Использование люминесцирующего бактериального биосенсора «Эколюм» при оценке биологической активности углеродных наноматериалов

 

Аннотация

 

 

Выпускная квалификационная работа содержит 68 страниц, в том числе 20 рисунков, 7 таблиц и 82 источника литературы.

Структура дипломной работы соответствует логике построения исследования и состоит из введения, трех глав, заключения и списка использованных источников.

В первой главе дипломного проекта были рассмотрены люминесцентные методы оценки различных сред и соединений, а также проблемы их использования для оценки биотоксичности углеродных наноматериалов. Во второй главе рассмотрены материалы и методы исследований, применяемые при выполнении данной работы. В третьей главе представлены результаты исследовательской работы. В третьей главе подробно описаны результаты проведенной работы, раскрываются основные причины и закономерности, выявленные в процессе выполнения работы.

 

Abstract

 

 

Final qualifying work contains 68 pages, including 20 drawings, 7 tables and 82 sources of the literature.

The structure of degree work corresponds to logic of construction of research and consists of the introduction, three chapters, the conclusion and the list of the used sources.

In the first chapter of the degree project luminescent methods of an estimation of various environments and connections, and also problems of their use for an estimation of biotoxicity carbon nanomaterials have been considered. In the second chapter materials and methods of research applied are considered at performance of the given work. In the third chapter results of research work are presented. In the third chapter results of the lead work are in detail described, principal causes and laws the works revealed during performance reveal.

 

Содержание

 

 

Введение.............................................................................................................. 6

1 Люминесцентные методы оценки различных сред и соединений и проблемы их использования для оценки биотоксичности углеродных наноматериалов ..... 8

1.1 Бактериальная биолюминесценция и ее использование в системе контроля качества различных сред и соединений............................................................................ 8

1.1.1 Молекулярные механизмы биолюминесценции..................................... 10

1.1.2 Использование люминесцирующих микроорганизмов в качестве биосенсоров для оценки биотоксичности различных сред и соединений................................... 15

1.2 Проблемы оценки биотоксичности углеродных наноматериалов........... 20

2 Материалы и методы исследования.............................................................. 28

2.1 Материалы исследования........................................................................... 28

2.1.1 Биосенсор «Эколюм» .............................................................................. 28

2.1.2 Углеродные наноматериалы.................................................................... 29

2.2 Методы исследования................................................................................. 30

2.2.1 Метод биолюминесцентного анализа...................................................... 30

2.2.2 Количественный метод оценки безопасности наноматериалов при помощи ростовых микробиологических тестов............................................................................. 33

2.2.3 Спектрофотометрический метод............................................................. 36

2.2.4 Методы исследование компонентного состава углеродных наноматериалов        36

2.2.5 Статистические методы............................................................................ 37

3 Результаты и их обсуждение......................................................................... 38

3.1 Определение химического состава углеродных наноматериалов............ 38

3.2 Исследование спектров поглощения углеродных наноматериалов......... 43

3.3 Адаптация традиционной процедуры биолюминесцентного анализа..... 45

3.4 Исследование биологических эффектов углеродных наноматериалов методом биолюминесцентного анализа.......................................................................... 52

3.5 Исследование биологических эффектов углеродных наноматериалов количественным методом оценки веществ при помощи ростовых микробиологических тестов 57

Заключение........................................................................................................ 61

Список используемых источников................................................................... 63

 
Введение

 

 

Перспективы продвижения высоких технологий XXI века связывают с развитием одного из основных направлений – нанотехнологиями. Под этим термином, предложенным в 1974 году Н. Танигучи [1], подразумевается совокупность технологических приемов и исследовательских методик, позволяющих создавать объекты размером до 100 нм и манипулировать ими.

Развитие нанотехнологий затрагивает практически все направления человеческой деятельности – от биологии и медицины до металлургии, строительства, микроэлектроники, энергетики, оптики, пищевой, парфюмерно-косметической промышленности, охраны окружающей среды, научных исследованиях, военного дела, освоения космоса и так далее. Здесь используют уникальные свойства ультрадисперсных, или наноматериалов, открытие и начало использования которых произошло в России в 50 годах прошлого века.

В настоящее время в мире зарегистрировано и выпускается промышленностью более 1800 наименований наноматериалов.

Широкое их использование в самых разных областях человеческой деятельности означает расширяющийся контакт людей и экосистем со всеми ними, а также целенаправленное использование наночастиц разной природы в области медицины, что определяет их адресное и систематическое введение в организм [2].

Несмотря на то, что наноматериалы в мире уже используются более десяти лет, ни один вид наноматериалов не был изучен в полном объеме на безопасность ни в одной из стран мира. Фактически, во всем мире проводилось незначительное количество таких исследований, которые не позволяют точно оценить потенциальные риски использования наноматериалов. Кроме того, требуется разработка высокочувствительных и адекватных методов определения наноматериалов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и биосредах [3, 4].

Совокупность накопленных фактов о наноматериалах свидетельствует о том, что в силу своей малой размерности и большой удельной поверхности они могут обладать совершенно иными биологическими (в том числе токсическими) свойствами, нежели вещества в обычном их физико-химическом состоянии.

Первые результаты изучения биологической активности наноуглерода оказались достаточно противоречивыми. Так в работах некоторых авторов сообщается о потенциальной токсичности углеродных нанотрубок при аэрозольном применении, результирующейся в формировании в легочной ткани специфических гранулем [5], также были обнаружены значительные повреждения сердечно-сосудистой системы у мышей после интраназального введения одностенных нанотрубок [6]. В противоположность этому в других трудах делают вывод о достаточно низкой токсичности углеродных наноматериалов высокой степени очистки [7], а в некоторых даже сообщается о положительных медицинских эффектах углеродных нанотрубок при регенерации костной ткани [8], производстве искусственных тканей и органов, не вызывающих реакцию отторжения [9].

В связи с возможной токсичностью наноматериалов закономерно появление и развитие новой дисциплины «нанотоксикологии», которую определяют как «науку, изучающую влияние искусственно созданных наноустройств и наноструктур на живой организм» [2].

Развитие нанотехнологий, существенно опережающее токсикологическую оценку их продуктов, с полной ответственностью можно расценивать как негативную тенденцию современного развития. Помимо этического аспекта и непредсказуемых медицинских последствий следует указать на возможные финансовые потери, которые могут произойти при недооценке этой проблемы.

Сложившаяся ситуация требует от медицинских и биологических наук обоснование и разработку адекватных методических подходов к исследованию рисков, возникающих при контакте биологических систем с наноматериалами. При этом незаменимую роль в выявлении и изучении механизмов потенциальной токсичности наноуглерода могут сыграть модельные бактериальные системы, поскольку имеют достаточно высокую степень биохимического сходства с высшими организмами, а также характеризуются значительно более высокой скоростью формирования ответных реакций. В полной мере сказанное относится и к индикаторным люминесцирующим микроорганизмам, в последние годы ставшим востребованным инструментом оценки интегральной биотоксичности различных природных сред и химических соединений [10].

Сказанное определило цель нашей работы – изучение биологических эффектов углеродных наноматериалов (нанотрубок различной степени очистки, морфологии, функционализации, нановолокон и фуллеренов) с использованием методов биолюминесцентного анализа.

Для достижения данной цели перед нами были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

• Формирование суспензий наноуглерода с высоким уровнем дисперсности.
• Разработка оптимального режима контакта углеродных наноматериалов с сенсорными микроорганизмами, позволяющего в наибольшей степени выявить их биологическую активность.
• Исключение влияния оптических свойств наноуглерода на результат исследования.
• Адаптация традиционного метода биолюминесцентного анализа для оценки биотоксичности углеродных наноматериалов.

1 Люминесцентные методы оценки различных сред и соединений и проблемы их использования для оценки биотоксичности углеродных наноматериалов

 

• Бактериальная биолюминесценция и ее использование в системе контроля качества различных сред и соединений

 

 

Биолюминесценция (с греч. «bios» – жизнь, лат. «lumen» – свет и «escent» – суффикс, означающий слабое действие) – это широко распространенное явление в окружающем нас мире, которое представляет собой видимое простым глазом свечение живых организмов различного уровня организации живой материи [11].

Свечение живых организмов отмечалось еще античными авторами – Плиний Старший в своей «Естественной истории» упоминал свечение морских организмов, многие авторы описывали свечение моря. Однако изучение природы биолюминесценции берет свое начало в 1668 году, когда Роберт Бойль, представитель пневмохимии, изучавший процессы горения, обнаружил сходство между процессами горения угля и свечением гнилушек [12].

В целом в настоящее время известно около 800 видов светящихся живых существ. Биолюминесценция наблюдается среди подвижных многоклеточных животных разных типов – от полипов (Renilla reniformis), медуз (Aequorea victoria) и гребневиков (Mnemiopsis leidyi) до кальмаров (Euprymna scolopes), ракообразных (Vargula) и рыб (Malacosteus niger). Большинство светящихся существ морские, среди них много глубоководных. Из наземных – отдельные виды земляных червей, улиток, многоножек, комаров и жуков [13]. Свечение встречается и среди представителей царства грибов, таких как Armillaria mellea, Mycena chlorophos, Panellus stipticus и другие. На этом фоне заметное место занимают люминесцирующие бактерии, преимущественно обитающие в морской среде [14]. По современным представлениям способность к биолюминесценции регистрируется у представителей четырех бактериальных родов: Photobacterium, Vibrio, Shewanella, а также Photorhabdus, относящихся к классу Gammaproteobacteria и находящихся в достаточно близком филогенетическом родстве (таблица 1) [15].

Одними из первых бактериальных изолятов, выращенных на искусственных питательных средах и демонстрирующих на них способность к самостоятельному свечению, были микроорганизмы, обозначенные их первооткрывателем F. Cohn как Micrococcus phosphoreum. В дальнейшем устоявшимся названием для данных бактерий стало Photobacterium phosphoreum. Данные микроорганизмы являются наиболее частыми симбионтами глубоководных морских рыб [16].

В конце 60 – начале 70 годов XX века был описан вид Photobacterium leiognathi, получивший свое название по причине обнаружения в световых органах рыб семейства Leiognathidae. Также микроорганизмы P. leiognathi обнаруживаются в световых органах кальмаров семейства Loliginidae [17].

 

Таблица 1 – Филогенетическая систематика люминесцирующих бактерий

Домен – Bacteria
Отдел – XII Proteobacteria
Класс – III Gammaproteobacteria
Порядок	Семейство	Род	Основные виды
XI Vibrionales	Vibrionaceae	Vibrio	V. albensis V. fischeri V. harveyi V. logei V. mediterranei V. orientalis V. splendidus
		Photobacterium	P. leiognathi P. phosphoreum
X Alteromonadales	Alteromonadaceae	Shewanella	S. hanedai S. woodyi
XIII Enteribacteriales	Enterobacteriaceae	Photorhabdus	P. asymbiotica P. luminescence P. temperata

 

Среди рода Vibrio выделяют шесть видов, для которых было характерно явление биолюминесценции: V. fisheri, V. harveyi, V. mediterranei, V. orientalis, V. logei и V. splendidus biotype. При этом подобный спектр в значительной степени формировался за счет уточнения таксономического положения микроорганизмов [15].

Так, V. harveyi имеет прямое отношение к видимому в ночное время суток свечению моря, с XVII века описываемого мореплавателями как «milky sea» [18]. При этом подобный эффект не мог быть в чистом виде истолкован как свечение свободно живущих бактерий, но был обусловлен V. harveyi, находящимися в ассоциации с микроводорослями Phaeocystis [19]. В отличие от V. harveyi V. fischeri являются симбионтами прибрежных (поверхностных) рыб и кальмаров [20], а именно симбионтами световых органов рыб семейства Monocentridae и короткохвостых кальмаров семейства Sepiolidae: Euprymna scolopes (Гавайские острова, США) [21], Euprymna tasmanica (Австралия) и Euprymna morsei (западное побережье Тихого океана).

Род Shewanella является относительно недавно описанным и, в этой связи, значительно менее изученным по сравнению с прочими люминесцирующими бактериями. К настоящему времени в составе рода Shewanella обнаружено два люминесцирующих вида – S. hanedai и S. woodyi.

На фоне существования обширной группы морских люминесцирующих микроорганизмов достаточно обособленный таксон формируют представители светящихся бактерий, первоначально описанных в 1977 году как симбионты энтомопатогенных (вызывающих заболевания насекомых) нематод Heterorhabdidis bacteriophora – Photorhabdus luminescens [22].

Биологическое значение биолюминесценции различно. Так, у светящихся насекомых вспышки биолюминесценции служат сигналом, позволяющим самцам и самкам находить друг друга; у ряда глубоководных рыб – для освещения и приманки добычи; у каракатицы – для защиты от хищников (путем выбрасывания светящейся жидкости) и так далее [23].

Это явление также нашло применение в разных областях человеческой деятельности. Так, биолюминесцентные системы широко применяются для аналитических целей, в основном в клинической медицине, экологическом мониторинге и контроле за качеством пищевых продуктов, а также в научных исследованиях. Биолюминесценция бактерий широко используется как чувствительный индикатор при исследовании действия различных токсических веществ [11].

 

 

• Молекулярные механизмы биолюминесценции

 

 

Бактериальная биолюминесценция – это ферментативный процесс, сопровождающийся потреблением кислорода и выделением света. Присутствие кислорода является абсолютно необходимым условием для генерации свечения: без него подобная реакция не происходит. Ферменты, катализирующие реакции генерации свечения, традиционно носят общее название «люциферазы», а участвующие в этих реакциях субстраты в большинстве случаев определяются как «люциферины» [15].

Бактериальная люцифераза – флавинзависимая монооксигеназа, функция которой состоит в окислении субстрата с отнятием у него протонов (ē) и последующим переносом последних к акцептору.

Бактериальные люциферазы отнесены к подклассу E.C.1.14.14.3 «Оксидоредуктаз с восстановленным флавином или флавопротеином в качестве донора» и щелочным FMN-зависимым монооксигеназам [24].

У различных люминесцирующих микроорганизмов люциферазы составляют до 5 % от общего количества белков и используют до 10 % энергии в клетке.

При небольших межвидовых различиях все люциферазы имеют сходное строение и представляют собой белковые α/β-гетеродимеры с молекулярной массой (76±4) kDa (рисунок 1) [25]. Активный центр люциферазы локализован на α-субъединице. На этом фоне роль β-субъединицы люциферазы, характеризующейся как минимум 30 % степенью аминокислотной гомологии с α-субъединицей, менее ясна, но ее наличие необходимо для обеспечения более высокого квантового выхода люминесцентной реакции.

В процессе эволюции первичные структуры субъединиц различных бактериальных люцифераз значительно дивергировали. При этом аминокислотная последовательность α-субъединицы оказалась значительно более консервативной, чем таковая у β-субъединицы, что указывает на ведущую роль первой в определении ферментативной активности люциферазы.

 

 

Рисунок 1 – Схематическое изображение структуры бактериальной люциферазы (слева) и трехмерная реконструкция ее поверхности (справа)

 

Биолюминесценция бактерий является одной из разновидностей хемилюминесцентной реакции, для осуществления которой необходимы два субстрата [26]. Одним из двух субстратов, выступающим в качестве донора в реакции, катализируемой бактериальной люциферазой, является восстановленный флавинмононуклеотид, способный отдавать два атома водорода по атомам N-изоаллоксазинового кольца. Вторым субстратом является длинноцепочечный алифатический альдегид, содержащий от 8 до 16 атомов углерода, постоянное поступление которого необходимо для бесперебойного функционирования люциферазы.

Таким образом, в наиболее общем виде бактериальная биолюминесценция может быть представлена как окисление восстановленного флавинмононуклеотида (FMNH₂) с одновременным окислением длинноцепочечного алифатического альдегида (RCHO) до соответствующей жирной кислоты (RCOOH) и излучением кванта света с длиной волны 495 нм согласно формуле

 

FMNH₂ + O₂ + RCHO → FMN + H₂O + RCOOH + фотон (495 нм)         (1)

 

Для обеспечения стабильности световой эмиссии необходимо непрерывное возобновление субстратов, для чего существует две ферментативные системы, первая из которых снабжает люциферазу восстановленными формами флавинмононуклеотида, а вторая ответственна за регенерацию альдегидов из соответствующих жирных кислот (рисунок 2).

За первый из этих процессов ответственны NAD(P)H:FMN-оксидоредуктазы, представляющие собой гомодимеры из двух идентичных субъединиц, связывающих флавинмононуклеотид (FMN) и восстановленный никотинамиддинуклеотид фосфат (NAD(P)H) в пространстве между обращенными друг к другу поверхностями. При этом каждая из подобных субъединиц имеет молекулярный вес 26,3 kDa и состоит из двух доменов, первый из которых складывается из четырех антипараллельных β-слоев, с каждой стороны фланкированных α-спиралями. Второй домен протягивается от одной субъединицы к другой и предположительно ответственен за сцепление между ними. В целостной бактериальной клетке оксидоредуктазы формируют с люциферазой единую электроннотранспортную цепь и обеспечивают последнюю FMNH₂, возникающим в процессе восстановления FMN за счет энергии NAD(P)H.

 

Рисунок 2 – Метаболические пути, ведущие к регенерации субстратов для реакции биолюминесценции

 

В люминесцирующих бактериях биосинтез альдегидов в значительной степени идет по пути восстановления жирных кислот, являющихся одним из продуктов люминесцентной реакции, которые после подобного превращения вновь вступают в нее согласно формуле

 

RCOOH + ATP + NAD(P)H → RCHO + AMP + PP + NAD(P)                 (2)

 

Значимость же подобного пути определяется не только «экономическими» соображениями, но и тем, что длинноцепочечные жирные кислоты являются конкурентными ингибиторами реакции биолюминесценции и поэтому должны динамически удаляться из цитозоля.

За данный процесс в бактериальных клетках отвечает мультиферментный комплекс восстановления жирных кислот, имеющий молекулярную массу около 500 kDa и состоящий из трех субъединиц – трансферазы, синтетазы и редуктазы. При этом каждый из этих белков присутствует в составе мультиферментного комплекса в количестве четырех идентичных копий.

Гены, вовлеченные в биосинтез белков и других веществ, необходимых для бактериальной биолюминесценции, получили общее обозначение «lux-гены», расширением которых стали различные буквы английского алфавита. В настоящее время количество подобных генов превысило два десятка, а перечень их названий варьирует от luxA до luxZ. Среди подобных генов принято выделять «структурные» – кодирующие белки, непосредственно задействованные в процессе генерации свечения, и «регуляторные» – ответственные за позитивный и негативный контроль этого процесса [15].

Первыми из структурных генов были описаны luxA и luxB [27]. Подобное обозначение универсально для всех известных люминесцирующих бактерий, а сами эти гены расположены на бактериальной хромосоме рядом (слева направо по ходу процесса транскрипции). Именно гены luxAB ответственны за синтез α- и β-субъединицы бактериальной люциферазы (таблица 2).

 

Таблица 2 – Номенклатура и функциональная характеристика lux-генов различных люминесцирующих бактерий

Название гена	Размер гена, н.п.	Молекулярный вес продукта, Да	Функция продукта
luxA	1428-1440	39364-41401	α-цепь бактериальной люциферазы / щелочной монооксигеназы (EC 1.14.14.3)
luxB	954-984	36345-37701	β-цепь бактериальной люциферазы / щелочной монооксигеназы (EC 1.14.14.3)
luxC	1428-1440	53713-54858	Ацил-CoA-редуктаза (EC 1.2.1.50)
luxD	774-945	29087-35742	Ацил-трансфераза (EC 2.3.1.-) / Миристол-ACP-специфичная тиоэстераза
luxE	1110-1149	42930-44480	Ацил-протеин-синтетаза (EC 6.2.1.19) / Лигаза длинноцепочечных жирных кислот
luxG	699-708	26109-27018	NAD(P)H-зависимая FMN-редуктаза (EC 1.5.1.29)

 

Слева от пары luxAB во всех известных случаях расположены еще два структурных гена: luxС и luxD, первый из которых ответственен за синтез фермента ацил-CoA-редуктазы, действующей на третьем этапе восстановления жирных кислот. Подобная реакция сопровождается затратой одной молекулы NAD(P)H и ведет к распаду комплекса альдегид-CoA до коэнзимаА и свободного длинноцепочечного альдегида. В свою очередь ген luxD, кодирует синтез фермента ацилтрансферазы, инициирующей процесс восстановления жирных кислот.

Справа гены luxAB фланкированы геном luxE [28], кодирующим синтез ацил-протеин-синтетазы длинноцепочечных жирных кислот, действующей на втором этапе восстановления жирных кислот и нуждающейся для этого в энергии АТФ.

В совокупности три перечисленных выше гена определяют синтез мультиферментного комплекса редуктазы жирных кислот, состоящего из трех различных субъединиц.

Значительная часть lux-генов собрана в относительно протяженные генные последовательности, называемые «lux-оперонами». Функциональным результатом подобной организации является возможность совместной транскрипции различных генов, необходимых и достаточных для развития люминесценции.

Гены luxCDABE являются наиболее универсальной частью целостного совместно транскрибируемого lux-оперона всех известных люминесцирующих микроорганизмов, необходимого и достаточного для воспроизведения феномена бактериальной биолюминесценции в клетках гетерологичных хозяев (рисунок 3). При этом все они расположены очень близко друг к другу и только между luxB и luxE обнаруживается относительно большой межгенный участок размером от 80 до 300 нуклеотидных пар (н.п.). Последний достаточно консервативен в геномах различных люминесцирующих бактерий и содержит палиндромную последовательность, способную формировать на однонитчатых дезоксирибонуклеиновых кислотах (ДНК) и рибонуклеиновых кислотах (РНК) шпилечные структуры.

 

 

Рисунок 3 – Порядок организации основных структурных генов биолюминесценции в составе lux-оперона

 

При достижении высокой плотности популяции с середины и до конца экспоненциальной фазы интенсивность световой эмиссии возрастает в несколько тысяч раз, резко опережая темпы роста самой бактериальной культуры. При этом в основе подобного явления лежит скачкообразное повышение интенсивности экспрессии luxCDABE генов с соответствующим накоплением в клетке как самой люциферазы, так и необходимых для ее функционирования субстратов. Предполагается, что аналогичные процессы происходят и в естественных условиях обитания биолюминесцирующих бактерий. Так, в морской воде, где плотность популяции V. fischeri обычно не превышает 100 колониеобразующих единиц на миллилитр (КОЕ/мл), способность данных микроорганизмов к биолюминесценции никак не проявляется. В то же время в специализированных светящихся органах – фотофорах различных морских животных, где бактерии обеспечиваются питательными веществами и достигают плотности до 1·10¹¹ КОЕ/мл, происходит интенсивная экспрессия lux-оперона с соответствующим появлением яркого свечения.

Изучение природы данного явления позволило констатировать, что экспрессия lux-оперона обеспечивается механизмом, действующим по принципу положительной обратной связи и опосредованным накоплением в среде низкомолекулярных веществ – автоиндукторов. Последние образуются и выделяются клетками на всех фазах роста, в связи с чем их концентрация в среде пропорциональна плотности бактериальной популяции. При достижении же определенного порогового значения автоиндукторы ведут к активизации свечения образующих их бактерий, соответственно оказывающемся возможным только при высокой плотности бактериальной популяции. В силу указанного обстоятельства описанное явление получило наименование «чувство кворума» (англ. – quorum sensing) [29], которое было предложено в 1994 году [30].

Эффект кворума был впервые обнаружен у морских биолюминесцирующих бактерий V. fischeri и V. harveyi.

Анализ химической природы автоиндуктора биолюминесценции позволил идентифицировать его как N-(3-оксогексаноил)гомосеринлактон (первоначальное название f-кетокапролил гомосеринлактон) [31]. При этом важной особенностью подобной молекулы, лежащей в основе осуществляемой ей функции, является способность к свободной диффузии через цитоплазматическую мембрану как во внешнюю среду, так и в обратном направлении [15].

 

 

1.1.2 Использование люминесцирующих микроорганизмов в качестве биосенсоров для оценки биотоксичности различных сред и соединений

 

 

Впервые указания на возможность использования феномена бактериальной биолюминесценции в исследовательских, а также аналитических целях были представлены в работах Мартина Бейеринка. Позднее в 30 – 40 годах ХХ века свечение бактерий было использовано для определения наркотиков, токсинов и антибиотиков.

К настоящему моменту разработано большое число разнообразных биолюминесцентных тестов, среди которых наибольшую популярность завоевали методы оценки качества окружающей среды. При этом востребованность последних определяется возрастающим вниманием к проблеме техногенного загрязнения природных экосистем.

В настоящее время традиционно используются методы химического анализа, позволяющие с достаточно высокой точностью количественно оценивать присутствие отдельных поллютантов и после сопоставления полученных величин с нормативными значениями – предельно допустимыми концентрациями (ПДК) делать заключение об уровне загрязнения и степени его опасности или безопасности для здоровья человека [32]. Недостатком подобного подхода является то, что количество веществ, для которых разработаны методики определения и обоснованы значения ПДК составляет лишь несколько сотен, в то время как общее количество производимых человеком веществ и соединений гораздо выше.

Все это способствовало созданию методов интегральной оценки качества природных сред с использованием живых организмов, в наиболее общем виде подразделяемых на биоиндикацию и биотестирование. В первом случае заключение делается на основе обнаружения реакций изначально присутствующих в исследуемых средах организмов, а во втором – о качестве среды судят по выживаемости, состоянию или поведению специально вносимых в нее биологических тест-объектов. Соответственно, выбор таких организмов определяется требованиями к их высокой чувствительности к определяемым загрязнителям, а также четкости и воспроизводимости регистрируемых реакций [15].

Имеющиеся интегральные биотесты с использованием живых организмов (парамеций, водорослей, дафний, рыб и так далее) имеют ряд недостатков, таких как трудоемкость, плохая воспроизводимость результатов, длительность анализа, трудности количественной оценки. На этом фоне биотесты на основе светящихся бактерий часто превосходят известные биотесты по быстродействию, точности, чувствительности и простоте, позволяют контролировать одновременно значительное число токсикантов [32].

Впервые биотест, основанный на использовании люминесцирующих бактерий, был предложен в 1963 году и доведен до уровня лабораторной технологии к началу 80 годов XX века [33].

В основу практического использования светящихся микроорганизмов положен анализ активности их люминесцентной системы, находящейся на пересечении основных метаболических путей бактериальной клетки и потому отвечающей изменением интенсивности свечения, пропорциональным суммарному воздействию всей совокупности находящихся в среде химических поллютантов (рисунок 4) [34]. Соответственно, возможными реакциями являются отсутствие изменения уровня свечения, его повышение или снижение, в последнем случае однозначно интерпретируемое как развитие токсического эффекта.

В настоящее время для определения люминесцентного биотестирования предложено использование более десяти природных морских и наземных светящихся бактерий, а также трансгенных штаммов микроорганизмов с клонированными в них lux-генами, выпускаемыми как российскими, так и зарубежными производителями [35].

 

 

Рисунок 4 – Изменение свечения люминесцирующих микроорганизмов под действием увеличивающихся концентраций токсикантов

 

Наибольшее применение за рубежом нашли биотесты на основе природных морских светящихся бактерий V. fischeri. Данные биотесты, произведенные в США, получили название Microtox, в Великобритании – LUMIStox, в Германии – ToxAlert, в Финляндии – BioTox (таблица 3).

Однако биотесты на основе V. fischeri, имеют свои особенности. Так, например, биотест Microtox широко используется в лабораторных и полевых исследованиях для контроля качества промышленных и природных вод, пищевых продуктов, определения степени токсичности вновь создаваемых химических соединений и фармацевтических препаратов [36], а также в медицинских исследованиях [37]. Европейский аналог данной системы представлен биосенсором LUMIStox, используемый для определения острой и хронической токсичности. Данный биотест применяется при первичном скрининге для определения токсичности поверхностных и сточных вод, индустриальных отходов [38]. Некоторые же особенности заключаются также в инструментальном обеспечение реализуемых технологий, включающем кюветный люминометр LUMIStox-300 с адаптированным программным обеспечением LUMISsoft-III и термостатом на 30 кювет, поддерживающим рекомендуемую для проведения исследования температуру 15 °С. Другой биолюминесцентный биотест ToxAlert  используется для скринингового тестирования токсичности почвы, воздуха, сточных и поверхностных вод. Именно он получил столь широкое распространение в странах Западной Европы и Северной Америки [39]. Что касается системы BioTox, то он используется для тестирования водных образцов, таких как индустриальные отходы, сточные воды, осадочные отложения, питьевая вода, вода хозяйственного назначения. Некоторые же инновации заключаются в разработке модифицированного «BioTox flash test», предназначенного для исследования твердых и окрашенных проб. Его суть заключается в кинетическом измерении интенсивности свечения сразу после смешивания биотеста и анализируемого образца.

Таблица 3 – Наиболее известные бактериальные биолюминесцентные тест-системы, применяемые для исследования интегральной биотоксичности природных сред

Коммерческое название	Индикаторный микроорганизм	Производитель	Соответствие нормативам
На основе природных люминесцирующих микроорганизмов
Microtox	Vibrio fischeri NRRL B-11177	AZUR Environmental, США	ISO №11348
LUMIStox	Vibrio fischeri NRRL B-11177	Dr. LANGE, Великобритания	ISO №11348
ToxAlert	Vibrio fischeri NRRL B-11177	Merk, Германия	ISO №11348
BioTox	Vibrio fischeri NRRL B-11177	Aboatox Oy, Финляндия	ISO №11348
Микробиосенсор B-17 677f	Photobacterium phosphoreum	ИБСО РАН, Красноярск Россия	КНД 211.1.4.060-97 (Украина)
Эколюм-1	Vibrio fischeri	МГУ имени Ломоносова, Москва Россия	МР № 01.017-07 № 01.017-07 № 01.019-07 № 01.020-07 № 01.021-07
Эколюм-2	Vibrio harveyi	МГУ имени Ломоносова, Москва Россия	МР № 01.017-07 № 01.017-07 № 01.019-07 № 01.020-07 № 01.021-07
На основе трансгенных штаммов с генами люминесцирующей системы
Микробиосенсор ЕСК	Escherichia coli c lux-опероном P. leiognathi	ИБСО РАН, Красноярск Россия	КНД 211.1.4.060-97 (Украина)
Эколюм-4, 5, 7, 9	Escherichia coli с lux-оперонами P. leiognathi	МГУ имени Ломоносова, Москва Россия	МР № 01.017-07 № 01.017-07 № 01.019-07 № 01.020-07 № 01.021-07
Эколюм-8	Escherichia coli с lux-оперонами P. luminescence	МГУ имени Ломоносова, Москва Россия	МР № 01.017-07 № 01.017-07 № 01.019-07 № 01.020-07 № 01.021-07

 

При этом подобный однотипный выбор светящихся микроорганизмов для создания различных тест-систем определяется возрастающими требованиями к максимальной стандартизации аналитических технологий в системе контроля качества окружающей среды. В результате же того, что международной системой контроля качества ISO №11348 «Water Quality – Determination of the Inhibitory Effect of Water Samples on the Light Emission of Vibrio fischeri (Luminescent Bacteria Test)» [40] для проведения токсикологических исследований узаконено использование только этого люминесцирующего микроорганизма, именно он получил столь широкое распространение в странах Западной Европы и Северной Америки.

В России подобные биосенсоры были предложены в Институте биофизики СО РАН в 1983 году [41], разработанные на основе морских светящихся бактерий под коммерческим названием «Микробиосенсор B-17 677f». Однако основой при их создании послужили природные светящиеся морские микроорганизмы Photobacterium phosphoreum. Данная коммерческая тест-система «Микробиосенсор B-17 677f» используется в лабораторных и полевых исследованиях для контроля качества промышленных и природных вод, определения степени токсичности химических соединений и фармацевтических препаратов. Там же разработан «Микробиосенсор ЕСК», сконструированный на основе генетически модифицированного штамма E. coli Z905, несущего плазмиду pHL1 с lux-опероном из морской люминесцирующей бактерии P. leiognathi [42]. Данный биосенсор используется в лабораторных и полевых исследованиях для контроля качества промышленных и природных вод, определения степени токсичности химических соединений и фармацевтических препаратов. Биотесты «Микробиосенсор ЕСК» являются стандартными тест-объектами для измерения интегральной токсичности исследуемых водных образцов, а также исключают необходимость культивирования и поддержания бактериальных культур с маркерным lux-геном. Упомянутые ранее биотесты рекомендованы для биотестирования на территории Украины, согласно нормативному документу КНД 211.1.4.060-97 «Методика визначення токсичностi води на бактерiях Photobacterium phosphoreum (Cohn) Ford» [43].

В России в МГУ имени М. В. Ломоносова также разработана серия люминесцирующих биосенсоров под общим названием «Эколюм» (экологическая люминометрия), рекомендованных методическими рекомендациями МР № 01.017-07, МР № 01.019-07, МР № 01.020-07 [44, 45, 46]. Первые из них были созданы на основе природных морских микроорганизмов, несущих гены люминесцентной системы V. fischeri («Эколюм-1») и V. harveyi («Эколюм-2»), и предназначены для определения острой химической токсичности питьевых, пресных поверхностных, грунтовых, сточных вод, а также атмосферы и почвы. Там же разработана серия «Эколюм», большинство из которых несет гены люминесцентной системы P. leiognathi («Эколюм-4», «Эколюм-5», «Эколюм-7», «Эколюм»), P. luminescens («Эколюм-8») встроенной в генетически модифицированный штамм E. coli [47]. Данные биосенсоры применяются для тестирования поверхностных, грунтовых, сточных, промышленных вод, атмосферных осадков, питьевых вод, почвы, а также различных химических соединений. Среди них наибольшее распространение при определении интегральной биотоксичности различных природных сред получил биосенсор «Эколюм». В сравнении с тест-системами на основе морских люминесцирующих бактерий «Эколюм» более прост в обращении. В этой связи начиная с 2000 года люминесцирующие бактериальные биотесты «Эколюм», а также реализуемые с их использованием технологии экспресс-оценки интегральной токсичности различных объектов окружающей среды, получили в Российской Федерации нормативную поддержку со стороны Федерального центра Госсанэпиднадзора Минздрава РФ (ныне – Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека). При этом действующие рекомендации устанавливают методики определения острой химической токсичности питьевых, поверхностных пресных, грунтовых, сточных и очищенных сточных вод, а также атмосферных осадков, интегральной химической токсичности водных вытяжек из почвы, токсичности проб воздуха или отдельных химических соединений, различных материалов, изделий и упаковок, включая полимеры и полимерсодержащие строительные материалы, изделия и конструкции, материалы, применяемые в водоснабжении и в качестве материалов, контактирующих с пищевыми продуктами. Кроме того, методика определения интегральной токсичности поверхностных пресных, грунтовых, питьевых, сточных и очищенных сточных вод, водных экстрактов объектов окружающей среды с использованием тест-объекта биолюминесцентных микроорганизмов «Эколюм» поддерживается сертификатом Комитета по стандартизации и метрологии РФ № 01.19.231/2000. Несмотря на подобное разнообразие бактериальных люминесцирующих биотестов, поиск микроорганизмов для создания на их основе новых тест-систем продолжается.

Таким образом, в настоящее время метод биолюминесцентного тестирования является одним из перспективных методов оценки биотоксичности различных сред и соединений, в основе которого лежит использование природных или генно-инженерных люминесцирующих микроорганизмов, а также выделенных из них ферментных систем генерации свечения.

 

 

1.2 Проблемы оценки биотоксичности углеродных наноматериалов

 

 

В настоящее время углеродные наноматериалы получают все большее распространение во всех сферах человеческой деятельности. Приставка «нано» происходит от греческого слова «nannos», которое переводится как «карлик» и означает одну миллиардную часть чего-либо [48].

На данный момент круг наноматериалов довольно широк. Углеродные наноматериалы (УНМ) представляют собой инженерно спроектированные микроскопические образования, имеющие размеры не более 100 нм. Среди них различают углеродные нанотрубки, нановолокна и фуллерены.

Различные УНМ были открыты в разное время и нельзя назвать точную дату их открытия. Так, например, общепризнанным является факт наблюдения структуры многостенных нанотрубок в 1991 году С. Иджимой, где в своей статье он ввел термин «углеродные нанотрубки» [49]. Однако до его работ в 1952 году российскими учеными Л. В. Радушкевичем и В. М. Лукъяновичем были опубликованы первые электроно-микроскопические изображение структур, которые мы сегодня называем углеродными нанотрубками [50].

Фуллерены были открыты в 1985 году группой зарубежных исследователей: Р. Керлом, Р. Смолли (США), Х. Крото (Великобритания), за что им в 1996 году была присуждена Нобелевская премия по химии. Они предложили название новой молекулы – бакминстерфуллерен, в честь американского архитектора Р. Бакминстера Фуллерена, автора концепции геодезических куполов – зданий-многогранников. Однако возможность существования молекул, состоящих только из атомов углерода, помещенных в вершины выпуклого многогранника было предвидено задолго до экспериментального открытия фуллеренов несколькими учеными из разных стран (Д. Джонсоном в 1966 году, Э. Осавой в 1970 году, Д. А. Бочваром,         Е. Г. Галлерном, И. В. Станкевичем в 1973 году) [51].

В 1993 году две группы ученых (из Японии и Калифорнии) независимо друг от друга впервые получили и идентифицировали одностенные углеродные нанотрубки [52, 53]. А в 1950 году были обнаружены углеродные наволокна с помощью электронной микроскопии советскими учеными Л. В. Радушкевичем и В. М. Лукьяновичем [50].

Нанотрубки представляют собой протяженные цилиндрические структуры диаметром от одного до нескольких десятков нанометров и длиной до нескольких сантиметров, состоят из одной или нескольких свернутых в трубку графитовых (гексагональных) плоскостей (графенов) и обычно заканчиваются полусферической головкой [54]. При этом различают одностенные, состоящие из одного слоя атомов углерода и многостенные нанотрубки – из множества сгруппированных углеродных трубок (рисунок 5).

 

Рисунок 5 – Схематическое изображение (А) и АСМ-изображения (Б) одностенных (1) и многостенных (2) углеродных нанотрубок

Многостенные нанотрубки отличаются от одностенных значительно более широким разнообразием форм и конфигурацией. Разнообразие структур проявляется как в продольном, так и в поперечном направлении.

Углеродные нановолокна – это семейство конструкционных волокон, имеющих диаметр менее 100 нм, содержащие внутреннюю полость с перегородками и состоящие из вложенных друг в друга искаженных конусов с графеновыми (сетки, подобные слоям в графите) стенками (рисунок 6).

 

Рисунок 6 – Схематическое изображение (А) и АСМ-изображения (Б) углеродных нановолокон

 

Фуллерены – это молекулярные соединения, принадлежащие классу аллотропных форм углерода (другие – алмаз, карбин и графит) и представляющие собой выпуклые замкнутые многогранники, составленные из четного числа трех координированных атомов углерода. Среди фуллеренов известно множество частиц изомеров от малых (С20, С28) до гигантских (С240, С1840) с совершенно различными свойствами (рисунок 7) [55]. Наиболее распространенным является фуллерен C60, который представляет собой замкнутую сферу, составленную из правильных 12 пятиугольников и 20 шестиугольников с атомами углерода в вершинах [48].

 

 

Рисунок 7 – Схематическое изображение (А) и АСМ-изображения (Б) фуллеренов

Все УНМ обладают уникальными физико-химическими свойствами, отличными от веществ более крупного размера, среди которых выделяют:

• Увеличение химического потенциала веществ на межфазной границе высокой кривизны, что существенно изменяет растворимость, реакционную и каталитическую способность наночастиц и их компонентов.
• Большая удельная поверхность наноматериалов увеличивает их адсорбционную емкость, химическую реакционную способность и каталитические свойства, что может приводить, в частности, к увеличению продукции свободных радикалов и активных форм кислорода, и далее к повреждению биологических структур (липиды, белки, нуклеиновые кислоты, в частности, ДНК).
• Небольшие размеры и разнообразие форм наночастиц позволяют связываться с нуклеиновыми кислотами, белками, встраиваться в мембраны, проникать в клеточные органеллы и, тем самым, изменять функции биоструктур. При этом процессы переноса наночастиц в окружающей среде с воздушными и водными потоками, их накопление в почве, донных отложениях могут также значительно отличаться от поведения частиц веществ более крупного размера.
• Высокая адсорбционная активность определяет их свойства высокоэффективных адсорбентов, гидрофобные свойства или увеличение адсорбции на них различных токсикантов.
• Высокая способность к аккумуляции позволяет не распознаваться защитными системами организма, не подвергаться биотрансформации и не выводиться из организма, что приводит к накоплению наноматериалов в растительных, животных организмах, а также микроорганизмах, передаче по пищевой цепи, что, тем самым, увеличивает их поступление в организм человека.

Благодаря невероятным особенностям в настоящее время наблюдается массовое внедрение УНМ в промышленность, косметологию, фармакологию, медицину и так далее.

Несмотря на кажущуюся хрупкость, углеродные нанотрубки оказались на редкость прочными при нагрузках как на растяжение, так и на изгиб. Они в десять раз прочнее и в шесть раз легче стали. К тому же нанотрубки не только прочные, но и гибкие. По своему поведению они напоминают не ломкие соломинки графитовых стержней, а жесткие резиновые трубки. Одностенные нанотрубки могут упруго удлиняться на 16 %. Более того, даже при механических напряжениях, превышающих критические, а также при серьезных воздействиях тепла или излучения нанотрубки не «рвутся» и не «ломаются», а перестраиваются [56].

Таким образом, углеродные нанотрубки вскоре окажутся везде, где необходимо сочетание прочности с гибкостью и малым весом. На их основе уже созданы искусственные мускулы, активные элементы измерительных устройств, определяющих нанометровую структуру поверхностей, сверхлегкие и сверхпрочные ткани для одежды пожарных и космонавтов [57]. Углеродные нановолокна связывают с созданием композитов на основе промышленных полимерных материалов (электропроводные композиты, композиты для защиты от электромагнитных излучений, ударопрочные композиты).

Первые теоретические предсказания электронных свойств одностенных нанотрубок были сделаны в 1992 году, а экспериментально подтверждены через шесть лет [58]. При этом электрические параметры одностенных углеродных нанотрубок характеризуются значительным разбросом, что связано с многообразием их структурных особенностей, обусловленным различиями методов и условий синтеза и очистки [59].

Углеродные нанотрубки в зависимости от расположения атомов углерода в их стенках проявляют полупроводниковую или металлическую проводимость. Благодаря этому их применяют как проводящие элементы в наноэлектронике [60]. В 1998 году создан полевой транзистор на основе индивидуальной полупроводниковой нанотрубки и в 2001 году – логические схемы на таких приборах [61].

Разрабатываются зонды, состоящий из углеродных нанотрубок, применяемые в атомно-силовой микроскопии [62]. Их также используют в качестве наноинденторов для измерения микротвердости.

В оптике же соединения наноуглерода применяют для создания дисплеев, светодиодов, оптических сенсоров, в качестве оптических элементов лазерных систем.

В пищевой промышленности наноматериалы находят применение в фильтрах для очистки воды, при получении более легких, прочных, термически устойчивых и обладающих антимикробным действием упаковочных материалов, при обогащении пищевых продуктов микронутриентами. Использование наночипов предполагается для идентификации условий и сроков хранения пищевой продукции и обнаружения патогенных микроорганизмов.

Создание нанокосметики стало настоящим прорывом в косметологии. Благодаря нанотехнологиям питательные вещества, содержащиеся в кремах, сыворотках, пилингах и других препаратах достигли размера наномолекул, что позволяет всем важным элементам беспрепятственно попадать по назначению. Благодаря наноразмерам, все ингредиенты легко попадают в кожу.

В фармакологии наночастицы и нанотехнологии применяются с целью уменьшения дозы лекарств при увеличении избирательности действия за счет изменения их фармакокинетических и фармакодинамических свойств. Одним из путей достижения этой цели стало снабжение лекарств переносчиками – наночастицами, нанокапсулами, нанотрубками и другими носителями, обеспечивающими пролонгированное поступление лекарств в определенные органы, ткани и клетки-мишени, а также улучшение фармакокинетических параметров препарата. Нанопереносчики способствуют проникновению лекарств через гематоэнцефалический барьер. Делаются успешные попытки использовать такие нанопереносчики лекарств при лечении заболеваний нервной системы – эпилепсия, болезнь Альцгеймера, глиома, болевые синдромы [63].

В медицине их используют в качестве протезов, биосовместимых имплантатов, искусственных органов чувств, для устранения различных дефектов костей, в том числе связанных с удалением опухолей, травмами, патологией развития. Фуллерены применяют для борьбы с онкологическими заболеваниями, для лечения артритов [64]. В будущем предполагается создание медицинских нанороботов, которые будут иметь микронные размеры, позволяющие двигаться по капиллярам, и состоять из углерода. Лечение будет заключаться во введении их в человеческое тело для дальнейшего анализа ситуации и принятия решения о выборе метода лечения. Врач будет управлять ими, получая информацию от активных нанороботов [65].

Одним из достижений современных нанотехнологий является их активное внедрение в различные области биологии и медицины, приведшее к возникновению таких новых направлений в науке, как нанобиотехнология и наномедицина [66].

В связи с широким применением УНМ остро встает вопрос об их влияние на биологические объекты, для которых они используются.

Имеющиеся в настоящее время в небольшом количестве исследования в этом направлении указывают на то, что наноматериалы могут быть токсичными, тогда как их эквивалент в обычной форме в этой же концентрации безопасен [3]. Однако, первые результаты изучения биологической активности наноуглерода оказались достаточно противоречивыми. Так в работах некоторых авторов сообщаются о том, что углеродные нанотрубки оказывали положительный медицинский эффект при регенерации костной ткани [8], обладали повышенным сродством к липидным структурам, образовывали стабильные комплексы с пептидами и ДНК-олигонуклеотидами, что обуславливает их применение в виде эффективных систем доставки вакцин и генетического материала, также устанавливали способность фуллеренов проявлять противовирусную активность, инактивировать свободные радикалы кислорода [67]. При этом антиоксидантная эффективность фуллеренов зависела от числа активных центров и расстояния между активными центрами и атомами-мишенями [68].

В противоположность этому в других трудах делают вывод о том, что наночастицы углерода вызывали повреждение ДНК, клеточных мембран и органелл, проявляли возможную генотоксичность, цитотоксичность, способствовали усилению транспорта потенциально токсичных компонентов через барьеры организма, проявляли генотоксичность и аллергезирующее действие [3].

УНМ могут проникать в клетки и избирательно накапливаться в разных типах клеток и клеточных компартментах сходных клеток, способны к трансцитозу через эпителиальные и эндотелиальные клетки, могут распространяться по ходу дендритов и аксонов, кровеносных и лимфатических сосудов, вызывать окислительный стресс и воспаление [69].

Многие авторы охарактеризовали нанотрубки как достаточно сильный дыхательный токсикант [70]. Предполагается, что наноматериалы способствуют раку легких [71].

В связи с этим необходимо, чтобы каждый индивидуальный наноматериал был в полной мере изучен в токсикологическом аспекте с определением допустимой суточной дозы или условно переносимого недельного (месячного) поступления.

Поскольку наноматериалы обладают совершенно иными физико-химическими свойствами и биологическим действием, чем вещества в обычном физико-химическом состоянии, то существующие в настоящее время методология оценки риска, основывающиеся на полной токсикологической оценке конкретного вещества или соединения, определении зависимости «доза-эффект» может быть неприменима (или применима ограниченно) вследствие следующих причин:

• Токсичность наночастиц не может быть выведена по сравнению с аналогами в макродисперсной форме или в виде сплошных фаз, так как токсикологические свойства наноматериалов являются результатом не только их химического состава, но и разнообразия их других особенностей, таких как поверхностные характеристики, размер, форма, состав, химическая реактивность и другие, рассмотренные ранее.
• Имеющиеся токсикологические методологии основаны на определении токсичности вещества относительно массовой концентрации, что не приемлемо для наноматериалов, для которых одним из основных определяющих свойств будет величина площади поверхности или число наночастиц.
• Отсутствуют стандартизованные индикаторы нанотоксичности, которые должны обязательно учитывать вклад таких характеристик, как поверхностные характеристики, размер, форма, состав, химическая реактивность составляющих их частиц.
• Отсутствуют данные об органах-мишенях действия конкретных наноматериалов.
• Методы выявления, идентификации и количественного определения наноматериалов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и биосредах, которые могли бы достоверно отличить их от химических аналогов в макродисперсной форме, не достаточно разработаны.
• Отсутствуют или недоступны новые базы данных и математические модели, опирающиеся на достижения биоинформатики и на экспериментальные данные по токсичности отдельных наноматериалов [3].

Совокупность изложенных факторов свидетельствует о том, что наноматериалы обладают комплексом физических, химических свойств и биологическим действием, которые часто радикально отличаются от свойств этого же вещества более крупного размера, в связи с чем они относятся к новым видам материалов и продукции, характеристика потенциального риска которых для здоровья человека и состояния среды обитания во всех случаях является обязательной [4].

Сложившаяся ситуация требует от медицинских и биологических наук обоснование и разработку адекватных методических подходов к исследованию рисков, возникающих при контакте биологических систем с наноматериалами.

В связи с этим в России 31 октября 2007 года была утверждена Концепция токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов, регламентированная на поиск методов оценки биотоксичности наноматериалов [3]. В ней дана характеристика новых свойств и поведения наноматериалов в окружающей среде и биологических объектах, рассмотрены особенности оценки риска производства и использования наноматериалов, представлен анализ сведений о безопасности производства и использования наноматериалов и определен порядок организации надзора и проведения токсикологических исследований наноматериалов. Впоследствии была написана статья главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко «Обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия населения в условиях расширенного использования наноматериалов и нанотехнологий». В данной статье говорилось о широком применении наноуглерода и возможных рисков, связанных с их использованием, а также указывалась необходимость изучения их потенциального вреда для здоровья человека и состояния среды его обитания [4].

Ответом на данный запрос стала разработка методического указания МУ 1.2.2634-10 «Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза». Данный документ разработан с целью обеспечения единства измерений и адаптации имеющихся методов и средств измерений в ходе оценки безопасности наноматериалов. Методическое указание предлагает следующие методы оценки безопасности водорастворимых наноматериалов: с помощью люминесцентного бактериального теста, который основан на определении изменения интенсивности биолюминесценции генно-инженерного штамма P. leiognathi при воздействии водорастворимых наноматериалов, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем и количественный метод оценки безопасности водорастворимых наноматериалов при помощи ростовых микробиологических тестов, при котором безопасность наноматериалов оценивается путем изучения влияния на ростовые свойства колоний почвенных микроорганизмов, растущих на поверхности агаризованных питательных сред [72]. Однако они позволяют оценить биотоксичность только для водорастворимых углеродных наноматериалов, что оставляет вопрос нахождения методов оценки биотоксичности наноматериалов в частности УНМ открытым.

 

2 Материалы и методы исследования

 

2.1 Материалы исследования

 

2.1.1 Биосенсор «Эколюм»

 

 

Биосенсор «Эколюм» представляет собой лиофилизированные культуры люминесцентных бактерий, содержащиеся в среде инертных газов в специальных стеклянных флаконах, выпускаемый ОАО «Иммунотех» (Россия). Данный биосенсор создан на основе рекомбинантного штамма Escherichia coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE-генами природного морского люминесцирующего микроорганизма Photobacterium leiognathi (рисунок 8) [73].

 

 

Рисунок 8 – Изображение биосенсора «Эколюм» (А) и электронная микрофотография культуры бактерий Escherichia coli (Б)

 

1. E. coli принадлежит к домену Bacteria, отделу Proteobacteria, классу – Gammaproteobacteria, порядку – Vibrionales, семейству – Enterobacteriaceae, роду – Escherichia.

Большинство представителей данного вида являются комменсалами, то есть представителями нормальной микрофлоры кишечника человека и других млекопитающих. По своей морфологии E. coli – мелкие грамотрицательные палочки длинной от 2 до 3 мкм, шириной от 0,5 до 0,7 мкм с закругленными концами, в мазках располагаются беспорядочно, не образуют спор, некоторые штаммы имеют микрокапсулу, перитрихии, кроме жгутиков, иногда обнаруживаются пили. E. coli являются факультативными анаэробами. Бактерии хорошо растут на простых питательных средах, таких как мясопептонный агар (МПА) и мясопептонный бульон (МПБ). Рост наблюдается при температуре от 10 ^оС до 46 ^оС, но оптимальной является температура в              37 ^оС, что согласуется с температурным пределом функционирования люциферазы светящихся бактерий (40 ^оС) [74].

Явление люминесценции у природных изолятов E. coli не регистрируется. Однако с использованием методов молекулярной генетики стала возможна разработка люминесцирующих штаммов E. coli, несущих luxCDABE-гены природных люминесцирующих микроорганизмов.

В сравнении с тест-системами на основе морских люминесцирующих бактерий «Эколюм» более прост в обращении и не имеет таких ограничений, как проведение измерений при пониженной до плюс 15 ^оС температуре или осмотическая коррекция анализируемых проб.

В настоящее время биосенсор «Эколюм» рекомендован национальными российскими нормативами для оценки биотоксичности наноматериалов [72].

 

 

2.1.2 Углеродные наноматериалы

 

 

УНМ представляют собой новую аллотропную форму углерода в виде замкнутых, каркасных систем.

В качестве объектов исследования использованы шесть образцов коммерчески доступных одностенных углеродных нанотрубок (ОУНТ), производимых фирмой «НаноКарбЛаб» (Россия) [75]. Первый образец представляет собой ОУНТ, непосредственно изолированные из реакционной зоны, выпускаемые под коммерческим названием R154s. Двумя следующими вариантами являются ОУНТ, прошедшие процедуру экстракции толуолом и кислотной обработки HCl и HNO₃ с последующим тепловым окислением на воздухе и содержащие от 2 % до 5 % концевых COOH-групп (L163_ol и K106-COOH). Четвертый образец представляет собой их укороченные варианты и содержит от 5 % до 10 % концевых COOH-групп (K103). Следующий препарат – ОУНТ, содержащие от 2 % до 5 % концевых NH₂-групп, характеризующиеся более высоким уровнем очистки от технологических примесей, чем вариант ОУНТ  K106-COOH и имеющие коммерческое название K106-NH₂. Последним образцом, принадлежащим фирме «НаноКарбЛаб», являются ОУНТ с отожженными под вакуумом концевыми СООН-группами (97_ot).

Исследованные лабораторные образцы были также представлены синтезированными в Российском химико-технологическом университете имени Д. И. Менделеева нановолокнами (НВ) и их вариантами, полученными в результате кислотной функционализации (НВФ). Следующими препаратами, используемыми в исследовательской работе, являются синтезированные в Институте проблем химической физики Российской Академии наук многостенные углеродные нанотрубки, имеющие коммерческое название MWNT, С60- и С70-фуллерены (C60, C70), а также аморфный углерод (S180).

Данные образцы УНМ характеризовались высокой степенью очистки, исключением стал образец R154s, имеющий низкую степень очистки, составляющую около 50 %.

Таким образом, объектами исследования явились двенадцать образцов УНМ, отличающихся своей морфологической организацией, характером функционализации, а также степенью очистки от технологических примесей, представленных компонентами катализаторов, используемых в технологиях структурирования наноуглерода.

 

 

2.2 Методы исследования

 

2.2.1 Метод биолюминесцентного анализа

 

 

Биотестирование на основе биолюминесцентного анализа имеет значительное преимущество перед другими тест-объектами. Биолюминесцентные методы обладают высокой чувствительностью, широким диапазонам применения и высокой информативностью, благодаря уникальным свойствам биотеста – изменять уровень биолюминесценции после воздействия на тест-объект, как отдельного вещества, так и группы одновременно присутствующих химических соединений в анализируемой пробе.

Биолюминесцентный анализ – один из перспективных методов исследования, в основе которого лежит использование природных или генно-инженерных люминесцирующих микроорганизмов, а также выделенных из них ферментных систем генерации свечения [32]. Данный метод основан на измерении уровня биолюминесценции тест-систем, инкубируемых в контакте с анализируемым раствором относительно уровня биолюминесценции тех же бактерий, находящихся в контрольном растворе, не содержащем токсичных веществ.

Уровень интенсивности биолюминесценции измеряется специальными приборами – биолюминометрами, серии БЛМ. В настоящее время разработаны биохемилюминесцентные анализаторы различных назначений и конструкций. Эти приборы являются одно и много кюветными автоматическими анализаторами, управляемыми встроенными микропроцессорами и современными персональными компьютерами. Биолюминометры имеют термостатированное кюветное отделение, в котором заданная температура поддерживается с использованием полупроводниковых термоэлектрических охлаждающих модулей. В отдельных приборах предусмотрено перемешивание реагентов в измерительной кювете. Принцип действия биолюминесцентных анализаторов основан на регистрации светового излучения в видимой сине-зеленой области спектра от 420 до 600 нм с максимумом при 495 нм, возникающего в люминесцирующих бактериях при специфических ферментативных реакциях.

При регистрации биолюминесценции нами использовался микропланшетный люминометр LM-01Т («Immunotech», Чехия) (рисунок 9).

Данная модель предназначена для измерения люминесценции при кoмнaтнoй тeмпepaтype либо при 37 ^оC в клиничecкиx, биoxимичecкиx и aнaлитичecкиx лaбopaтopияx. Предлагается два типа пpoгpaммнoгo oбecпeчeния: LIANA и KILIA для выбора метода измерения, оценки и архивирования данных. Нами использовалась программа KILIA, представляющая собой oпepaционную cиcтeму Windows 95 или 98, пpeднaзнaчeнную для динaмичecкoгo измepeния любых типов люминecцeнции, вcecтopoннeй xapaктepиcтики измepeнныx кpивыx, зaпиcи дaнныx и мaнипyляций с ними.

 

 

 

Рисунок 9 – Микропланшетный люменометр LM-01T

 

Микропланшетный люменометр LM-01T являeтcя чpeзвычaйнo гибкой мoдeлью блaгoдapя paздeлeнию кoмaнд тexничecкoгo и пpoгpaммнoгo oбecпeчeния и вoзмoжнocти пpoвoдить aнaлизы с иcпoльзoвaниeм любoгo вида люминecцeнции (биo- и xeмилюминecцeнции). B данной модели могут использоваться микропланшеты вcex cтaндapтныx типов.

Для оценки токсичности проб используют величины биолюминесцентного индекса (БЛИ), рассчитанного как отношение интенсивности свечения в опытной пробе к интенсивности свечения в контрольной пробе по указанной формуле

 

                                                                                                                   (3)

где I₀ – интенсивность свечения в опытной кювете;

      I_k – интенсивность свечения в контрольной кювете.

 

В соответствии с действующими нормативами изменение биолюминесценции не более чем на 20 % по отношению к контролю позволяло оценивать пробы как нетоксичные, от 20 % до 50 % – как токсичные и более   50 % – как сильно токсичные (рисунок 10).

Существует еще один параметр определения химической токсичности, который в большей степени характерен для токсикологии – индекс токсичности (Т), который вычисляется по формуле

 

                                                                                                             (4)

где I_k – интенсивность свечения в контрольной кювете;

      I₀ – интенсивность свечения в опытной кювете.

Индекс токсичности и биолюминесцентный индекс – это два аналогичных параметра с той лишь разницей, что отсчет при использовании индекса токсичности проводится от нуля, а при использовании биолюминесцентного индекса – от единицы. При этом расчет с помощью биолюминесцентного индекса позволяет определять значения токсичности, когда интенсивность свечения в контрольной пробе меньше интенсивности свечения в опытной пробе.

 

 

Рисунок 10 – Пределы значений биолюминесцентного индекса для определения токсичности образца

 

Зависимость БЛИ от концентраций исследуемых образцов позволяет для каждого из анализируемых образцов определить два параметра – EC₂₀ и EC₅₀ (ЕС – эффективная концентрация), соответствующих распространенным токсикологическим параметрам LD₂₀ и  LD₅₀ соответственно (LD – летальная доза) [73]. Эти параметры показывают, при каких концентрациях исходного слабо токсического образца достигается установленный предел токсичности (LD₂₀ и/или LD₅₀) или при каких разведениях сильно токсический образец станет безопасным (величины менее LD₂₀). ЕС₅₀ есть эффективная концентрация образца, вызывающая тушение свечение биосенсора на 50 % по сравнению с контролем. В этом случае образец сильно токсичен. ЕС₂₀ есть эффективная концентрация образца, которая приводит к 20 % тушению свечения биосенсора по сравнению с контролем. Все значения величин менее ЕС₂₀ свидетельствуют о том, что образец безвреден для человека.

Перед биотестированием необходимо провести предварительную подготовку посуды, рабочего места и образцов наноматериалов для исследования их на токсичность. Все процедуры предварительной подготовки должны исключать попадание посторонних токсичных, органических и каких-либо других веществ в исследуемый образец.

Реконструкцию биосенсора «Эколюм» проводят согласно инструкции, включающей:

• Вскрытие флакона с лиофилизированным биореагентом. Для получения суспензий бактерий добавить 10 мл охлажденной до 8 ^оС дистиллированной воды. Желательно использовать стерилизованную дистиллированную воду. Рекомендуется несколько раз встряхнуть флакон с суспензией бактерий.
• Хранение суспензий бактерий в холодильнике в течение 30 минут при температуре плюс 4 ^оС.
• Доведение температуры суспензий бактерий до комнатной температуры (25 ^оС). Рекомендуется перемешивание рабочих суспензий бактерий перед отбором определенных объемов для проведения анализа.

Если у биосенсора истек гарантийный срок хранения и/или он стал плохо растворяться в охлажденной дистиллированной воде, рекомендуется более энергично его встряхивать и отфильтровать суспензию бактерий через бумажный фильтр. Биосенсор, содержащийся при температуре от 2 ^оС до 4 ^оС, имеет гарантированный срок хранения не менее шести месяцев.

Для создания суспензий наноуглерода необходимо поместить навески УНМ в стеклянные емкости и внести химически чистой дистиллированной воды или слабо полярный растворитель (ДМСО), затем интенсивно перемешать пипетированием, после чего в течение 30 минут обрабатывать ультразвуком частотой 35 кГц в источнике ванного типа «Сапфир ТТЦ» (ЗАО ПКФ «Сапфир», Россия) для механического разобщения частиц наноуглерода. Далее путем разведений получают дополнительные концентрации исследуемых образцов. В дальнейшем полученные растворы смешивают с бактериальной суспензией.

При определении параметров токсичности проводят параллельное измерение контрольных, не содержащих токсичных веществ и опытных (анализируемого раствора) проб. Рекомендуется выполнять не менее трех повторов опытной пробы для увеличения точности результата. Для большей достоверности данных число повторов опытной пробы может быть увеличено до 10 измерений [72].

 

 

2.2.2 Количественный метод оценки безопасности наноматериалов при помощи ростовых микробиологических тестов

 

 

Безопасность наноматериалов также оценивали путем изучения влияния на ростовые свойства колоний микроорганизмов, растущих на поверхности агаризованных питательных сред.

Для работы использовали питательную среду – бромкрезоловый фиолетовый агар (BCP), изготовленный во Франции (Bio-Merieux). Агар BCP представляет собой неингибирующую среду, применяемую для обнаружения и выделения колиформных бактерий, а также в дифференциальных исследованиях на основе ферментации лактозы. В состав данной среды входят пептоновая смесь, лактоза, бромкрезоловый фиолетовый, бактериологический агар. Ее необходимо хранить при температуре 20 ^оС, при этом срок годности составляет 4 года. Для его приготовления необходимо развести 28 г питательной среды в 1 литре дистиллированной воды, осторожно перемешать, затем нагреть при частом помешивании и кипятить в течение одной минуты. Далее требуется распределить полученную питательную среду по соответствующим стеклянным емкостям и стерилизовать в течение 40 минут в автоклаве. После остывания среды ВСР необходимо добавить антибиотик (ампициллин) в конечной концентрации 100 мкг/мл (селективный маркер для использованного рекомбинантного штамма E. coli), затем разлить в чашки Петри, соблюдая условия стерильности.

Для оценки бактерицидного эффекта УНМ использовали биосенсор «Эколюм». В соответствии с инструкцией провели его реконструкцию. Перед экспериментом суспензию бактерий встряхивали.

В данном методе в качестве контроля использовали стерильную дистиллированную воду или слабо полярный растворитель (ДМСО), в качестве опытных проб – суспензии УНМ. Для их создания навески помещали в стеклянные емкости и вносили химически чистой дистиллированной воды или слабо полярный растворитель (ДМСО), интенсивно перемешивали пипетированием, после чего в течение 30 минут обрабатывали ультразвуком частотой 35 кГц в источнике ванного типа «Сапфир ТТЦ». Затем исследуемые образцы разводили дистиллированной водой до получения соответствующих концентраций и смешивали с бактериальной суспензией.

Для оценки бактерицидного эффекта УНМ в отношении используемых клеток-мишеней из опытных и контрольных проб по истечении 60 мин (120 и 210 мин) контакта отбирали аликвоты по 100 мкл, из которых создавали серии десятикратных разведений. Полученные образцы в объеме 10 мкл высевали на чашки с питательной средой, затем помещали в термостат.

После 24 часов инкубации при 37 ^оС проводили учет КОЕ. КОЕ – это одна микробная клетка, из которой вырастает колония на искусственной питательной среде при проведении бактериологического посева [76].

При использовании количественного метода оценки безопасности наноматериалов при помощи ростовых микробиологических тестов также рассчитывали количество бактерий, утративших свою жизнеспособность в результате контакта с УНМ, выражая его в процентах от контрольных значений. О токсичном действии испытуемого наноуглерода судили по результатам количественной оценки выживаемости.

При выполнении данного исследования с каждым препаратом наноуглерода проводили не менее трех независимых экспериментов для увеличения точности результата. Для большей достоверности данных число повторов опытной пробы может быть увеличено до десяти измерений.

Результаты исследования соединений наноуглерода использовали для последующих статистических расчетов при помощи стандартного пакета программ «Excel».

2.2.3 Спектрофотометрический метод

 

 

В анализе различных веществ широкое применение находит спектрофотометрический метод, который характеризуется доступностью, простотой в исполнении, хорошей воспроизводимостью. Данный метод основан на измерении спектров поглощения в оптической области электромагнитного излучения.

Измерение поглощения осуществляют с помощью спектрофотометра. Эти приборы могут работать в различных диапазонах длин волн – от ультрафиолетового до инфракрасного. В зависимости от этого они имеют разное назначение. Несмотря на различия в конструкции, все спектрофотометры состоят из источника света, монохроматора (для выделения определенной длины волны), прозрачной кюветы, куда помещается образец, детектора света измерительного прибора или самописца для регистрации выходного сигнала детектора. Ход работы обычно следующий: измеряют при одной длине волны интенсивность света, прошедшего через растворитель, затем следует измерение интенсивности света, прошедшего через раствор изучаемого вещества в том же растворителе. Далее фиксируется изменение в интенсивности света, по которому можно судить о поглощении растворенного вещества [77].

При исследовании спектров поглощения суспензий УНМ измерения проводились с использованием классического исследовательского спектрофлуориметра «Флюорат-02 Панорама» (НПФ «Люмекс», Россия), предназначенного для широкого круга научных и методических исследований спектрально-временных характеристик люминесценции самых разнообразных объектов (рисунок 11).

 

  

Рисунок 11 – Спектрофлюориметр Флюорат-02-Панорама

 

Управление прибором осуществляли от внешнего компьютера. Математическую обработку результатов измерений осуществляли средствами поставляемого программного обеспечения для проведения автоматизированных спектрально-временных измерений.

Измерения в данной работе проводились в фотометрическом режиме в диапазоне от 200 до 800 нм с шагом 2 нм. Перед исследованием спектров поглощения производилась подготовка образцов наноформ углерода. Для создания суспензий наноуглерода их навески помещали в стеклянные емкости и вносили химически чистую дистиллированную воду или слабо полярный растворитель, интенсивно перемешивали пипетированием, после чего в течение 30 минут обрабатывали ультразвуком частотой 35 кГц в источнике ванного типа «Сапфир ТТЦ» (ЗАО ПКФ «Сапфир», Россия). Суспензии исследуемых соединений помещали в кварцевые кюветы (НПФ «Люмекс», Россия) с оптическим путем 1 см и объемом 3 мл. Кюветы заполнялись до уровня обеспечивающего прохождение светового излучения через весь слой раствора.

При исследовании спектров поглощения рассчитывали оптическую плотность (D), представляющую собой меру непрозрачности слоя вещества для световых лучей. Она равна десятичному логарифму отношения потока излучения, падающего на слой, к ослабленному в результате поглощения и рассеяния потоку, прошедшему через этот слой. Сказанное можно выразить следующей формулой (5):

 

                                                                                                              (5)

где F₀ – поток излучения падающего на объект;

       F  – поток излучения прошедшего через объект.

 

 

2.2.4 Методы исследование компонентного состава УНМ

 

 

С целью выявления точного компонентного состава каждого из использованных образцов УНМ, они были исследованы масс-спектральным методом с индуктивно-связанной плазмой (MS) и атомно-эмиссионным методом с индуктивно-связанной плазмой (AES).

Для реализации масс-спектрального метода с индуктивно-связанной плазмой использовали квадрупольный масс-спектрометр Elan-6100 («PerkinElmer» Instruments, США), в основе действия которого лежит использование аргоновой индуктивно-связанной плазмы в качестве источника ионов и масс-спектрометра для разделения и последующего детектирования этих ионов. Перед проведением измерений навеску 100 мг анализируемой пробы переводили раствор, для чего использовали процедуру кислотного вскрытия с использованием реактивов фирмы «Merck» (Германия), обеспечивающих оптимальные пределы обнаружения элементов с минимизацией так называемого «матричного» эффекта при последующем MS-измерении.

Полученный раствор распыляли потоком инертного газа (аргона) в виде частиц мелкодисперсного аэрозоля, в течение двух миллисекунд проходящих через плазму, что вызывало процессы десольватации, испарения твердых частиц, атомизации, возбуждения и ионизации атомов. На следующем этапе положительно заряженные ионы отбирались в вакуумную часть масс-спектрометра и поступали в квадрупольный масс-анализатор, где происходило их разделение по отношению массы к заряду. Интенсивности ионов с одинаковым отношением массы к заряду измерялись системой регистрации, полученные масс-спектры записывались в памяти управляющего компьютера. Для повышения точности измерения проводили с использованием эталонных растворов содержащих от 1 до 500 мкг/л определяемых элементов, что позволяло корректно определить предел обнаружения определяемых элементов с учетом чистоты используемых реактивов, лабораторной посуды и помещений.

Количественное присутствие ряда элементов параллельно оценивали атомно-эмиссионным методом с индуктивно-связанной плазмой, проводя подобные измерения на атомно-эмиссионном спектрометре Optima-4300 («Perkin Elmer», США). Данный прибор обеспечивает высокую точность измерений, надежность полученных результатов, улучшенные пределы определения и расширенный динамический диапазон.

 

 

2.2.5 Статистические методы

 

 

Для анализа результатов был использован регрессионный анализ. Данная форма статистического анализа позволяет оценить степень связи между переменными, предлагая механизм вычисления предполагаемого значения переменной из нескольких уже известных значений. В рамках регрессионного анализа были построены линии тренда, позволяющие графически отображать тенденцию изменения данных на основании нескольких значений.

В качестве другого статистического метода использован корреляционный анализ – метод обработки статистических данных, с помощью которого измеряется теснота связи между двумя или более переменными. В ходе работы рассчитывали коэффициент корреляции, применив компьютерную программу SPSS (с англ. «Statistical Package for the Social Sciences» – «статистический пакет для социальных наук»), которая является одним из лидеров рынка в области коммерческих статистических продуктов.

 

3 Результаты и их обсуждение

 

 

Использование нанотехнологий и наноматериалов является одним из наиболее интригующих направлений развития науки и техники в XXI веке.

Ожидаемый прогресс в производстве и использовании УНМ потенциально может привести к их последующему поступлению в природные экосистемы с формированием соответствующих рисков [78]. Сказанное определяет актуальность оценки и прогнозирования возможных последствий воздействия наноуглерода на биологические объекты различного уровня организации [79].

В настоящее время во многих странах мира ведутся разработки методов оценки биотоксичности УНМ. Наибольшее распространение получил биолюминесцентный метод.

Поскольку традиционные методы оценки биотоксичности не применимы для классических УНМ, представляющих собой лиофобные частицы, в водной среде формирующие грубодисперсные и агрегатно неустойчивые суспензии, то возникает необходимость в коррекции биолюминесцентного метода исследования УНМ.

Поэтому главная цель нашей работы заключалась в адаптации метода биолюминесцентного анализа для оценки токсичности соединений наноуглерода.

 

 

3.1 Определение химического состава УНМ

 

 

Наша работа была начата с исследования точного компонентного состава каждого из использованных образцов наноуглерода масс-спектральным методом с индуктивно-связанной плазмой (MS) с использованием квадрупольного масс-спектрометра Elan-6100 («Perkin Elmer», США) и атомно-эмиссионным методом с индуктивно-связанной плазмой (AES), с применением атомно-эмиссионного спектрометра Optima-4300 («Perkin Elmer», США). Данные приборы обладают высокой точностью измерений, а также надежностью полученных результатов.

Использование указанных методов позволило с чувствительностью не менее 0,1 % масс определить в образцах УНМ количественное присутствие 62 химических элементов: Li, Be, Na, Mg, Al, K, Ca, Sc, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, As, Se, Rb, Sr, Y, Zr, Nb, Mo, Rh, Pd, Ag, Cd, Sn, Sb, Te, Cs, Ba, La, Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Hf, Ta, W, Re, Ir, Pt, Au, Hg, Tl, Pb, Bi, Th, U.

Обобщенные результаты, полученные методами MS и AES, приведены в таблице 4.

 

 

Полученные результаты позволили констатировать, что из 62 анализируемых элементов 10 (Be, Sc, V, Rh, Pd, Te, Ir, Pt, Au, Hg) не были выявлены в количествах, превышающих чувствительность данных методов (MS и AES). В свою очередь качественное присутствие и определенное количество прочих элементов существенно варьировало, демонстрируя связь с характером наноуглерода.

Так использованный образец аморфного углерода S180 характеризовался присутствием Na, Ca и Fe, содержание каждого из которых находилось в диапазоне от 100 до 1000 мкг на 1 г сухого вещества. Ряд химических элементов (Mg, Al, K, Ti, Mn, Ni, Co, Zn, Cu, Rb, Ba, Pb) обнаруживались в концентрации меньше 100 мкг/г. В целом определенные химические примеси составляли менее 0,1 % от массы исследованного образца S180, расчетная степень чистоты которого составила 99,93 % (таблица 5).

На этом фоне использованные образцы ОУНТ характеризовались значительно более представительным количеством примесных элементов, предположительно попавших в них на различных этапах технологического цикла. В первую очередь сказанное относится к Ni и Y, используемых в составе никель/иттриевого катализатора при получении ОУНТ методом термического распыления графитовых электродов в плазме дугового разряда. Следствием этого стало обнаружение в препарате ОУНТ низкой степени очистки R154s, выделенного непосредственно из реакционной зоны 200000 мкг/г Ni и 30000 мкг/г Y, а также Na, Ca, Fe, Zn в диапазоне концентраций от 100 до 1000 мкг/г и Mg, Al, K, Ti, Mn, Ni, Co, Zn, Cr, Cu, Rb, Ba, Pb в концентрации меньше              100 мкг/г. В результате названный препарат характеризовался достаточно высоким (23,10 %) суммарным содержанием технологических примесей, потенциально способных проявлять собственную, отличную от наноуглерода, биологическую активность. Сказанное относится и к препарату ОУНТ высокой степени очистки L163_ol, выполнение, в отношении которого процедуры экстракции толуолом с последующей кислотной обработкой и окислением на воздухе незначительно (до 22,09 %) снизило содержание технологических примесей, по-прежнему преимущественно определяемое присутствием Ni и Y и составило 200000 мкг/г и 19000 мкг/г соответственно. Таким образом, указанные образцы оказались химически загрязненными препаратами, степень очистки которых составила 76,90-77,91 % (таблица 5).

На этом фоне образцы функционализированных ОУНТ К106-СООН и K106-NH2 демонстрировали сходный качественный состав определяемых элементов, при этом содержание Ni преобладало и составило 3400 мкг/г и           2700 мкг/г соответственно. По количественному содержанию они могли быть охарактеризованы как препараты с достаточно высокой (99,21 % и 99,23 %) степенью очистки от технологических примесей (таблица 5).

Препараты ОУНТ К-103 и 97_ot имели также сходный качественный состав определяемых элементов и могли быть охарактеризованы как препараты с достаточно высокой (99,40 % и 97,64 %) степенью очистки от технологических примесей. Высокий уровень очистки (99,97 %) мог быть констатирован и для использованного препарата MWNT, в составе которого только Al обнаруживался в концентрации несколько выше 100 мкг/г, а также и для образцов НВ и НВФ, степень очистки которых составила 99,17 % и 99,84 % соответственно (таблица 5).

Наконец образцы фуллеренов С60 и С70 характеризовались высокой степенью очистки от технологических примесей, которая составила 99,95 % и 99,91 % (таблица 5).

 

Таблица 5 – Степень очистки углеродных наноматериалов от технологических примесей и рассчитанный на этой основе суммарный показатель их токсичности (Ксум)

Изученные УНМ	Вещества и элементы с содержанием				Степень очистки, %	Kсум
	Элементы с содержанием >10000мкг/г	Элементы с содержанием от 10000 до 1000 мкг/г	Элементы с содержанием от 1000 до 100 мкг/г	Элементы с содержанием <100 мкг/г
S180	-	-	Na, Ca, Fe	Mg, Al, K, Ti, Mn, Ni, Co, Zn, Cr, Cu, Rb, Ba, Pb	99,93	0,68
R154s	Ni, Y	-	Na, Ca, Fe, Zn	Mg, K, Ti, Cr, Al, Cu, Ba,Pb,Zr, Sn, Ho,Mn	76,90	1000,15
L163_ol	Ni, Y	-	Na, Ca, K, Al, Zn, Fe	Mg, Ti, Cr, Cu, Ba, W, Pb, Co, Zr, Mo, Ag, Rb,Mn	77,91	1000,29
K106-COOH	-	Na, Ni, Y	Ca, K, Al, Fe	Mg, Ti, Cu, Zn, Zr, Ta, Sc, Cr, Mn, Co, As, Rb, Sr, Nb, Mo, Sn, Ba, La, Ce, W, Pb	99,21	0,79
K106-NH2	-	Na, Ni, Y	Ca, K, Al, Fe	Mg, Cr, Ti, Mn, Cu, Zn, Zr, Ta, Sc, Co, As, Rb, Sr, Nb, Mo,  Sn, Ba, La, Ce, W, Pb	99,23	0,77
97_ot	Ni	Na, Y	Ca, Al	Mg, K, Ti, Zn, Fe, W, Pb, Cu, Zr, Mn, Cr, Sr, Ba	97,64	90,08
K-103	-	Ni	Na, Ca, K, Al, Ti, Fe, Y, Ba	Mg, Cr, Cu, Zn, Zr, Nb, Ta,W, Li, Mn, Co, As, Sr, Mo, Sn, La, Ce, Pb, Sc	99,40	14,81
MWNT	-	-	Al	Na, Ca, Fe, K,  Cu, Zn, Mn, Cr, Ba, Mg, Y, Ti, Ni	99,97	0,09
HB	-	Ni	Na, Ca, Al, Zn, Fe	Mg, K, Cr, Ti,  Cu, Sc, Mn, Co, As, Rb, Zr, Mo, Sn, Ba, La, Pb	99,17	0,83
НВФ	-	-	Na, Ca, Al, Ti, Fe, Ni	Mg, K, Cr,  Zn, Sn, Ba, Pb, Bi, Sc, Mn, Co, Cu, As, Sr, Zr, Nb, Mo	99,84	0,16
С60	-	-	Ca	Mg, Al, K, Ti, Zn, Fe, Na, Ba, Cr, Cu, Pb, Mn, Ni, As, Se, Sr, Zr,Sn, Sc	99,95	0,10
С70	-	-	Na, Ca, K	Mg, Al, Ti, Zn, Fe, Cu, Cr, Pb, Mn, Ni, Sc, Sr, Zr,Sn, Ba, Bi	99,91	0,13

В качестве меры потенциальной активности наноформ углерода использовался токсикологический показатель Kсум – суммарный показатель, рассчитываемый по формуле  

 

                                                          (6),

где C₁^м и C_n^м – определенные в эксперименте концентрации отдельных элементов, загрязнителей;

        ПДК_c1 и ПДК_cn – нормируемые предельно допустимые концентрации их содержания;

        N – поправочный коэффициент, величина которого определяется классом опасности каждого конкретного элемента [80].

 

При проведении вычислений учитывали действующие в Российской Федерации значения ПДК для всех исследованных элементов (Li, Be, Na, Mg, Al, K, Ca, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, As, Se, Rb, Sr, Nb, Mo, Ag, Cd, Sb, Te, Ba, Sm, Eu, W, Hg, Tl, Pb, Bi, U). При вычислении итоговой нагрузки учитывали тот факт, что рабочей концентрацией УНМ в создаваемых суспензиях являлась 100 мкг/мл (для S180, ОУНТ, MWNT, НВ, НВФ) и 100 мкМ (для С60 и С70 фуллеренов).

Как видно из таблицы 5, рассчитанные на данной основе показатели Ксум варьировали в пределах от 0,09 до 0,83 для образцов MWNT, фуллеренов C60 и C70, аморфного углерода S180, функционализированных ОУНТ K106-NH2 и K106-СООН, нановолокон НВФ и НВ, что позволило сделать вывод о низкой степени химической токсичности. В тоже время препараты ОУНТ 97_ot и химически загрязненные ОУНТ R154s и L163_ol имели Ксум равные 90,08 и больше 1000 соответственно.

Таким образом, использованные при выполнении работы соединения наноуглерода представляют собой достаточно разнообразную по качественному и количественному составу группу препаратов, биологическая активность которых может определяться как собственными  свойствами, так и присутствующими технологическими примесями.

 

 

3.2 Исследование спектров поглощения УНМ

 

 

Принцип биолюминесцентного биотестирования основан на определении интенсивности спонтанной светимости бактериальной клетки-мишени и присутствие УНМ в виде суспензий является причиной снижения ее светопроницаемости за счет поглощения и рассеивания светового потока. Это обстоятельство послужило предпосылкой для исследования спектров поглощения наноформ углерода, который представляет собой зависимость интенсивности поглощенного веществом излучения от частоты.

Для регистрации спектральных характеристик УНМ использовали классический исследовательский спектрофлуориметр «Флюорат-02 Панорама». Исследования спектров поглощения суспензий наноуглерода с использованием данного прибора позволили зафиксировать их различия, зависящие как от уровня структурированности, так и от характера используемого растворителя. Так для ряда соединений, диспергированных в дистиллированной воде с последующей УЗ-обработкой, но без использования слабополярных растворителей (этанол, ДМСО), хотя и были воспроизведены характерные спектры с рядом максимумов в УФ-области, но достигаемые значения поглощения оказывались достаточно низкими (рисунок 12).

 

Рисунок 12 – Спектры поглощения образцов аморфного углерода S180 (а), ОУНТ L163_ol (б) и фуллерена С60 (в) в различных растворителях: воде (1), спирте (2), ДМСО (3)

 

Выраженное повышение дисперсности исследуемых УНМ, достигаемое в результате их первичного суспендирования в слабополярных растворителях, а также обработки ультразвуком позволили достичь более высоких значений поглощения. Так, например, для препарата аморфного углерода S180 максимум поглощения находился на длине волны (λ) равном 225 нм в случае с этанолом и 279 нм в случае с ДМСО. Образец MWNT имел максимум поглощения на длине волны 220 нм при использовании этанола и 275 нм – ДМСО. Некоторые образцы УНМ, такие как, например, ОУНТ R154s, L163_ol, 97_ot, фуллерен С60 характеризовались двумя максимумами поглощения.

Следует также отметить, что применение слабо полярных растворителей позволило зафиксировать умеренный батохромный сдвиг самих спектров для всех использованных соединений наноуглерода, что в совокупности может рассматриваться как проявление большей дезагрегации наноуглерода в слабо полярных растворителях (ДМСО и этаноле) (рисунок 12).

Таким образом, обработка полученных результатов показала, что использование этанола и ДМСО привели к формированию тонкой структуры спектров с характерными максимумами поглощения, а также позволило зафиксировать формирование более высоких значений поглощения в ряду растворителей: вода – этанол – ДМСО, что подтверждает целесообразность использования слабополярных растворителей и позволяет достичь более высокой степени разобщения УНМ.

 

 

3.3 Адаптация традиционной процедуры биолюминесцентного анализа

 

 

В наиболее общем виде технология биолюминесцентного тестирования биотоксичности различных природных сред и химических соединений включает три основных этапа (рисунок 13 А).

 

 

Рисунок 13 – Традиционная схема проведения биолюминесцентного биотестирования (А) и ее адаптации для целей исследования биологической активности УНМ (Б)

Первым из них является подготовка исследуемых образцов, конкретные требования к которой определяются особенностями исследуемого объекта. Общими моментами при этом являются использование химически чистой и инертной лабораторной посуды, недопустимость внесения каких-либо консервантов, а также нормирование рН и температуры исследуемых проб.

Необходимость модификации данного этапа биолюминесцентного биотестирования определяется тем, что в отличие от широкого круга водорастворимых токсикантов (солей тяжелых металлов, пестицидов и другие). Соединения наноуглерода представляют собой лиофобные (в данном случае – гидрофобные) частицы, в водной среде формирующие полидисперсные, в значительной степени седиментационно и агрегативно неустойчивые коллоидные суспензии. В этой связи задача выявления и оценки токсичности УНМ в отношении биологических объектов, в том числе сенсорных люминесцирующих микроорганизмов, оказывается в значительной степени связанной с обеспечением достаточной дисперсности подобных систем. Сказанное в качестве одного из важных требований к адаптации традиционной схемы проведения биолюминесцентного биотестирования для целей исследования биологической активности наноуглерода определяет создание суспензий наноуглерода с максимально высоким уровнем дисперсности (рисунок 13 Б).

Вторым (ключевым) этапом является собственно процедура биотестирования, предусматривающая контакт исследуемых проб, разведение соединений наноуглерода и контрольных растворов с бактериальным биосенсором и их быстрое смешивание, исключающее лимитирование люминесцентной реакции по кислороду. В последующий период времени происходит «созревание эффекта» присутствующих в пробах биологически активных веществ и соединений в отношении бактериальных клеток-мишеней с соответствующим изменением активности их биолюминесцентной системы. При этом наиболее часто рекомендуемая продолжительность этого периода составляет 30 минут, что позволяет оценивать регистрируемый параметр как «острую токсичность».

В тоже время в соответствии с накапливающимися данными предполагается, что УНМ для проявления своей биологической активности требуют значительно больше времени, чем «классические» молекулярные токсиканты. Сказанное выше требует обоснования необходимого для их детекции времени контакта. При этом регистрируемый параметр будет характеризоваться как «хроническая токсичность». Поскольку с течением длительного времени происходит тушение свечения использованного бактериального биосенсора, определяемого истощением пула энергетических субстратов для реакции биолюминесценции, то необходимо внесение питательной среды. Однако данная операция приводит к агрегации наночастиц углерода, что нарушает одну из важных требований к адаптации традиционной схемы проведения метода биолюминесцентного анализа, заключающееся в создании суспензий наноуглерода с максимально высоким уровнем дисперсности [81].

В этой связи рекомендовано определение «подострой токсичности» УНМ, позволяющего динамике эксперимента развивать собственную, не связанную с присутствием технологических примесей биологическую активность.

Наконец завершающим этапом исследования является оценка интенсивности свечения в опытных и контрольных пробах с последующим расчетом величин, характеризующих уровень биотоксичности анализируемого образца.

В связи с тем, что результативным параметром при проведении биолюминесцентного биотестирования является свечение, то цветность и мутность суспензий исследуемых УНМ способны оказать искажающее влияние на результат проводимого исследования.

Таким образом, разработка метода оценки биологических эффектов УНМ с использованием технологии биолюминесцентного анализа требует комплексного решения триединой задачи, заключающейся в следующем:

1) формировании суспензий УНМ с высоким уровнем дисперсности;

2) выявлении оптимального режима контакта люминесцирующих бактериальных клеток с суспензиями наноуглерода;

3) разработке математического алгоритма, исключающего искажающее влияние оптических свойств тестируемых суспензий наноуглерода на результат проводимого исследования.

Действием, предложенным для повышения степени дисперсности суспензий наноуглерода, стала их обработка ультразвуком (УЗ), ведущая к механическому разобщению частиц УНМ. Другим действием, предложенным для увеличения степени дисперсности подобных систем, явилось их создание на основе органических растворителей с меньшей, чем у воды, величиной диэлектрической проницаемости, с последующим переносом части сформированных суспензий в водную среду. При этом важнейшими требованиями к подобным растворителям стали значимое повышение достигаемого уровня дисперсности УНМ, что было доказано спектрофотометрическими методами исследования; возможность последующего смешивания с водой для формирования «рабочих» суспензий; а также отсутствие собственного токсического влияния на бактериальные клетки-мишени, сопровождающегося подавлением уровня их биолюминесценции.

В этой связи с целью создания более однородных систем нами были использованы два органических растворителя с меньшей, чем у воды, степенью полярности: диметилсульфоксид (ДМСО) (диэлектрическая постоянная 45) и этанол (диэлектрическая постоянная 24). Получаемые при этом суспензии наноуглерода оказывались существенно более седиментационно стабильными.

В качестве другого важного условия рассмотрено использование данных растворителей в конечных концентрациях, не оказывающих существенного влияния на уровень светимости бактериальных люминесцирующих биосенсоров. При этом проведенные эксперименты по влиянию различных концентраций этанола и ДМСО на интенсивность биолюминесценции позволили констатировать, что пороговым значением, не вызывающим отклонения интенсивности свечения более чем на 20 % от интактных контрольных образцов является концентрация на уровне от 1,25 % до 2,5 % от конечного объема анализируемой пробы (для ДМСО) и от 2,5 % до 5,0 % (для этанола).

В свою очередь формирование подобных концентраций предложено через осуществление двухэтапной процедуры:

• Внесение наноуглерода в исходный 100 % растворитель – ДМСО или этанол.
• Перенос суспензии УНМ в данном растворителе в водную фазу до достижения указанных выше конечных концентраций ДМСО или этанола.

В дальнейшем для исследования УНМ использовали только ДМСО, поскольку данный растворитель позволяет достичь более высокой степени разобщения наноуглерода и в наименьшей степени вызывает отклонение интенсивности свечения от контрольных значений.

Решение другого важного условия, необходимого для адаптации биолюминесцентного метода, связанного с разработкой оптимального режима контакта, заключалось в установке максимально возможного времени проведения исследования, которое составило 180 минут, что определялось развивающимся во времени собственным тушением свечения использованного бактериального биосенсора в контрольных пробах, определяемых истощением пула энергетических субстратов для реакции биолюминесценции.

Для исключения искажающего влияния собственных оптических свойств суспензии наноуглерода на результат биолюминесцентного биотестирования был разработан математический аппарат. При этом оригинальность подобного действия определяется следующими основными моментами:

• Производимые расчеты хотя и основаны на использовании закона Бугера-Ламберта-Бера, описывающего характер ослабления света при его распространении в поглощающей среде, но в связи с тем, что закон описывает монохроматический пучок света, производимые расчеты предусматривают произведение вычислений для n-ого количества длин волн.
• При проведении вычислений учитывается, что свет (биолюминесценция) возникает внутри анализируемой пробы, соответственно перед попаданием на регистратор (фотоэлектронный умножитель) проходя через разные по толщине слои исследуемой суспензии наноуглерода.
• Анализируемый диапазон длин волн определяется спектром световой эмиссии используемого сенсорного штамма coli К12 TG1 с клонированными luxCDABE генами P. leiognathi с учетом определенных для него значений доли от суммарной световой эмиссии, излучаемой в каждом спектральном диапазоне.

Итогом выполнения работ в данном направлении стала разработанная оригинальная формула (7), позволяющая на основе определенных в эксперименте величин рассчитать истинный суммарный уровень биолюминесценции микроорганизмов E. coli К12 TG1 с клонированными luxCDABE генами P. leiognathi I₀ с учетом частичного поглощения излучаемого света при его прохождении через анализируемую пробу:

 

                        ,                              (7)

где I(L) – экспериментально определенная в исследуемом образце толщиной L интенсивность биолюминесценции;

      g(λ_i) – предварительно установленная в эксперименте доля его световой эмиссии сенсорного микроорганизма на длине волны λ_i от суммарной интенсивности его свечения в диапазоне от 400 до 600 нм;

      Dl(λ_i) – определенное в каждой точке диапазона от 400 до 600 нм в кювете шириной l значение поглощения исследуемой суспензии наноуглерода на длине волны λ_i.

 

В связи с трудоемкостью подобных расчетов при одновременной необходимости исследования от десятков до сотен анализируемых проб для практической реализации разработанного подхода была создана специализированная программа для электронных вычислительных машин – ЭВМ (свидетельство о государственной регистрации № 2010611423), предназначенная для количественной оценки биолюминесценции – свечения, возникающего в результате специфических биохимических реакций у бактерий, находящихся в оптически слабо прозрачных (окрашенных и/или мутных) жидких средах (рисунок 14).

Основным же назначением данной программы является оценка результатов биолюминесцентного биотестирования, выполняемого с использованием сенсорного рекомбинантного штамма E. coli K12 TG1, несущего lux-оперон природного морского микроорганизма P. leiognathi («Эколюм»). При этом программа использует заранее определенные для данного микроорганизма значения g(λ_i), характеризующие спектр его световой эмиссии.

 

 

 

Рисунок 14 – Окно начала работы с программой

Вычислительный аппарат программы основывается на следующих принципах:

• Производимые расчеты основаны на использовании закона Бугера-Ламберта-Бера, описывающего характер ослабления света при его распространении в поглощающей среде. В связи с тем, что закон описывает монохроматический пучок света, производимые расчеты предусматривают произведение вычислений для n-ого количества длин волн.
• Анализируемый диапазон длин волн определяется спектром световой эмиссии используемого люминесцирующего микроорганизма E. coli с клонированным lux-опероном природного морского люминесцирующего микроорганизма P. leiognathi («Эколюм»). При этом программа использует заранее определенные для данного микроорганизма значения доли от суммарной световой эмиссии, излучаемой в определенном спектральном диапазоне. Налагаемые этим ограничения программы определяются невозможностью ее использования для оценки светимости бактерий с иными спектральными характеристиками световой эмиссии.
• Желательным требованием является регистрация как самой биолюминесценции, так и светопоглощения исследуемых проб с использованием фотоэлектронных умножителей или иных оптических регистраторов с максимально сходной или идентичной спектральной чувствительностью. В частности, производимые при разработке настоящей программы измерения выполнены с использованием спектрофлюориметра «Флюорат-02-Панорама» (НПФ «Люмэкс», СПб, Россия), который может быть рекомендован в качестве базового прибора, совместимого с настоящей программой.
• В связи с тем, что оптические свойства анализируемой пробы определяются как качественными (индивидуальная характеристика определенной формы наноуглерода), так и количественными (концентрация в суспензии) параметрами, каковые не учитываются в рамках данной программы, ее использование предполагает предварительно определение светопропускания для каждой отдельной анализируемой пробы. При этом важным требованием является проведение подобного измерения в диапазоне длин волн, соответствующем спектру световой эмиссии бактериального люминесцирующего биосенсора, в данном случае E. coli с клонированным lux-опероном природного морского люминесцирующего микроорганизма P. leiognathi («Эколюм»).
• В связи с тем, что определяемые свойства анализируемой пробы зависят от длины оптического пути, через который проходит свет, ее использование предполагает учет ширины в кюветах, в которых проводятся исследования.

При соблюдении описанных выше требований нажатие клавиши «расчет» запускает вычисление искомой истинной интенсивности свечения люминесцирующего бактериального биосенсора, отражающей его функциональное состояние при нахождении в исследуемой суспензии УНМ и представляемой в соответствующем окне программы (рисунок 15).

 

Рисунок 15 – Окно специализированной программы для ЭВМ, позволяющей проводить коррекцию результатов биолюминесцентного биотестирования суспензий УНМ

 

Другой подход, направленный на исключение оптических свойств наноуглерода на результат проводимого исследования, был связан с динамическим измерением интенсивности свечения анализируемых проб при развитии токсического эффекта УНМ, что было реализовано на платформе микропланшетного люминометра LM-01Т («Immunotech», Чехия). В данном случае нивелирование оптических свойств наноуглерода на результат исследования может быть осуществлено путем проведения вычислений по формуле

 

                                                         ,                                                   (8)

где Ik₀ и Ik_n – значения светимости контрольной пробы на нулевой и n-ой секунде проведения эксперимента, отражающие кинетику «спонтанного» тушения свечения бактериального биосенсора за счет исчерпания энергетических субстратов для реакции биолюминесценции;

       Io₀ – интенсивность свечения опытной пробы на нулевой секунде после внесения сенсорного микроорганизма в суспензию УНМ, отражающая значимость их оптических свойств в снижении регистрируемого параметра;

       Io_n – интенсивность свечения опытной пробы на n-ой секунде проведения эксперимента, интегрирующая в себе оптические и биологические характеристики УНМ.

 

Таким образом, адаптированная процедура метода биолюминесцентного анализа может быть представлена в следующем виде:

• Навеску исследуемого соединения наноуглерода разводили химически чистой дистиллированной водой или слабо полярным растворителем ДМСО, интенсивно перемешивали пипетированием.
• В течение 30 минут обрабатывали ультразвуком частотой 35 кГц в источнике ванного типа «Сапфир ТТЦ» (ЗАО ПКФ «Сапфир», Россия) для механического разобщения частиц наноуглерода.
• Путем двукратных разведений получали дополнительные концентрации исследуемых образцов.
• Полученные растворы УНМ смешивали с бактериальной суспензией.
• Регистрацию свечения бактерий проводили на микропланшетном биолюминометре в кинетическом режиме в течение 180 минут.
• Рассчитали интенсивность свечения по формуле (8) с учетом нивелирования оптических свойств УНМ.

 

 

3.4 Исследование биологических эффектов углеродных наноматериалов методом биолюминесцентного анализа

 

 

Полученные результаты кинетического измерения свечения наноуглерода свидетельствовали о том, что их биологический эффект имел достаточно развивающуюся и постепенно снижающуюся во времени динамику, характерную для всех использованных УНМ, что подтверждает целесообразность исследования подострой токсичности (рисунок 16).

 

 

0,1 мг/мл;  0,05 мг/мл;  0,025 мг/мл;  0,0125 мг/мл;  0,00625;  контроль.

 

Рисунок 16 – Динамика изменения интенсивности биолюминесценции сенсорного микроорганизма E. coli при его контакте с аморфным углеродом

При этом следует отметить, что регистрируемое в первые минуты контакта снижение интенсивности свечения является проявлением не токсического, но оптического эффекта наноформ углерода, устраняемого использованными нами и некоторыми другими математическими алгоритмами, в процессе работы [82].

При последующей оценке биотоксичности УНМ для каждого из них, тестируемого в отношении определенного сенсорного микроорганизма, проводился расчет токсикологических параметров ЕС20 и ЕС50, соответствующих концентрациям соединений наноуглерода, вызывающим      20 % или 50 % ингибирование свечения по сравнению с контрольными величинами (таблица 6).

Полученные результаты позволили констатировать зависимость детектируемой биотоксичности наноуглерода от продолжительности контакта (рисунок 17). Зафиксированные значения ЕС50 повышались в зависимости от времени контакта исследованных УНМ с бактериальным биосенсором. Так использованные образцы ОУНТ L163_ol, 97_ot и MWNT, функционализированных нановолокон НВФ, а также фуллеренов С70 на основании регистрируемых значений EC20 и EC50 уже к 60 минуте контакта были оценены как умеренно токсичные, а начиная со 120 минуты – как сильно токсичные образцы. На 180 минуте контакта все соединения наноуглеродов, сформированные в ДМСО, характеризовались определенными для них значениями ЕС50 (таблица 6).

 

   

Рисунок 17 – Зависимость биологической активности УНМ от времени контакта (1 – 60 минут, 2 – 120 минут, 3 – 180 минут) на примере аморфного углерода S180 в воде (a) и в ДМСО (б)

Другой вариант биологической активности демонстрировал исследованный образец аморфного углерода S180, на первом этапе эксперимента проявляющий себя как нетоксичный, но в динамике прогрессивно увеличивающий подобную биологическую активность. В результате уже к 180 минуте контакта данный препарат характеризовался значениями ЕС20 и ЕС50 равными 4 мкг/мл и 8 мкг/мл соответственно, что заставляло констатировать его наибольшую по сравнению с прочими УНМ биотоксичность в отношении использованного сенсорного штамма E. coli (таблица 6).

 

Таблица 6 – Значения токсикологических параметров ЕС20 и ЕС50, определенных при оценке влияния суспензий наноуглерода на уровень биолюминесценции рекомбинантного штамма E. coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE-генами P. leiognathi

В микрограммах на миллилитр

Изученные УНМ	Метод диспергирования	Токсикологические характеристики УНМ при различном времени контакта
		60 минут		120 минут		180 минут
		ЕС20	ЕС50	ЕС20	ЕС50	ЕС20	ЕС50
S180	УЗ	> 100	> 100	48±2,28	98±0,63	8±0,05	40±0,23
	УЗ + ДМСО	65±3,36	> 100	32±1,56	44±1,99	4±0,01	8±0,05
R154s	УЗ	29±1,45	> 100	18±0,91	> 100	14±0,71	95±4,75
	УЗ + ДМСО	> 100	> 100	14±0,71	68±3,41	11±0,55	21±1,15
L163_ol	УЗ	46±2,31	> 100	41±2,05	82±4,11	28±1,41	38±1,91
	УЗ + ДМСО	68±3,41	80±4,01	38±1,91	43±2,15	20±1,01	22±1,11
K106-COOH	УЗ	> 100	> 100	> 100	> 100	30±1,56	62±3,62
	УЗ + ДМСО	> 100	> 100	63±2,78	77±4,05	12±0,64	18±0,72
K106-NH2	УЗ	> 100	> 100	> 100	> 100	> 100	> 100
	УЗ + ДМСО	> 100	> 100	> 100	> 100	35±1,54	48±2,22
К-103	УЗ	> 100	> 100	52±2,39	85±5,01	22±1,07	54±2,81
	УЗ + ДМСО	70±3,55	> 100	45±2,54	66±3,82	10±4,59	17±0,98
97_ot	УЗ	> 100	> 100	66±3,22	90±4,98	50±5,03	78±3,89
	УЗ + ДМСО	67±3,33	92±4,58	39±2,04	57±2,55	30±1,27	46±2,98
MWNT	УЗ	> 100	> 100	> 100	> 100	99±0,46	> 100
	УЗ + ДМСО	52±2,53	65±3,37	38±1,57	48±2,26	28±0,13	23±0,11
НВ	УЗ	> 100	> 100	> 100	> 100	90±0,45	> 100
	УЗ + ДМСО	> 100	> 100	52±2,63	60±3,04	14±0,65	20±0,97
НВФ	УЗ	72±3,6	> 100	42±2,1	69±0,14	23±1,15	68±3,41
	УЗ + ДМСО	66±3,31	79±3,95	38±1,91	40±0,21	5±0,25	9±0,45
С60	УЗ	> 100	> 100	> 100	> 100	> 100	> 100
	УЗ + ДМСО	> 100	> 100	87±4,85	> 100	72±3,59	84±4,34
С70	УЗ	> 100	> 100	> 100	> 100	70±3,48	> 100
	УЗ + ДМСО	65±3,71	71±3,66	64±3,84	69±4,06	44±2,14	50±2,53

 

На этом фоне особое внимание привлекли к себе результаты сравнения токсичности водных суспензий двух структурно идентичных серий ОУНТ с низкой (L163_ol) и высокой (K106-COOH) степенями очистки от технологических примесей, для которых показаны значимые различия в уровне воздействия на сенсорный штамм E. coli (значения ЕС50 составили 46 мкг/мл и больше 100 мкг/мл соответственно) (таблица 6). Аналогично показал себя и химически загрязненный препарат ОУНТ R154s, оказывающий токсический эффект на первых минутах контакта (29 мкг/мл), что как и в случае с ОУНТ L163_ol обусловлено примесным составом, а не биологической активностью собственно УНМ.

Таким образом, увеличение времени контакта сенсорного микроорганизма с УНМ привело к развитию более выраженного токсического эффекта с возможностью расчета как параметра ЕС20, так и ЕС50, но сопровождалось существенным снижением влияния примесного состава на результат биолюминесцентного биотестирования.

Полученные результаты также позволили констатировать зависимость детектируемой биотоксичности УНМ как от собственных свойств исследуемых соединений наноуглерода, так и от достигаемой степени их дисперсности в анализируемой системе. Так для ряда соединений наноуглерода, диспергированных в дистиллированной воде с последующей УЗ-обработкой, но без использования слабо полярного растворителя ДМСО, была установлена только слабо выраженная биотоксичность. Сказанное относится к образцам функционализированных ОУНТ K106-NH₂, нановолокон НВ, MWNT, а также фуллеренов С60 и С70, вероятные значения токсикологического параметра ЕС50 которых оказывались выше максимальной тестируемой концентрации 100 мкг/мл. В свою очередь УНМ, представленные препаратами ОУНТ R154s, 97_ot, K103, K106-COOH и функционализированных нановолокон НВФ, к концу периода биотестирования могли быть охарактеризованы как токсичные соединения с соответствующими значениями параметра ЕС50 равными 95, 78, 54, 62 и 68 мкг/мл соответственно (таблица 6).

Наконец наиболее высокая биологическая активность в отношении использованного сенсорного микроорганизма была констатирована для образцов ОУНТ высокой степени очистки с СООН-группами L163_ol, для которого значение ЕС50 составило 38 мкг/мл и аморфного углерода S180, имеющее значение ЕС50 равное 40 мкг/мл (таблица 6).

Повышение дисперсности исследуемых соединений наноуглерода, достигаемое путем их первичного суспендирования в ДМСО, обработки ультразвуком и последующего переноса части сформированной суспензии в водную среду значительно усилило скорость и выраженность регистрируемых эффектов, что результировалось в увеличении значений ЕС20 и ЕС50. При этом наиболее токсичным соединением оказывался аморфный углерод S180, для которого определенное значение ЕС50 составило 8 мкг/мл. Вторым по уровню токсичности соединением УНМ стал образец функционализированных нановолокон НВФ, характеризуемый значением ЕС50 равным 9 мкг/мл.

На этом фоне прочие исследуемые одностенные и многостенные соединения наноуглерода демонстрировали сходные уровни токсичности с величинами ЕС20, варьирующими в диапазоне от 11 до 35 мкг/мл и ЕС50 – в диапазоне от 20 до 48 мкг/мл. Кроме того, достигаемое повышение дисперсности УНМ переводило в разряд «токсичных» соединений и фуллерены С70, определенные для которых значения ЕС20 и ЕС50 равнялись 44 мкг/мл и 50 мкг/мл соответственно.

Наконец наименее биологически активным соединением оказывался фуллерен С60, для которого значение ЕС20 и ЕС 50 составили 72 мкг/мл и 84 мкг/мл соответственно (таблица 6).

Таким образом, увеличение степени разобщенности наноуглерода в суспензиях, достигаемое при использовании слабо полярного растворителя ДМСО, позволяет повысить значения биологической активности  по сравнению с водными суспензиями УНМ (рисунок 18).

 

 

Рисунок 18 – Зависимость биологической активности УНМ от растворителя    (1 – вода, 2 – ДМСО) на примере аморфного углерода S180 (a) и ОУНТ низкой степени очистки R154s (б)

 

Исследование биотоксичности соединений наноуглерода показало его развитие в водных суспензиях у семи УНМ и в суспензиях ДМСО – у всех исследуемых образцов на 180 минуте контакта.

Полученные результаты позволили ранжировать исследуемые соединения наноуглерода по выраженности их токсического эффекта на рекомбинантный люминесцирующий штамм E. coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE-генами природного морского люминесцирующего микроорганизма P. leiognathi, детектировав наибольшую биотоксичность у образца аморфного углерода, а наименьшую – у фуллерена С60.

3.5 Исследование биологических эффектов углеродных наноматериалов количественным методом оценки веществ при помощи ростовых микробиологических тестов

 

 

Вторым методом, используемым для изучения токсичности УНМ стал количественный метод оценки веществ при помощи ростовых микробиологических тестов, заключающийся в подсчете колониеобразующих единиц (КОЕ).

Результаты исследования токсичности УНМ, полученные с использованием количественного метода оценки веществ при помощи ростовых микробиологических тестов, показали развитие бактерицидного эффекта суспензий наноуглерода с течением времени (рисунок 19). Так, процент убитых бактериальных клеток для водных суспензий аморфного углерода S180 на 60 минуте контакта составил 51,0 %, на 120 минуте – 80,2 %, а на 180 минуте – 96,0 %. Аналогично проявили себя все использованные УНМ (таблица 7).

   

в

б

а

2

1

1

2

1

2

Рисунок 19 – Бактерицидный эффект УНМ в зависимости от длительности их контакта с E. coli (1 – вода, 2 – ДМСО) на примере ОУНТ К106-СООН (а), фуллерена С70 (б), нановолокна НВ (в)

 

Полученные результаты позволили также констатировать зависимость исследованных соединений наноуглерода от достигаемой степени их дисперсности в анализируемой системе. Так ряд соединений УНМ, диспергированных в дистиллированной воде с последующей УЗ-обработкой, но без использования ДМСО, не проявлял бактерицидного эффекта. Сказанное относится к образцам MWNT, функционализированных ОУНТ K106-COOH и K106-NH2, а также нановолокон НВ. В свою очередь УНМ, представленные препаратами ОУНТ R154s, K103, 97_ot, фуллеренов С60, С70 и функционализированных нановолокон НВФ могли быть охарактеризованы как бактерицидные соединения с соответствующим процентом убитых бактериальных клеток в пределах от 52,0 % до 70,0 % соответственно. Наконец наиболее высокий бактерицидный эффект в отношении использованного сенсорного микроорганизма E. coli был констатирован для препаратов ОУНТ низкой степени очистки L163_ol (процент убитых бактериальных клеток составил 82,9 %) и аморфного углерода S180 (96,0 %) (таблица 7).

 

Таблица 7 – Бактерицидный эффект, вызываемый суспензиями УНМ в концентрации 100 мкг/мл (100 мкМ) по отношению к сенсорному штамму       E. coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE-генами P. leiognathi

В процентах

Исследованный УНМ	Время инкубации
	60 минут		120 минут		180 минут
	УЗ	УЗ+ДМСО	УЗ	УЗ+ДМСО	УЗ	УЗ+ДМСО
S180	51,0	56,5	80,2	82,4	96,0	98,0
R154s	30,5	31,5	33,5	43,5	58,3	64,2
L163_ol	15,2	68,5	73,2	74,4	82,9	88,4
K106-COOH	9,15	13,5	17,3	22,7	25,0	56,0
K106-NH2	7,0	9,1	24,8	26,6	38,0	56,0
K103	14,9	-	23,6	-	62,0	90,0
97_ot	9,1	25,5	27,9	32,8	67,0	72,0
MWNT	0	0	0	0	0	3,9
НВ	4,4	26,1	25,9	56,4	41,0	62,0
НВФ	61,1	66,0	66,2	71,3	70,0	85,0
С60	21,8	34,0	31,2	47,6	52,0	65,0
С70	51,4	56,8	63,7	71,9	70,0	80,0

 

Повышение дисперсности исследуемых соединений наноуглерода, достигаемое путем их первичного суспендирования в слабо полярном растворителе ДМСО, обработки ультразвуком и последующего переноса части сформированной суспензии в водную среду значительно усилило бактерицидный эффект. При этом наиболее бактерицидным соединением оказывался аморфный углерод S180 (процент убитых бактериальных клеток составил 98,0 %). Вторым соединением наноуглерода по силе бактерицидного эффекта стал препарат ОУНТ К-103, характеризуемый процентом убитых бактериальных клеток равным 90,0 %. В свою очередь УНМ, представленные образцами ОУНТ K106-COOH, K106-NH₂, R154s, 97_ot, L163_ol, фуллеренов С60 и С70, а также нановолокон НВ и НВФ могли быть охарактеризованы как бактерицидные соединения с соответствующим процентом убитых бактериальных клеток в пределах, варьирующих от 56,0 % до 88,4 % соответственно. На общем фоне только препарат MWNT не проявлял бактерицидного эффекта (таблица 7).

Таким образом, исследование бактерицидного эффекта суспензий УНМ показали его развитие в водных суспензиях у четырех УНМ и в суспензиях ДМСО – у девяти исследуемых объектов на 180 минуте контакта. Следовательно, увеличение степени разобщенности наноуглерода в суспензиях, достигаемое при использовании слабо полярного растворителя ДМСО, позволяет повысить степень выявляемой бактерицидности.

Проведение параллельного исследования воздействия суспензий УНМ на показатели светимости бактериальных клеток-мишеней и показатели их жизнеспособности при высеве на плотные питательные среды с определением количества КОЕ после подобного воздействия позволили зафиксировать определенные зависимости между подавлением биолюминесценции и развитием бактерицидного эффекта суспензий УНМ (рисунок 20), заключающиеся в опережающем во времени по сравнению развитием бактерицидного эффекта подавление светимости для большинства УНМ при использовании ДМСО.

 

Рисунок 20 – Зависимость биолюминесценции и бактерицидности УНМ от использованного растворителя (1 – вода, 2 – ДМСО)

 

Следует отметить, что значения ЕС50 можно зафиксировать для некоторых УНМ, тогда как достижение LD50 наблюдается при более длительном времени контакта. Так, суспензии УНМ, диспергированные в ДМСО на 60 минуте контакта по результатам биолюминесцентного анализа могли быть оценены как токсичные только у семи из двенадцати исследованных образцов (аморфного углерода S180, ОУНТ L163_ol, К-103, 97_ot, MWNT, функционализированных нановолокон НВФ и фуллерена С70). В свою очередь достоверный бактерицидный эффект в отношении использованных клеток-мишеней был установлен только для четырех УНМ (аморфного углерода S180, ОУНТ с СООН-группами L163_ol, функционализированного нановолокна НВФ и фуллерена С70). Таким образом, установлено, что тушение биолюминесценции бактериальных клеток частично связано с развитием бактерицидного эффекта УНМ.

 

Заключение

 

 

В настоящее время все возрастающее внимание во всем мире уделяется перспективам развития нанотехнологий, то есть технологий направленного получения и использования веществ и материалов в диапазоне размеров до 100 нм. Особенности поведения вещества в виде частиц таких размеров, свойства которых во многом определяются законами квантовой физики, открывают широкие перспективы в целенаправленном получении материалов с новыми свойствами, такими как уникальная механическая прочность, особые спектральные, электрические, магнитные, химические, биологические характеристики. Такие материалы могут найти и уже находят применение в различных сферах человеческой деятельности.

Поскольку в перспективе ожидается тесный контакт человека и других биологических объектов с наноматериалами, то изучение вопросов потенциальных рисков их использования представляется важнейшей задачей. За рубежом проблема безопасности наноматериалов в настоящее время выдвигается на первый план.

УНМ представляют собой широкий спектр аллотропных соединений углерода, представленных нанотрубками, нановолокнами, фуллеренами. Одним из перспективных методов тестирования биологической безопасности УНМ является биолюминесцентный анализ, основанный на оценке реакции люминесцирующих (светящихся) бактерий.

Бактериальные тест-системы получают все большее распространение при исследовании биологической активности наноматериалов и оценке потенциальных рисков их поступления в природные экосистемы и среду обитания человека. Биотесты на основе светящихся бактерий дают интегральную оценку токсичности и часто превосходят другие известные биотесты в скорости, точности, чувствительности и простоте использования.

В Российской Федерации наибольшее распространение и законодательное подтверждение получил биотест «Эколюм», представляющий собой рекомбинантный люминесцирующий штамм E. coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE-генами природного морского люминесцирующего микроорганизма P. leiognathi, выпускаемый в лиофилизированной форме.

Поскольку УНМ обладают совершенно иными биологическими (в том числе токсическими) действиями, чем вещества в обычном физико-химическом состоянии, то традиционные методы оценки биотоксичности не применимы для них. В связи с этим в России утверждена Концепция, регламентированная на поиск методов оценки биотоксичности. Ответом на данный запрос стала разработка методического указания МУ 1.2.2634-10 «Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза», предлагающая два метода оценки биотоксичности водорастворимых наноматериалов: с помощью люминесцентного бактериального теста и при помощи ростовых микробиологических тестов.

Поскольку данные методы оценки биотоксичности не применимы для классических УНМ, представляющих собой гидрофобные частицы, то возникает необходимость в адаптации биолюминесцентного метода для оценки наноформ углерода.

Коррекция традиционного метода биолюминесцентного анализа для оценки биотоксичности УНМ предусматривала решение следующих задач: формирование суспензий наноуглерода с высоким уровнем дисперсности, исключение влияния оптических свойств наноуглерода на результат исследования, разработку оптимального режима контакта наноуглерода с сенсорными микроорганизмами, позволяющего в наибольшей степени выявить их биологическую активность.

Решением первой задачи стало их обработка ультразвуком, ведущая к механическому разобщению частиц УНМ. Другим действием, предложенным для увеличения степени дисперсности подобных систем, явилось создание  суспензий наноуглерода на основе органических растворителей с меньшей, чем у воды, величиной диэлектрической проницаемости (в ДМСО).

При решении второй задачи было установлено максимально возможное время проведения исследования, что определялось развивающимся во времени собственным тушением свечения использованного бактериального биосенсора в контрольных пробах, определяемых истощением пула энергетических субстратов для реакции биолюминесценции.

Решением третьей задачи стала разработка математического аппарата, предложенного для исключения искажающего влияния собственных оптических свойств суспензий наноуглерода на результат биолюминесцентного биотестирования. Другим действием, направленным на нивелирование оптических свойств УНМ на результат исследования, стало проведение вычислений в кинетическом режиме, реализованном на микропланшетном люминометре.

Практическое использование разработанной технологии позволило ранжировать широкий спектр соединений наноуглерода по уровню биотоксичности, а также определить зависимость подобной биологической активности от характера их функционализации и степени очистки от технологических примесей.

В целом результаты выполнения данной работы подтверждают реалистичность и адекватность разрабатываемого метода оценки биологической активности наноуглерода с использованием люминесцирующего бактериального биосенсора «Эколюм».

 

Список использованных источников

 

 

• Кац, Е. А. Углеродные нанотрубки – фантастика наяву. Часть 1. Что значит «нано», «нанотехнология», «нанотрубки»? / Е. А. Кац // Энергия: экономика, техника, экология. – 2008. – № 3. – C. 42-49.
• Oberdorster, G. Nanotoxicology: An Emerging Discipline Evolving from Studies of Ultrafine Particles / G. Oberdorster, E. Oberdorster, J. Oberdorster // Environ. Health Perspect. – 2005. – № 7. – P. 823-839.
• Онищенко, Г. Г. Концепция токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 31 октября 2007 году № 79. – 8 с.
• Онищенко, Г. Г. Обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия населения в условиях расширенного использования наноматериалов и нанотехнологий / Г. Г. Онищенко // Гигиена и санитария. – 2010. – № 2. – С. 4-7.
• Muller, J. Respiratory toxicity of carbon nanotubes: How worried should we be? / J. Muller, F. Huaux, D. Lison // Carbon. – 2006. – № 44. – Р. 1048-1056.
• Li, Z. Cardiovascular effects of pulmonary exposure to single-wall carbon nanotubes / Z. Li, T. Hulderman, R. Salmen, R. Chapman, S. Leonard, S.-H. Young, A. Shvedova  // Environ.Health Perspect. – 2007. – № 115. – P. 377-382.
• Fiorito, S. Effects of fullerenes and single-wall carbon nanotubes on murine and human macrophages / S. Fiorito, A. Serafino, F. Andreola, A. Togna, P. Bernier // Carbon. – 2006. – № 44. – Р. 1100-1105.
• Edwards, S. L. Tubular micro-scale multiwalled carbon nanotube-based scaffolds for tissue engineering / S. L. Edwards, J. S. Church, J. A. Werkmeister, J.A.M. Ramshaw // Biomaterials. – 2009. – № 9.– P. 1725-1731.
• Кобаяси, Н. Введение в нанотехнологию: пер. с японск. / Н. Кобаяси – М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2008. – 134 с. – ISBN 978-5-94774-841-3 (русск.), ISBN 4-492-09151-3 (яп.).
• Данилов, В. С. Расширение возможностей люминесцентного бактериального теста для анализа токсичности химических соединений / В. С. Данилов, Т. П. Юдина, Е. В. Сорокина // Вестник ОГУ. – 2007. – № 75 (специальный выпуск). – С. 102-104.
• Владимиров, Ю. А. Активированная хемилюминесценция и биолюминесценция как инструмент в медико-биологических исследованиях / Ю. А. Владимиров // Cоросовский образовательный журнал. – 2001. – Т. 7. – № 1. – C. 16-23.
• Травина, И. Подводная феерия / И. Травина // Вокруг света. – – № 6. – С. 8-18. – ISSN 0321-0669.
• Лабас, Ю. А. Неразгаданная Дарвином биолюминесценция / Ю. А. Лабас, А. В. Гордеева // Природа. – 2003. – № 3. – C. 25-31.
• Wegrzyn, G. How do marine bacteria produce light, why are they luminescent, and can we employ bacterial bioluminescence in aquatic biotechnology? / G. Wegrzyn, A. Czyz // Oceanologia. – 2002. – № 44. – C. 291-305.
• Дерябин, Д. Г. Бактериальная биолюминесценция: фундаментальные и прикладные аспекты: учебник / Д. Г. Дерябин. – М. : Наука, 2009. – 246 с. – ISBN 978-5-02-036687- 9.
• Dunlap, P. V. Genomic and phylogenetic characterization of luminous bacteria symbiotic with the deep-sea fish chlorophthalmus albatrossis (Aulopiformes: Chlorophthalmidae) / P. V. Dunlap, J. C. Ast // Appl. Environ. Microbiol. – 2005. – Vol. 71. – № 2. – Р. 930-939.
• Wada, M. LuxA gene of light organ symbionts of the bioluminescent fish Acropoma japonicum (Acropomatidae) and Siphamia versicolor (Apogonidae) forms a lineage closely related to that of Photobacterium leiognathi Mandapamensis / M. Wada, A. Kamiya, N. Uchiyama S. Yoshizawa, K. Kita-Tsukamoto, K. Ikejima, R. Yu, C. Imada, H. Karatani, N. Mizuno, Y. Suzuki, M. Nishida, K. Kogure // FEMS Microbiol. Lett. – 2006. – Vol. 260. – № 2. – P. 186-192.
• Miller, S. D. Detection of a bioluminescent milky sea from space / S. D. Miller, S. H. D. Haddock, C. Elvidge, T. F. Lee // Proc. Nat. Acad. Sci. – 2005. – Vol. 102. – № 40. – P. 14181-14184.
• Nealson, K. H. Quorum sensing on a global scale: massive numbers of bioluminescent bacteria make milky seas / K. H. Nealson, J. W. Hastings // Appl. Environ. Microbiol. – 2006. – Vol. 72. – № 4. – P. 2295-2297.
• Herring, P. Marine microlights: the luminous marine bacteria / P. Herring // Microbiol. Today. – 2002. – Vol. 29. – P. 174-176.
• Lemus, J. D. Alterations in the Proteome of the Euprymna scolopes Light Organ in Response to Symbiotic Vibrio fischeri / D. Lemus, M. J. McFall-Ngai // Applied and Environmental Microbiology. – 2000. – Vol. 66. – № 9. – P. 4091-4097.
• Poinar, G. O. Characteristics of the specific bacterium associated with Heterorhabditis bacteriophora (Heterorhabditidae: Rhabditida) / G. O. Jr. Poinar, G. Thomas, R. Hess // Nematologica. – 1977. – Vol. 23. – P. 97-102.
• Lee, F. Imaging of light emission from the expression of luciferases in living cells and organisms: a review / F. Lee, А. Aladar, A. S. Zalay // Luminescence. – 2002. – Vol. 17. – P. 43-74.
• Hastings, J. W. Bacterial luciferase: FMNH2-aldehyde oxidase / J. W. Hastings, R. P. Presswood // Methods Enzymol. – 1978. – № 53. – P. 558-570.
• Lin, L. Y. Modeling of the bacterial luciferase-flavin mononucleotide complex combining flexible docking with structure-activity data / L. Y. Lin, T. Sulea, R. Szittner, V. Vassilyev, E. O. Purisima, E. A. Meighen // Protein Science. – 2001. – № 10. – P. 1563-1571.
• Hastings, J. W. Bioluminescence and Chemiluminescence / J. W. Hastings, C. H. Johnson // Methods Enzymol. – 2003. – № 360. – P. 75-104.
• Duchaud, E. The genome sequence of the entomopathogenic bacterium Photorhabdus luminescens / E. Duchaud , C. Rusniok , L. Frangeul, C. Buchrieser // Nat. Biotechnol. – 2003. – № – P. 1307-1313.
• Lin, J. W. Nucleotide sequence and functional analysis of the luxE gene encoding acyl-protein synthetase of the lux operon from Photobacterium leiognathi / W. Lin, Y. F. Chao, S. F. Weng // Biochem Biophys. Res. Commun. – 1996. – Vol. 228. – № 3. – P. 764-773.
• Fuqua, C. Regulation of gene expression by cell-to-cell communication: acyl-homoserine lactone quorum sensing / C. Fuqua, R. M. Parsek, E. P. Greenberg // Annu. Rev. Genet. – 2001. – № 35. – P. 439-
• Грузина, В. Д. Коммуникативные сигналы бактерий / В. Д. Грузина // Антибиотики и химиотерапия. – 2003. – Т. 48 – № 10. – С. 32-39.
• Олескин, А. В. Экологически важные свойства популяций микроорганизмов / А. В. Олескин // Соросовский образовательный журнал. – 2001. – Т. 7. – № 8. – C. 7-11.
• Кудряшева, Н. С. Физико-химические основы биолюминесцентного анализа: учеб. пособие / Н. С. Кудряшева, В. А. Кратасюк, Е. Н. Есимбекова. – Красноярск : Краснояр. гос.ун-т., 2002. – 154 c. – ISBN 5-7638-0346-9.
• Bulich, A. A. Use of the luminescent bacterial system for the rapid assessment of aquatic toxicity / A. A. Bulich, D. L. Isenberg // ISA Trans. – 1981. – № 1. – P. 29-33.
• Gellert, G. Sensitivity and significance of luminescent bacteria in chronic toxicity testing based on growth and bioluminescence / G. Gellert // Ecotoxicol Environ Saf. – 2000. – № 1. – P. 87-91.
• Алешина, Е. С. Использование люминесцирующих микроорганизмов для биотестирования минеральных вод : дис. канд. биол. наук / Е. С. Алешина. – М., 2007. – 187 с.
• Hyung, C. S. A portable toxicity biosensor using freeze-dried recombinant bioluminescent bacteria / C. S. Hyung, M. B. Gu // Biosens. Bioelectron. – 2002. – № 17. – P. 433-440.
• Pellinen, T. Detection of traces of tetracyclines from fsh with a bioluminescent sensor strain incorporating bacterial luciferase reporter genes / T. Pellinen, G. Bylund, M. Virta, A. Niemi, M. Karp // J. Agr. Food Chem. – Vol. 17 – № 50. – P. 4812-4815.
• Dzyadevych, S. V. Early-warning electrochemical biosensor system for environmental monitoring based on enzyme inhibition / S. Dzyadevych, A. Soldatkin, V. Arkhypova, C. Georgiou, J.-M. Chovelon, C. Martelet // Sensors and Actuators chemical. – 2005. – № 10. – P. 581-587.
• Kovats, N. Assesment of soil contaminaition using ToxAlert test / N. Kovats, A. Reichel, T. G. Szalay, G. Bakonyi, P. Nagy // Journal of Hungarian Geomathematics. – 2004. – № 2. – P. 1-15.
• ISO 11348-1. Water quality - Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) - Part 3: Method using freezedried bacteria : International Organisation for Standardization, 2007. – 28 p.
• Kuznetsov, A. M. Analysis of river water by bioluminescent biotests / A. M. Kuznetsov, E. K. Rodicheva, S. E. Medvedeva // Luminescence. – 1999. – Vol. 14. – № 5. – P. 263-265.
• Кузнецов, А. М. Использование генетически модифицированного штамма Escherichia coli в биотестировании / А. М. Кузнецов, С. Е. Медведева, Э. К. Родичева // Проблемы окружающей среды и природных ресурсов. – 2000. – № 10. – С. 67-73.
• КНД 211.1.4.060-97. Методика визначення токсичностi води на бактерiях Photobacterium phosphoreum (Cohn) Ford. – Затв. наказом Мiнприроди Украiни вiд, 1997. – 22 с.
• МР № 01.017-07. Оценка качества этиловых спиртов, водок и алкогольной продукции. Экспресс-метод с использованием бактериальной биолюминесценции : ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2007. – 21 с.
• МР № 01.019-07. Определение интегральной токсичности почв с помощью биотеста «Эколюм» : ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2007. – 22 с.
• МР № 01.020-07. Определение токсичности воздушной среды с помощью биотеста «Эколюм» : ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2007. – 21 с.
• Данилов, В. С. Сенсорные биолюминесцентные системы на основе lux-оперонов разных видов люминесцентных бактерий / В. С. Данилов, А. П. Зарубина, Г. Е. Ерошников, Л. Н. Соловьева, Ф. В. Карташев, Г. Б. Завильгельский // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 16. Биология. – 2002. – № 3. – С. 20-24.
• Дьячков, П. Н. Углеродные нанотрубки. Строение, свойства, применение / П. Н. Дьячков. – М. : Бином. Лаборатория знаний. – 2006. – 293 с.
• Iijima, S. Helical microtubules of graphitic carbon / S. Iijima // Nature. – 1991. – № 354. – P. 56-58.
• Радушкевич, Л. В. О структуре углерода, образующегося при термическом разложении окиси углерода на железном контакте / Л. В. Радушкевич, В. М. Лукьянович // Физическая химия. – 1952. – № 1. – С. 88-95.
• Кац, Е. А. Фуллерены – молекулы чистого углерода / Е. А. Кац // Энергия: экономика, техника, экология. – 2002. – № 3.– C. 25-31.
• Iijima, S. Single-shell carbon nanotubes of 1-nm diameter / S. Iijima, T. Ichihashi // Nature. – 1993. – № 363. – P. 603-605.
• Bethune, D. S. Cobalt-catalysed growth of carbon nanotubes with single-atomic-layer walls / D. S. Bethune, C. H. Kiang, G. Gorman, R. Savoy, J. Vazquez, R. Beyers // Nature. – 1993. – № 363. – P. 605-607.
• Елецкий, А. В. Углеродные нанотрубки и их эмиссионные свойства / А. В. Елецкий // Успехи физических наук. – 2002. – Т. 172. – № 4. – C. 401-438.
• Ивановский, А. Л. Горошины в стручке или фуллерены и нанотрубки – в одном флаконе // Химия и жизнь, 21в. – 2004. – № 1. – C. 20-23.
• Кац, Е. А. Углеродные нанотрубки – фантастика наяву. Часть 4. Механические свойства углеродных нанотрубок. Космический лифт // Энергия: экономика, техника, экология. – № 4. – 2008. – P. 61-69.
• Biercuk, M. G. Fisher carbon nanotube composites materialsfor thermal management / M. G. Biercuk, M. C. Llagino, M. Radosavljevic, J. K. Hyun, A. T. Johnson // Appl. Phys.Lett. – 2002. – № 80. – P. 2767-2769.
• Кац, Е. А. Углеродные нанотрубки – фантастика наяву. Часть 3. Электронные свойства углеродных нанотрубок. Наноэлектроника и оптоэлектроника / Е. А. Кац // Энергия: экономика, техника, экология. – № 5. – 2008. – P. 49-55.
• Елецкий, А. В. Транспортные свойства углеродных нанотрубок / А. В. Елецкий // Успехи физических наук. – 2009. – № 3. – P. 225-242.
• Ремпель, А. А. Нанотехнологии, свойства и применение наноструктурированных материалов / А. А. Ремпель // Успехи химии. – 2007. – Т. 76. – № 5. – С. 474-500.
• Bachtold, A. Logic Circuits with carbon nanotubes transistors / A. Bachtold, P. Hadiey, T. Nakanishi, C. Dekker // Science. – 2001. – Vol. 294. – № 5545. – P. 1317-1320.
• Akita, S. Nanotweezers consisting of carbon nanotubes operating in an atomic force microscope / S. Akita, Y. Nakayama, S. Mizooka, Y. Takano, T. Okawa, Y. Miyatake, S. Yamanaka, M. Tsuji, T. Nosaka // Appl. Phys. Lett. – 2001. – № 79 – P. 1691-1693.
• Сейфулла, Р. Д. Проблемы использования нанотехнологии в фармакологии / Р. Д. Сейфулла, А. Б. Тимофеев, З. Г. Орджоникидзе // Эксперимен. и клинич. фармакология. – 2008. – № 1. – С. 61-69.
• Yudoh, K. Water-soluble fullerene (C60) inhibits the development of artrits in the rat model of arthritis / K. Yudoh, R. Karasawa, K. Masuko, T. Kato // Inter. J. of Nanomedicine. – 2009. – № – P. 217-225.
• Freitas, R. Current Status of Nanomedicine and Medical Nanorobotics / R. Freitas, A. Robert // Journal of Computational and Theoretical Nanoscience. – Vol. 2. – 2005. – P. 1-25.
• Moghimi, M. Nanomedicine: current status and future prospects / M. Moghimi, A. Hunter, J. Murray // FASEB J. – 2005. – № 19. – P. 311-330.
• Lai, H.S. Free radical scavenging activity of fullerenol on grafts after small bowel transplantation in dogs / H. S. Lai, Y. Chen, W. J. Chen, L. Y. Chiang // Transplant. Proc. – 2000. – Vol. 6. – № 32. – Р. 1272-1274.
• Huang, S. S. Effect of hexasulfobutylated C60 on the isolated aortic ring of guinea pig / S. S. Huang, T. Mashino, M. Mochizuki, L. Y. Chiang, L. H. Chih, H. M. Hsieh, C. M. Teng // Pharmacology. – 2000. – № 64. – P. 91-97.
• Medina, C. Nanoparticles: pharmacological and toxicological significance / C. Medina, M. J. Santos-Martinez, A. Radomski, O. I. Corrigan., M. W. Radomski // British Journal of Pharmacology. – 2007. – № 5. – P. 552-558.
• Smith, C. J. Toxicity of single walled carbon nanotubes to rainbow trout, (Oncorhynchus mykiss): respiratory toxicity, organ pathologies, and other physiological effects / C. J. Smith, B. J. Shaw, R. D. Handy // Aquat.Toxicol. – 2007. – № 82. – Р. 94-109.
• Magrez, А. Cellular Toxicity of Carbon-Based Nanomaterials / A. Magrez, S. Kasas, V. Salicio, N. Pasquier, J. Won Seo, M. Celio, S. Catsicas, B. Schwaller, L. Forrо // Nano Letters. – 2006. – Vol. 6. – № 6 – Р. 1121-1125.
• Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза. – М. : Федеральный Центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. – 58 с.
• Данилов, В. С. Сенсорные биолюминесцентные системы на основе lux-оперонов разных видов люминесцентных бактерий / В. С. Данилов, А. П. Зарубина, Г. Е. Ерошников, Л. Н. Соловьева, Ф. В. Каташев, Г. Б. Завильгельский // Вестник Московского Университета. Сер. 16: Биология. – 2002. – № 3. – С.20-24.
• Корнелаева, Р. П. Санитарная микробиология сырья и продуктов животного происхождения / Р. П. Корнелаева, П. П. Степаненко, Е. В. Павлова – М. : ООО Полиграфсервис, 2006. – 407 с.
• Medchemlabs division Nanocarblab. Production and prices, 2005. – Режим доступа: http: // nanocarblab.com/prod price.html. – 3.06.11.
• Планета Здоровья XXI. посев. Режим доступа: http: // health-planet.ru/l-posev.php. – 3.06.11.
• Фрайфелдер, Д. Физическая биохимия: применение физико-химических методов в биохимии и молекулярной биологии / Д. Фрайфелдер : пер. с англ. Е. С. Громовой, С. В. Яроцкого ; под ред. З. А. Шабаровой. - М. : Мир, 1980. – 582 с.
• Gottschalk, F. Modeled environmental concentrations of engineered nanomaterials (TiO₂, ZnO, Ag, CNT, Fullerenes) for different regions / F. Gottschalk, T. Sonderer, R. W. Scholz, B. Nowack // Environmental Science and Technology. – – Vol. 43. – № 24. – P. 9216-9222.
• Hurt, R. H. Toxicology of carbon nanomaterials: Status, trends, and perspectives on the special issue / R. H. Hurt, M. Monthioux, A. Kane // Carbon. 2006. – 44 – № 6 – P. 1028-1033.
• Буштуева, К. А. Выбор зон наблюдения в крупных промышленных городах для выявления влияния атмосферных загрязнений на здоровье населения / К. А. Буштуева, Д. П. Парцеф, А. А. Беккер, Б. А. Ревич // Гигиена и санитария. – 1985. – № 1. – С. 4-6.
• Зарубина, А. П. Биотестирование биологических эффектов одностенных углеродных нанотрубок с использованием тест-системы люминесцентных бактерий / А. П. Зарубина, Е. П. Лукашев, Л. И. Деев, И. М. Пархоменко, А. Б. Рубин // Российские нанотехнологии. – 2009. – Т. 4. – № 11-12. – С. 152-155.
• Алёшина, Е. С. Коррекция результатов биолюминесцентного анализа с учётом оптических свойств исследуемых углеродных наноматериалов / Е. С. Алёшина, И. П. Болодурина, Д. Г. Дерябин, М. Г. Кучеренко // Вестник Оренбургского государственного университета. – 2010. – № 6. – С. 141-146.

 Скачать: DIPLOM.doc