поэтому они синтезируют и выделяют защитные молекулы против патогенных микроорганизмив, в том числе и способных к QS. Американские ученые получили первый антагонист АИ, выделенный из листьев конокарпуса – это эллаготанин (рисунок 12).

1 Касталагин

2 Вескалагин

Рисунок 12 – Изомерная форма эллаготанина

Бактерии и эукариотические организмы продуцируют вещества иной природы, подавляющие QS-регуляцию у бактерий – циклические дипептиды (дикетопиперазины), соединения, способные активировать QS-систему (рисунок 13). Предполагают, что они также взаимодействуют с участками связывания АГЛ с рецепторными белками [49].

Дикетопиперазины – шестичленные гетероциклические соединения, производные пиперазина, циклические ангидриды α-аминокислот: дикетопиперазины – бесцветные кристаллы; нейтральные соединения, легко растворимые в горячей воде, трудно – в холодной. При гидролизе образуются дипептиды, затем аминокислоты; натрием в спирте восстанавливаются до пиперазинов. могут быть получены циклизацией α-аминокислот или их эфиров, а также выделены из гидролизатов белков.

Рисунок 13 – Дикетопиперазин

Таким образом, уже исследовано и протестировано на различных биосенсорах большая группа ингибирующих веществ системы QS как химически синтезированных, так и природного происхождения. Все они обладают, как правило, ярко выраженным ингибирующим свойством, некоторые сохраняют бактерицидный эффект. Но, среди всех этих ингибиторов не выявленного универсального средства ингибирования системы QS, многие вещества обладают токсическими свойствами, и не пригодны для применения в терапевтических целях.

2 Материалы и методы

2.1 Бактериальные штаммы и условия их культивирования

2.1.1 Виолацеинпродуцирующие биосенсоры

В качестве основного инструмента исследования в первой части работы мы используем биосенсор на основе Chromobacterium violaceum, ярким проявлением QS у которого является продукция фиолетового пигмента – виолацеина (violacein). Данный вид относится к классу Betaproteobacteria, порядку Neisseriales, семейству Neisseriaceaе.

Chromobacterium violaceum – это грамотрицательная бактерия, представляющая собой тонкую, слегка изогнутую палочку или коккобактерию. Её размеры приблизительно от 0,6 до 0,9 мкм в ширину и от 1,5 до 3,0 мкм в длину. Движение бактерии осуществляется с помощью одного полярного жгутика и ресничек. C.violaceum – факультативный анаэроб. Оптимальный рост достигается при температуре от 30 °С до 35 °С. Этих бактерий считают обычной флорой почвы и воды тропических и субтропический регионов, где они могут играть важную роль в ризосфере.

C.violaceum один из миллиона видов свободноживущих микроорганизмов, которые населяют почву и воду в тропической и субтропической зонах. Это возможно, потому что C.violaceum смогла адаптироваться к жизни в суровых условиях окружающей среды: в условиях нехватки питательных веществ, высокого уровня радиации и ядов [34].

C.violaceum – патогенная бактерия, редко вызывающая инфекции человека, но все же является причиной человеческих смертей. Наиболее часто заболевание, вызванные C.violaceum, встречаются в Австралии, Южной Америке и Юго-восточной Азии, где типичными болезнями являются такие болезни, как кожные воспаления, сепсис, абсцесс печени и глазные инфекции.

Природный штамм C.violaceum ATCC 31532 образует фиолетовый пигмент виолацеин, который обладает свойствами антибиотика, также установлено, что виолацеин участвует в защите от видимого излучения, что и позволяет бактерии выжить в почве тропических и субтропических районов земного шара [35].

Синтез пигмента регулируется системой QS, которая включает AГЛ – N-гексаноил-гомосерин-лактон (С₆-ГСЛ). Два гена сviI и сviR были выявлены в геноме C.violaceum, кодируещие белки CviI – С₆-ГСЛ синтазы и CviR – регуляторный белкок, структурно и функционально схожие с белками, которые участвуют в контроле биолюминесценции V.fischeri. Сигнальные молекулы продуцируются бактерией и свободно диффундируют из клетки в окружающую среду [39].

При достижении определенной концентрации в среде аутоиндукторы проникают в бактериальные клетки, связываются с CviR и активируют ген сviI – С₆-ГСЛ синтазы, что приводит к массовой продукции C₆-ГСЛ. Эта сигнальная молекула связывается с оператором cviR, вызывая его выражение. Увеличение CviR позволяет ему связываться с транскрипционным сайтом оперона биосинтеза violacein vioABDC (рисунок 14) и запустить экспессию, что приведет к увеличению пигмента. CviR способен стимулировать экспрессию других генов в C.violaceum, таких, как хитиназы и экзопротеазы.

Рисунок 14 – Схематическое изображение структурных генов оперона биосинтеза пигмента виолацеин

Особенно интересен мутантный штамм Chromobacterium violaceum NCTC 13274 (C.violaceum 026 (СV026)). СV026 был приобретен в Национальной коллекции типовых культур (Health Protection Agency, Великобритания). Этот мини-Tn5 штамм мутант дикого типа C.violaceum ATCC 31532, который имеет инактивированный cviI ген, что приводит его к неспособности синтезировать ГСЛ при сохранении способности образовать пигмент в ответ на экзогенное внесение ГСЛ [39]. Поэтому С.violaceum NCTC 13274 бесцветный без С₆-ГСЛ, но производит фиолетовый пигмент виолацеин в его присутствии.

Таким образом, первый из использованных штаммов позволяет оценивать комплексное воздействие растительных экстрактов на кворум-зависимый биосинтез виолацеина, а второй – избирательно детектировать присутствие С₆-ГСЛ, а также выявлять ингибиторы его связывания с соответствующим рецепторным белком.

Культивирование штаммов производили на плотных и жидких Luria - Bertani (LB, (Sigma, США)) средах с добавлением глюкозы (10 мг\мл) и дрожжевого экстракта (10 мг\мл) при температуре от 27 °С до 30 °С в течение 24 ч., затем суточные культуры использовались для экспериментов.

2.1.2 Люминесцирующий биосенсор

Во второй части работы мы использовали биосенсор, полученный путем внедрения плазмид, несущих гены luxCDABE, в результате в качестве репортерной системы выступает система биолюминесценции.

Штамм Escherichia coli JLD271, pAL103; luxR+ luxI luxCDABE; TetR p15A, разработан A. Lindsay и B.M. Ahmer [38]. Его особенностью является наличие плазмиды pAL103, в составе которой кассета генов биолюминесценции luxCDABE клонирована под контролем гена luxR, воспринимающего C₆-оксо-ГСЛ и С₆-ГСЛ (рисунок 15).

Рисунок 15 – ДНК фрагмент для составления биосенсорной плазмиды. Матрица: область luxRI V. fischeri (pSB401) (А). Плазмида pSB401 включает в себя luxR+ luxI luxCDABE (Б)

При этом в отсутствие гена luxI, ответственного за синтез собственного автоиндуктора, биолюминесценция подобной конструкции возможна только в присутствии экзогенно вносимого ГСЛ. Кроме того, для повышения чувствительности данной репортерной системы, она клонирована в хозяйском штамме E.coli JLD271 с мутацией в гене sdiA, продукт которого также распознает ГСЛ и мог бы конкурировать с luxR за его связывание. В качестве контрольного образца использован нелюминесцирующий штамм E.coli pAL 104 lux I:: luxCDABE (lux R^-).

E.coli – грамотрицательная бактерия, факультативный анаэроб, не образует эндоспор. Клетки палочковидные, со слегка закруглёнными концами, размером от 0,4 до 0,8 мкм в ширину и от 1 до 3 мкм в длину, объём клетки составляет от 0,6 мкл³ до 0,7 мкл³ [38].

Кишечная палочка может жить на разных субстратах. В анаэробных условиях E.сoli образует в качестве продукта жизнедеятельности лактат, cукцинат, этанол, ацетат и углекислый газ. Оптимальный рост достигается культурами E.сoli при температуре 37 °C, некоторые штаммы могут делиться при температурах до 49 °C. Рост может стимулироваться аэробным или анаэробным дыханием, различными парами окислителей и восстановителей, в том числе, окислением пирувата, формиата, водорода, аминокислот, а также восстановлением кислорода, нитрата, диметилсульфоксида и триметиламин N-оксида.

Перед проведением исследований E.coli выращивали в течение от 16 до 18 ч. при 37 ºC в LB-бульоне («Sigma», США) в присутствии 12 мкг/мл антибиотика доксициклина, являющегося селективным фактором плазмиды pAL103.

Особенности биосенсоров в виде сравнения приведены в таблице 3.

Таблица 3 – Особенности сенсорных штаммов

Название биосенсора	Генетическая особенность	Сенсорный белок	АИ	Индикатор-ная система	Результатив-ный признак	Литература
C.violaceum ATCC 31532	Производство виолацеина находится под контролем QS	CviR	C₆-ГСЛ	vioABEDC	Биосинтез пигмента виолацеина	Kay H.McClean, Michael K. Winson, Leigh Fish; 1997
C.violaceum 026	Блокада синтеза автоиндуктора QS – требует экзогенного добавления АГЛ	CviR	C₆-ГСЛ	vioABEDC	Биосинтез пигмента виолацеина	Kay H.McClean, Michael K. Winson, Leigh Fish; 1997
Escherichia coli pAL 103		LuxR (от V. fischeri)	(3-oxo C₆-ГСЛ)	luxCDABEG	Биолюми-несценция	Amber Lindsay, Brian M.M. Ahmer; 2005

2.3 Растительные материалы – лекарственные растения

В качестве исследуемого растительного материала было отобрано и протестировано 28 лекарственных растений. Все они издревна применялись в народной (традиционной) медицине как бактерицидные и противовоспалительные вещества (таблица 4). Лекарственные средства, изготовленные из растений, несмотря на относительно слабо выраженную на первый взгляд фармакологическую активность, в некоторых случаях могут оказаться значительно более эффективными, чем их синтетические аналоги.

Согласно фармацевтическим рецептам, нами были разработаны способы приготовления отваров, настоев и настоек из лекарственных растений (таблица 4).

Все растительные вытяжки: отвары, настои, настойки отличаются друг от друга рядом особенностей приготовления и извлечения.

Отвар – водное извлечение из грубых частей растения.

Приготовление: на 6 грамм измельченного растительного материала, предварительно проавтоклавированного, добавляется 50 мл стерильной дистиллированной горячей или кипяченой воды. Затем осуществляется кипячение на водяной бане в течение 30 минут, настаивание – 10 минут, после чего проводилось процеживание через стерильную марлю в стеклянную посуду.

Настой – водное извлечение из мягких частей растений. На 6 грамм измельченного растительного материала приходится 50 мл горячей или холодной, в зависимости от фармакологических рекомендаций, дистиллированной воды. Кипячение на водяной бане осуществляли 15 минут, настаивание производи в течение 45 минут, затем настоявшийся настой процеживали через стерильную марлю в стеклянную посуду.

Таблица 4 – Виды вытяжек лекарственных растений и их фармакологические свойства

№	Лекарственное растительное сырье	Латинское наименование	Вид вытяжки:		Фармакологические свойства
№	Лекарственное растительное сырье	Латинское наименование	водная	спиртовая	Фармакологические свойства
1	Анисы плоды	Anisi fructus	настой	настойка	противовоспалительное, антисептическое, спазмолитическое.
2	Багульника побеги	Lieli palustris cormus	настой	настойка	бактерицидное
3	Березовые почки	Betulae gemmae	настой	настойка	мочегонное, бактерицидное и ранозаживляющее
4	Брусники листья	Vitisidaeae folia	настой	настойка	дезинфицирующее и диуретическое
5	Девясила корневища	Jnulae rhizomata	отвар	настойка	противовоспалительное, желчегонное, отхаркивающие
6	Дуба кора	Quercus cortex	отвар	настойка	вяжущее и противовоспалительное
7	Зверобоя трава	Hyperici herba	настой	настойка	антидепрессивное
8	Золототысячника трава	Centaurii herba	настой	настойка	противоглистное и слабительное
9	Крушины кора	Frangule cortex	отвар	настойка	противовоспалительное
10	Мать-и-мачехи листья	Tussilago folia	настой	настойка	отхаркивающие, противовоспалительное
11	Можжевельника плоды	Juniperi fructus	настой	настойка	Противовоспалительное, диуретическое
12	Ноготков цветки	Calendulае flores	настой	настойка	противовоспалительное, бактерицидное
13	Одуванчика корневища	Taraxacum rhizomata	отвар	настойка	спазмолитическое, слабительное и кровоочистительное
14	Омелы побеги	Visciale cormu	настой	настойка	противовоспалительное
15	Подорожника листья	Plantaginis majoris folia	настой	настойка	кровоостанавливающее, противовоспалительное и ранозаживляющее
16	Ромашки цветы	Chamamillae flores	настой	настойка	противовоспалительное, антисептическое, вяжущее
17	Сабельника корневища	Comarum palustre	настой	настойка	противовоспалительное
18	Солодки корень	Glycyrrhizae radix	отвар	настойка	муколитическое и противокашлевое
19	Толокнянки листья	Arctostаphylos folia	отвар	настойка	обезболивающее
20	Тысячелистника трава	Achillеa herba	настой	настойка	Противовоспалительное, диуретическое
21	Укропа плоды	Anethi Graveolentis fructus	настой	настойка	мочегонное,спазмолитическое ранозаживляющее

Продолжение таблицы 4

№	Лекарственное растительное сырье	Латинское наименование	Вид вытяжки:		Фармакологические свойства
№	Лекарственное растительное сырье	Латинское наименование	водная	спиртовая	Фармакологические свойства
22	Фиалки трава	Violae herba	настой	настойка	мочегонное,жаропонижающее противоаллергическое
23	Череды трава	Bidentis herba	настой	настойка	муколитическое, мочегонное, противовоспалительное
24	Чистотела трава	Chelidonii herba	настой	настойка	для удаления бородавок, сухих мозолей, папиллом
25	Шалфея листья	Salviae folia	настой	настойка	бактерицидное
26	Шиповника плоды	Rosae fructus	настой	настойка	фитонцидное и бактерицидное
27	Эвкалипта листья	Eucalyptus folia	настой	настойка	дезинфицирующее
28	Эрвы трава	Aervae Lanatae herba	настой	настойка	гипоазотемическое и диуретическое

Настойка – спиртовая вытяжка из растительного сырья. На 3 грамма мелкоизмельченного растительного материала, предварительно проавтоклавированного, приходится 20000 мкл 40 % спирта. Настаивание производится не менее 24 ч., затем также осуществляли процеживание через марлю. Все растительные вытяжки после приготовления хранятся в холодильнике, настои и отвары не более 2 недель.

Производя отбор растительного материала, мы руководствовались и такими критериями как эволюция растений и родство систематических групп. Эволюция растений и их приспособление к меняющимся условиям шли параллельно с эволюцией микроорганизмов, которые, так или иначе, способствовали дивергенции растений в связи с паразитическим влиянием.

Наиболее эволюционно развитыми являются цветковые растения. Они доминируют на земной поверхности в данную эпоху. От полюсов до экватора нет такого участка, где возможна растительная жизнь, но не найдено покрытосеменных.

Цветковые растения обычно рассматриваются как отдел. Так как эта систематическая категория более высокого ранга, чем семейство, есть определённая свобода в выборе названия. Статья 16 Международного Кодекса Ботанической Номенклатуры позволяет использовать как и традиционные исторические названия, так и название, образованное от рода. Официальное униноминальное название этого таксона – Magnoliophyta, от названия рода Magnolia. Но традиционно укоренились такие имена, как Angiospermae и Anthophyta (цветковые растения).

Большая часть лекарственных растений, рассмотренных нами (за исключением можжевельника – отдел Голосеменные) как раз и относится к отделу Magnoliophyta, порядку двудольных (eudicots), кладу истинно двудольные (core eudicots). Нами была составлена кладограмма (по данным Системы классификации APG III (2009)), в которой мы постарались выявить эволюцию и сестринские группы растений (рисунок 16).

Кладограмма – одно из основных понятий в современной биологической систематике – древовидный граф, отражающий отношения сестринского родства между таксонами. В кладограмме принято различать терминальные группы (группы, расположенные на концах ветвей – в нашем случае они представлены родами), ноды (узлы, или развилки) и интерноды (линии, соединяющие узлы). Ни длина интернодов, ни форма развилков, ни конкретный вариант расположения терминальных групп не несут при этом никакой информации.

2.4 Виолацеин-анализ

2.4.1 Качественная оценка ингибирования QS

Для визуализации эффектов ингибирования QS растительными вытяжками эксперименты с C.violaceum мы осуществляем на плотной питательной среде путем высева культуры «газоном» на чашки Петри, после чего в агаровых пластинках пробойником делали лунки для внесения тестируемых образцов. Высев культуры газоном осуществлялся по следующей схеме: в 5·10³ мкл расплавленного LB-агара (0,5 %) добавлялось 200 мкл культуры CV ATCC 31532 или CV026, выращенной за сутки в LB-бульоне. К CV026 добавлялся C₆-ГСЛ (конечная концентрация ГСЛ 5·10^{-8 М}). Затем агаровую культуру немедленно разливали по поверхности застывших агаровых пластин (1,5 % LB-агар объемом 10 мкл). 30 мкл растительных вытяжек отмеривали пипеткой в лунку, предварительно сделанную в отвердевшем агаре стерильным пробойником.

В качестве контроля использовалась вода или спирт 40 %, в зависимости от вида исследуемой растительной вытяжки. В эксперименте по сопоставлению ингибирующих эффектов растительных вытяжек с их комбинацией в лунку с комбинацией вносилось так же 30 мкл смеси вытяжек, полученной путем перемешивания тестируемых растительных ингибиторов в отношении 1:1:1. Чашки выдерживались сутки в термостате: CV026 при 30 °C, CV ATCC 31532 при температуре от 25 °C до 27 °C, после чего исследовались на производство пигмента виолацеина.

Подавление пигментации обнаруживалось бесцветным, непрозрачным, но жизнеспособным ореолом вокруг лунок. Зоны подавления роста наблюдались в виде прозрачных зон с полным отсутствием роста культуры.

Учет результатов велся как расчет площадей подавления пигментации S_ппи площадей подавления роста S_пр, для этого также высчитывалась площадь лунки S_л, которая затем вычиталась. Условно считалось, что зоны имеют строго форму окружностей с разными радиусами, исходя из чего мы пользовались для расчетов формулой круга (рисунок 17).

Рисунок 16 – Кладограмма двудольных растений

Рисунок 17 – Пример зон ингибирования биосинтеза виолацеина (слева) и алгоритм расчета площадей ингибирования (справа)

2.4.2 Количественная оценка ингибирования системы Quorum sensing

Количественный учет QS ингибирующей активности растительных вытяжек проводился путем измерения оптической плотности (ОП) биомассы при длине световой волны в 450 нм и пигментообразования при длине волны 620 нм на иммуноферментном анализаторе «Униплан» в стандартном прозрачном планшете из 96 микрокювет.

Биомассу получали следующим образом: суточную культуру CV 026 и CV ATCC 31532 в количестве 20 мкл инкубировали в течение времени от 18 до 24 ч. в пенициллиновых флакончиках, содержащих 1·10³ мкл LB-бульона, дрожжевой экстракт и глюкозу (пункт 2.1.1), ГСЛ в рабочей концентрации 3·10^{-8 М и растительные вытяжки. Для каждой растительной вытяжки был составлен концентрационный ряд разведений: в первом флаконе концентрация вытяжки составляла 1:100, в конечном – 1:12800, производилось двукратное разведение. В качестве контроля выступал ряд с аналогичным разведением этилового спирта 40 % – для настоек и стерильная дистиллированная вода – для настоев.}

По истечении времени инкубации биомасса суспензировалась до гомогенного состояния на вортоксе или дозатором. Затем гомогенная суспензия в количестве 200 мкл дозатором переносилась в планшет для изменения ОП биомассы, а оставшаяся масса переносилась в эппендорфы и центрифугировалась при 10000 об/мин в течение 5 минут для осаждения клеток. После этого образовавшийся супернатант сливался, а к осевшим клеткам добавлялся этиловый спирт 95 % в количестве 200 мкл. Эппендорфы повторно центрифугировали при том же режиме, это необходимо для разрушения клеток и освобождения образовавшегося пигмента виолацеина. После чего 200 мкл отцентрифугированного пигментного супернатанта переносили в планшет для количественного измерения образовавшегося пигмента.

2.5 Биолюминесцентный анализ

Непосредственно перед постановкой эксперимента суточную культуру E.coli разводили той же свежей питательной средой и дополнительно подращивали в течение времени от 2 до 3 ч. до достижения оптической плотности 0,5 опт. ед. при 450 нм. Проверку чувствительности системы проводили путем ее индукции С₆-ГСЛ в диапазоне концентраций от 1·10³ М до 1·10⁶ М.

Исследование влияния растительных водных вытяжек на способность модельных микроорганизмов к восприятию ГСЛ проводили следующим образом: в ячейки 96-луночного планшета из непрозрачного пластика («Thermo», США) одномоментно вносили по 100 мкл бактериальной культуры, С₆-ГСЛ в концентрации 1·10^-6, 1·10^-7 и 1·10^{-8 М, а также растительные водные вытяжки. В контрольных вариантах ГСЛ заменяли равными объемами растворителя, контроль роста исключал растительные вытяжки.}В эксперименте по сопоставлению ингибирующих эффектов растительных вытяжек с их комбинацией в лунку с комбинацией вносилось смеси вытяжек, полученной путем перемешивания тестируемых растительных ингибиторов в отношении 1:1:1.

После этого планшеты помещали в термостатируемый измерительный блок биолюминометра LM 01T («Immunotech», Чехия), с использованием которого в течение 120 минут проводили динамическую регистрацию интенсивности развивающегося свечения опытных и контрольных образцов, осуществляя оценку и архивирование полученных данных с использованием штатного программного обеспечения KILIA. Степень индукции биолюминесценции (I) определяли по формуле

, (1)

где I_o– интенсивность свечения бактерий в опытном образце,

I_к– интенсивность свечения бактерий в контрольном образце.

2.6 Корреляционный анализ

Для анализа и сопоставления полученных результатов проводился корреляционный анализ, в котором сопоставлялись данные площадей подавления роста и пигментации и данные биолюминесценции. Для этих целей была использована программа «Статистика», позволяющая строить корреляционные таблицы.

Корреляция (корреляционная зависимость) – статистическая взаимосвязь двух или нескольких случайных величин (либо величин, которые можно с некоторой допустимой степенью точности считать таковыми). Математической мерой корреляции двух случайных величин служит корреляционное отношение, либо коэффициент корреляции R (или r).

Достоверность полученных результатов (P) находилась в пределах от 0,01 до 0,001.

Согласно гипотезе о наличии корреляции, изменение значения переменной А произойдет одновременно с пропорциональным изменением значения Б: если обе переменные растут, то корреляция положительная; если одна переменная растет, а вторая уменьшается – корреляция отрицательная, мы судили о зависимости выявленных результатов.

3 Результаты и обсуждение

Много работ по поиску ингибиторов QS направлены на изучение растительных экстрактов и вытяжек. Как уже упоминалось, «иммунная система» растений устроена иначе, чем у животных, поэтому они синтезируют и выделяют как экзогенно, так и эндогенно защитные молекулы, так называемые антагонисты, против патогенных микроорганизмов. Некоторые из этих молекул-антагонистов способны ингибировать QS. Американские ученые получили первый антагонист аутоиндуктора – эллаготанин, но ни принцип действия, ни механизм ингибирования QS ими пока не представлен.

Целью же нашей работы стал поиск потенциальных ингибиторов «чувства кворума» растительного происхождения в тестах ингибирования биосинтеза виолацеина Chromobacterium violaceum и биолюминесценции Escherichia coli.

Для достижения поставленной цели на первом этапе работы была проведена оценка и сопоставление биологических эффектов растительных вытяжек (настоев, отваров и настоек) 28 лекарственных растений на рост и пигментацию двух сенсорных штаммов вида Chromobacterium violaceum.

Проведение исследований в данном направлении позволило выявить у исследуемых вытяжек лекарственных растений две группы эффектов, первый из которых заключался в прямом бактерицидном действии на сенсорные микроорганизмы и проявлялся в подавлении их роста вокруг лунок с тестируемыми настоями и настойками. При этом наибольшим бактерицидным эффектом обладали вытяжки из листьев толокняника (Arctostáphylos folia), листьев брусники (Vitisidaeae folia), побегов багульника (Lieli palustris cormus).

Данные растения-бактерициды относятся к одной эволюционно сложившейся сестринской группе asterids, порядку Ericales (Верескоцветные), это отчетливо видно при изучении кладограммы двудольных растений (рисунок 16). Растения порядка Ericales стоят особняком относительно других групп, что выделяет их и характеризует как эволюционно сложившихся бактерицидов.

Бактерицидные эффекты, обозначенные в виде прозрачных зон-ореолов на чашках Петри, были математически обработаны по формуле для расчета площадей подавления роста (рисунок 17) и выражены числовым значением в таблице 5.

Другим детектированным эффектом стало подавление образования виолацеина без изменения жизнеспособности сенсорных микроорганизмов, проявляющееся зонами депигментации вокруг лунок с тестируемыми настоями, отварами и настойками. При этом наиболее сильными ингибиторами пигментообразования стали настои или отвары и настойки листьев эвкалипта (Euca folia), коры дуба (Quercus cortex) и почек березы (Betulae gemmae).

Как видно из кладограммы двудольных растений (рисунок 16), данные растения, из которых производилось извлечение активных молекул – антагонистов QS, относятся к одному эволюционно сложившемуся кладу rosids, и, в общем-то, являются близкородственными видами. Особенно близкородственные связи наблюдаются между дубом и березой, они относятся к одному порядку Fagales (Букоцветные).

Результаты так же были математически обработаны и внесены в таблицу 5, в которой обозначены ингибиторы QS и бактерициды. Двойным эффектов в разной степени выраженности обладают вытяжки из листьев эвкалипта и толокнянки.

Таблица 5 – Влияние 28 вытяжек лекарственных растений на образование пигмента виолацеина и рост Сhromobacterium violaceum

В миллиметрах квадратных

Лекарственное растительное сырье	С.violaceum 026+ГСЛ 3·10 М		C.violaceum АТСС 31532
Лекарственное растительное сырье	S_пп	S_пр	S_пп	S_пр
Анисы плоды	0,00	0,00	0,00	0,00
Багульника побеги	0,00	51,70	66,70	15,70
Березовые почки	172,78	0,00	188,40	0,00
Брусники листья	0,00	51,70	132,50	31,61
Девясила корневища	0,00	0,00	0,00	0,00
Дуба кора	167,87	20,60	188,40	0,00
Зверобоя трава	0,00	0,00	25,91	0,00
Золототысячника трава	0,00	0,00	0,00	0,00
Крушины кора	0,00	25,90	0,00	15,70
Мать-и-мачехи листья	0,00	0,00	0,00	0,00
Можжевельника плоды	0,00	0,00	0,00	0,00
Ноготков цветки	0,00	0,00	0,00	0,00
Одуванчика побеги	0,00	0,00	0,00	0,00
Ромашки цветы	0,00	0,00	0,00	0,00
Сабельника корневища	25,90	0,00	37,75	0,00
Солодки корень	0,00	0,00	0,00	0,00
Толокнянки листья	261,50	141,30	179,07	188,50
Тысячелистника трава	0,00	0,00	0,00	0,00
Укропа плоды	0,00	0,00	0,00	0,00
Фиалки трава	0,00	0,00	0,00	0,00
Череды трава	7,00	0,00	0,00	0,00
Чистотела трава	0,00	15,70	7,00	0,00
Шалфея листья	0,00	0,00	0,00	0,00
Шиповника плоды	25,90	0,00	51,05	0,00
Эвкалипта листья	188,40	25,90	263,90	0,00
Эрвы трава	0,00	0,00	0,00	0,00
S_пп - площадь подавления пигментообразования S_пр – площадь подавления роста

На рисунке 17 показаны эффекты подавления пигментообразования и роста наглядно. Вокруг лунок с вытяжками ингибиторов QS, обозначенных под номерами 3, 6, мы наблюдаем белые ореолы, вокруг лунок с ингибиторами роста, обозначенных под номерами 5 – прозрачные ореолы.

Вытяжки: 1 – плодов аниса, 2 – побегов багульника, 3 – почек березы, 4 – корневищ девясила, 5 – листьев брусники, 6 – коры дуба, 7 – травы зверобоя.

Рисунок 17 – Пример влияния вытяжек лекарственных растений на образование пигмента виолацеина штаммами CV АТСС 31532 (А) и CV026, инкубированного с добавлением ГСЛ в концентрации 3·10^{-8 М} (Б)

Данные результаты были получены чашечным методом путем высева культур микроорганизмов «газоном» согласно методике, описанной в главе материалы и методы. Для того чтобы избежать накладывания эффектов или их перекрывание, раскапывание растительных вытяжек осуществлялось в чашки Петри не чаще семи лунок на чашку. На рисунке 17 представлены фотографии первых семи вытяжек в связи с наибольшей наглядностью эффектов, так как здесь продемонстрированы как явные ингибиторы QS, так и бактерициды.

Кроме эффектов ингибирования роста и пигментоообразования можно наблюдать обратный эффект – эффект индукции QS. Это явление можно объяснить извлекаемыми сахарами или другими питательными веществами из растений в растительные вытяжки, которые и индуцируют рост и продукцию пигмента виолацеина сенсорных штаммов Chromobacterium violaceum, а в целом – эффект «чувства кворума».

На следующем этапе исследования мы провели статистический анализ эффектов ингибирования растительными вытяжками роста и пигментообразования биосенсорных моделей C.violaceum 026 и АТСС 31532. Анализ площадей подавления роста и площадей подавления пигментации позволил констатировать сходство подобного реагирования для C.violaceum 026 и C. violaceum ATCC 13532 (коэффициент корреляции r=0,931, P<0,01 и r=0,884, P<0,01 соответственно) (рисунок 18). Установленные высокие коэффициенты корреляции свидетельствуют о большой степени сходства механизмов ингибирования QS 2-х сенсорных систем.

r=0,931

P<0,01

r=0,884 P<0,01

Рисунок 18 – Графики соответствия эффектов ингибирования пигментообразования (А) и соответствие эффектов подавления роста (Б) биосенсоров CV026 и CV31532

В целом, при сопоставлении выраженности эффектов подавления пигментоообразования у двух сенсорных систем (таблица 5) установлено, что таковые превалируют при проведении тестирования с использованием дикого штамма C.violaceum ATCC 31532 по сравнению с мутантным штаммом C.violaceum 026. Сказанное позволяет констатировать присутствие в исследуемых экстрактах лекарственных растений факторов, преимущественно нарушающих процессы образования АИ и, в меньшей степени, ингибирующих процессы их восприятия соответствующими рецепторными системами бактериальных клеток.

Другим результатом стали незначимые коэффициенты корреляции показателей подавления роста и пигментоообразования внутри исследуемых сенсорных штаммов C.violaceum 026. и С.violaceum ATCC 31532 (r=0,6 P<0,01 и r=0,4, P<0,01 соответственно) (рисунок 19), что свидетельствует в пользу независимости зарегистрированных бактерицидных и бактериорегуляторных эффектов. Особенно ярко это наблюдается для дикого штамма, так как его система восприятия ингибирующих молекул наиболее пластична и способна воспринимать больше молекул-мишеней.

r=0,6

P<0,01

r=0,4

P<0,01

Рисунок 19 – Графики соответствия эффектов ингибирования пигментообразования с эффектами ингибирования роста биосенсоров CV026 (А) и CV31532 (Б)

Особый интерес вызвал тот факт, что мы не наблюдаем резких различий в выраженность эффекта водных вытяжек (настоек, отваров) по сравнению со спиртовыми (настоями) или наоборот (рисунок 20). То есть ингибирующие молекулы практически одинаково извлекаются из сухого растительного материала водными или спиртовыми растворителями. Это позволило на следующих этапах исследования ингибиторов QS использовать только один вид вытяжек.

Результаты, представленные на рисунке 20 в виде диаграммы, были получены путем серийных двукратных разведений растительных вытяжек тех лекарственных растений, которые оказали наилучшее ингибирующее действие. Начальное разведение выражено концентрационной пропорцией 1:100, конечное – 1:1600. В связи со схожестью результатов для двух виолацеинпродуцирующих тест-систем данные представлены только для дикого штамма CV ATCC 31532.

Еще одним интересным наблюдением стало повышение чувствительности к воздействиям растительных вытяжек у C.violaceum 026 в присутствии С₆-ГСЛ, по сравнению с эффектами для того же штамма, культивируемого без АИ (данные в таблице 5 не представлены). В целом же выявленное подавление роста сенсорных микроорганизмов может быть оценено как проявление известного эффекта лекарственных растений, определяемого присутствием в них биологически активных веществ прямого антибактериального действия – так называемых «фитонцидов».

Рисунок 20 – Диаграмма сопоставления эффектов водных и спиртовых вытяжек

Еще одной задачей при поиске потенциальных ингибиторов QS растительного происхождения в тестах индукции пигмента виолацеина было сопоставление эффектов ингибиторов QS – вытяжек коры дуба, почек березы, листьев эвкалипта с их комбинацией на примере тест-системы Chromobacterium violaceum. Эксперимент производился на чашках Петри путем высева культуры методом «газона» (рисунок 21 А). Комбинация вытяжек была получена путем смешивания вытяжек в отношении 1:1:1 по методике, описанной в главе материалы и методы.

По результатам данного эксперимента, нам не удалось выявить более сильного эффекта, чем каждый ингибитор давал по отдельности, но мы не наблюдаем и его снижения (рисунок 21 Б). Из этого можно сделать вывод о том, что данные комбинации вытяжек лекарственных растений могут быть использованы в терапевтических целях. При этом, варьируя концентрациями каждой вытяжки по отдельности, можно снижать негативные эффекты, эффекты побочного характера, каждого из них, без снижения активности ингибирования QS.

Таким образом, в первой части экспериментальной работы, которая была направлена на поиски ингибиторов растительного происхождения в тестах ингибирования биосинтеза пигмента виолацеина, нам удалось отобрать три ярко выраженных ингибиторов QS, которые хорошо комбинируют между собой, сохраняя ингибирующие свойства.

S, мм²

Вытяжки растений: 1 – коры дуба, 2 – почек березы, 3 – листьев эвкалипта, 4 – комбинация вытяжек, 5 – контроль.

Рисунок 21 – Сопоставление эффектов вытяжек ингибиторов QS с их комбинацией на примере продукции виолацеина Сhromobacterium violaceum в виде фотографии (A) и диаграммы (Б)

На следующем этапе поиска потенциальных ингибиторов QS растительного происхождения был использован биолюминесцирующий штамм Escherichia coli JLD271, pAL103; luxR+ luxI luxCDABE; TetR p15A, сенсорный белок которого встроен в него от V.fischeri. Установлено, что растительные вытяжки лекарственных растений также способны ингибировать QS рекомбинантного штамма E.coli (рисунок 22, эффекты обозначены маркером только для ингибиторов QS) путем либо увеличения срока проявления свечения (кривая свечения под действием настоя листьев эвкалипта), либо путем снижения его максимума (кривые, отражающие ингибирующее действие настоев цветков ромашки и ноготков, корневищ девясила).

Таким образом, в подобной индикаторной системе проявляют себя отличные от виолацеинпродуцирующей системы вытяжки лекарственных растений, в частности вытяжки корневищ девясила (Jnulae rhizomata), цветков ромашки (Chamamillae flores) и ноготков (Calendulае flores), об ингибирующих эффектах которых мы уже знали из различных научных публикаций [49-51].

Производя анализ кладограммы двудольных растений (рисунок 16), нельзя не отметить тот факт, что данные растительные ингибиторы для тест-системы Escherichia coli pAL103, относятся к одному сестринскому кладу companulids, порядку Asterales (Астроцветные), семейству Asteroideae (Астровые). Следовательно, они, как и рассмотренная выше группа ингибиторов QS тест-системы Сhromobacterium violaceum, представляют собой эволюционно сформированную группу, чье развитие шло в сторону защиты от фитопатогенов путем выработки веществ, конкурирующих с АИ за связывание с рецепторными регуляторными белками.

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 [t, мин]

Рисунок 22 – График проявления эффекта ингибирования биолюминесценции E.coli pAL 103 в присутствии ГСЛ (1·10^{-4 M}) 28 растительными вытяжками

Так же мы обратили внимание на два пика кривой контроля свечения E.coli pAL 103 (кривая, обозначенная как ГСЛ на рисунке 22), которые не наблюдаются при добавлении вытяжек лекарственных растений, что свидетельствует об изменении характера свечения штамма. Это говорит о том, что все растительные вытяжки оказывают воздействие на характер свечения E.coli pAL 103. Но истинный ингибирующий эффект наблюдается только у трех растений семейства Asteroideae, что и характеризует данные виды растений как эволюционно сформированную группу ингибиторов QS.

Следует отметить и эффект настоя листьев эвкалипта, который, как уже отмечалось, смещает рост кривой в сторону уменьшения проявления свечения по времени, но к окончанию второго часа интенсивность свечения достигает уровня контроля.

На следующем этапе анализа ингибирующего воздействия вытяжек лекарственных растений на биолюминесценцию рекомбинантного штамма E.coli pAL 103 ставился эксперимент по выявлению эффектов вытяжек-ингибиторов биолюминесценции и их комбинации (рисунок 23).

Эксперимент производился в трех вариантах, отличающихся друг от друга концентрацией вносимого АИ-ГСЛ (рисунок 23 А). Это необходимо было сделать для определения концентрации, при которой эффект ингибирования выражался наиболее демонстративно (рисунок 23 Б), а так же для выявления зависимости изменения динамики ингибирования свечения рекомбинантного штамма от вносимого количества АИ.

Полученные результаты значений свечения для каждой вытяжки по отдельности и для их комбинации были сопоставлены со средними величинами, в результате чего можно отметить, что значения свечения под действием комбинации настоев ниже среднего для каждой концентрации, но не ниже значений настоя цветков ромашки (рисунок 23).

Таким образом, эксперимент по снижению биолюминесценции E.coli pAL 103 комбинацией отобранных вытяжек-ингибиторов QS показал схожие результаты, что и в аналогичном эксперименте с тест-системой Chromobacterium violaceum: мы не наблюдаем большей выраженности снижения значений биолюминесценции, но и нет снижения эффекта ингибирования.

вытяжки	1·10^-6	1·10^-5	1·10^-4
контроль	58,54	358,28	1120,40
настой корневищ девясила	6,52	29,21	117,24
настой цветков ноготков	9,89	50,69	160,52
настой цветков ромашки	3,13	11,98	40,25
комбинация настоев	5,38	25,22	96,74
средняя величина	6,51	30,62	106,00

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

[t , мин]

концентрации

ГСЛ, М

Рисунок 23 – эффекты вытяжек ингибиторов биолюминесценции и их комбинации, выраженные в виде таблицы значений биолюминесценции E. coli pAL 103на последних минутах измерения (А) и графика (Б)

Анализ соответствия эффектов ингибирования QS: снижения биолюминесценции E.coli pAL 103 и подавления пигментообразования и роста Chromobacterium violaceum не выявил зависимости данных показателей (таблица 6). Это может быть связано с тем, что биосенсорные системы имеют различное строение рецепторных белков, на которые и воздействуют растительные вытяжки. Это обстоятельство не позволяет рекомендовать универсальное средство ингибирования QS. Следовательно, для каждой системы QS должен подбираться индивидуальный ингибитор.

Таблица 6 – Соответствие эффекта биолюминесценции E.coli pAL 103 и эффектов ингибирования QS и подавления роста биосенсоров CV026 и CV31532

коэффициенты корреляции		E.coli pAL 103		CV026 (ГСЛ 3·10^{-8 М)}		CV026 (ГСЛ 3·10^{-9 М)}
коэффициенты корреляции		1 пик	2 пик	Подавление пигментации	Подавление роста	Подавление пигментации	Подавление роста
E. coli pAL 103	1 пик	1,000	-0,007	-0,026	-0,191	0,096	-0,154
E. coli pAL 103	2 пик	-0,007	1,000	-0,100	0,080	0,090	0,222
** Достоверность значений Р<0,01 * Достоверность значений Р<0,05

Таким образом, результатом проведения исследований стало обнаружение нового механизма, лежащего в основе терапевтического эффекта лекарственных растений при различных инфекционных состояниях и определяемого присутствием в них биологически активных веществ, нарушающих функционирование кворум-зависимых систем бактериальных клеток.

Заключение

Проведённая исследовательская работа позволила сделать ряд выводов и обобщений.

Мы рассмотрели такое явление как эффект «чувства кворума», которое способно регулировать широкий спектр физиологических процессов у различных видов грамотрицательных бактерий. В настоящее время исследования в области биотехнологии сфокусированы на разработке антогонистов АГЛ. В медицине такие вещества могут быть использованы в качестве антимикробных препаратов, а в растениеводстве – для защиты сельскохозяйственных культур от фитопатогенов.

Кроме того, посредством эффекта кворума регулируются процессы синтеза антибиотиков и других высокоценных продуктов, что может быть использовано для регуляции экспрессии генов и роста бактериальных культур в условиях производства. Однако возможности практического применения эффекта кворума и АГЛ как специфических регуляторов различных осуществляемых бактериями процессов ограничиваются недостаточной изученностью механизмов действия QS систем.

В практической части работы было выявлено при исследовании 28 вытяжек лекарственных растений на биосенсорной системе Chromobacterium violaceum 026 и ATCC 31532 2 группы эффектов: бактерицидный эффект (вытяжки листьев толокнянки, брусники, эвкалипта), эффект ингибирования QS (вытяжки листьев эвкалипта, коры дуба и почек березы). Скрининг полученных вытяжек на рост и пигментацию у С.violaceum 026 и C.violaceum АТСС 12472 показал, что подавление «чувства кворума» и бактерицидность – это два не зависимых друг от друга процесса. Подавления пигментации характерное явление для C.violaceum АТСС 31532, так как в нем подавляется синтез аутоиндукторов.

Исследование биологической активности растительных вытяжек на рекомбинантном штамме Escherichia coli pAL 103 позволило выявить 3 ингибитора QS данного штамма (вытяжки корневищ девясила, цветков ноготков и ромашки). Статистический анализ эффектов ингибирования растительными вытяжками роста и пигментообразования биосенсорных моделей Chromobacterium violaceum 026 и АТСС 31532 и биолюминесценции Escherichia coli pAL 103 позволил показать наличие разных рецепторных белков в системе Chromobacterium violaceum и Escherichia coli pAL 103.

Таким образом, поставленная цель и задачи исследования были достигнуты. По данным исследовательской работы были опубликованы статьи в журнале Advanced Studies in Biology, том 4, 2012, и в журнале Перспектива, том 13, 2010 (приложение Б).

Полученные данные определяют задачу более глубокого изучения механизмов действия растительных экстрактов на соответствующие стороны физиологии микроорганизмов, а также определяют перспективу создания на данной основе фармакологических препаратов нового принципа действия.

Список используемых источников

Завильгельский, Г. Б. «Quorum sensing», или как бактерии «разговаривают» друг с другом / Г.Б. Завильгельский, И.В. Манухов // Молекуляр. биология. – – Т. 35. – № 2. – С. 268-277.
Гинцбург, А. Л. «Quorum sensing» или социальное поведение бактерий / А.Л. Гинцбург, Т.С. Ильина, Ю.М. Романова // Микробиология. – – № 5. – С. 86-93.
Смольская, С. В. Механизмы межклеточных взаимодействий у прокариот / С.В. Смольская, А.Г. Песнякевич / Труды Белорусского государственного университета // Физиологические, биохимические и молекулярные основы функционирования биосистем. Выпуск 1. – 2006. – С. 42-55.
Хмель, И. А. Quorum-sensing регуляция экспрессии генов: фундаментальные и прикладные аспекты, роль в коммуникации бактерий / И.А. Хмель // Микробиология. – – Т. 75. - № 4. – С. 45-464.
Хмель, И. А. Quorum Sensing регуляция экспрессии генов – перспективная мишень для создания лекарств против патогенности бактерий / И.А. Хмель, А.З. Метлицкая // Мол. биология. – – Т. 40. – С. 195-210.
Ильина, Т. С. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития / Т.С. Ильина, Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург // Генетика. – – Т. 40. – № 11. – С. 1-12.
Шапиро, Дж. А.Бактерии как многоклеточные организмы / Дж.А. Шапиро // В мире науки. – – № 8. – С. 46-54.
Светличный, В. А. Характеристики ауторегуляторного фактора d₂, вызывающего автолиз клеток Pseudomonas carboxydoflava и Bacillus cereus / Г.И. Эль-Регистан, А.К. Романова, В.И. Дуда // Микробиология. – – Т. 52. – № 1. – С. 33-38.
Fuqua, W. C. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators / W.C. Fuqua, S.C. Winans, E.P. Greenberg // Bacteriol. – – V. 176. – №. 2. – P. 269-275.
Greenberg, E. P.Quorum sensing by bacteria // E.P. Greenberg, S. Winans, C. Fuqua / Ann. Rev. Microbiol. – – V. 50. – P. 727- 751.
Олескин, А. В. Надорганизменный уровень взаимодействия в микробных популяциях // А.В. Олескин / Микробиология. – – Т. 62. – № 3. – С. 389-403.
Bowden, M. G. The Myxococcus Xanthus lipopolysaccharide O-antigen is required for social motility and multicellular development / M.G. Bowden, H.B. Kaplan // Molecular Microbiology. – 1998. – V. 30. – № 2. – P. 275-284.
Bacterial locomotion and signal transduction / M.D. Mamson, J.D. Armitage, J.A. Hoch, R.M.J. Macnab // Bacteriol. – – V. 180. – № 5. –P. 1009-1022.
Cellular signals regulating antibiotic sensitivities of bacteria / Matsuhashi M.[et al.] // Microbial Drug Res. – 1996. – V. 2. – №. 1. – P. 91-
Казначеев, В. П. Сверхслабое излучение в межклеточных взаимодействиях / В.П. Казначеев, Л.П. Михайлова // Новосибирск: Наука, 1981. – 144 с.
Influence of the MexAB-OprH multidrug efflux system on quorum sensing inPseudomonas aeruginosa / K. Evans [et al.]. // Bacteriol. – 1998. – V. 180. – №. 20. – P. 5443-5447.
Шпаков, А. О. Системы сигнальной трансдукции прокариот / А.О. Шпаков, М.Н. Перцева // Журнал эволюционной биохимии физиологии. – 2008. – Т. 44. – № 2. – С. 113-130.
Шпаков, А. О. Сигнальные молекулы бактерий пептидной природы QS–типа / А.О. Шпаков // Микробиология. – 2009. – Т. 78. – № 2. – С. 163-175.
Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов / Ю.А. Николаев, А.Л. Мулюкин, И.Ю. Степаненко, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология. – 2008. – Т. 75. – № 4. – С. 489-496.
Эль-Регистан, Г. И. Адаптогенные функции внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов / Г.И. Эль-Регистан [и др.] // Микробиология. – 2006. – Т. 75. – № 4. – С. 446-456.
Waters, C. M. Quorum sensing cell-to-cell communication in bacteria / C.M. Waters, B.L. Bassle // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. – 2005. – V. 21. – 319-346.
Fuqua, C. Regulation of gene expression by cell-to-cell communication: acyl-homoserine lactone quorum sensing / C. Fuqua, R.M. Parsek, E.P. Greenberg // Annu. Rev. Genet. – 2001. – V. 35. – P. 439-
Stock, A. M. Two-component signal transduction / A.M. Stock, V.L. Robinson, P.N. Goudreau // Annu. Rev. Biochem. – 2000. – V. 69. – P. 183-
Acyl homoserine-lactone quorum-sensing signal generation / M.R. Parsek. [et al.]. // Natl. Acad. Sci. USA. – 1999. – V. 96. – P. 4360-4365.
Kaplan, H. B. Diffusion of autoinducer is involved in regulation of the Vibrio fischeri luminescence system / H.B. Kaplan, E.P. Greenberg // Bacteriol. – 1985. – V. 163. – № 17. – P. 1210-1214.
. Parsek, M. R. Analysis of random and site-directed mutations in rhlI, a Pseudomonas aeruginosa gene encoding an acylhomoserine lactone synthase / M.R. Parsek, A.L. Schaefer, E.P. Greenberg // Molecular Microbiology. – 1997. – V. 26. – P. 301-310.
The Vibrio fischeri quorum sensing systems ain and lux sequentially induce luminescence gene expression and are important for persistence in squid host / C. Lupp [et al.]. // Molecular Microbiology. – 2003. – V. 50 – № – P. 319-331.
Lupp, C. Vibrio fischeri uses two quorum-sensing systems for the regulation of early and late colonization factors / C. Lupp, E.G. Ruby // Bacteriol. – 2005. – V. 187. – № 11. – P. 3620-3629.
Mutational analysis of Vibrio fischeri LuxI polypeptide: critical regions of an autounducer synthase / B.L. Hanzelka [et al.] // Bacteriol. – 1997. – V. 179. – № 22. – P. 4882-4887.
N-acyl-homoserine lactone binding to the CarR receptor determines quorum-sensing specificity in Erwinia / M. Welch [et al.]. // EMBO J. – 2000. – V. 19. – P. 631-641.
Microarray analysis of Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing regulons: effects of growth phase and environment / V.E. Wagner [et al.] // J. Bacteriol. – 2003. – V. 185 - № 7. – P. 2080-2095.
Smith, R. S. Pseudomonas aeruginosa quorum sensing as a potential antimicrobial target / R.S. Smith, B.H. Iglewski // Clin. Invest. – 2003. – V. 112. – P. 1460-
Fray, R. G. Altering plant – microbe interaction through artificially manipulating bacterial quorum sensing / R.G. Fray // Annals of Botany. – 2002. – V. 89. – P. 245-243.
Piper, K. R. Quorum sensing but not autoinduction of Ti plasmid conjugal transfer requires control by the opine regulon and the antiactivator TraM / K.R. Piper, S.K. Farrand // Bacteriol. – 2000. – V. 182. – № 4. – P. 1080-1088.
Quorum-sensing in Gram-negative bacteria / N. A. Whitehead [et al.] // FEMS Microbiol. Rev. – 2001. –V. 25. – P. 365-
Blosser, R. S. Extraction of violacein from Chromobacterium violaceum provides a new quantitative bioassay for N-acyl homoserine lactone autoinducers / R. S. Blosser, K. M Gray // Microbiol. Methods. – 2000. – 40 – P. 47-55.
Steindler, L. Detection of quorum-sensing N -acylhomoserine lactone signal molecules by bacterial biosensors / L. Steindler, V. Venturi // FEMS Microbiol. Lett. – 2006. – V. 266. – № – Р. 1-9.
Lindsay, A. Effect of sdiA on biosensors of N-acylhomoserine lactones / A. Lindsay, B.M. Ahmer // Bacteriol. – 2005. – V. 187. – P. 5054-5058.
Quorum sensing and Chromobacterium violaceum: exploitation of violacein production and inhibition for the detection of N- acylhomoserine lactones / K.H. McClean [et al.] // Microbiology. – 1997. – V. 143. – P. 3703-3711.
Detecting and characterizing N-acyl-homoserine lactone signal molecules by thin-layer chromatography / P.D. Shaw [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA. – 1997. – V. 94. – P. 6036-6041.
Construction and analysis of luxCDABE-based plasmid sensors for investigating N-acyl-homoserine lactone-mediated quorum sensing / M.K. Winson [et al.] // FEMS Microbiol Lett. – 1998. – V. 163. – P. 185-192.
Engineering the luxCDABE genes from Photorhabdus luminescens to provide a bioluminescent reporter for constitutive and promoter probe plasmids and mini-Tn5 constructs / M.K. Winson [et al.] // FEMS Microbiol Lett. – 1998. – V. 163. – P. 193-202.
Structure of the autoinducer required for expression of Pseudomonas aeruginosa virulence genes / J.P. Pearson [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1994. –V. 91. – P. 197-
Quorum sensing in Aeromonas hydrophila and Aeromonas salmonicida: identiﬁcation of the LuxRI homologs AhyRI and AsaRI and their cognate N-acylhomoserine lactone signal molecules / S. Swift // Bacteriol. – 1997. – V. 179. – P. 5271-5281.
The two-component response regulator PprB modulates quorum-sensing signal production and global gene expression in Pseudomonas aeruginosa / Y.H. Dong [et al.] // Microbiol. – 2005. – V. 56. – P. 1287-1301.
Farrand, S. K. Quorum-sensing system of Agrobacterium plasmids: analysis and utility / S.K. Farrand, Y. Qin, P. Oger // Methods Enzymol. – 2002. – V. 358. – P. 452-484.
N-acylhomoserine-lactone-mediated communication between Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia in mixed bioﬁlms / K. Riedel [et al.] // – 2001. – V. 147. – P. 3249-3262.
Gfp-based N-acyl homoserine-lactone sensor systems for detection of bacterial communication / J.B. Andersen [et al.] // Appl Environ Microbiol. – 2001. – V. 67. – P. 575-585.
Hentzer, M. Pharmacological inhibition of quorum sensing for the treatment of chronic bacterial infections / M. Hentzer, M. Givskov // Clin. Invest. – 2003. – V. 112. – P. 1300-
«Subinhibitory» erythromycin represses production of Pseudomonas aeruginosa lectins, autoinducer and virulence factors / D. Sofer, N. Gilboa-Garber, A. Belz, N.C. Garber // Chemotherapy. – 1999. – V. 45. – P. 335-341.
Regulatory effects of macrolides on bacterial virulence: potential role as quorum-sensing inhibitors / K. Tateda, T.J. Standiford, J.C. Pechere, K. // Yamaguchi Curr. Pharm. Des. – 2004. – V. 10. – P. 3055-
Azitromycin inhibits quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa / Tateda [et al.] // Antimicribial Agents and Chemother. – 2001. – V. 45. – P. 1930-1933.
N-acylhomoserine lactones undergo lactonolysis in a pH-, temperature-, and acyl chain length-dependent manner during growth of Yersinia pseudotuberculosis and Pseudomonas aeruginosa /A. Yates [et al.] // Infect. Immun. – 2002. – V. 70. – P. 5635-5646.
AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora / Y.H. Dong, J.L. Xu, X.Z. Li, L.H. Zhang // Natl. Acad. Sci. USA. – 2000. – V. 97. – P. 3526-3531.
March, J. C. Quorum Sensing and bacterial cross-talk in biotechnology / J.C. March, W.E. Bentley // Current Opinion in Biotechnology. – – V. 15. – P. 495-502.
Leadbetter, J. R. Metabolism of acyl-homoserine lactone quorum-sensing signals by Variovorax paradoxus / J.R. Leadbetter, E.P. Greenberg // Bacteriol. – – V. 182. – P. 6921-6926.
Inactivation of a Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing signal by human airway epithelia / C.K. Chun [et al.] // Natl. Acad. Sci. USA. – 2004. – V. 101 – P. 3587-3590.
Suga, H. Molecular mechanisms of bacterial quorum sensing as a new drug target / H. Suga, K. Smith // Current Opinion in Chemical Biology. – – V. 7. – P. 586-591.
Martinelli, D. Effects of natural and chemically synthesized furanones on quorum sensing in Chromobacterium violaceum / Martinelli // BMC Microbiology. – 2004. – V. 4. – P. 25-28.
Teplitski, M. Plants secrete substances that mimic bacterial N-acyl homoserine lactone signal activities and affect population density-dependent behaviours in associated bacteria / M. Teplitski, J. B. Robinson W. D. Bauer // Mol. Plant–Microbe Interact. – – V. 13. – P. 637-648.
Halogenated furanones inhibit quorum sensing through accelerated LuxR tumover / M. Manefifild [et al.] // Microbiolody (UK). – 2002. – V. 148. – P. 1119-1127.
Differential gene expression shows nanural brominated furanones interfere with the autoinducer-2 bacterial signaling systern of Escherichia coli / I. Ren [et al.] // Biotechnol. Bioeng. – 2004. – V. 88. – 630-642.
The Linnean Society of London. An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG III // Botanical Journal of the Linnean Society. – – № 161. – Р. 105-121.

Приложение А

(справочное)

Типы Quorum sensing системы

Таблица А.1 – Примеры системы QS с различными аутоиндукторами

Микроорганизм	Функция:	Аутоиндукторы:
1. Системы типа «luxI-luxR» и др. системы с производными лактонов гомосерина
V.fischeri	биолюминесценция	N-(3-оксогексаноил)-L-лактон гомосерина
V.fischeri	биолюминесценция	N-октаноил-L-лактон гомосерина
V.harveyi	биолюминесценция	N-(3-оксибутаноил)-L-лактоном гомосерина
V.harveyi	биолюминесценция	не идентифицированное соединение AI-2
E.carotovora	синтез внеклеточных гидролитических ферментов (пектиназ, целлюлаз и др.)	N-(3-оксогексаноил)-L-лактон гомосерина
E.carotovora	синтез антибиотика карбапенема	N-(3-оксогексаноил)-L-лактон гомосерина
P.aeruginosa	синтез факторов вирулентности (система lasI-lasR)	N-(3-оксододеканоил)-L-лактон гомосерина
P.aeruginosa	синтез факторов вирулентности (система vsmI-vsmR, или rhlI-rhlR)	N-бутаноил-L-лактон гомосерина
A.tumefaciens	конъюгативный перенос Ti-плазмид	N-3-(оксо-октаноил)-L-лактон гомосерина
S.liquefaciens	стимуляция движения клеток-швермеров по агару	N-бутаноил-L-лактон гомосерина
Y.enterocolitica	инфекционный процесс с участием Yop-белков	N-(3-оксогексаноил)-L-лактон гомосерина и N-гексаноил-L-лактон гомосерина
S.griseus	синтез стрептомицина, развитие воздушного мицелия, споруляция. Примечание: системы стрептомицетов отличаются от типичной системы «luxI-luxR»	2-изокапроил-3-оксиметил-γ-бутиролактон гомосерина
S.virginiae	синтез виргиниамицина	различные бутиролактоны и бутанолиды

Продолжение таблицы А.1

Микроорганизм	Функция:	Аутоиндукторы:
2. Системы с пептидной активацией
E.faecalis	конъюгативный перенос плазмид	гекса- или октопептиды, например cPD1 (H-Phe-Leu-Val-Met-Phe-Leu-Ser-Gly-OH)
B.subtilis	споруляция, компетентность к трансформации	пентапептид H-Ala-Arg-Asn-Glu-Thr-OH и др.
S.pneumoniae	компетентность к трансформации	гептадекапептид H-Glu-Met-Arg-Leu-Ser-Lys-Phe-Phe-Arg-Asp-Phe-Ile-Leu-Gln-Arg-Lys-Lys-OH
X.maltophila	стимуляция роста	гомолог хорионного гонадотропина
M.luteus	стимуляция роста после периода покоя	белок (мол. вес 19 кДа)
V.carteri (зелёная водоросль)	половой процесс	гликопротеин
P.tetraurelia (инфузория)	стимуляция роста	белок (мол. вес 17 кДа)
3. Системы с аминными/аминокислотными аутоиндукторами.
M.xanthus	роение и образование плодовых тел (ранние этапы)	фактор А – смесь аминокислот (с преобладанием тирозина, пролина, фенилаланина, лейцина, изолейцина) с примесью коротких пептидов
P.mirabilis	формирование швермеров	глутамин
E.coli	колониальная макро- и микроструктура	аспарагиновая кислота

Приложение Б

(справочное)

Сведения об опубликованных материалах исследования

Толмачева, А. А. Поиск потенциальных ингибиторов «чувства кворума» растительного происхождения в тестах ингибирования биосинтеза виолацеина / А.А. Толмачева // Перспектива. Сборник статей молодых ученых № 13, Оренбургский гос. ун-т. – Оренбург: ОГУ, 2010. – С. 379-381.
Толмачева, А. А. Поиск потенциальных ингибиторов «чувства кворума» растительного происхождения в тестах ингибирования биосинтеза пигмента виолацеина / А.А. Толмачева // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: материалы конференции / V Межрегиональная конференция молодых ученых. – Саратов: Научная книга, 2010. – 105 с.
Deryabin, D. G. Hexanoic acid derivatives differently mimics homoserine lactone in LuxR and CviR Quorum sensing systems / D.G. Deryabin, A.A. Tolmacheva, P.M. Kalimullina // Advanced Studies in Biology. – 2012. – V. 4. – № 6. – P. 265-273.

Скачать: diplom-peresohranennyy.doc

Категория: Дипломные работы / Дипломные работы по биологии

Уважаемый посетитель, Вы зашли на сайт как незарегистрированный пользователь.
Мы рекомендуем Вам зарегистрироваться либо войти на сайт под своим именем.

Привет студент