Привет студент

Химико-биологический факультет

 

 

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

 

Зависимость биотоксичности углеродных наноматериалов, оцениваемой с использованием бактериальных люминесцирующих биосенсоров, от их физико-химических характеристик

 

 

 

Аннотация

 

 

Выпускная квалификационная работа содержит 63 страницы, в том числе 24 рисунка, 6 таблиц и 99 источников литературы.

Структура дипломной работы соответствует логике построения исследования и состоит из введения, трех глав, заключения и списка использованных источников.

В первой главе дипломного проекта были рассмотрены химические свойства и биологическое значение углерода, его аллотропные модификации, а также биологические эффекты некоторых из них и проблемы оценки. Во второй главе рассмотрены материалы и методы исследований, применяемые при выполнении данной работы. В третьей главе представлены результаты исследовательской работы.

 

Abstract

 

 

Final qualifying work contains 63 pages, including 26 drawings, 6 tables and 99 sources of the literature.

The structure of degree work corresponds to logic of construction of research and consists of the introduction, three chapters, the conclusion and the list of the used sources.

In chapter 1 of the degree project chemical properties and biological value of carbon, its allotropic updatings, and also biological effects of some of them and assessment problems were considered. In chapter 2 materials and the methods of researches applied at realization of this work are considered. In a chapter 3 results of research work are presented.

 

Содержание

 

 

Введение.............................................................................................................. 6

1 Углерод. Химические свойства и биологическое значение............................ 8

1.1 Аллотропные формы углерода.................................................................. 10

1.1.1 Графит...................................................................................................... 10

1.1.2 Алмаз........................................................................................................ 12

1.1.2.1 Наноалмазы........................................................................................... 13

1.1.3 Карбин...................................................................................................... 16

1.1.4 Фуллерены................................................................................................ 17

1.1.5 Углеродные нанотрубки и нановолокна................................................. 23

1.2 Биологические эффекты углеродных наноматериалов и проблемы             их оценки............................................................................................................................ 27

2 Материалы и методы исследования.............................................................. 32

2.1 Материалы исследования........................................................................... 32

2.1.1 Углеродные наноматериалы.................................................................... 32

2.1.2 Биосенсор «Эколюм»............................................................................... 32

2.2 Методы исследования................................................................................. 33

2.2.1 Исследование смачивания углеродных наноматериалов....................... 33

2.2.2 Исследование дисперсности суспензий углеродных наноматериалов.. 34

2.2.3 Методика определения биологической активности углеродных наноматериалов............................................................................................................................ 37

2.2.4 Статистические методы исследования..................................................... 41

3 Результаты и их обсуждение......................................................................... 42

3.1 Исследование гидрофильно-гидрофобных характеристик суспензий углеродных наноматериалов................................................................................................. 42

3.2 Исследование размерных характеристик суспензий углеродных наноматериалов 44

3.3 Исследование биологических эффектов углеродных наноматериалов методом биолюминесцентного анализа.......................................................................... 47

3.4 Исследование влияния растворителя на достигаемую степень дисперсности суспензий углеродных наноматериалов............................................................................ 51

Заключение........................................................................................................ 55

Список используемых источников................................................................... 57

 

                                                                                                                   

 

Введение

 

 

Перспективы продвижения высоких технологий XXI века связывают с развитием нанотехнологии. Под этим термином, подразумевается совокупность технологических приемов и исследовательских методик, позволяющая создавать объекты размером от 1 до 100 нм и манипулировать с ними. Термин был предложен Норио Танигучи в 1974 г. Международный союз чистой и прикладной химии (IUPAC) установил, что если хотя бы по одному измерению размер объекта не превышает 100 нм, то мы говорим о наносистеме [1].

Углерод известен человечеству с древнейших времен, прежде всего как уголь и алмаз. Как индивидуальный химический элемент углерод был признан А.Л. Лавуазье в конце XVIII в. и получил свое название (Carboneum) от латинского carbo – уголь. Еще несколько десятилетий назад были известны три основных аллотропных формы углерода: алмаз, графит и карбин. Однако в последнее время были открыты новые наноразмерные модификации углерода, обладающие уникальными свойствами – фуллерены, нанотрубки и нановолокна.

Широкое использование углеродных наноматериалов (УНМ) в самых разных областях человеческой деятельности означает расширяющийся контакт людей и экосистем со всеми ними, а использование наночастиц в области медицины определяет их адресное и систематическое введение в организм [2].

Несмотря на то, что наноматериалы в мире уже используются более десяти лет, ни один вид наноматериалов не был изучен в полном объеме на безопасность ни в одной из стран мира. Фактически, во всем мире проводилось незначительное количество таких исследований, которые не позволяют точно оценить потенциальные риски использования наноматериалов. Кроме того, требуется разработка высокочувствительных и адекватных методов определения наноматериалов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и биосредах [3, 4].

Данные о токсичности УНМ противоречивы и носят разрозненный характер. Так, например, некоторые авторы охарактеризовали нанотрубки как достаточно сильный дыхательный токсикант [5], также были обнаружены значительные повреждения сердечно-сосудистой системы у мышей после интраназального введения одностенных нанотрубок [6]. Однако в других трудах делают вывод о достаточно низкой токсичности углеродных наноматериалов высокой степени очистки [7], кроме того, сообщается о положительных медицинских эффектах углеродных нанотрубок при регенерации костной ткани [8].

В последнее время все чаще появляются работы, посвященные выявлению зависимости антибактериальных свойств от физико-химических характеристик УНМ [9]. По накапливающимся данным, важное значение имеют организация наноуглерода, особенности его взаимодействия с водным окружением [10], а также свойства формируемых водных суспензий [11] для биологической активности УНМ. В то же время наблюдения о роли названных характеристик в определении антибактериальных свойств УНМ носят немногочисленный характер [12], что требует продолжения и расширения исследований в обозначенном направлении.

Сказанное определило цель нашей работы – определение зависимости биотоксичности углеродных наноматериалов, оцениваемой с использованием бактериальных люминесцирующих биосенсоров, от их физико-химических характеристик.

Для достижения данной цели перед нами были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

• оценка гидрофильно-гидрофобных характеристик УНМ и их влияния на свойства формируемых суспензий;
• анализ влияния достигаемой степени дисперсности УНМ на их биологические эффекты в отношении бактериального люминесцирующего биосенсора;
• анализ влияния растворителя на достигаемую степень дисперсности суспензий УНМ и определение значимости эффектов на биотоксичность.

 

 

1 Углерод: химические свойства и биологическое значение

 

 

«Углерод встречается в природе как в свободном, так и в соединенном состоянии, в весьма различных формах и видах. В свободном состоянии углерод известен по крайней мере в трех видах: в виде угля, графита и алмаза. В состоянии соединений углерод входит в состав так называемых органических веществ, т.е. множества веществ, находящихся в теле всякого растения и животного. Он находится в виде углекислого газа в воде и воздухе, а в виде солей углекислоты и органических остатков в почве и массе земной коры. Разнообразие веществ, составляющих тело животных и растений, известно каждому. Воск и масло, скипидар и смола, хлопчатая бумага и белок, клеточная ткань растений и мускульная ткань животных, винная кислота и крахмал – все эти и множество иных веществ, входящих в ткани и соки растений и животных, представляют соединения углеродистые. Область соединений углерода так велика, что составляет особую отрасль химии, т.е. химии углеродистых или, лучше, углеводородистых соединений». Так описывал углерод Д.И. Менделеев в своей книге «Основы химии» [13].

Углерод – элемент с шестым порядковым номером, относится к IV главной подгруппе во втором периоде периодической системы                        Д.И. Менделеева.

Углерод не принадлежит к самым распространенным в природе элементам – из общего числа атомов земной коры на его долю приходится лишь 0,14 %. Однако этот элемент является основой строения всего животного и растительного мира. Поэтому среди химических элементов углерод занимает особое положение.

Необычайно велико число углеродсодержащих органических соединений, в настоящее время их описано несколько миллионов, тогда как для остальных 103 элементов периодической системы известно всего лишь около 200000 соединений. Углерод является основным элементом полезных ископаемых: углей, нефти и газа [14].

Если рассмотреть все существующие в природе элементы, то, прежде всего, бросается в глаза, что при обычных земных условиях в атомарном (так сказать, мономерном) состоянии способны существовать, лишь немногие элементы. Кроме углерода, это, конечно, благородные газы (Не, Ne, Ar, Kr, Xe, Rn); мономерны также пары ртути. Остальные элементы существуют в природе в виде молекул различной степени сложности, для разложения которых на отдельные атомы необходимы температуры, измеряемые сотнями и тысячами градусов. Д.И. Менделеев первым предположил, что эта особенность углерода лежит в основе его твердости. Он писал: «Если бы углерод образовывал молекулу С₂, как и О₂, то был бы газом» [15].

Углерод – единственный элемент, у которого координационное число соответствует его валентности. Это одна из причин устойчивости связи между атомами углерода. Этот элемент всегда четырехвалентен, но, поскольку в периоде он находится как раз посередине, степень его окисления в разных обстоятельствах бывает от –4 до +4. В реакциях с неметаллами он электроположителен, с металлами – наоборот. Даже в тех случаях, когда связь не ионная, а ковалентная, углерод остается верен себе – его формальная валентность остается по-прежнему равной четырем.

Конфигурация внешней электронной оболочки атома углерода 2s²2p². В составе органических соединений углерод, как правило, образует четыре ковалентные связи. Это обусловлено возбуждением внешней электронной оболочки до состояния 2sp³. Поэтому углерод способен в равной степени как притягивать, так и отдавать электроны. Он способен образовывать одинарные, двойные и тройные связи, что определяет возможность формирования линейных, разветвленных, циклических и даже гетероциклических соединений.

Связь атомов углерода между собой, так же как и с атомами водорода, кислорода, азота, серы, фосфора и прочих элементов, входящих в состав органических веществ, может разрушаться под воздействием природных факторов. Поэтому углерод непрерывно круговращается в природе.

Содержание углерода в живых организмах в расчете на сухое вещество составляет: от 34,5 % до 40 % у водных растений и животных, от 45,4 % до 46,5 % у наземных растений и животных и 54 % у бактерий. В процессе жизнедеятельности организмов, в основном за счет тканевого дыхания, происходит окислительный распад органических соединений с выделением во внешнюю среду СО₂. Углерод выделяется также в составе более сложных конечных продуктов обмена веществ. После гибели животных и растений часть углерода вновь превращается в СО₂ в результате осуществляемых микроорганизмами процессов гниения. Таким образом, происходит круговорот углерода в природе. Значительная часть углерода минерализуется и образует залежи ископаемого углерода: каменные угли, нефть, известняки и другие. Углекислый газ, растворенный в природных водах и в биологических жидкостях, участвует в поддержании оптимальной для жизненных процессов кислотности среды. В составе СаСО₃ углерод образует наружный скелет многих беспозвоночных (например, раковины моллюсков), а также содержится в кораллах, яичной скорлупе птиц. Такие соединения углерода, как HCN, СО, ССl₄, преобладавшие в первичной атмосфере Земли в добиологический период, в дальнейшем, в процессе биологической эволюции, превратились в сильные антиметаболиты обмена веществ [16].

Итак, уникальная роль углерода в живой природе обусловлена его свойствами, которыми в совокупности не обладает ни один других элементов периодической системы.

Элементарный углерод может существовать в виде различных аллотропных форм. Аллотропия – способность одного и того же элемента образовывать несколько типов простых веществ [17].

Свойство аллотропии характерно для углерода благодаря тому, что электронные орбитали его атома могут иметь различную геометрию, в зависимости от степени гибридизации его электронных орбиталей. Существует три основных геометрии углерода:

• тетраэдрическая, образуется при смешении одного s- и трех            p-электронов (sp³-гибридизация). Атом углерода находится в центре тетраэдра, связан четырьмя эквивалентными связями с атомами углерода или иными в вершинах тетраэдра. Такой геометрии атома углерода соответствуют аллотропные модификации углерода алмаз и лонсдейлит, а также органические соединения, например, в метане и других углеводородах;
• тригональная, образуется при смешении одной s- и двух                  p-электронных орбиталей (sp²-гибридизация). Атом углерода имеет три равноценные σ-связи, расположенные в одной плоскости под углом 120° друг к другу. Не участвующая в гибридизации p-орбиталь, расположенная перпендикулярно плоскости σ-связей, используется для образования связи с другими атомами. Такая геометрия углерода характерна для графита, фенола;
• дигональная, образуется при смешении одного s- и одного              p-электронов (sp-гибридизация). При этом два электронных облака вытянуты вдоль одного направления и имеют вид несимметричных гантелей. Два других р-электрона дают π-связи. Углерод с такой геометрией атома образует особую аллотропную модификацию – карбин [18].

Столь уникальные и разнообразные свойства углерода – причина того, что и чистый углерод, и содержащие его материалы служат объектами фундаментальных исследований. Все это ярко свидетельствует о его огромной важности для цивилизации.

 

1.1 Аллотропные формы углерода

 

 

Основные аллотропные формы углерода, такие как графит, алмаз и карбин, были известны человечеству с давних времен. Однако в последнее время были открыты новые, наноразмерные модификации углерода: наноалмазы, фуллерены, нанотрубки и нановолокна.

 

 

1.1.1 Графит

 

 

Графит (от греч. пишу) – это наиболее устойчивая фаза углерода при нормальных условиях. В древности графит считали одним из минералов свинца, возможно из-за того, что, подобно свинцу, он оставляет на бумаге след. В XVIII в. К.В. Шееле доказал, что графит представляет собой «особый минеральный уголь». Родственные отношения между алмазом и графитом были подробно изучены коллегой А.Л. Лавуазье французским химиком                Л.Б.Г. де Морво: при осторожном нагревании алмаза без доступа воздуха он получил порошок графита.

Графит имеет слоистую структуру, образованную параллельными плоскостями, построенными из соприкасающихся шестиугольников. Кристаллы графита состоят из графеновых слоев, упорядоченных в стопки (рисунок 1). Каждый атом углерода в графите соединен прочными ковалентными связями с тремя соседними атомами, образуя три σ-связи. Существуют две основные трехмерные структурные разновидности графита – гексагональная и ромбоэдрическая, различающиеся порядком чередования графеновых слоев в кристаллах. В природном графите гексагональная и ромбоэдрическая модификации обнаруживаются в пропорции от 85 % до 90 % на от 10 % до 15 %, причем при высокотемпературной обработке ромбоэдрическая структура переходит в гексагональную [19].

Благодаря легкости относительного смещения плоскостей механическая прочность графита в направлении, параллельном плоскостям намного ниже («мягкость» графита), чем в перпендикулярном ему направлении. Три электрона каждого атома углерода образуют ковалентные связи внутри слоя, четвертый электрон свободен и является общим для всего слоя атомов. Это свойство ответственно за хорошую электропроводность кристалла в направлении, параллельном слоям. Связь между слоями обеспечивается только за счет ван-дер-ваальсова взаимодействия [17, 19].

Графит – распространенный в природе минерал. Встречается обычно в виде отдельных чешуек, пластинок и скоплений, разных по величине и содержанию графита. Различают месторождения кристаллического графита, связанного с магматическими горными породами или кристаллическими сланцами, и скрытокристаллического графита, образовавшегося при метаморфизме углей. Содержание графита в кристаллических сланцах составляет от 3 % до 20 %, в магматических горных породах – от 3 % до 50 %, в углях – от 60 % до 85 %.

 

 

Рисунок 1 – Кристаллическая решетка графита

 

Графит – жирное на ощупь вещество черного или серо-черного цвета с металлическим блеском. Его свойства зависят от происхождения или способа получения. Наиболее правильные кристаллы образует минерал цейлонских месторождений. В связи с низкой твердостью и весьма совершенной спайностью графит легко оставляет след на бумаге. Эти свойства графита обусловлены слабыми связями между атомными слоями. Прочностные характеристики этих связей характеризуют низкая удельная теплоемкость графита и его высокая температура плавления. Благодаря этому, графит обладает чрезвычайно высокой огнеупорностью. Кроме того, он хорошо проводит электричество и тепло, устойчив при воздействии многих кислот и других химических реагентов, легко смешивается с другими веществами, отличается малым коэффициентом трения, высокой смазывающей и кроющей способностью. Все это привело к уникальному сочетанию в одном минерале важных свойств. Поэтому графит широко используется в промышленности.

Графит ценится за хорошую проводимость тепла и электроэнергии и высокую огнеупорность. Чешуйчатый графит находит большое применение в производстве угольных электродов, пластин и щеток, требующихся в электротехнической промышленности и сухих батарейках. Все сорта графита, особенно высокого класса аморфный и кристаллический графит, используются в качестве смазочных материалов. Графит имеет чрезвычайно низкий коэффициент трения при любых условиях работы. Это свойство имеет неоценимое значение в смазочных материалах. Он уменьшает трение и имеет тенденцию сохранять движущиеся поверхности охлажденными. Сухой графит, а также графит смешивается с жиром и масло используют в качестве смазки для тяжелого и легкого скольжения. Большое количество графита используется в литейном производстве, при производстве красок и карандашей [20].

 

 

1.1.2 Алмаз

 

 

Алмаз – бесцветное, прозрачное кристаллическое вещество, чрезвычайно сильно преломляющее лучи света.

Атомы углерода в алмазе находятся в состоянии sp³-гибридизации. В возбужденном состоянии происходит распаривание валентных электронов в атомах углерода и образование четырех неспаренных электронов.

Каждый атом углерода в алмазе окружен четырьмя другими, расположенными от него в направлении от центра в вершинах тетраэдра. Расстояние между атомами в тетраэдрах равно 0,154 нм. Прочность всех связей одинакова. Весь кристалл представляет собой единый трехмерный каркас (рисунок 2).

При 20 °С плотность алмаза составляет 3,1515 г/см³. Этим объясняется его исключительная твердость, которая по граням различна и уменьшается в последовательности: октаэдр – ромбододекаэдр – куб. В то же время алмаз

Рисунок 2 – Кристаллическая решетка алмаза

 

обладает совершенной спайностью (по октаэдру), а предел прочности на изгиб и сжатие у него ниже, чем у других материалов, поэтому алмаз хрупок, при резком ударе раскалывается и при дроблении сравнительно легко превращается в порошок. Алмаз обладает максимальной жесткостью. Сочетание этих двух свойств позволяет использовать его для абразивных и других инструментов, работающих при значительном удельном давлении [19].

Показатель преломления и дисперсия алмаза намного превышают аналогичные свойства других прозрачных минералов, что в сочетании с максимальной твердостью обусловливает его качество как драгоценного камня.

В алмазах обнаружены примеси азота, кислорода, натрия, магния, алюминия, кремния, железа, меди и других, обычно в тысячных долях процента. Алмаз чрезвычайно стоек к кислотам и щелочам, не смачивается водой, но обладает способностью прилипать к некоторым жировым смесям.

Алмазы в природе встречаются как в виде хорошо выраженных отдельных кристаллов, так и поликристаллических агрегатов. Правильно образованные кристаллы имеют вид многогранников с плоскими гранями: октаэдр, ромбододекаэдр, куб и комбинации этих форм. Очень часто на гранях алмазов имеются многочисленные ступени роста и растворения; если они неразличимы глазом, грани кажутся искривленными, сферическими, в форме октаэдроида, гексаэдроида, кубоида и их комбинаций. Различная форма кристаллов обусловлена их внутренним строением, наличием и характером распределения дефектов, а также физико-химическим взаимодействием с окружающей кристалл средой [18].

 

 

1.1.2.1 Наноалмазы

 

 

К наноалмазам относят достаточно разнородные по атомной структуре и физико-химическим свойствам углеродные наноматериалы, которые образованы атомами углерода, имеющими свойственные алмазу электронные конфигурации, близкие к sp³. Наноалмазы обладают комплексом уникальных физико-химических свойств, таких как: высокая твердость, рекордно низкий коэффициент сжимаемости, большая ширина запрещенной зоны, высокая теплопроводность, высокая термическая и радиационная стойкость, а также химическая инертность [19].

К настоящему времени наиболее изучены наноалмазы минерального, искусственного и космического происхождения. Быстро развивается применение искусственных наноалмазов во многих отраслях промышленности, энергетики, электроники, биофармацевтики [21].

Иногда к алмозоподобным наноаллотропам углерода относят большое семейство алмазоподобных фуллеритов [19].

Наименьшие алмазоподобные углеводородные кластеры размером 1 нм выделены из нефти, они получили название даймонидов. Они представляют собой каркасы из нескольких десятков атомов углерода, замкнутых на концах атомами водорода. Получены икосаэдрические наноалмазы, в основу которых взят малый фуллерен – С20. Фуллерен использовали как ядро, которое достраивали оболочкой sp³-атомов, таким образом, чтобы икосаэдрическая структура исходной частицы сохранялась.

Большую группу sp³-наноструктур составляют протяженные монолитные алмазоподобные нановолокна. Такие волокна кроме основных групп атомов углерода с sp³- и sp²-конфигурациями содержат так же определенные число атомов с конфигурациями sp¹. Недавно получены алмазоподобные нанотрубки, стенки которых имеют sp³-атомную структуру [22].

 

 

 

1

2

3

 

1 – атомы исходной молекулы С20; 2 – атомы «алмазоподобной оболочки; 3 – «поверхностные» атомы.

Рисунок 3 – Атомные модели даймонида пентамантана (А), фуллерена С20 (Б) и икосаэдрического наноалмаза С100 (В)

 

Исследования последних лет показали, что наноалмазы могут быть использованы для создания нанокомпозиционных материалов, элементов наноэлектроники, селективных адсорбентов и катализаторов, объектов  медико-биологического использования. В Институте общей физики им.        А.М. Прохорова РАН разработан ряд химически активных полировальных композиций на основе наноалмазов. Композиции прошли апробацию в технологии обработки металлов, полупроводников и диэлектриков. Наноалмазы опробованы как добавка в металлические гальванические покрытия. Наиболее продвинутая область это хром-алмазные износостойкие покрытия для нефтедобычи [23].

 

 

 

 

Рисунок 4 – Ансамбль вертикально ориентированных алмазоподобных нанортубок, выращенных на поликристаллической алмазной подложке (А) и отдельные алмазоподобные нанотрубки (Б)

 

Принципиально новый вид добавки в смазочные материалы на основе ультрадисперсных алмазов предназначен для значительного улучшения защитных свойств смазочных материалов, увеличения их эффективного срока службы, восстановления и защиты от износа узлов трения различных машин и механизмов.

Cообщается о создании на плоской подложке надмолекулярной структуры окисная пленка алюминия – адгезионный слой – наноалмаз – люцифераза. Показано, что фермент сохраняет каталитическую активность в данной структуре и она может рассматриваться как прототип люминесцентного биочипа для использования в биолюминесцентном анализе. В Институте биофизики Сибирского отделения РАН опробовано применение наноалмазов для выделения рекомбинантного апообелина и рекомбинантной люциферазы из бактериальных клеток E.coli. Применение наноалмазов упрощает процедуры очистки белков, сокращает время их выделения, исключает из процесса специализированное хроматографическое оборудование, позволяет получить высокоочищенные препараты апообелина и люциферазы с выходом белков порядка 45 %. Наноалмазы RUDDM обладают уникальной сорбционной способностью и могут быть использованы в качестве адсорбента для экспрессного выделения белков из грубых белковых смесей. Выделение возможно как белков из рекомбинантных бактериальных штаммов, так и из природных объектов. Применение наноалмазов RUDDM позволяет проводить доочистку коммерческих белковых препаратов [24].

1.1.3 Карбин

 

 

Карбин – еще одна аллотропная форма углерода на основе                    sp-гибридизации углеродных атомов. Карбин представляет собой мелкокристаллический порошок черного цвета. Получен в искусственных условиях из длинных цепочек атомов углерода, уложенных параллельно друг другу. Карбин – линейный полимер углерода (рисунок 5А). В молекуле карбина атомы углерода соединены в цепочки поочередно либо тройными и одинарными связями (полиеновое строение, α-карбин), либо постоянно двойными связями (поликумуленовое строение, β-карбин).

Первая попытка синтезировать одномерный полимер углерода была сделана А. Байером в конце 1885 г. Однако полученные им соединения оказались неустойчивыми. Поэтому А. Байер постулировал невозможность получения цепочкоподобного полимера углерода [19].

Это вещество впервые получено советскими химиками В.В. Коршаком, А.М. Сладковым, В.И. Касаточкиным и Ю.П. Кудрявцевым в начале 60-х гг. в Институте элементоорганических соединений Академии наук СССР [25].

При синтезе карбин получается в виде волокон, порошка, пленок с разнообразной структурой: длинные неупорядоченные цепи, аморфный и квазиаморфный материал с микрокристаллическими включениями, послойно ориентированные цепочки.

 

 

 

 

Рисунок 5 – Возможный механизм формирования фуллеренов из фрагментов карбиновых цепей: А – карбин; Б – графит; В – сборка молекулы фуллерена

 

Частицы кристаллического карбина имеют совершенную огранку и пластинчатую форму кристаллов, бывают частицы в виде волокон длиной порядка 9,5 мм. При конденсации карбина на подложках получены слои, в которых линейные цепочки углерода ориентированы преимущественно нормально относительно подложки.

Ряд свойств карбина нельзя отнести к конкретной модификации, его плотность, по данным разных авторов, изменяется от 1,9 до 3,30 г/см³. Карбин – полупроводник n-типа (с шириной запрещенной зоны от 1 до 2 эВ). У карбина обнаружены фотоэлектрические свойства: под действием света электропроводность карбина сильно увеличивается. На этом свойстве основано первое практическое применение карбина – в фотоэлементах. Важно, что карбин не утрачивает фотопроводимости даже при температуре до 500 °C, которая намного больше, чем у других материалов того же назначения.

Средняя теплота сгорания карбина значительно меньше по сравнению с графитом и алмазом. По мнению В.В. Коршака с соавторами, карбин более термодинамически устойчив, чем графит [26].

Карбин оказался стабильной аллотропной формой углерода при высокой температуре и низком давлении. Он, особенно в кристаллическом состоянии, обнаруживает поразительную инертность к различным окислителям. По отношению к кипячению в смеси концентрированных азотной и серной кислот он ведет себя подобно алмазу. Только взаимодействие карбина с озоном приводит к полной его деструкции. Карбин инертен и к действию других химических реагентов. Так, взаимодействие его с хлором начинается лишь при температуре выше 800 °С и сопровождается деструкцией и образованием различных полихлоридов. Несмотря на наличие в структуре двойных и тройных связей, карбин не реагирует с водородом в присутствии гомогенных или гетерогенных катализаторов. Имеются сведения, что карбин проявляет каталитическую активность в реакциях дегидрирования и дегидратации. Благодаря особенностям своей кристаллической структуры карбин может образовывать соединения включения (соединения внедрения) с металлами.

При нагревании карбин переходит в графит. Считается, что β-карбин является метастабильной фазой и легко переходит в графит и алмаз, то есть   α-карбин – более устойчивая модификация. В то же время, обнаружено, что при высоких давлении и температуре происходит превращение полиина в поликумулен (менее плотной фазы в более плотную) [27].

Ряд авторов, опираясь на модельные расчеты и экспериментальные результаты, считает, что углеродные цепи могут быть изогнуты и содержать петли, поэтому карбины могут формировать листовые структуры. Гипотетическая возможность цепочек углеродных атомов преобразовываться в кольцевые структуры может служить основой механизма формирования фуллеренов (рисунок 5) [19].

Карбин встречается в природе в виде минерала чаоита (белые прожилки и вкрапления в графите) и получен искусственно – дегидрополиконденсацией ацетилена, действием лазерного излучения на графит, из углеводородов или CCl₄ в низкотемпературной плазме [21].

 

 

1.1.4 Фуллерены

 

 

В 1985 году группа исследователей – Р. Керл, Х. Крото Р. Смолли,  Дж.Р. Хит и С.Ц. О’Брайен – провели совместный эксперимент, исследуя испарения графитового диска, полученных при лазерном облучении в атмосфере гелия, и обнаружили пики с максимальной амплитудой, соответствующие кластерам состоящими из 60 и 70 атомов углерода. Они предположили, что данные пики отвечают молекулам С60 и С70 и выдвинули гипотезу, что молекула С60 имеет форму усеченного икосаэдра. Для молекулы С70 была предложена структура с более вытянутой эллипсоидальной формой. Полиэдрические кластеры углерода получили название фуллеренов, а наиболее распространенная молекула С60 – бакминстерфуллерена, по имени американского архитектора Бакминстера Фуллера, применявшего для постройки куполов своих зданий пяти- и шестиугольники, являющиеся основными структурными элементами молекулярных каркасов всех фуллеренов [28].

Следует отметить, что открытие фуллеренов имеет свою предысторию: возможность их существования была предсказана еще в 1966 г. в Америке      Д. Джонсом. Он предположил, что внедрение в графитовый слой дефектов в виде пятиугольников может превратить этот плоский слой в полую замкнутую молекулу [29]. В 1970 г. японский химик-органик Э. Осава опубликовал статью о возможности существования молекулы из 60 атомов углерода, совместно с   З. Йошидой, он предположил, что такой молекуле свойственна ароматичность. Теоретическое обоснование этому было получено в 1972 г. в России           Д.А. Бочваром и Е.А. Галперн [30]. За открытие фуллеренов Х. Крото,             Р. Смолли и Р. Керлу в 1996 году была присуждена Нобелевская премия по химии [29].

Фуллерены – это замкнутые многогранные молекулы чистого углерода, имеющие только пяти- и шестиугольные грани [29]. Все атомы углерода в таких молекулах, как и в графите, находятся в состоянии sp²-гибридизации. Пятиугольники, отсутствующие в слоистой структуре графита, обеспечивают замкнутость каркасов фуллеренов. Наиболее стабильным и доступным является бакминстерфуллерен С60. Молекула С60 представляет собой икосаэдр, составленный из 12 пяти- и 20 шестиугольных граней, и напоминает по форме футбольный мяч [31].

Согласно теореме Л. Эйлера, сформулированной в 1758 г., в любой молекуле фуллерена количество пятиугольных граней всегда будет равно 12, а вот количество шестиугольных граней может быть различным, при этом число вершин многогранника всегда остается четным. Наименьшая молекула фуллерена – С20 состоит только из 12 пятиугольников. Кроме того, группа исследователей из университета в Галвестоне и Х. Крото предложили гипотезу, отвечающую на вопрос о сверхмагической стабильности молекулы С60. Бакминстерфуллерен – это наименьший фуллерен, в котором все пятиугольные грани изолированы друг от друга, следующей такой молекулой является С70. Так было сформулировано правило изолированных пятиугольников [17].

Все многообразие фуллеренов принято делить на два семейства (по отношению к С60) высших, где С_n больше 60, и низших, где С_n меньше 60. Среди фуллеренов известно множество частиц изомеров от малых (С20, С28) до гигантских (С240, С1840) с совершенно различными свойствами (рисунок 6) [32].

Рисунок 6 – Схематическое изображение фуллеренов

 

Фуллерены могут иметь как одну, так и несколько углеродных оболочек, «вложенных» друг в друга. Кроме того они могут взаимодействовать с различными атомами, молекулами и комплексами снаружи своей оболочки, так и включать их внутрь своего каркаса (экзо- и эндофуллерены).

Все фуллерены представляют собой кристаллические вещества, окраска которых зависит от степени дисперсности образца. Так, крупные кристаллы С60-фуллерена окрашены в черный цвет, тогда как тонкие пленки – в желто-коричневый. Термодинамически фуллерены являются менее стабильными аллотропами углерода, чем алмаз и графит.

Фуллерены плохо растворимы в сильнополярных растворителях (воде, спирте, эфирах, кислотах и кетонах), кроме функционализированных водорастворимых производных. Несколько лучше фуллерены растворяются в алифатических углеводородах и галогеналканах, тогда как максимальные величины растворимости получены для ароматических углеводородов и их галогенпроизводных, а также сероуглерода.

Характерным свойством фуллеренов является способность образовывать комплексы с молекулами растворителей с перераспределением заряда и образованием упорядоченных структур. Так, например, методом рентгеноструктурного анализа установлено кристаллическое строение для С60∙TiCl₄ и С70∙2TiCl₄ [33].

В ряде работ продемонстрировано, что молекула фуллерена может аккумулировать большое количество энергии, до 30 эВ. Однако, при воздействии высокоэнергетических частиц молекула фуллерена разваливается на фрагменты. Такой процесс может приводить к формированию эндоэдральных соединений – фуллеренов, содержащих внутри каркаса атомы и молекулы, например, He@C60 – молекула С60-фуллерена, содержащая внутри атом гелия [17].

Химические свойства фуллеренов лучше изучены для С60 и С70, в то время как высшие фуллерены практически не исследованы, что связано с трудностями их выделения. Наиболее часто для функционализации используется ковалентное присоединение каких-либо групп по кратным связям каркаса. Этот процесс можно рассматривать как классический вариант «экзоэдральной» функционализации.

Неклассические подходы к функционализации фуллеренов дают нам гетерофуллерены – молекулы, с замененными в каркасе атомами углерода на атомы других элементов, например, (С₅₉N)₂ [32].

Кратные связи в каркасе фуллерена являются сильно электронно-дефицитными. Молекула С60 может принять от 1 до 6 электронов с образованием анионов. Фуллерены легко реагируют с нуклеофилами, практически не вступают в реакции электрофильного присоединения, способны присоединять радикальные частицы по радикальному механизму (например, с галогенами), вступают в различные реакции циклоприсоединения (рисунок 7). Фуллерен легко может быть восстановлен до анионов при взаимодействии с сильными органическими донорами и металлами, с образованием солей. Фуллериды (соли фуллеренов с металлами, чаще с щелочными и щелочноземельными) обладают сверхпроводимостью [33].

 

Рисунок 7 – Возможные пути химической модификации фуллеренов

 

Высокая реакционная способность фуллеренов приобрела практическое значение ввиду того, что многие соединения, полученные в результате исследования свойств фуллеренов, показали весьма ценные свойства [33].

За последние 17 лет были синтезированы тысячи производных фуллерена С60, в том числе и водорастворимых, разработаны способы получения водных наносуспензий чистого фуллерена.

Прежде всего, фуллерены нашли свое применение в технике. В настоящее время в научной литературе обсуждаются вопросы использования фуллеренов для создания фотоприемников и оптоэлектронных устройств [31], катализаторов роста алмазных и алмазоподобных пленок [16], сверхпроводящих материалов, а также в качестве красителей для копировальных машин [32]. Фуллерены применяются для синтеза металлов и сплавов с новыми свойствами.

Фуллерены планируют использовать в качестве основы для производства аккумуляторных батарей. Эти батареи во многих отношениях аналогичны широко распространенным никелевым аккумуляторам, однако, обладают способностью запасать примерно в пять раз больше удельное количество водорода. Кроме того, такие батареи характеризуются более высокой эффективностью, малым весом, а также экологической и санитарной безопасностью по сравнению с наиболее продвинутыми в отношении этих качеств аккумуляторами на основе лития. Такие аккумуляторы могут найти широкое применение для питания персональных компьютеров и слуховых аппаратов [31].

Фуллериты – молекулярные кристаллы, в узлах которых находятся молекулы фуллеренов – обладают фотопроводимостью в спектральном диапазоне, оптимальном для создания солнечных элементов. Спектр фотопоглощения фуллеритовых пленок лежит в диапазоне длин волн от 280 до 680 нм, а квантовый выход (вероятность образования электрон-ионной пары при поглощении одного фотона) составляет 0,9. Такие свойства фуллеренов определяют перспективы их использования для конструирования солнечных батарей [27].

На основе фуллеренов возможно создание новых конструкционных материалов с уникальными свойствами для использования в строительстве инженерно-технических сооружений и в изготовлении средств индивидуальной защиты: тканые материалы специального назначения (ленты, полотна, паруса, канаты, сверхпрочные нити) на основе полимерных молекул, модифицированных фуллеренами; радиозащитные материалы на основе графитов, модифицированных фуллеренами; бетонополимеры повышенной прочности.

Известно, что использование водорода в качестве универсального высокоэффективного и экологически чистого энергоносителя в энергетике имеет большие перспективы, особенно в виде топлива для мобильных транспортных средств. В последние годы в качестве обратимых сорбентов водорода для создания его аккумуляторов все чаще предлагают использовать фуллерены и их производные, углеродные нанотрубки и нановолокна. В России исследования и разработки ведутся на химическом факультете МГУ, изучается проблема обратимого хранения и выделения водорода в мягких условиях с использованием фуллерена С60 [33].

Весьма перспективным представляется применение фуллеренов в медицине. Высокая химическая активность молекул фуллерена, имеющих большое число свободных связей, придает ей способность присоединять различные радикалы, в том числе биологически активные. Основное препятствие для быстрого внедрения фуллеренов в медицинскую практику связано с нерастворимостью молекул фуллеренов в воде, что затрудняет их введение в живой организм. Данная проблема была решена подбором водорастворимой молекулы, образующий комплекс с фуллереном [27]

В период с 1998 по 2005 г. опубликовано более 200 научных работ, демонстрирующих эффективность применения фуллеренов при лечении целого ряда заболеваний, включая рак, артрит [34], склероз, вирусные и бактериальные инфекции. В России ведутся работы и получены положительные результаты, подтвержденные публикациями и патентами, в области применения фуллеренов и их модификаций для лечения гриппа, онкологических заболеваний и бактериальных инфекций [35]. Делаются успешные попытки использовать такие нанопереносчики лекарств при лечении заболеваний нервной системы – эпилепсия, болезнь Альцгеймера, глиома, болевые синдромы [36]. Показано разрушающее действие фуллерена С60 и его поликарбоскильного производного на амилоидные фибриллы in vitro, которые играют центральную роль в патогенезе болезней Альцгеймера, Паркинсона, диабета второго типа и др. [37].

Разработаны методы получения производных фуллеренов путем прямого присоединения аминокислот и пептидов по двойной связи фуллерена через аминогруппу. Такие производные хорошо растворимы в воде, обладают малой токсичностью и проявляют различную биологическую активность. Так, обнаружены мембранотропные, антиоксидантные и иммуномодулирующие свойства таких гибридных структур, их активность против СПИДа. Недавно для этих аминокислотных производных была обнаружена высокая активность против цитомегаловирусной инфекции, а также стререоспецифичность взаимодействия аминокислотных производных с мембранами и белками [38].

Показаны радиопротекторная и антирадикальная активности и          защитный эффект для дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) высокостабильных водных растворов С60 фуллерена in vitro. Кроме того, в экспериментах in vivo на мышах показано предотвращение радиационного поражения тканей и органов [39].

В тоже время уже имеющиеся данные позволяют рассматривать как сам фуллерен С60, так и другие наноструктуры углерода как перспективную основу для создания как супрамолекулярных наномедицинских препаратов [39], особенно для местного применения, так и различных диагностикумов, причем различными белками [38].

Приведенные выше примеры не оставляют сомнений в том, что в ближайшие годы соединения фуллеренов перейдут в разряд классических материалов для органической электроники, а также широко используемых компонентов для фармацевтики, косметологии, медицины. Применение фуллеренов на данном этапе развития ограничивается наличием противоречивых результатов. Ряд авторов указывают на токсическое действие фуллеренов. Все это говорит о том, что вопрос о применении фуллеренов остается открытым и требует от медицинских и биологических наук обоснование и разработку адекватных методических подходов к исследованию рисков, возникающих при контакте биологических систем с наноматериалами.

 

 

1.1.5 Углеродные нанотрубки и нановолокна

 

 

Нельзя назвать точную дату открытия углеродных нанотрубок (УНТ), но общепризнанным является факт наблюдения структуры многостенных нанотрубок в 1991 году С. Иджимой, где в своей статье он ввел термин «углеродные нанотрубки» [40]. Однако до его работ в 1952 году российскими учеными Л.В. Радушкевичем и В.М. Лукъяновичем были опубликованы первые электроно-микроскопические изображение структур, которые мы сегодня называем УНТ [41]. В 1993 году две группы ученых (из Японии и Калифорнии) независимо друг от друга впервые получили и идентифицировали одностенные УНТ [42, 43].

Существует множество теоретических работ по предсказанию данной аллотропной формы углерода. В своей работе химик Д.Е.Х. Джонс (Дедалус) размышлял о свернутых трубах графита. В работе Л.А. Чернозатонского и др., вышедшую в тот же год, что и работа С. Ииджимы, были получены и описаны углеродные нанотрубы, а М.Ю. Корнилов предсказал существование однослойных углеродных нанотруб в 1986 г.

УНТ представляют собой протяженные цилиндрические структуры диаметром от одного до нескольких десятков нанометров и длиной до нескольких сантиметров, состоят из одной или нескольких свернутых в трубку графитовых (гексагональных) плоскостей (графенов) и обычно заканчиваются полусферической головкой [44]. При этом различают одностенные, состоящие из одного слоя атомов углерода и многостенные нанотрубки – из множества сгруппированных углеродных трубок (рисунок 8).

Существуют три типа однослойных УНТ – в зависимости от того, как двумерная молекула графена скручена по отношению к ее гексагональной решетке:

• трубки со структурой armchair, или зубчатые нанотрубки, в которых стороны графеновых шестиугольников ориентированы перпендикулярно оси цилиндра;
• трубки зигзагообразной структуры, в которых стороны графеновых шестиугольников ориентированы параллельно оси цилиндра;
• разнообразные хиральные нанотрубки, в которых винтовая ось параллельна оси трубки [1].

Многостенные нанотрубки бывают образованы по 3 типам: трубки-матрешки (вложенные друг в друга), рулонные (рулоны из одного графитового листа), папье-маше (когда один слой такой нанотрубки образован 2 и более незамкнутыми листами) (рисунок 9).

 

 

 

 

1 – зубчатая нанотрубка; 2 – зигзагообразная нанотрубка; 3 – хиральная нанотрубка.

Рисунок 8 – Атомные модели основных конфигураций одностенных углеродных нанортубок (А); микрофотография и атомная модель замкнутых многослойных нанотрубок (Б)

 

Нанотрубки могут иметь на своей поверхности различные химические функциональные группы, например, карбиксильные или аминные, процесс прививки таких групп к поверхности нанотрубок называется функционализацией.

 

 

а – русская матрешка; б – свиток; в – папье-маше.

Рисунок 9 – Атомная модель многослойной нанотрубки и характерные сечения многослойных нанотрубок

 

Углеродные нановолокна (УНВ) – это семейство конструкционных волокон, имеющих диаметр менее 100 нм, содержащие внутреннюю полость с перегородками и состоящие из вложенных друг в друга искаженных конусов с графеновыми (сетки, подобные слоям в графите) стенками (рисунок 10).

 

 

Рисунок 10 – Схематическое изображение (А) и АСМ-изображения (Б) углеродных нановолокон

 

Нановолокна, как и нанотрубки, могут быть функциализированы путем прививки к кончикам или боковой поверхности тех или иных химических функциональных групп [45].

Несмотря на кажущуюся хрупкость, УНТ оказались на редкость прочными при нагрузках как на растяжение, так и на изгиб. Они в десять раз прочнее и в шесть раз легче стали. К тому же нанотрубки не только прочные, но и гибкие. По своему поведению они напоминают не ломкие соломинки графитовых стержней, а жесткие резиновые трубки. Одностенные нанотрубки могут упруго удлиняться на 16 %. Более того, даже при механических напряжениях, превышающих критические, а также при серьезных воздействиях тепла или излучения нанотрубки не «рвутся» и не «ломаются», а перестраиваются [46].

Первые теоретические предсказания электронных свойств одностенных нанотрубок были сделаны в 1992 г., а экспериментально подтверждены через шесть лет [47]. При этом электрические параметры одностенных УНТ характеризуются значительным разбросом, что связано с многообразием их структурных особенностей, обусловленным различиями методов и условий синтеза и очистки [48].

УНТ в зависимости от расположения атомов углерода в их стенках проявляют полупроводниковую или металлическую проводимость [49].

УНВ, как и нанотрубки, обладают высокой прочностью и эластичностью. Другим важным свойством УНВ является высокая сорбционная способность, гораздо выше чем гранулированные углеродные сорбенты [50]. УНВ могут быть изготовлены с очень большой площадью поверхности и малым диаметром волокна (обычно от 10 до 20 мкм), что обеспечивает быстрое протекание процессов адсорбции или каталитических процессов [51].

Возможность нанотрубок проявлять металлические и полупроводниковые свойства позволила предсказать возможность изготовления нанотрубчатых приборов с гетеропереходами металл/полупроводник из чистого углерода. В 1998 г. создан полевой транзистор на основе индивидуальной полупроводниковой нанотрубки и в 2001 г. – логические схемы на таких приборах [52].

В то же время, прямозонность таких полупроводников автоматически включает их в число материалов оптоэлектроники. В 2003 г. исследователи из фирмы IBM продемонстрировали электролюминесценцию полупроводниковой нанотрубки диаметром 1,4 нм. В оптике же соединения наноуглерода применяют для создания дисплеев, светодиодов, оптических сенсоров, в качестве оптических элементов лазерных систем.

Еще одной фундаментальной особенностью нанотрубок является поразительная чувствительность их проводимости к механическим напряжениям. То есть, мы имеем датчик малейших деформаций, такой датчик мог бы найти применение в устройствах, контролирующих состояние механических узлов и деталей [53].

Однослойные нанотрубки весьма чувствительны к газовой атмосфере. Это послужило основой для разработки «электронного носа» – химического сенсора газов. В частности описаны сенсоры, чувствительные к NO₂, NH₃ [54].

В сканирующей зондовой микроскопии пространственное разрешение и точность отображения профиля исследуемой поверхности практически полностью определяется геометрией острия [55]. Уникальные механические свойства УНТ, в частности, высокая прочность, во много раз превосходящая прочность стали, делают их подходящими объектами для использования в качестве кончиков игл для зондовой микроскопии [56, 57]. При жестком контакте с исследуемой поверхностью нанотрубки сгибаются, а после снятия нагрузки восстанавливают свою форму. Их также используют в качестве наноинденторов для измерения микротвердости [54].

Пикосекундные и фемтосекундные лазеры открывают широкие перспективы для исследования быстропротекающих процессов в физике, химии и биологии. Ожидается, что сверхкороткие импульсы найдут применение при разработке новых технологий широкополосной связи. Методы получения сверхкоротких импульсов могут быть осуществлены с использованием просветляющихся фильтров (насыщающихся поглотителей). Насыщающиеся поглотители с рабочей областью в ближнем ИК-диапазоне могут быть созданы на базе одностенных УНТ [58, 59].

Одностенные нанотрубки являются наиболее перспективным материалом для элекрохимических актюаторов (исполнительных механизмов) и искусственных мускулов [54].

Одностенные и многостенные нанотрубки предложены в качестве основы для фильтров против вирусов и бактерий. Так, нанотрубки, прикрепленные к полиамидной или полипропиленовой матрице оказывали инактивирующее действие в отношении бактерий Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens [60], Esherichia coli и вируса MS2 [61]. Такие фильтры могут быть использованы для контроля загрязнений лечебных учреждений и питьевой воды.

В работах некоторых авторов сообщаются о том, что УНТ оказывали положительный медицинский эффект при регенерации костной ткани [8], обладали повышенным сродством к липидным структурам, образовывали стабильные комплексы с пептидами и ДНК-олигонуклеотидами, что обуславливает их применение в виде эффективных систем доставки вакцин и генетического материала [62].

В противоположность этому в других трудах нанотрубки охарактеризовали как достаточно сильный дыхательный токсикант [5]. Предполагается, что наноматериалы способствуют раку легких [63].

Благодаря высокой сорбционной способности УНВ, их применяют как сорбенты в различных отраслях промышленности. Современные исследователи связывают более высокую эффективность сорбции УНВ (по сравнению с углями) не только с малым диаметром волокон, но и с особенностями их строения. Считается, что благодаря упорядоченности структуры углеродного волокна в единице объема их активированных форм содержится большое количество мезо- и микропор. Последние расположены перпендикулярно оси волокна и доступны непосредственно с внешней поверхности, что обеспечивает их большую кинетическую активность по отношению к сорбируемым веществам по сравнению с гранулированными углеродными сорбентами. Они используются для снаряжения воздухоочистительных фильтров, поглотителей в противогазах, респираторах; в очистке питьевой и технической воды; для извлечения благородных, цветных и редких металлов из низкоконцентрированных технологических растворов гальванических и металлургических производств (в том числе в качестве электродов); для создания и поддержания вакуума; в медицинской практике для создания препаратов и материалов медицинского назначения (гемо- и энтеросорбенты, аппликаторы и так далее), выделения и разделения препаратов в медицине и фармакологии [50].

УНВ связывают с созданием сверхпрочных композитов на основе промышленных полимерных материалов (электропроводные композиты, композиты для защиты от электромагнитных излучений, ударопрочные композиты) [45].

 

 

1.2 Биологические эффекты углеродных наноматериалов и проблемы их оценки

 

 

Имеющиеся в настоящее время в небольшом количестве исследования в этом направлении указывают на то, что наноматериалы могут быть токсичными, тогда как их эквивалент в обычной форме в этой же концентрации безопасен [3].

В своих исследованиях авторы делают вывод о том, что наночастицы углерода вызывали повреждение ДНК, клеточных мембран и органелл, проявляли возможную генотоксичность, цитотоксичность, способствовали усилению транспорта потенциально токсичных компонентов через барьеры организма, проявляли генотоксичность и аллергезирующее действие [3].

УНТ, в зависимости от их поступления в организм животных, проявляют различную токсическую активность. Многие авторы охарактеризовали нанотрубки как достаточно сильный дыхательный токсикант [5]. Предполагается, что наноматериалы способствуют раку легких [8]. Так ингаляция крыс и мышей вызывает воспаление и фиброз, накопление нейтрофилов и белка в легочной ткани, увеличение массы легких и активности лактат-дегидрогеназы [65, 66].

УНМ могут проникать в клетки и избирательно накапливаться в разных типах клеток и клеточных компартментах сходных клеток, способны к трансцитозу через эпителиальные и эндотелиальные клетки, могут распространяться по ходу дендритов и аксонов, кровеносных и лимфатических сосудов, вызывать окислительный стресс и воспаление [67].

Показан цитостатический эффект водорастворимого фуллерена С60 на фибробласты кожи и нейроны человека, человеческие клетки карциномы печени. Это растворимое в воде производное соединение С60 разрушает нормальную клеточную функцию через перекисное окисление липидов [68].

Исследование in vitro в культуре клеток эпидермальных кератоцитов человека и мыши показало, что УНТ проникают через мембрану, аккумулируется внутри клетки и индуцируют апоптоз. Одностенные УНТ в концентрациях 25, 50, 100 и 150 мкг/мл ингибируют пролиферацию эмбриональных клеток человеческой почки [69, 70].

При пероральном введении гидроксилированные (растворимые в воде) УНТ распределяются по тканям и органам, исключая мозг. Многостенные УНТ снижают жизнеспособность клеток, увеличивают содержание воспалительного маркера интерлейкина-8. Однако растворы и суспензии содержащие УНТ не вызывают аллергических реакций [66]. Одностенные и многостенные УНТ отличаются степенью цитотоксичности и способностью индуцировать окислительный стресс [71, 66].

Инъекции фуллеренов и их водорастворимых форм были внутривенно введены крысам в дозах 15 и 25 мг/кг, последняя в течение 5 мин привела к смерти двух из двадцати крыс. Фуллерены почти полностью связывались с белками плазмы и инактивировали активность печеночных глутатион-S-трансферазы, глутатион-пероксидазы и глутатион-редуктазы и индуцировали окислительное повреждение гепатоцитов крыс [66].

При пероральном введении фуллеренов LD50 (LD – летальная доза) для крыс составила 600 мг/кг. При сублетальных дозах у животных наблюдалось снижение активности щелочной фосфатазы и содержания триацилглицеридов, уменьшение масс тимуса и сердца, увеличение селезенки, активности аспарагиновой трансаминазы (АСТ), а также развивалась нефропатия [65].

Изучение токсичности C60 на водной культуре водорослей (Pseudokirchneriella subcapitata) и дафний (Daphnia magna) в присутствии атразина, метилпаратиона, пентахлорфенола и фенантрена, показало, что фуллерен способен увеличивать токсичность фенантрена и уменьшать пентахлорфенола, при этом 85 % фенантрена агрегировано с C60. Таким образом, фуллерены способны аккумулировать ксенобиотики и тем самым усиливать их токсичность [72].

В результате работы по оценке токсичности наноматериалов в настоящее время ведутся в различных странах и на большом числе разнообразных методик и тест систем. Исследования безопасности углеродных наноматериалов проводят на различных уровнях организации живого:

• на молекулярном уровне: взаимодействие наноматериалов с липидами, белками, нуклеиновыми кислотами (ДНК, РНК, клеточными мембранами, рибосомами, ферментами, цитохромами Р-450) в системах in vitro [35, 37,38];
• в моделях in vitro выживаемость пробиотических микроорганизмов нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта и патогенных микроорганизмов в присутствии наноматериалов [60, 61];
• на модельных клеточных системах, эукариотических организмов: механизмы проникновения наноматериалов через биомембраны, связывания с мембранными рецепторами в системе in vitro [68, 69, 70, 72];
• в составе органных и тканных модельных систем, воспроизводящих различные среды организма (желудочное и кишечное содержимое, кровь, лимфа, желчь, моча и т.д.): изменение характеристик наночастиц (гидрофильности/гидрофобности, адсорбционных характеристик, способности к образованию ассоциатов) [67];
• на организменном уровне: процессы всасывания, транспорта и аккумуляции наноматериалов в различных системах организма на моделях in situ и in vivo; зависимость токсичности наноматериалов от способа введения в организм [8, 65, 66];
• на уровне экосистем: воздействие наноматериалов на различные организмы [73].

Создание нормативных документов по данному вопросу позволяет расширить применение методов, позволяющих всесторонне тестировать безопасность искусственных наноматериалов и нанотехнологической продукции для широкого спектра биологических объектов.

В нашей стране разработаны методические рекомендации «Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза» в рамках реализации Федеральной целевой программы «Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008-2010 гг.» в целях внедрения единого, научно обоснованного подхода к оценке безопасности искусственных наноматериалов. Данные методические рекомендации предлагают методы оценки безопасности новых наноматериалов по их воздействию на показатели жизнедеятельности различных модельных систем, в роли которых выступают патогенные, условно-патогенные и симбиотические микроорганизмы, культуры клеток высших животных, репрезентативные компоненты водных биоценозов (ракообразные, рыбы), организмы млекопитающих и высшие растения [74].

Бактериальные тест-системы получают все большее распространение при исследовании биологической активности наноматериалов и оценке потенциальных рисков их поступления в природные экосистемы и среду обитания человека. Биотесты на основе светящихся бактерий дают интегральную оценку токсичности и часто превосходят другие известные биотесты в скорости, точности, чувствительности и простоте использования.

Для проведения люминесцентного биотестирования предложено использование более десяти природных морских и наземных светящихся бактерий, а также трансгенных штаммов микроорганизмов с клонированными в них lux-генами, выпускаемыми как российскими, так и зарубежными производителями [69].

Однако такие биотесты не имеют общего стандарта в России и за рубежом и позволяют исследовать биотоксичность только для водорастворимых углеродных наноматериалов. Поэтому существует необходимость разработки всесторонней, стандартизованной методологии оценки биотоксичности углеродных наноматериалов на различных модельных системах.

Помимо отсутствия стандартизированного подхода в анализе биологических эффектов УНМ, существует и ряд других проблем, связанных с их индивидуальными физико-химическими характеристиками. Все чаще появляются работы, посвященные выявлению зависимости биотоксичности УНМ от их физико-химических свойств. Так, например, интересным становится вопрос о взаимодействии УНМ с водным окружением [11], а также о свойствах формируемых водных суспензий [12], по накапливающимся данным имеющим важное значение для биологической активности УНМ.

Структурирование углерода в виде наночастиц ведет к существенному изменению физико-химических характеристик образуемых соединений [75] в отличии от их макроразмерных аналогов. В частности, одним из таких проявлений является выраженная гидрофобность частиц наноуглерода, по результатам молекулярного моделирования определяемая энергией разрыва связей между молекулами воды для смачивания поверхности УНМ [76]. УНМ не способны формировать истинные водные растворы, но при помещении в воду или иные полярные растворители формируют коллоиды различной степени дисперсности [77].

Одним из вариантов решения проблемы, является использование для суспендирования УНМ поверхностно-активных веществ, способных дополнительно повышать степень дисперсности УНМ [78]. В то же время решение задачи тестирования биологической активности (токсичности) химических веществ и соединений обычно предполагает проведение подобных исследований в водной среде, адекватной для поддержания жизнеспособности и функциональной активности сенсорных микроорганизмов [3]. Поэтому еще одной проблемой в данном случае становится правильное сочетание воды и органических растворителей, не ведущее к гибели тест-организма.

Другим вариантом решения проблемы плохого смачивания УНМ является ковалентная [79] или нековалентная [80] модификации поверхности наноуглерода с достижением высоких значений гидрофилизации как условия его диагностического или терапевтического использования в живых системах. Так, антибактериальная активность С60-фуллерена может быть существенно модифицирована в результате функционализации его поверхности различными химическими группировками (аддендами) [11, 81]. В качестве основной причины, определяющей зависимость биологической активности УНМ от степени дисперсности, можно назвать увеличение их удельной поверхности, обеспечивающей множественный характер контакта частиц наноуглерода и бактериальных клеток-мишеней с формированием у последних состояния так называемого «мембранного стресса» [82].

Помимо гидрофобности частиц наноуглерода, для биологической активности важное значение имеет их размер [81]. Так, например, многостенные УНТ оказывают меньший токсический эффект по сравнению с одностенными [67]. Данный факт можно объяснить тем, что увеличение размера частиц ведет к локализации контакта бактериальных клеток на крупных частицах наноуглерода.

Однако наблюдения о роли названных характеристик в определении антибактериальных свойств УНМ носят немногочисленный характер [7], что требует продолжения и расширения исследований в обозначенном направлении.

 

2 Материалы и методы исследования

 

2.1 Материалы исследования

 

2.1.1 Углеродные наноматериалы

 

 

В качестве объектов исследования были использованы представители всех классов УНМ. Это десять электронейтральных и условно электронейтральных УНМ с различной морфологической организацией и степенью очистки от технологических примесей.

Первые три образца представляют собой одностенные углеродные нанотрубки (ОУНТ) производства фирмы «НаноКарбЛаб» (Россия) [83], содержащие от 2 % до 5 % концевых COOH-групп (ОУНТ-1), прошедшие процедуру экстракции толуолом и обработки соляной (HCl) и азотной (HNO₃) кислотами с последующим тепловым окислением на воздухе; их укороченные варианты, содержащие от 5 до 10 % концевых COOH-групп (ОУНТ-2), а также ОУНТ с отожженными под вакуумом концевыми СООН-группами (ОУНТ-3). Использованные лабораторные образцы нановолокнон (НВ) и их вариант, прошедший процедуру кислотной функционализации (фНВ) [45] любезно предоставлены проф. Э.Г. Раковым (РХТУ им. Д.И. Менделеева). Многостенные УНТ (МУНТ), С60- и С70-фуллерены, а также фуллеренол (С60(ОН)_~24) были синтезированы в Институте проблем химической физики РАН. В качестве объекта сравнения использовался аморфный углерод (АУ).

 

 

2.1.2 Биосенсор «Эколюм»

 

 

Оценка биологических эффектов проводилась с использованием бактериальной тест-системы «Эколюм».

Биосенсор «Эколюм» представляет собой лиофилизированные культуры люминесцентных бактерий, содержащиеся в среде инертных газов в специальных стеклянных флаконах, выпускаемый ЗАО НВО «Иммунотех» (Россия). Данный биосенсор создан на основе рекомбинантного штамма Escherichia coli K12 TG1, содержащий гибридную плазмиду pUC19 с клонированными luxCDABE генами Photobacterium leiognathi 54D10 [84].

E.coli принадлежит к домену Bacteria, отделу Proteobacteria, классу – Gammaproteobacteria, порядку – Vibrionales, семейству – Enterobacteriaceae, роду – Escherichia [85]. Названы в честь открывшего их в 1885 году немецкого ученого Т. Эшериха (T. Escherich), эти микроорганизмы являются постоянными обитателями толстого отдела кишечника человека и животных.

По своей морфологии E.coli – мелкие грамотрицательные палочки длинной от 2 до 3 мкм, шириной от 0,5 до 0,7 мкм с закругленными концами, в мазках располагаются беспорядочно, не образуют спор, некоторые штаммы имеют микрокапсулу, перитрихии, кроме жгутиков, иногда обнаруживаются пили. E.coli являются факультативными анаэробами. Температурный оптимум для роста 37 °С, не устойчивы к высокой температуре, при 60 °С гибель их наступает через 15 минут, при 100 °С – мгновенно [86].

Явление люминесценции у природных изолятов E.coli не регистрируется. Однако с использованием методов молекулярной генетики стала возможна разработка люминесцирующих штаммов E.coli, несущих luxCDABE-гены природных люминесцирующих микроорганизмов.

 

 

2.2 Методы исследования

 

2.2.1 Исследование смачивания углеродных наноматериалов

 

 

В качестве параметра, интегрально характеризующего взаимодействие УНМ с полярным растворителем (водой), использовали работу адгезии (англ. – work of аdhesion, W_a), определяемую по результатам экспериментального измерения равновесных краевых углов смачивания [87].

Работа адгезии – термодинамическая работа, которую необходимо совершить для разделения в равновесных условиях двух приведенных в контакт разнородных тел. Понятие адгезии самым непосредственным образом связано с поверхностной энергией тел. Поверхностное натяжение (или свободная поверхностная энергия, σ_ж-г) – это энергия, которую необходимо затратить для образования единицы новой поверхности.

Расчет работы адгезии W_a производили по формуле

                                                                                 (1)

где σ – коэффициент поверхностного натяжения воды при 20 ºС, принимаемый за 72,86∙0,001 Н/м;

     θ – усредненные значения статического краевого угла смачивания [88].

Краевой угол (θ) – это угол, который образует капля с поверхностью твердого тела со стороны жидкости, то есть угол между твердой поверхностью и касательной в точке соприкосновения фаз (рисунок 11).

Если вода на твердой поверхности образует θ меньше 90°, то такую поверхность называют гидрофильной, если θ больше 90°, то поверхность называют гидрофобной [89].

 

Краевые углы θ < 90° (а), θ = 90° (б), θ > 90° (в).

Рисунок 11 – Различные случаи неполного смачивания

Для определения краевых углов смачивания заранее формировали поверхности из частиц УНМ. Полоски слюды помещали в термостат, на предварительно выровненную с помощью уровня поверхность, затем на них наносили по 20 мкл суспензий исследованных наноматериалов и оставляли в нем при температуре 37 °С до полного высыхания. Данную процедуру повторяли несколько раз, для формирования равномерной поверхности УНМ. После чего на сформированные поверхности наносили по 2 мкл дистиллированной воды при температуре окружающей среды от 20 ºС до 21 ºС и после установления устойчивого контакта капли с исследуемой поверхностью осуществляли фотодокументирование (рисунок 12).

 

 

Рисунок 12 – Результат исследования процесса смачивания поверхности наноуглерода (на примере препарата С70) и алгоритм определения величин краевых углов смачивания

 

Исследование смачивания УНМ водой было несколько затруднено гистерезисными явлениями, основной причиной которых являлся выраженный микрорельеф сформированных поверхностей. В этой связи для каждого из исследованных образцов наноуглерода было проведено как мининум пять отдельных измерений, сформировавших ограниченный разброс полученных данных.

 

 

2.2.2 Исследование дисперсности суспензий углеродных наноматериалов

 

 

УНМ формируют полидисперсные суспензии, состоящие из частиц разного размера. В практике физико-химических исследований наибольшее распространение получили методы седиментационного анализа, основанные на определении скорости оседания частиц под действием силы тяжести. Для проведения седиментационного анализа недостаточно силы земного тяготения. Последнюю заменяют более значительной центробежной силой центрифуг и ультрацентрифуг. Идея этого метода принадлежит И.В. Думанскому (1912 г.), который впервые применил центрифугу для осаждения коллоидных частиц [90].

Перед исследованием способности к седиментации производилась подготовка образцов наноформ углерода. Для создания суспензий наноуглерода их навески помещали в стеклянные емкости и вносили химически чистую дистиллированную воду или апротонный растворитель –      диметилсульфоксид (ДМСО), интенсивно перемешивали пипетированием, после чего в течение    30 минут обрабатывали ультразвуком частотой 35 кГц в источнике ванного типа «Сапфир ТТЦ» (ЗАО ПКФ «Сапфир», Россия). После чего суспензии подвергались седиментации при центрифугировании («MiniSpin», Eppendorf, Германия) со значениями 100, 1000 и 10000 g с последующей аппаратной оптической оценкой супернатанта и выражением доли осевших частиц в процентах от оптической плотности исходной (неседиментировавшей) суспензии.

При исследовании спектров поглощения суспензий УНМ измерения проводились с использованием классического исследовательского спектрофлуориметра «Флюорат-02 Панорама» (НПФ «Люмекс», Россия), предназначенного для широкого круга научных и методических исследований спектрально-временных характеристик люминесценции самых разнообразных объектов (рисунок 13).

 

Рисунок 13 – Спектрофлюориметр Флюорат-02-Панорама

 

Управление прибором осуществляли от внешнего компьютера. Математическую обработку результатов измерений осуществляли средствами поставляемого программного обеспечения для проведения автоматизированных спектрально-временных измерений.

Измерения в данной работе проводились в фотометрическом режиме в диапазоне от 400 до 600 нм с шагом 2 нм. Суспензии исследуемых соединений помещали в кварцевые кюветы (НПФ «Люмекс», Россия) с оптическим путем 1 см и объемом 3 мл. Кюветы заполнялись до уровня обеспечивающего прохождение светового излучения через весь слой раствора.

При исследовании спектров поглощения оценивали оптическую плотность кажущуюся, представляющую собой меру непрозрачности слоя вещества для световых лучей и рассчитанную по формуле

                                                                                                (2)

где I₀ – интенсивность света, прошедшего через кювету с контрольным раствором (дистилированная вода или ДМСО) и измереннного с помощью фотоприемника;

       I – интенсивность света, прошедшего через кювету с суспензией исследуемого образца и измеренного с помощью фотоприемника.

Затем для каждого УНМ осуществляли расчет пороговых значений радиуса (r) частиц, седиментирующих при определенном значении ускорения силы тяжести (g), по формуле

                                             ,                                     (3)

где U_сед – скорость седиментации частицы, см/с;

     т – масса частицы, кг;

     ρ и ρ₀ – плотность дисперсной фазы и дисперсионной среды, кг/м³;

     η – вязкость среды, кг/м∙с.

Известно, что при равномерном движении частицы скорость седиментации определяется отношением высоты оседания ко времени оседания частицы по формуле

                                               ,                                                   (4)

где Н – высота оседания, м;

       t – время оседания, с;

в то же время, массу сферической частицы можно определить по значениям ее радиуса и плотности по формуле

                                               .                                                   (5)

Подставив приведенные выше выражения для U_сед и m в уравнение (3), получили расчетную формулу

                               .                  (6)

Из выражения (6), для определения значений радиуса частиц составили расчетную формулу

                                            .                                             (7)

При этом для расчета порогового радиуса частиц в суспензиях использовали справочные значения вязкости воды (η_в) и ДМСО (η_Д), и плотности растворителей (воды (ρ_в) и ДМСО (ρ_Д)) и УНМ (таблица 1) [91]. Время центрифугирования («MiniSpin», Eppendorf, Германия) составляло 600 с, а высота оседания частиц (Н) – 0,024 м.

Так, например, расчет порогового радиуса частиц ОУНТ, суспендированных в воде, седиментирующих при ускорении свободного падения равном 100 g осуществлялся по формуле

                             м.                   (8)

 

Таблица 1 – Справочные данные вязкости растворителей и плотности растворителей и УНМ, использованных при расчете порогового радиуса частиц, седиментирующих при определенном значении ускорения свободного падения, равным 100; 1000 и 10000 м/с²

 

Растворитель/УНМ	Значение показателя
Плотность (ρ), кг/м3
Вода	998,2
ДМСО	1101,4
АУ	2260
ОУНТ	1400
МУНТ	1800
НВ/НВФ	2000
С60/С70/С60(ОН)~24	1680
Вязкость (η), кг/м∙с
Вода	1,002∙10-3
ДМСО	1,996∙10-3

 

 

 

2.2.3 Методика определения биологической активности углеродных наноматериалов

 

 

Биолюминесцентный анализ – один из перспективных методов исследования, в основе которого лежит использование природных или генно-инженерных люминесцирующих микроорганизмов, а также выделенных из них ферментных систем генерации свечения [92]. Данный метод основан на измерении уровня биолюминесценции тест-систем, инкубируемых в контакте с анализируемым раствором относительно уровня биолюминесценции тех же бактерий, находящихся в контрольном растворе, не содержащем токсичных веществ.

Уровень интенсивности биолюминесценции измеряется специальными приборами – биолюминометрами. В настоящее время разработаны биохемилюминесцентные анализаторы различных назначений и конструкций. Эти приборы являются одно и много кюветными автоматическими анализаторами, управляемыми встроенными микропроцессорами и современными персональными компьютерами. Биолюминометры могут иметь термостатированное кюветное отделение, в котором заданная температура поддерживается с использованием полупроводниковых термоэлектрических охлаждающих модулей. В отдельных приборах предусмотрено перемешивание реагентов в измерительной кювете. Принцип действия биолюминесцентных анализаторов основан на регистрации светового излучения в видимой сине-зеленой области спектра от 420 до 600 нм с максимумом при 495 нм, возникающего в люминесцирующих бактериях при специфических ферментативных реакциях.

При регистрации биолюминесценции нами использовался микропланшетный люминометр LM-01Т («Immunotech», Чехия) (рисунок 14).

Данная модель предназначена для измерения люминесценции при комнатной температуре либо при 37 ^оC в клинических, биохимических и аналитических лaбopaтopияx. Предлагается два типа программного обеспечения: LIANA и KILIA для выбора метода измерения, оценки и архивирования данных. Нами использовалась программа KILIA, представляющая собой операционную систему Windows 95 или 98, предназначенную для динамического измерения любых типов люминесценции, всесторонней характеристики измеренных кривых, записи данных и манипуляций с ними.

 

 

Рисунок 14 – Микропланшетный люменометр LM-01T

 

Критерием токсического действия является изменение интенсивности биолюминесценции тест-объекта в исследуемой пробе по сравнению с контрольной, не содержащей токсических веществ.

Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту. Токсическое действие исследуемой пробы наноматериала на бактерии определяется по ингибированию их биолюминесценции за 30-ти минутный (в экспрессном варианте – 5 минут) период экспозиции (при необходимости экспозиция может быть увеличена до 1 или 2 часов). Количественная оценка параметра тест-реакции выражается в виде индекса токсичности (Т), безразмерной величины, рассчитываемой по формуле

                                                   ,                                           (9)

где Iо и I – интенсивность свечения контроля и опыта, соответственно, при фиксированном времени экспозиции исследуемой пробы с тест-объектом.

Кроме того, для оценки токсичности проб также используют биолюминесцентный индекс (БЛИ), рассчитываемый как отношение интенсивности свечения в опытной пробе к интенсивности свечения в контрольной пробе по указанной формуле

                                                                                                    (10)

где I₀ – интенсивность свечения в опытной кювете;

     I_k – интенсивность свечения в контрольной кювете.

Индекс токсичности (Т) и биолюминесцентный индекс (БЛИ) – это два аналогичных параметра с той лишь разницей, что отсчет при использовании индекса токсичности проводится от нуля, а при использовании биолюминесцентного индекса – от единицы. При этом расчет с помощью биолюминесцентного индекса позволяет определять значения токсичности, когда интенсивность свечения в контрольной пробе меньше интенсивности свечения в опытной пробе.

При проведении расчета в нашем случае использовали иной математический алгоритм (9), который учитывает, что УНМ формируют полидисперсные системы, способные экранировать свет, идущий от источника света, что может привести к искажению результатов биолюминесцентного анализа. Формула (11) позволяет нивелировать данный оптический эффект УНМ:

                                                                          (11)

где I_k и I_o – интенсивность свечения контрольных и опытных проб на 0-ой и           n-ой минутах измерения.

В соответствии с действующими нормативами изменение биолюминесценции не более чем на 20 % по отношению к контролю позволяло оценивать пробы как нетоксичные, от 20 % до 50 % – как токсичные и более  50 % – как сильно токсичные (рисунок 15).

Зависимость БЛИ от концентраций исследуемых образцов позволяет для каждого из анализируемых образцов определить два параметра – EC₂₀ и EC₅₀ (ЕС – эффективная концентрация), соответствующих распространенным токсикологическим параметрам LD₂₀ и LD₅₀ соответственно (LD – летальная доза) [93]. Параметры ЕС₂₀ и ЕС₅₀ показывают, при каких концентрациях исходного слабо токсического образца достигается установленный предел токсичности (LD₂₀ и/или LD₅₀) или при каких разведениях сильно токсический образец станет безопасным (величины менее LD₂₀). Все значения величин менее ЕС₂₀ свидетельствуют о том, что образец безвреден для человека.

Перед биотестированием необходимо провести предварительную подготовку посуды, рабочего места и образцов наноматериалов для исследования их на токсичность. Все процедуры предварительной подготовки должны исключать попадание посторонних токсичных, органических и каких-либо других веществ в исследуемый образец.

 

 

Рисунок 15 – Пределы значений биолюминесцентного индекса для определения токсичности образца

 

При создании суспензий УНМ их навески в количестве 4 мг (в случае нанотрубок, НВ и АУ) или 4 мМ (в случае фуллеренов) помещали в стеклянную емкость, куда вносили по 1 мл дистиллированной воды или ДМСО. После чего суспензии обрабатывали ультразвуком частотой 35 кГц в источнике ванного типа (ЗАО ПКФ «Сапфир», Россия) в течение 30 минут.

При проведении биотестирования суспензии УНМ в объеме 10 мкл вносили в ячейки 96-луночных планшетов из непрозрачного пластика («Thermo», США), предварительно заполненные 190 мкл дистиллированной воды, а из полученных смесей готовили серии двукратных серийных разведений до 1:1024 включительно в объеме по 100 мкл, в зависимости от исходного характера суспензии используя в качестве растворителя дистиллированную воду или 2,5 % раствор ДМСО. Соответствующим образом формировали контроли, не содержащие исследуемые УНМ. На следующем этапе в каждую ячейку вносили по 100 мкл бактериального биосенсора, после чего планшеты помещали в измерительный блок люминометра LM-01Т («Immunotech», Чехия), динамически регистрируя интенсивность свечения полученных смесей в течение 180 минут с интервалом 5 минут.

Биотестирование с использованием биосенсора «Эколюм» предполагает соблюдение инструкции, включающей:

• вскрытие флакона с лиофилизированным биореагентом. Для получения суспензий бактерий добавление 10 мл охлажденной до 8 ^оС дистиллированной воды. Желательно использовать стерилизованную дистиллированную воду. Рекомендуется несколько раз встряхнуть флакон с суспензией бактерий;
• хранение суспензий бактерий в холодильной установке в течение 30 минут при температуре плюс 4 ^оС;
• доведение температуры суспензий бактерий до комнатной температуры (25 ^оС). Рекомендуется перемешивание рабочих суспензий бактерий перед отбором определенных объемов для проведения анализа.

Если у биосенсора истек гарантийный срок хранения и/или он стал плохо растворяться в охлажденной дистиллированной воде, рекомендуется более энергично его встряхивать и отфильтровать суспензию бактерий через бумажный фильтр. Биосенсор, содержащийся при температуре от 2 ^оС до 4 ^оС, имеет гарантированный срок хранения не менее шести месяцев.

 

 

2.2.4 Статистические методы исследования

 

 

Для анализа результатов был использован регрессионный анализ. Данная форма статистического анализа позволяет оценить степень связи между переменными, предлагая механизм вычисления предполагаемого значения переменной из нескольких уже известных значений. В рамках регрессионного анализа были построены регрессии, позволяющие графически отображать тенденцию изменения данных на основании нескольких значений. Кроме того были построены границы регрессии, позволяющие указать доверительные границы для выбранной линии регрессии.

Для определения силы влияния каждого из использованного нами способа диспергирования суспензий УНМ была проведена процедура дисперсионного анализа. Дисперсионный анализ можно определить как статистический метод, предназначенный для оценки влияния различных факторов на результат эксперимента, а так же для последующего планирования экспериментов.

Оба варианта анализа были выполнены с использованием одного из наиболее известных в России пакетов для прикладного статистического анализа данных STATISTIKA 6. Это универсальная интегрированная система, предназначенная для статистического анализа и обработки данных [95].

В качестве другого статистического метода использован корреляционный анализ – метод обработки статистических данных, с помощью которого измеряется теснота связи между двумя или более переменными. В ходе работы рассчитывали коэффициент корреляции, применив компьютерную программу SPSS (с англ. «Statistical Package for the Social Sciences» – «статистический пакет для социальных наук»), которая является одним из лидеров рынка в области коммерческих статистических продуктов.

3 Результаты и их обсуждение

 

 

Актуальность исследования антибактериальной активности УНМ определяется тем, что микроорганизмы являются важными компонентами природных экосистем и трофических цепей, в связи с чем рассматриваются в качестве инструмента оценки рисков при поступлении УНМ в среду обитания человека [3]. Кроме того, все возрастающее производство УНМ, создание на их основе нового поколения наноматериалов и нанопокрытий [96] с антибактериальными свойствами также диктует необходимость исследования и контроля формируемой активности.

Особый интерес представляет выявление зависимости антибактериальных свойств от физико-химических характеристик УНМ, определяющих характер их взаимодействия с живыми системами [9].

В настоящее время во многих странах мира ведутся разработки методов оценки биотоксичности УНМ, в том числе методом биолюминесцентного анализа. В частности, действующий национальный норматив по микробиологической и молекулярно-генетической оценке наноматериалов [73] рекомендует использование для заявленных целей рекомбинантного люминесцирующего штамма E.coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE-генами Photobacterium leiognathi.

Поэтому в нашей работе мы исследовали значение дисперсности водных суспензий УНМ, определяемой их собственными физико-химическими особенностями или достигаемой использованием специальных методов суспендирования, для развития токсического эффекта ноноуглерода в отношении сенсорного люминесцирующего микроорганизма Escherichia coli.

 

 

3.1 Исследование гидрофильно-гидрофобных характеристик суспензий УНМ

 

 

На первом этапе работы нами были оценены гидрофильно-гидрофобные характеристики суспензий УНМ, так как они могут лежать в основе параметров диспергирования и стабилизации суспензий.

Полученные результаты свидетельствовали о закономерных изменениях степени смачиваемости исследованных УНМ в зависимости от уровня их структурированности и наличия на поверхности карбоксильных (-COOH), гидроксильных (-OH) и других полярных групп (рисунок 16). В частности, по сравнению с АУ, значения краевых углов смачивания которого составляли (33,8±0,9)°, его структурирование приводило к выраженному увеличению гидрофобности с соответствующим снижением величин работы адгезии (таблица 2) в препаратах. Так, снижение величин W_a, по сравнению с АУ, в случае с относительно хорошо смачиваемыми ОУНТ-2 и ОУНТ-1 находилось в пределах 6 Н/м до значений (132,7±0,4) Н/м и (127,7±0,7) Н/м соответственно. Что касается УНМ, на поверхности которых капля образует краевые углы смачивания больше 90°, оцененных нами как гидрофобные, то для ОУНТ-3 было достигнуто значение работы адгезии равное (58,3±9,7) Н/м, а для наиболее гидрофобных НВ – (22,6±0,7) Н/м. В то же время исследование смачивания гидрофильных фНВ показало, что значение величины W_a в данном случае превышало таковое у АУ, и составляло (139,2±2,3) Н/м.

Наконец, в случае с фуллеренами, наиболее гидрофильным оказался фуллеренол со значением W_a (134,0±0,6) Н/м и углом (29,1±0,5)°, наименее – С70 со значением W_a (114,5±3,1) Н/м и углом (55,1±2,2)°.

 

 

Рисунок 16 – Краевые углы смачивания поверхности углеродных наноматериалов на примере ОУНТ-3 (А), ОУНТ-2 (Г), НВ (Б), фНВ (Д), С60 (В) и С60(ОН)_~24 (Е)

 

Таблица 2 – Количественная характеристика гидрофильности/гидрофобности УНМ, выраженная в величинах работы адгезии (W_a)

 

Исследованные углеродные наноматериалы	Угол, °	Wa, Н/м
ОУНТ-1	(41,1±1,2)	(127,7±0,7)
ОУНТ-2	(34,8±0,7)	(132,7±0,4)
ОУНТ-3	(101,6±1,2)	(58,3±9,7)
МУНТ	(71,7±0,4)	(95,5±5,2)
НВ	(133,9±6,9)	(22,6±0,7)
фНВ	(24,7±1,3)	(139,2±2,3)
С60	(48,5±0,8)	(121,1±3,5)
С60(ОН)~24	(29,1±0,5)	(134,0±0,6)
С70	(55,1±2,2)	(114,5±3,1)
АУ	(33,8±0,9)	(133,3±1,9)

 

Из выше сказанного следует, что насыщение поверхности УНМ полярными группировками различного химического состава значимо повышало их гидрофильность, что было наиболее характерно для фНВ и фуллеренола, смачиваемость которых водой, превосходила таковую у препарата АУ.

Таким образом, структурирование углерода в виде наночастиц ведет к существенному изменению физико-химических характеристик образуемых соединений. В частности, одним из таких проявлений является выраженная гидрофобность частиц наноуглерода, что подтверждают результаты настоящего исследования: большинство исследованных УНМ оказались несмачиваемыми или ограниченно смачиваемыми. Полученные данные свидетельствуют о том, что насыщение поверхности УНМ полярными группами существенно повышает степень их смачивания.

 

 

3.2 Исследование размерных характеристик углеродных наноматериалов

 

 

Известно, что УНМ формируют полидисперсные системы, поэтому для определения фракционного состава таких суспензий нами был проведен их седиментационный анализ (рисунок 17), который позволил оценить их как характеризующиеся широким диапазоном и различным вероятностным распределением размера частиц (таблица 3).

По оси абсцисс – режим центрифугирования; по оси ординат – доля частиц в суспензиях в процентах.

Рисунок 17 – Результаты седиментационного анализа водных суспензий УНМ на примере ОУНТ-3 (белые столбики) и ОУНТ-2 (закрашенные столбики) – слева; С60 (белые столбики) и С60(ОН)_~24 (заштрихованные столбики) – справа

 

Так, более 90 % частиц высоко структурированных ОУНТ-3 и МУНТ, оседали под действием 100 g, в то время как около 20 % частиц более гидрофильных ОУНТ-1 и ОУНТ-2 не седиментировали даже после центрифугирования на 10 000 g. Однако, не смотря на гидрофобность НВ, их суспензии были относительно устойчивы, по сравнению с ОУНТ-3 и МУНТ, что может быть объяснено несколько меньшим размером частиц в них.

Одновременно с этим, проводилось вычисление пороговых значений радиуса частиц, седиментирующих при определенных значениях ускорения свободного падения g, для этого использовалась расчетная формула (6), определение радиуса частиц осуществлялось с использованием известных значений (см. 2.2.3 Исследование дисперсности суспензий УНМ).

При этом ряд высокоструктурированных соединений наноуглерода (ОУНТ, МУНТ) формировал преимущественно грубодисперсные системы из микроразмерных частиц со средним расчетным радиусом более 1000 нм, предположительно представляющих собой агрегаты нанотрубок или нановолокон. На этом фоне насыщение поверхности подобных соединений полярными группировками, сопровождающееся их укорочением, значимо повышало дисперсность суспензий ОУНТ-2 и фНВ, по своим характеристикам приближающихся к седиментационно устойчивым коллоидным системам.

 

Таблица 3 – Соотношение доли частиц водных суспензий УНМ с пороговыми значениями их радиуса

В процентах

УНМ	100g	1 000g	10 000g	Более 10 000g
r >, мкм	2,119	0,670	0,212	0,067
ОУНТ-1	40,99	17,17	23,41	18,43
ОУНТ-2	45,35	13,55	22,10	19,00
ОУНТ-3	93,80	1,20	5,00	0,00
r >, мкм	1,500	0,474	0,150	0,047
МУНТ	90,97	7,66	1,09	0,29
r >, мкм	1,342	0,424	0,134	0,042
НВ	27,93	21,13	44,93	6,01
фНВ	0,00	13,51	72,96	13,53
r >, мкм	1,626	0,514	0,163	0,051
C60	4,00	21,00	57,00	18,00
С60(ОН)~24	2,00	8,00	60,45	29,55
C70	15,60	44,87	17,55	21,98
r >, мкм	1,196	0,378	0,120	0,038
АУ	0,00	0,00	100,00	0,00

 

Сходные распределения были зарегистрированы и для суспензий С60- и С70-фуллеренов, частицы которых более чем тысячекратно превышали размер их одиночных молекул и являлись результатом их выраженной агрегации в водном окружении. В случае же фуллеренола насыщение его поверхности гидроксильным группами в сравнении с С60-фуллереном почти двукратно уменьшало размер частиц в водной суспензии.

Визуализация частиц УНМ, осажденных из сформированных суспензий осуществлялась с использованием атомно-силовой микроскопии (АСМ) (рисунок 18). В частности, препарат одностенных укороченных углеродных нанотрубок (ОУНТ-2) был визуализирован в виде одиночных образований шириной/высотой от 2,7 до 20 нм (7,3±4,4) и длиной от 0,2 до 1,6 мкм (1,0±0,5) (рисунок 18 А), что хорошо согласовывалось с приведенными выше данными седиментационного анализа. На этом фоне частицы функционализированных углеродных нановолокон (фНВ) с использованием АСМ были оценены как несколько более крупные спирально скрученные образования шириной/высотой от 52,0 до 114,0 нм (101,6±23,3) и длиной от 0,3 до 2,0 мкм (1,4±0,6) (рис. 18 Б). Наконец, частицы фуллеренола (С60(ОН)_~24) были представлены округлыми образованиями диаметром от 50,5 до 230,0 нм (170,2±29,0), в соответствии с проведенными расчетами представляющими собой агрегаты из нескольких тысяч молекул (рисунок 18 В).

 

 

Рисунок 18 – АСМ-изображения частиц ОУНТ-2 (А), фНВ (Б) и С60(ОН)_~24 (В)

 

Кроме того, был поставлен вопрос о зависимости степени дисперсности водных суспензий УНМ от степени их смачиваемости полярными растворителями (водой). Результаты корреляционного анализа свидетельствовали о существовании выраженной обратной зависимости         (r=-0,660; P<0,05) между средним расчетным радиусом частиц наноуглерода в водной суспензии и экспериментально зафиксированными для них значениями W_a (рисунок 19).

 

 

Рисунок 19 – Зависимость среднего размера частиц УНМ (Rср) в суспензии (по оси ординат) от характеризуемой величиной W_a гидрофобности их поверхности (по оси абсцисс)

 

Таким образом, во всей исследуемой выборке УНМ могла быть продемонстрирована следующая зависимость: чем лучше смачиваемой была поверхность индивидуального соединения наноуглерода, тем более мелкодисперсной оказывалась его водная суспензия. Одновременно следует отметить, что при сходных значениях смачиваемости исследованные образцы углеродных нанотрубок формировали более крупнодисперсные суспензии, что может объясняться дополнительным участием в их агрегации сил молекулярного взаимодействия Ван-дер-Ваальса, менее значимых в суспензиях нановолокон и фуллеренов.

 

 

3.3 Исследование биологических эффектов углеродных наноматериалов методом биолюминесцентного анализа

 

 

Перед проведением биолюминесцентного анализа, с помощью АСМ был подтвержден факт контакта УНМ с клетками тест-объекта (рисунок 20). При этом использование АСМ визуализировало результат подобного взаимодействия наиболее дисперсных ОУНТ-2 и фНВ (рисунок 20 А, Б) как множественный по количеству и вариативный по расположению относительно бактериальной поверхности контакт частиц наноуглерода по всему периметру бактериальной клетки. В свою очередь аналогичное взаимодействие частиц фуллеренола с бактериальными клетками (рисунок 20 В) имело единичный характер, что корреспондировалось известными представлениями об отсутствии у данного соединения выраженной антимикробной активности [97].

Биологическая активность исследуемых наноматериалов оценивалась в тестах тушения биолюминесценции сенсорного штамма E.coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE-генами природного морского люминесцирующего микроорганизма Photobacterium leiognathi (таблица 4). При этом полученные результаты свидетельствовали о том, что в сходных по структуре группах углеродных наноматериалов (одностенные углеродные нанотрубки, нановолокна, фуллерены) значения регистрируемой токсичности были обратно пропорциональны размеру частиц наноуглерода в исследуемой суспензии.

 

 

Рисунок 20 – АСМ-изображения пространственных контактов частиц ОУНТ-2 (А), фНВ (Б) и С60(ОН)_~24 (В) с клетками E.coli K12 TG1

 

Так, исследование биологической активности УНТ показало, что в сравнении с исходным образцом ОУНТ-1, процесс функционализации, заключающийся в насыщении поверхности полярными группировками и укорочении нанотрубок, приводит к увеличению токсичности образца ОУНТ-2 до значений ЕС₂₀ равного (22,4±1,1) мкг/мл и ЕС₅₀ равного (54,0±2,8) мкг/мл, что в сравнении с прочими УНМ заставляло рассматривать их как одни из наиболее биотоксичных. И наоборот, отжиг СООН-групп с поверхности УНТ ведет к увеличению гидрофобности частиц в суспензии и снижению токсичности образца ОУНТ-3. Увеличение количества слоев в структуре УНТ, также увеличивает размер частиц в суспензии, что результируется в еще большем снижении биологической активности МУНТ, что позволяет оценить образец в данной постановке экспериментов как нетоксичный.

В группе нановолокон насыщение поверхности полярными группировками с одновременным расщеплением исходных НВ на более короткие фрагменты, также вело к выраженному увеличению регистрируемой биологической активности. При этом исходный образец нановолокон (НВ) оценен как нетоксичный. В то же время, формирующий мелкодисперсную коллоидную систему образец фНВ, характеризующийся значениями ЕС₂₀ равным (8,5±0,1) мкг/мл и ЕС₅₀ равным (42,0±1,3) мкг/мл к 180-й минуте контакта с сенсорным микроорганизмом, проявил себя как сильно токсичный, уступая по данному параметру лишь АУ с величинами ЕС₂₀ и ЕС₅₀, равным соответственно (8,1±0,1) и (40,0±2,0).

 

Таблица 4 – Значения токсикологического параметра ЕС₂₀ и ЕС₅₀, определенные для сформированных в воде суспензий УНМ при оценке их влияния на уровень биолюминесценции сенсорного штамма E.coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE-генами P.leognathi

В микрограммах на миллилитр (миллимолях)

Исследованные углеродные наноматериалы	ЕС20	ЕС50
ОУНТ-1	(30,2±1,6)	(62,0±3,6)
ОУНТ-2	(22,4±1,1)	(54,0±2,8)
ОУНТ-3	(50,3±5,0)	(78,3±3,9)
МУНТ	(99,1±0,5)	>100
НВ	(90,6±0,5)	>100
фНВ	(8,5±0,1)	(42,0±1,3)
С60	>100	>100
С60(ОН)~24	>100	>100
С70	(70,7±3,5)	>100
АУ	(8,1±0,1)	(40,0±2,0)

 

Наконец исследованные водные суспензии С60- и С70-фуллерена также не вызывали тушения использованного сенсорного микроорганизма, проявляя себя как нетоксичные соединения наноуглерода. При этом увеличение степени дисперсности суспензий фуллеренола в использованном диапазоне концентраций в данной биоиндикационной системе не вело к формированию детектируемой биотоксичности, что дополнительно подтверждают относительную инертность данной группы УНМ.

Вероятной причиной обозначенных зависимостей представляются различия в величине удельной поверхности тестируемых соединений наноуглерода, прогрессивно возрастающей с уменьшением размера частиц в суспензии и увеличивающей возможность пространственного контакта УНМ с поверхностью бактериальных клеток-мишеней как инициального этапа реализации их биологической активности [97, 98].

Так полученные результаты АСМ позволили констатировать, что до (64,5±17,4) укороченных ОУНТ формировали пространственный контакт с клетками E.coli K12 TG1, оставаясь в качестве свободного компонента суспензии в (35,5±17,6) случаев. Возникающие же при этом взаимодействия оказывались достаточно разнообразны и варьировали от параллельного до перпендикулярного поверхности модельного микроорганизма расположения ОУНТ-2. При этом проведенный морфометрический анализ не позволил выявить какой-либо преимущественной ориентации нанотрубок, оцениваемой углом контакта их концевых участков с клеточной поверхностью и свидетельствующей о достаточно вероятностном характере подобных событий. Так (38,2±18,0) укороченных ОУНТ, установивших контакт с поверхностью E.coli, располагались к ней по касательной или под углом от 0º до 25º, в то время как перпендикулярно поверхности или под углом от 65º до 90º находилось до (23,9±12,1) от визуализированных ОУНТ-2.

Сходные результаты получены и при исследовании контакта фНВ с клетками E.coli K12 TG1, имеющего достаточно вероятностный характер в плане расположения относительно плоскости бактериальной поверхности. С другой стороны, как и в случае с ОУНТ-2, не выявлено какого-либо преимущественного сродства концевых участков фНВ к бактериальной поверхности, а также не визуализированы морфологические признаки ее «прокола» с излитием внутриклеточного содержимого во внешнюю среду.

Напротив, при анализе контактов фуллеренола с клетками E.coli K12 TG1, было показано, что данное явление имело единичный характер, что дополнительно подтверждает его инертность в данной биоиндикационной системе.

В целом же полученные данные позволили частично связать биологическую активность (биотоксичность) углеродных наноматериалов со степенью их сродства к полярным растворителям, а через нее – с достигаемым уровнем дисперсности водных суспензий УНМ, характеризуемым средним размером частиц наноуглерода в суспензии. При этом именно последний параметр оказывался наиболее значимым для определения уровня биотоксичности УНМ.

 

К – контроль; по оси абсцисс – время контакта, минут; по оси ординат – регистрируемые значения интенсивности свечения (I).

Рисунок 21 – Пример динамики свечения E.coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE-генами P.leiognathi при контакте с водной суспензией фНВ, использованной в концентрациях 100 (1), 50 (2), 25 (3) 12,5 (4), 6,25 (5) мкг/мл

 

Полученные результаты кинетического измерения свечения наноуглерода свидетельствовали о том, что для развития эффекта необходим определенный промежуток времени (рисунок 21), что характерно для всех использованных УНМ. К тому же, показано, что функционализация УНМ приводит к увеличению их биологической активности. Исследование биологической активности УНМ, суспендированных в воде с использованием E.coli позволило зафиксировать значения ЕС₂₀ для 8, а ЕС₅₀ для 5 из исследованных нами УНМ.

Полученные результаты позволили ранжировать исследуемые соединения наноуглерода по выраженности их токсического эффекта на сенсорный люминесцирующий штамм E.coli K12 TG1 в ряд: C60 < С60(ОН)_~24 < C70 < МУНТ < НВ < ОУНТ-3 < ОУНТ-1 < ОУНТ-2 < НВФ < АУ.

 

 

3.4 Исследование влияния растворителя на достигаемую степень дисперсности суспензий УНМ

 

 

На следующем этапе работы для разобщения кластеров УНМ и формирования более мелкодисперсных систем было предложено использование апротоннного растворителя ДМСО с меньшей, чем у воды диэлектрической проницаемостью (ε_дмсо=45 против ε_вода=81) для приготовления суспензий УНМ.

Белые столбики – водные суспензии; закрашенные – суспензии в ДМСО; по оси абсцисс – режим центрифугирования; по оси ординат – доля частиц в суспензиях в процентах.

Рисунок 22 – Результаты седиментационного анализа суспензий УНМ на примере ОУНТ-3 – слева и ОУНТ-2 – справа

 

Так, в случаях с высоко структурированными ОУНТ-3 (рисунок 22), МУНТ внесение ДМСО сказалось незначительно на степени дисперсности их суспензий, однако позволило зарегистрировать для них значения ЕС₅₀ равные (46,3±2,9) мкг/мл и (28,6±0,1) мкг/мл соответственно. В то же время, использование ДМСО для приготовления суспензий ОУНТ-1 и ОУНТ-2 более значимо повышало их дисперсность, особенно в случае с укороченными УНТ, приводя к тому, что более 50 % частиц ОУНТ-2 не седиментировало после центрифугирования на 10000 g. Что касается фНВ, то повышение доли крупноразмерных частиц в суспензиях с ДМСО объясняется гидрофильностью данного образца (таблица 5).

Одновременно с определением выше описанных зависимостей, использование апротонного растворителя позволило констатировать рост биотоксичности УНМ выявляемой у 9 из 10 исследованных соединений наноуглерода (таблица 6).

Таблица 5 – Соотношение доли частиц ДМСО суспензий УНМ с пороговыми значениями их радиуса

В процентах

УНМ	100g	1 000g	10 000g	Более 10 000g
r >, мкм	2,119	0,670	0,212	0,067
ОУНТ-1	33,92	8,71	33,65	23,71
ОУНТ-2	0,00	0,00	40,00	60,00
ОУНТ-3	91,83	6,04	2,14	0,00
r >, мкм	1,500	0,474	0,150	0,047
МУНТ	92,43	7,22	0,20	0,15
r >, мкм	1,342	0,424	0,134	0,042
НВ	44,76	43,83	8,84	2,56
фНВ	33,95	18,84	35,59	11,61
r >, мкм	1,626	0,514	0,163	0,051
C60	35,00	19,00	39,50	6,50
С60(ОН)~24	0,48	6,49	1,69	91,34
C70	80,38	9,60	6,46	3,57
r >, мкм	1,196	0,378	0,120	0,038
АУ	7,00	9,00	67,00	17,00

 

Так, оцененные нами как нетоксичные водные суспензии МУНТ, НВ, С60 и С70, в данной постановке экспериментов, позволили зафиксировать достаточно низкие значения ЕС₅₀, что говорит о высокой токсичности подобным образом сформированных суспензий.

Таблица 6 – Значения токсикологического параметра ЕС₂₀ и ЕС₅₀, определенные для сформированных в ДМСО суспензий УНМ при оценке их влияния на уровень биолюминесценции сенсорного штамма E.coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE-генами P.leognathi

В микрограммах на миллилитр (миллимолях)

Исследованные углеродные наноматериалы	ЕС20	ЕС50
ОУНТ-1	(12,7±0,6)	(18,3±0,7)
ОУНТ-2	(10,2±4,6)	(17,2±0,9)

 

Продолжение таблицы 6

ОУНТ-3	(30,1±1,3)	(46,3±2,9)
МУНТ	(23,4±0,1)	(28,6±0,1)
НВ	(14,2±0,6)	(20,4±1,0)
фНВ	(5,0±0,1)	(9,2±0,1)
С60	(72,1±3,6)	(84,1±4,3)
С60(ОН)~24	>100	>100
С70	(44,1±2,1)	(50,4±2,5)
АУ	(4,3±0,1)	(8,3±0,1)

 

При этом непротиворечивость подобного результата подтверждали данные корреляционного анализа, свидетельствующего о взаимозависимости токсикологических параметров ЕС₅₀ (r=0,653, P<0,05), определенных в сериях экспериментов без и с использованием ДМСО (рисунок 23).

 

Рисунок 23 – Взаимозависимости токсикологических параметров ЕС₅₀, определенных в сериях экспериментов без (по оси абсцисс) и с использованием ДМСО (по оси ординат)

 

Полученные результаты в экспериментах с апротонным растворителем позволили сформулировать два возможных механизма его действия: 1) ДМСО действует на УНМ, повышая дисперсность суспензий и 2) ДМСО действует на поверхностные структуры клеток, изменяя их свойства, тем самым способствуя большему проникновению УНМ в клетки, а, следовательно, к повышению биологической активности. Для этого была проведена серия экспериментов: суспензии УНМ, сформированные в воде и ДМСО смешивали с клетками тест-объекта, суспендированном так же в воде и ДМСО. В итоге было показано, что применение ДМСО в качестве растворителя повышало дисперсность суспензий УНМ, не вызывая изменений в поверхностных структурах бактериальных клеток. Наоборот, суспендирование бактерий в ДМСО снижало активность УНМ, вследствие адаптации клеток к растворителю.

Совокупность полученных результатов явилась основанием для постановки вопроса о значимости дисперсности различным образом сформированных суспензий наноуглерода в определении их биологической активности на всю исследуемую выборку УНМ, представленную разнородными по морфологической организации соединениями. Однако, рассчитанная для этого зависимость уровня биотоксичности УНМ (ЕС₅₀) от их размерных характеристик (средние значения радиуса частиц в суспензии, Rср.), принципиально подтвердив описанные выше тенденции, заставила констатировать достаточно низкое номинальное значение связывающего данные параметры парного коэффициента корреляции (r=0,272; P>0,05) (рисунок 24). Таким образом, если в однородных по структуре группах углеродных наноматериалов, гидрофобно-гидрофильные свойства и определяемая этим дисперсность в значительной степени определяли различия в уровне их биологической активности, то в разнородной по форме и строению выборке УНМ значение данных факторов в значительной степени нивелировалось.

Рисунок 24 – Зависимость биотоксичности (по оси ординат), характеризуемой величиной ЕС₅₀, от среднего размера частиц УНМ (Rср) в суспензии (по оси абсцисс)

 

Сказанное позволяет предполагать потенциальную зависимость биотоксичности УНМ от их электрического заряда [73], электропроводности [99], а также иных характеристик, определяющих результат воздействия наноуглерода на микроорганизмы и представляющих интерес при продолжении исследований природы биологической активности наноуглерода.

 

Заключение

 

 

В настоящее время все возрастающее внимание во всем мире уделяется перспективам развития нанотехнологий, то есть технологий направленного получения и использования веществ и материалов в диапазоне размеров до  100 нм. Особенности поведения вещества в виде частиц таких размеров, свойства которых во многом определяются законами квантовой физики, открывают широкие перспективы в целенаправленном получении материалов с новыми свойствами, такими как уникальная механическая прочность, особые спектральные, электрические, магнитные, химические, биологические характеристики. Такие материалы могут найти и уже находят применение в различных сферах человеческой деятельности.

Поскольку в перспективе ожидается тесный контакт человека и других биологических объектов с наноматериалами, то изучение вопросов потенциальных рисков их использования представляется важнейшей задачей. За рубежом проблема безопасности наноматериалов в настоящее время выдвигается на первый план.

УНМ представляют собой широкий спектр аллотропных соединений углерода, представленных нанотрубками, нановолокнами, фуллеренами. Одним из перспективных методов тестирования биологической безопасности УНМ является биолюминесцентный анализ, основанный на оценке реакции люминесцирующих (светящихся) бактерий.

Поскольку УНМ обладают совершенно иными биологическими (в том числе токсическими) действиями, чем вещества в обычном физико-химическом состоянии, то традиционные методы оценки биотоксичности не применимы для них. Все больше внимания уделяется индивидуальным особенностям УНМ, таким как, особенности смачивания, диспергирования УНМ, размерные характеристики частиц наноуглерода. Интерес к исследованию физико-химических характеристик наноматериалов объясняется наличием работ, подтверждающих зависимость биологической активности от таковых. Так, например, известно, что УНМ в своем большинстве гидрофобны, в то же время показано, что суспендирование УНМ с использованием поверхностно-активных веществ [77], ковалентная [78] или нековалентная [79] модификации поверхности наноуглерода, ведущие к достижению высоких значений гидрофилизации и повышению степени дисперсности суспензий УНМ, увеличивают их биотоксичность. В то же время, немногочисленность подобных работ, говорит о необходимости продолжения и углубления исследования в данном направлении.

Результаты настоящего исследования подтверждают несмачивание или ограниченное смачивание большинства исследованных УНМ, следствием которого является их существование в водных суспензиях в виде достаточно крупных агрегатов, а результатом – отсутствие биотоксичности в тесте тушения люминесценции Escherichia coli с клонированными luxCDABE-генами Photobacterium leiognathi. В частности, сказанное относится к исследованным образцам НВ, МУНТ, С60-, С70-фуллеренам и фуллеренолу.

К тому же, насыщение поверхности УНМ полярными группами существенно повышает степень их смачивания, ведет к повышению дисперсности водных суспензий и в использованной системе биотестирования результируется как проявление токсических свойств, что наиболее ярко может быть продемонстрировано в парах соединений сходной морфологической организации: ОУНТ-3 → ОУНТ-2 и НВ → фНВ. Кроме того, повышение дисперсности каждого из индивидуальных УНМ путем создания на его поверхности адсорбционного слоя из молекул ДМСО в большинстве случаев также ведет к пропорциональному росту регистрируемой биологической активности. Тем самым полученные результаты свидетельствуют в пользу реальности экологических рисков при поступлении в окружающую среду хорошо смачиваемых наночастиц, а также дополнительном увеличении таковых в присутствии поверхностно-активных веществ.

Одновременно совокупность полученных данных, указывающих на пропорциональность показателей дисперсности и биотоксичности в группах соединений сходной морфологической организации, свидетельствует о том, что в разнородной выборке УНМ достигаемый уровень дисперсности их суспензий определяет не более 10 % вариабельности регистрируемой биологической активности. Сказанное позволяет предполагать потенциально важное значение электрического заряда [16], электропроводности [24], а также иных характеристик УНМ для их биотоксичности. Что представляет интерес при продолжении исследований природы биологической активности наноуглерода.

 

Список использованных источников

 

 

• Кац, Е. А. Углеродные нанотрубки – фантастика наяву. Часть 1. Что значит «нано», «нанотехнология», «нанотрубки»? / Е. А. Кац // Энергия: экономика, техника, экология. – 2008. – № 3. – C. 42-49.
• Oberdorster, G. Nanotoxicology: An Emerging Discipline Evolving from Studies of Ultrafine Particles / G. Oberdorster, E. Oberdorster, J. Oberdorster // Environ. Health Perspect. – 2005. – № 7. – P. 823-839.
• Онищенко, Г. Г. Концепция токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 31 октября 2007 года № 79. – 8 с.
• Онищенко, Г. Г. Обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия населения в условиях расширенного использования наноматериалов и нанотехнологий / Г. Г. Онищенко // Гигиена и санитария. – 2010. – № 2. – С. 4-7.
• Smith, C. J. Toxicity of single walled carbon nanotubes to rainbow trout, (Oncorhynchus mykiss): respiratory toxicity, organ pathologies, and other physiological effects / C. J. Smith, B. J. Shaw, R. D. Handy // Aquat.Toxicol. – 2007. – № 82. – Р. 94-109.
• Li, Z. Cardiovascular effects of pulmonary exposure to single-wall carbon nanotubes / Z. Li, T. Hulderman, R. Salmen, R. Chapman, S. Leonard, S.-H. Young, A. Shvedova // Environ.Health Perspect. – 2007. – № 115. – P. 377-382.
• Fiorito, S. Effects of fullerenes and single-wall carbon nanotubes on murine and human macrophages / S. Fiorito, A. Serafino, F. Andreola, A. Togna,    P. Bernier // Carbon. – 2006. – № 44. – Р. 1100-1105.
• Edwards, S. L. Tubular micro-scale multiwalled carbon nanotube-based scaffolds for tissue engineering / S. L. Edwards, J. S. Church, J. A. Werkmeister, J.A.M. Ramshaw // Biomaterials. – 2009. – № 9. – P. 1725-1731.
• Kang, S. Physicochemical determinants of multiwalled carbon nanotube bacterial cytotoxicity. / S. Kang, M.S. Mauter, M. Elimelech // Environ. Sci. Technol. – 2008. – № 42. – P. 8127-8132.
• Mathur, A. Experimental demonstration of hydrophobicity variation in carbon nanotubes by surface modifications. / A. Mathur, S. Wadhwa, J.A. Byrne, S.S. Roy, J.A. McLaughlin // J. Surf. Sci. Nanotech. – 2010. – №. 7. – P. 334-336.
• Lyon, D. Y. // Antibacterial аctivity of fullerene water suspensions: effects of preparation method and particle size. // D.Y. Lyon, L.K. Adams,            J.C. Falkner, P.J. Alvarez // Environ. Sci. Technol. – 2006. – 40. – № 14. –      Р. 4360-4366.
• Mauter, M. Environmental applications of carbon-based nanomaterials. / M.S. Mauter, M. Elimelech // Environ. Sci. Technol. – 2008. – V. 42. – № 16. – Р. 5843-5859.
• Менделеев, Д. И. Основы химии. 7-е издание, испр. и доп. /          Д.И. Менделеев. – Спб.: Типо-литография М.П. Фроловой. – 1903.
• Мелешко, А. И. Углерод, углеродные волокна, углеродные композиты. / А. И. Мелешко, С. П. Половников. – М.: «САЙНС-ПРЕСС». – 2007. – 192 с: ил.
• Слободин, Я. М. Чем славен углерод, или полимеры в природе /      Я. М. Слободин // Химия и Жизнь. – 1980. – №10. – С. 8-12.
• Станцо, В. В. Популярная библиотека химических элементов. /       В.В Станцо, М. Б. Черненко. – М.: Наука, 1983.
• Сидоров, Л. Н. Фуллерены: Учебное пособие. /Л.Н. Сидоров,      М.А. Юровская и др. – М.: Издательство «Экзамен», 2005. – 688 с.
• Общие сведения об углероде. Режим доступа: http://www.uglerod.info.ru/modif.php. – 3.12.11.
• Беленков, Е. А. Наноалмазы и родственные углеродные наноматериалы. Компьютерное материаловедение. / Е.А. Беленков,              В.В. Ивановская, А.Л. Ивановский. – Екатеринбург: УрО РАН, 2008.
• Графит. Режим доступа: http://www.minerals-zone.com/minerals/graphite.html. – 10.12.11.
• Долматов, В. Ю. Ультрадисперсные алмазы детонационного синтеза. Получение, свойства, применение. / В.Ю. Долматов. – СПб: Издательство ГПУ, 2003.
• Дъячков, П. Н. Углеродные нанотрубки: строение, свойства, применения. / П.Н. Дъячков. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2006. – 293 с.
• Перспективы наноалмазов. Режим доступа: http://www.nanonewsnet.ru/blog/empirv/perspektivy-nanoalmazov. – 4.12.11.
• Биологические аспекты применения наноалмазов марки RUDDM. Режим доступа: http://www.diamond-nanodiamond.com/index.php. – 4.12.11.
• Карбин – третья аллотропная модификация углерода: открытие и свойства. Режим доступа: http://him.1september.ru/articlef.php. – 6.01.12.
• Сладков, А. М. Карбин – третья аллотропная форма углерода. / А.М. Сладков. – М.: Наука, 2003. – 151 с.
• Хайманн, Р .Б. Аллотропия углерода. / Р.Б. Хайманн, С.Е. Евсюков // Природа. – 2003. – № 8. – С. 66.
• Kroto, H. W. C60: buckminsterfullerene / H.W. Kroto, J.R. Heath, S.C. O'Brien et al. // Nature. – 1985. – № 318. – P. 162.
• Кац, Е. А. Фуллерены – молекулы чистого углерода / Е. А. Кац // Энергия: экономика, техника, экология. – 2002. – № 3.– C. 25-31.
• Kroto, H. W. Symmetry, space, stars and C60 / H.W. Kroto, edited by Ingmar Grethe. // Nobel lectures series: Chemistry 1996-2000. – 2003.
• Трошин, П. А. Функциональные производные фуллеренов: методы синтеза и перспективы использования в органической электронике и биомедецине. / П.А. Трошин, О.А. Трошина, Р.Н. Любовская, В.Ф. Разумов; под ред. В.Ф. Разумова и М.В. Клюева. – 2-е изд., испр. И доп. – Иваново: Иван. гос. ун-т, 2010. – 340 с.
• Мищенко, С. В. Углеродные наноматериалы. Производство, свойства, применение. / С.В. Мищенко, А.Г. Ткачев – М.: Машиностроение, 2008. – 320 с.; ил.
• Каманина, Н. В. Электрооптические системы на основе жидких кристаллов и фуллеренов – перспективные материалы наноэлектроник. Свойства и области применение. Учебное пособие. / Н.В. Каманина – СПб.: СПбГУИТМО, 2008 – 137 с.
• Yudoh, K. Water-soluble fullerene (C60) inhibits the development of artrits in the rat model of arthritis. / K. Yudoh, R. Karasawa, K. Masuko, T. Kato // Inter. J. of Nanomedicine. – 2009. – № 4. – P. 217-225.
• Котельников, Р. А. Гибридные наноструктуры на основе фуллеренов для применения в медицине и биологии. / А.И. Котельников,                          Р.А. Котельникова, Г.Н. Богданов, Н.П. Коновалова, В.С. Романова,              Ю.Н. Бубной, С.М. Алдошин // Альманах клинической медицины. – 2008. – №17-2. – С. 340-343.
• Пиотровский, Л. Б. Фуллерены в дизайне лекарственных веществ. / Л.Б. Пиотровский // Российские нанотехнологии. – 2007. – Т.2 – № 7-8. – С.6-18.
• Марсагишвили, Л. Г. Разрушение амилоидных фибрилл Х-белка in vitro. / Л.Г. Марсагишвили Л.Г., Бобылев А.Г., Шпагина М.Д., Подлубная З.А. // Биофизика. – 2006. – №5. – С. 799-804.
• Шавловский, М. М. Комплексы фуллерена C60 с белками плазмы крови человека. / М.М. Шавловский, К.В. Соловьев, М.А. Думпис,                Е.В. Литасова, Л.Б. Пиотровский. // Нанотехнологии в биологии и медицине, под ред. Е.В. Шляхто. С.Петербург – 2009.
• Тихомиров, А. А. Особенности антирадикальных и радиозащитных свойств гидратированного С60 фуллерена. / А.А. Тихомиров, С.В. Гудков,     Г.В. Андриевский // Биология – наука XXI века: 12-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых, (Пущино, 10-14 ноября 2008 года). Сборник тезисов. – 2008. – С. 109.
• Iijima, S. Helical microtubules of graphitic carbon / S. Iijima // Nature. – 1991. – № 354. – P. 56-58.
• Радушкевич, Л. В. О структуре углерода, образующегося при термическом разложении окиси углерода на железном контакте /                      Л.В. Радушкевич, В.М. Лукьянович // Физическая химия. – 1952. – № 1. – С. 88-95.
• Iijima, S. Single-shell carbon nanotubes of 1-nm diameter. / S. Iijima,      T. Ichihashi // Nature. – 1993. – № 363. – P. 603-605.
• Bethune, D. S. Cobalt-catalysed growth of carbon nanotubes with single-atomic-layer walls. / D.S. Bethune, C.H. Kiang, G. Gorman, R. Savoy, J. Vazquez, R. Beyers // Nature. – 1993. – № 363. – P. 605-607.
• Кац, Е. А. Углеродные нанотрубки – фантастика наяву. Часть 2. История открытия углеродных нанотрубок. / Е. А. Кац // Энергия: экономика, техника, экология. – 2008. – № 4. – P. 32-36.
• Раков, Э. Г. Исследование кислотной функциализации углеродных нановолокон. / Э.Г. Раков, Чан Хунг Нгуен, Мань Тыонг Нгуен. // Неорганические материалы. – 2010. – Т.49. – №10. – С. 1-7.
• Кац, Е. А. Углеродные нанотрубки – фантастика наяву. Часть 4. Механические свойства углеродных нанотрубок. Космический лифт. /              Е.А. Кац. // Энергия: экономика, техника, экология. – № 4. – 2008. – P. 61-69.
• Кац, Е. А. Углеродные нанотрубки – фантастика наяву. Часть 3. Электронные свойства углеродных нанотрубок. Наноэлектроника и оптоэлектроника / Е.А. Кац // Энергия: экономика, техника, экология. – 2008. – № 5. – P. 49-55.
• Елецкий, А. В. Транспортные свойства углеродных нанотрубок /    А.В. Елецкий // Успехи физических наук. – 2009. – № 3. – P. 225-242.
• Елецкий, А. В. Углеродные нанотрубки и их эмиссионные свойства / А.В. Елецкий // Успехи физических наук. – 2002. – Т. 172. – № 4. – C. 401-438.
• Земскова, Л. А. Модифицированные углеродные волокна: сорбенты, электродные материалы, катализаторы / Л.А. Земскова // Вестник ДВО РАН. – 2009. – № 2. – С. 39-52.
• Елецкий, А. В. Механические свойства углеродных наноструктур и материалов на их основе. / А.В. Елецкий // Успехи физических наук. – 2007. – Т. 177. – №3. – С. 233-274.
• Bachtold, A. Logic Circuits with carbon nanotubes transistors / A. Bachtold, P. Hadiey, T. Nakanishi, C. Dekker // Science. – 2001. – V. 294. – № 5545. – P. 1317-1320.
• Ремпель, А. А. Нанотехнологии, свойства и применение наноструктурированных материалов. / А.А. Ремпель // Успехи химии. – 2007. – Т. 76. – № 5. – С. 474-500.
• Раков, Э. Г. Химия и применение углеродных нанотрубок. /          Э.Г. Раков // Успехи химии. – 2001.
• Кобаяси, Н. Введение в нанотехнологию: пер. с японск. / Н. Кобаяси – М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2008. – 134 с.
• Филонов, А. Обработка и анализ данных в сканирующей зондовой микроскопии: алгоритмы и методы. / А. Филонов, И. Яминский. // Наноиндустрия. – 2007. – № 2. – С. 32-34.
• Томишко, М. М. Зонды для сканирующих туннельных микроскопов на основе углеродных нанотрубок. / М.М. Томишко, А.М. Алексеев,              Л.Л. Клинова, А.Г. Томишко, О.В. Демичева, И.А. Чмутин. // Нанотехника. – 2006. – №1. – С. 15-17.
• Таусенев, А. В. Самосинхронизация мод в эрбиевых волоконных лазерах с насыщающимися поглотителями в виде полимерных пленок, содержащих синтезированные методом дугового разряда одностенные углеродные нанотрубки. / А.В. Таусенев, Е.Д. Образцова, А.С. Лобач,          А.И. Чернов, В.И. Конов, А.В. Конященко, П.Г. Крюков, Е.М. Дианов // Квантовая электроника. – 2007. – Т. 37 – №3. – С. 205-208.
• Ильичев, Н. Н. Самосинхронизация мод с помощью пассивного затвора на основе одностенных углеродных нанотрубок в лазере на кристалле LiF: F^2-. / Н.Н. Ильичев, Е.Д. Образцова, П.П. Пашинин, В.И. Конов,              С.В. Гарнов // Квантовая электроника. – 2004. – Т. 34. – №9. – С. 785-785.
• Guan, T. Use of carbon nanotube filter in removing bioaerosols. / Tianjia Guan, Maosheng Yao. // Journal of Aerosol Science. – 2010. – №41. – P. 611-620.
• Vecitis, Chad D. Electrochemical multiwalled carbon nanotube filter for viral and bacterial removal and inactivation / Chad D. Vecitis, Mary H. Schnoor, Md. Saifur Rahaman, Jessica D. Schiffman, and Menachem Elimelech // Environmental Science & Technology. – 2001. – №45. – Р. 3672-3679.
• Lai, H. S. Free radical scavenging activity of fullerenol on grafts after small bowel transplantation in dogs / H.S. Lai, Y. Chen, W.J. Chen, L.Y. Chiang // Transplant. Proc. – 2000. – V. 6. – № 32. – Р. 1272-1274.
• Magrez, А. Cellular Toxicity of Carbon-Based Nanomaterials /              A. Magrez, S. Kasas, V. Salicio, N. Pasquier, J. Won Seo, M. Celio, S. Catsicas,      B. Schwaller, L. Forrо // Nano Letters. – 2006. – V. 6. – № 6 – Р. 1121-1125.
• Hydrogen Materials Science and Chemistry of Carbon Nanomaterials. / International Conference. Sudak-Crimea-Ukraine. September 14-20, 2003
• Allsopp, M. Nanotechnologies and nanomaterials in electrical and electronic goods: A review of uses and health concerns / M. Allsopp, A. Walters,    D. Santino // Greenpeace research laboratories. December. – 2007. – P.22.
• Donaldson, K. Carbon nanotubes: review of their properties in relation to pulmonary toxicology and workplace safety / K. Donaldson, R. Aitken, L. Tran,      V. Stone, R. Duffin, G. Forrest, A. Alexander // Toxicological Science. – 2006. –    № 92. – P. 5-22.
• Medina, C. Nanoparticles: pharmacological and toxicological significance / C. Medina, M. J. Santos-Martinez, A. Radomski, O. I. Corrigan., M. W. Radomski // British Journal of Pharmacology. – 2007. – № 5. – P. 552-558.
• Sayes, Christie M. Nano-C₆₀ cytotoxicity is due to lipid peroxidation / Christie M. Sayes, Andre M. Gobin, Kevin D. Ausman, Joe Mendez, Jennifer L. West, Vicki L. Colvin. // Biomaterials. – 2005.
• Арчаков, А. И. Нанобиотехнология и наномедицина. Дополнение к проекту Доктрины развития в Российской Федерации работ в области нанотехнологий / А.И. Арчаков – 2006.
• Ostiguy, C. Health effects of nanoparticles. / C. Ostiguy, G. Lapointe, M. Trottier, L. Menard, Y. Cloutier, M. Boutin, M. Antoun, Ch. Normand // Studies and research projects. IRSST. – 2006. – Р.52.
• Сейфулла, Р. Д. Проблемы использования нанотехнологии в фармакологии. / Р. Д. Сейфулла, А. Б. Тимофеев, З. Г. Орджоникидзе // Эксперимен. и клинич. фармакология. – 2008. – № 1. – С. 61-69.
• Baun, A. Toxicity and bioaccumulation of xenobiotic organic compounds in the presence of aqueous suspensions of aggregates of nano-C /      A. Baun, S.N. Sorensen, R.F. Rasmussen, N.B. Hartmann, C.B. Kocb // Aquatic Toxicology. – 2008. – №. 86. – P. 379-387.
• Perez, S. Analysis, behavior and ecotoxicity of carbon-based nanomaterials in the aquatic environment. / S. Perez, M. Farre // Trends in analytical chemistry. – 2009. – V. 28. – № 6. – P. 820-832.
• Методические указания 1.2.2634-10 «Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза». – М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии роспотребнадзора. – 2010. – 58 с.
• Tenne, R. Inorganic nanotubes and fullerene-like nanoparticles. / R. Tenne // Nanotechnol. – 2006. – № 1. – P. 103-111.
• Walther, J. H. Carbon nanotubes in water: structural characteristics and energetics. / J.H. Walther, R. Jaffe, T. Halicioglu, P. Koumoutsakos // J. Phys. Chem. – 2001. – № 105. – P. 9980-9987.
• Mathur, A. Experimental demonstration of hydrophobicity variation in carbon nanotubes by surface modifications / A. Mathur, S. Wadhwa, J.A Byrne.,    S.S. Roy, J.A. McLaughlin // J. Surf. Sci. Nanotech. – 2010 – V. 7. – P. 334-336.
• Hyung, H. Natural organic matter stabilizes carbon nanotubes in the aqueous phase. / H. Hyung, J.D. Fortner, J.B. Hughes, J-H. Kim // Environ. Sci. Technol. – 2007. – V. 41. – № 1. – P. 179-184.
• Holzinger, M. Cycloaddition for cross-linking SWCNTs. / M. Holzinger, J. Steinmetz, D. Samaille, M. Glerup, M. Paillet, P. Bernier, L. Ley, R. Graupner // Carbon. – – № 42. – P. 941-947.
• Tummala, N. R. Stabilization of aqueous carbon nanotube dispersions using surfactants: insights from molecular dynamics simulations. / N.R. Tummala, B.H. Morrow, D.E. Resasco, A. Striolo // ACS Nano. – – V. 4. – № 12. – P. 7193-7204.
• Lyon, D. Y. Antibacterial аctivity of fullerene water suspensions: effects of preparation method and particle size. / D.Y. Lyon, L.K. Adams, J.C. Falkner, P.J. Alvarez // Environ. Sci. Technol. – – V. 40. – № 14. – Р. 4360-4366.
• Liu, S. Antibacterial activity of graphite, graphite oxide, graphene oxide, and reduced graphene oxide: membrane and oxidative stress. / S. Liu, T.H. Zeng,    M. Hofmann, E. Burcombe, J. Wei, R. Jiang, J. Kong, Y. Chen // ACS Nano. – – V. 5. – № 9. – P. 6971-6980.
• Режим доступа: http://www.nanocarblab.com. – 6.01.12.
• Данилов, В. С. Сенсорные биолюминесцентные системы на основе lux-оперонов разных видов люминесцентных бактерий / В.С. Данилов,            А.П. Зарубина, Г.Е. Ерошников, Л.Н. Соловьева, Ф.В. Каташев,                      Г.Б. Завильгельский // Вестник Московского Университета. Сер. 16: Биология. – 2002. – № 3. – С.20-24.
• Taxonomy browser Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. – 10.09.11.
• Воробьев, А. В. Микробиология: Учебник. – 2-е изд., перераб и доп. / А.В. Воробьев, А.С. Быков, Е.П. Пашков, А.М. Рыбакова. – М.: Медицина, 2003. – 336с.:ил.
• Работа адгезии. – режим доступа: http://p-km.ru. – 17.08.2010.
• Емельяненко, А. М. Смачиваемость межфазных границ как индикатор их свойств и состояния. / А.М. Емельяненко. // Журн. Физикохимия поверхности и защита материалов. – 2008. – Т. 44. – № 5. – С. 453-463.
• Гельфман, М. И. Коллоидная химия. 2-е изд., стер.: Учебник для вузов. (Специальная литература) / М.И. Гельфман, О.В. Ковалевич,                В.П. Юстратов. – Спб.: Издательство «Лань», 2004. – 336 с.:ил.
• Кировская, И. А. Химия. Коллоидные растворы: Учеб. пособие (с тестовыми заданиями). / И.А. Кировская. – Омск: Изд-во ОмГТУ, 2003. – 120 с.
• Марков, В. Ф. Краткий конспект лекций по курсу «Поверхностные явления и дисперсные системы». Составитель: проф., д.х.н. В.Ф.Марков. – Екатеринбург, 2006.
• Кудряшева, Н. С. Физико-химические основы биолюминесцентного анализа: учеб. пособие / Н. С. Кудряшева, В. А. Кратасюк, Е. Н. Есимбекова. – Красноярск : Краснояр. гос.ун-т., 2002. – 154 c.
• Gellert, G. Sensitivity and significance of luminescent bacteria in chronic toxicity testing based on growth and bioluminescence / G. Gellert // Ecotoxicol Environ Saf. – 2000. – № 1. – P. 87-91.
• Алешина, Е. С. Использование люминесцирующих микроорганизмов для биотестирования минеральных вод : дис. канд. биол. наук / Е. С. Алешина. – М., 2007. – 187 с.
• Халафян, А. А. STATISTIKA 6. Статистический анализ данных. 3-е изд. Учебник / А.А Халафян – М.: ООО «Бином-Пресс», 2007. – 512 с.: ил.
• Tiraferri, A. Covalent binding of single-walled carbon nanotubes to polyamide membranes for antimicrobial surface properties. / A. Tiraferri,            C.D. Vecitis, M. Elimelech. // ACS Publications. – 2011. – №3. – Р. – 2869-2877.
• Tang, Y. J. Charge-associated effects of fullerene derivatives on microbial structural integrity and central metabolism. / Y.J Tang., J.M. Ashcroft, D. Chen,      G. Min, C-H. Kim, B. Murkhejee, C. Larabell, J.D. Keasling, F.F. Chen // Nano Lett. – 2007. – V. 7. – № 3. – P. 754-760.
• Magrez, Ar. Cellular toxicity of carbon-based nanomaterials. /                Ar. Magrez, S. Kasas, V. Salicio, N. Pasquier, J.W. Seo, M. Celio, S. Catsicas,         B. Schwaller, L. Forrо // Nano Lett. – 2006. – V. 6. – № 6. – P. 1121-1125.
• Vecitis, C. D. Electronic-structure-dependent bacterial cytotoxicity of single-walled carbon nanotubes. / C.D.Vecitis, K.R. Zodrow, S. Kang, M. Elimelech // ACS Nano. – 2010. – V. 4. – № 9. – P. 5471-5479.

 

Скачать: Diplom-celikom.doc