Привет студент

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

 

Исследование механизмов антибактериальной активности тетрааминопроизводного С60-фуллерена

 

Введение

Одним из значимых открытий конца ХХ века стало обнаружение нового класса веществ – фуллеренов, представляющих собой строго упорядоченные по количеству и расположению атомов сферические соединения углерода [1]. Практически сразу после открытия в 1985 г. и, особенно, после присуждения их создателям Нобелевской премии в 1996 г., фуллерены стали интенсивно изучаться на предмет возможности использования в биологии и медицине, что к настоящему моменту привело к созданию целого спектра веществ с нейропротекторной [2], антиоксидантной [3], противоопухолевой [4] и противовирусной [5] активностями.

В этой связи целью дипломной работы явилось исследование антибактериальной активности двух новых водорастворимых амино– и карбокси–производных С60–фуллерена [6], а также исследование механизмов подобной биологической активности с учетом оригинальных физико–химических особенностей данных соединений.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

 

 

1.Антибактериальная активность С60–фуллеренов

 

1.1Открытие фуллеренов

 

До недавнего времени было известно, что углерод образует три аллотропных формы: – алмаз, графит и карбин. Первые фуллерены С60 и С70 – были открыты в 20 веке, но гипотезы о существовании подобных структур были выдвинуты Архимедом (287 – 212 до н.э.), а Леонардо да Винчи (1452–1519) представил структуру усеченного икосаэдра в книге Dе Divina Proportione ("О божественной пропорции") (рисунок 1).

 

 

Рисунок 1 – Титульный лист книги Луки Пачоли «Dе Divina Proportione» ("О божественной пропорции).

 

Модель образования фуллеренов предложена Д. Джонсом в 1982 году. Согласно ей каркасные молекулы углерода могут образоваться в результате внедрения дефектов в графитовый слой, что влечет за собой его сворачивание и замыкание слоя. Эти дефекты имеют форму пятичленных циклов [7].

Также возможность существования высокосимметричной молекулы углерода, напоминающей футбольный мяч, была представлена японскими учеными Е. Осава и З. Иошилда в 1970 году [8], но никаких расчетов приведено не было. Российские ученые Д.А. Бочвар и Е.Г. Гальперин в 1973 году сделали первые теоретические квантовохимические расчеты такой молекулы и доказали что замкнутый полиэдр из атомов углерода в форме усеченного икосаэдра имеет замкнутую электронную оболочку и высокую энергию связи [9]. Однако эта работа прошла незамеченной.

 В 1985 году Британский химик Гарольд Крото в Университете Сассекса использовал в своей работе метод микроволновой спектроскопии, позволяющей изучать спектры поглощения звездных частиц находящихся на расстоянии миллиарды километров. В то же время, Ричард Смолли совместно с Робертом Керлом и аспирантами Хитом и О' Брайеном занимались исследованиями по кластерной химии, в университете Райса в Хьюстоне, штат Техас. В ходе анализа масс–спектральных характеристик продуктов разложения графита был выявлен пик, соответствующий значению 720 условных единиц массы (у.е.м.), происхождение которого объяснялось присутствием молекул С60. Другой, менее интенсивный пик, соответствующий массе 840 у.е.м., связывался с молекулой С70 (рис. 2). Впоследствии ученые представили свои открытия в журнал "Nature" в рукописи под названием "C60 Бакминстерфуллерен", опубликованной  14 ноября 1985 года [10].

 

Рисунок 2 – Масс–спектр паров графита [10].

 

Новая аллотропная модификация углерода получила название «фуллерены» по имени американского инженера и архитектора Ричарда Букминстера Фуллера, конструировавшего полусферические архитектурные сооружения, состоящие из шести– и пятиугольников.

1.2 Структура и физико–химические свойства фуллеренов

 

1.2.1 Структура С60–фуллерена

С химической точки зрения фуллерены представляют собой молекулярные формы углерода, в которых атомы расположены в вершинах правильных шести– и пятиугольников, покрывающих поверхность сферы. Самым симметричным и наиболее распространенным из них является С60–фуллерен. В молекуле С60 каждый атом углерода связан с тремя другими атомами ковалентными связями, образуя при этом правильные пятиугольники (до 12) и неправильные шестиугольники (до 20). В икосаэдрической структуре молекулы С60–фуллерена  все атомы углерода эквивалентны, каждый атом принадлежит двум шестиугольникам и одному пятиугольнику и связан с ближайшими атомами двойной и двумя одиночными ковалентными связями. Длина связи С–С в пентагоне составляет 1,43Ǻ, в гексагоне длину около 1,393Ǻ. Молекула С60 имеет высокую симметрию, наиболее близкую к сферической, поэтому молекулу фуллерена можно рассматривать как сферическую оболочку. Толщина этой оболочки составляет приблизительно 1 Ǻ, а ее радиус 3,6 Ǻ.

В кристаллической решетке С60 – фуллерена существует слабая связь, называемая Ван–дер–ваальсовой, в результате чего молекулы могут поляризовать друг друга, то есть приводить к смещению в пространстве центров положительного и отрицательного зарядов, что приводит к их взаимодействию [11].

При определенных условиях молекулы С60 упорядочиваются в пространстве, располагаясь в узлах кристаллической решетки. Для того чтобы молекулы С60 – фуллерена регулярным образом расположились в пространстве, они должны быть связаны между собой. Число атомов углерода в таком кластере не произвольно, а подчиняется определенной закономерности Согласно геометрическому расчету, проведенному еще Эйлером, для построения такого многогранника необходимо, чтобы число пятиугольных граней было равно двенадцати, число же шестиугольных граней может быть произвольно. Такому условию отвечают кластеры с числом атомов N = 32, 44, 50, 58, 60, 70, 72, 78, 80, 82, 84 и т.д. Наибольший интерес экспериментальных исследований представляет С60–фуллерен ввиду его наибольшей стабильности и высокой симметрии (рис.3) [12].

 

А                                                     Б

 

Рисунок 3 – С60–фуллерен (А) и его молекулярный граф (Б) [12].

 

Молекулярный кристалл фуллерена является полупроводником с шириной запрещённой зоны ~1.5 эВ и его свойства во многом аналогичны свойствам других полупроводников. Поэтому ряд исследований был связан с вопросами использования фуллеренов в качестве нового материала для традиционных приложений в электронике [13].

 

1.2.2 Растворимость С60–фуллерена

 

Интерес к исследованию фуллеренов значительно возрос после того, как в 1990 году Вольфганг Кретчмер и Дональд Хаффман разработали технологию их получения в макроскопических, граммовых количествах путем испарения графитовых электродов в электрической дуге в атмосфере гелия [14].

Однако, основным ограничением для использования является малая доступность высокорастворимых в воде (более 1 мг в 1 мл) соединений фуллеренов с однозначно установленным составом и строением.

Фуллерены в полярных растворах проявляют тенденцию к образованию агрегатов или кластеров, состоящих из нескольких молекул, что усиливается в присутствии солей или белков и сопровождается существенным снижением биологической активности [15].

Анализ литературных источников [16,17] показывает, что фуллерены лучше всего растворяются в растворителях, для которых значение удельной энтальпии испарения, отнесенной к удельному объему молекулы растворителя, близко к соответствующему значению для молекулы С60–фуллерена (примерно 100 кал*см^–3). Это соответствует диалектическому правилу «подобное растворяется в подобном». Выбор адекватных растворителей не единственный способ получения истинных растворов фуллеренов, что будет подробнее описано ниже (таблица 1).

 

Таблица 1– Растворимость С60–фуллерена [18].

 

Растворитель	Растворимость мг/мл.
1–хлорнафталин	51
1–метилнафталин	33
тетрагидронафталин	16
сероуглерод	8
бромоформ	5
кумол	4
толуол	3
бензол	1.5
циклогексана	1.2
тетрахлорметан	0.4
хлороформ	0.25
Н–гексан	0.046
тетрагидрофурана	0.006
ацетонитрил	0.004
метанол	0.00004
вода	1.3×10−11

 

1.2.3 Оптические свойства С60–фуллеренов

 

Растворы фуллеренов в неполярных растворителях характеризуются нелинейными оптическими свойствами, что проявляется, в резком снижении прозрачности раствора при определенных условиях[19], однако, спектроскопия оптического поглощения в ультрафиолетовой и видимой областях является удобным методом количественного определения фуллеренов в растворах в силу его высокой чувствительности.

В 1990 году с помощью этого метода было установлено, что наличие двух максимумов в ультрафиолетовом спектре поглощения фуллеренсодержащей сажи, объясняется присутствием молекул С60–фуллерена (рис. 4).

 

Рисунок 4 – Спектр поглощения С60–фуллерена в ультрафиолетовой и видимой областях [19].

 

Появление слабой полосы поглощения в области 700 нм делает возможным использование таких соединений для фотодинамической терапии. Фуллерены являются сенсибилизаторами превращения кислорода в его синглетное состояние [20]. Это свойство было использовано для получения гетерогенных катализаторов на основе фуллеренов при проведении реакций с участием синлетного кислорода [21].

Фотовозбужденные фуллерена переходят в синглетное состояние (время жизни ≈ 1,3 нс), которое преобразуется в долгоживущее триплетное состояние (время жизни = 50–100 мс). Триплетного состояния передает энергию молекулярному  кислороду, порождая синглетный кислород с почти унитарным выходом (рис. 5). Биологическая активность фуллерена обусловлена, естественно, его физическими и химическими свойствами, и поэтому он способен при освещении проявлять свойства окислителя, тогда как в темноте выступает в роли высокоактивного антиоксиданта благодаря своей способности «улавливать» свободные радикалы [22].

 

 

Рисунок 5 – Энергетические превращения при фотовозбуждении С60–фуллерена [23].

 

1.2.4 Модификация С60–фуллерена

 

Существенным ограничением для практического применения фуллеренов является их низкая солюбилизация, в водных растворах. Решение данной проблемы возможно путем ковалентной модификации углеродного каркаса С60–фуллерена различными функциональными группировками (аддендами), что позволяет не только существенно повышать его растворимость в воде, но и создавать соединения с новыми свойствами [24, 25].

Методы химического синтеза позволяют получать фуллерены с различными функциональными группировками, что может увеличить их растворимость. Подобные соединения могут быть получены  путем ковалентного присоединения полярных солюбилизирующих групп, например, восстановление фуллерена подходящими реагентами позволяет получать растворы анионов с концентрациями до 1мг/мл.

Другим подходом является образование межмолекулярных комплексов фуллерена с субстратом. Наиболее простой вариант–применение поверхностно–активных веществ, образующих мицеллы внутри которых располагаются фуллерены, однако растворимость фуллерена при этом подходе очень низкая. В качестве водорастворимых полимеров часто используются поливинилпирролидон и полиэтиленгликоль, но состав и строение их комплексов с фуллеренами является неопределенным, а биологическая активность – слабо выраженной.

Наиболее эффективный способ солюбилизации – химическая функционализация путем ковалентной модификации углеродного каркаса С60–фуллерена различными функциональными группировками (аддендами), что позволяет не только существенно повышать его растворимость в воде, но и создавать соединения с новыми свойствами [26].

Результатом подобной модификации являются молекулы, которые  условно можно разде­лить две группы:

1) соединения, в которых адденды равномерно покрывают всю поверхность фуллеренового каркаса, в следствии чего много­численные адденды, присоединенные по всей поверхности, ме­няют электронную структуру углеродного каркаса и делают его недоступным для взаимодействия с биологическими мишенями;

2) соединения, имеющие один или несколько аддендов, сгруп­пированных на небольшой части каркаса.

Именно последний приём наиболее распространен при синтезе потенциально биоактивных фуллереновых циклоаддуктов [27].

При этом наиболее многообещающие результаты получены с использованием химически модифицированных С60 и С70–фуллеренов, в основном содержащих ионогенные группы – аминные и карбоксильные [28,29,30].

Круг возможных применений фуллеренов включает: 1) новые классы сверхпроводников, полупроводников, магнетиков, сегнетоэлектриков, нелинейных оптических материалов; 2) новые технологии синтеза алмазов и алмазоподобных соединений сверхвысокой твердости; 3) новые классы полимеров с заданными механическими, оптическими, электрическими, магнитными свойствами для записи и хранения информации; 4) новые типы катализаторов и сенсоров для определения состава жидких и газовых сред; 5) новые классы антифрикционных покрытий и смазок, в том числе, на основе фторсодержащих соединений фуллеренов; 6) новые виды топлив и добавок к топливам; 7) капсулы для безопасного захоронения радиоактивных отходов; 8) новые классы соединений для фармакологии и медицины [31]. При этом именно последнее направление в последнее время рассматривается как одно из наиболее перспективных.

 

• Биологическая активность С60–фуллеренов и их производных

Известны данные об обнаружении у С60–фуллерена и некоторых других аллотропных соединений наноуглерода антибактериальной активности [32]. В основе биологической активности фуллеренов лежат три свойства этих молекул: липофильность, определяющая мембранотропные свойства, электронодефицитность, приводящая к способности взаимодействовать со свободными радикалами, и способность их возбужденного состояния передавать энергию молекуле обычного кислорода и превращать его в синглетный кислород.

Важным условием для биомедицинского применения фуллеренов стала разработка простых и удобных методов синтеза их производных, поверхностно функционализированных различными химическими группировками (аддендами), существенно повышающими растворимость получаемых соединений и сообщающих им усиленные или новые биологические активности [31]. Известными примерами являются водорастворимые аминокислотные и пептидные производные С60–фуллерена для использования в качестве адъювантов для вакцин нового поколения [33,34]; средство для ингибирования репродукции оболочечных вирусов, направленное на лечение инфекций, вызываемых вирусом иммунодефицита человека, вирусом гепатита С, а также вируса гриппа, в том числе серотипа H5N1 [35].

На этом фоне заметное место занимают данные об обнаружении у С60–фуллеренов и антибактериальной активности. При этом следует указать, что подобное свойство исходно присуще даже нефункционализированному фуллерену и связывается с его высоким сродством к внутреннему слою мембранных структур микроорганизмов [36]. Результатом этого является гибель бактериальных клеток, характеризуемая значениями минимальной ингибирующей концентрации на уровне 0,5–1,0 мг/л в отношении грамотрицательного микроорганизма Escherichia coli и 1,5–3,0 мг/л в отношении грамположительного микроорганизма Bacillus subtilis [37]. Как и в приведенных выше примерах, антибактериальная активность С60–фуллерена может быть существенно усилена (модифицирована) в результате функционализации различными аддендами. Примеры модифицированных С60–фуллеренов, обладающих биологической активностью приведены в таблице 2. Так особенностью монометокситриетиленгликоль– замещенного фуллеропирролидина стала его увеличенная активность в отношении возбудителей туберкулеза Mycobacterium avium и Mycobacterium  tuberculosis, подавляемым в присутствии данного соединения в концентрациях 260 мг/мл и 50 мг/мл соответственно [38]. Другим подходом к усилению противотуберкулезных свойств фуллеренов стало ковалентное присоединение к ним известного препарата изониазида, что сопровождалось повышением водорастворимости полученных соединений [39].

 

Таблица 2 – Структура и биологические свойства фуллеренов

 

Структурная формула	Активность	Ссылка
	Антимикробная в сочетании с УФ	[39]
	Антимикробная 50 мг/мл	[40]
	Антимикробная 260мг/мл	[40]
	Антимикробная подавление клеточного дыхания	[42]
	Антимикробная подавление клеточного дыхания	[43]
	Угнетение вируса ВИЧ–1	[44]
	Подавление активности ВИЧ–2	[45]

 

Повышение антибактериальной активности зафиксировано и у бис–пироллидоновых солей С60–фуллерена, из которых наиболее активным оказывался транс–2 изомер, вызывающий гибель клеток E. coli уже в концентрации 1 мкМ [44]. При этом механизм подобной активности связывался авторами с ингибированием дыхательных цепей бактериальных клеток–мишеней. В дальнейшем антибактериальный эффект  бис–пироллидоновых солей С60–фуллерена, сопоставимый с таковым у антибиотика ванкомицина, продемонстрирован и в отношении грамположительного микроорганизма Enterococcus faecalis [37].

Другим примером функционализированных С60–фуллеренов, обладающих антибактериальной активностью в отношении E. coli, стали его катионоидные аминопроизводные С60–бис(N,N–диметилпироллидон иодид) и С60–бис (N,N–диметилпиперазин иодид), на фоне которых анионоидный С60–дималонова кислота не вызывала подобных эффектов [40]. При этом в качестве причины гибели бактериальных клеток–мишеней авторы называли угнетение кислородного дыхания и обусловленное этим подавление их энергетического метаболизма. В более же поздней работе [45] ими показан зависящий от концентрации двухфазный эффект катионоидных фуллеренов: низкие дозы данных производных С60–фуллерена подавляли активность клеточного дыхания, в то время как увеличение их действующих концентраций приводило к увеличению количества потребляемого кислорода, конвертируемого в перекись водорода.

Еще одним катионоидным производным С60–фуллерена с антибактериальной активностью является N, N–диметил–2–(4′–N,N,N–триметиламинофенил) фуллеропиролидин иодид [41]. При этом подобное соединение демонстрирует собственный бактерицидный эффект в отношении клеток E. coli, который может быть существенно усилен при освещении и определяется возникновением его долгоживущего триплетного состояния с последующим энергетическим переносом на молекулярный кислород. В результате авторы делают заключение о возможности применения использованного ими катионоидного производного С60–фуллерена для фотодинамической инактивации микроорганизмов, что нашло свое продолжение в последних работах по данной тематике [46].

Бактерицидная активность по отношению к E.coli W3110 и Shewanella oneidensis MR (рисунок 6) выявлена у С60–фуллерена функционализированного NH₂–группой. Причем при концентрациях порядка 10 мг/мл выявлялся бактериостатический эффект, а при 80 мг/мл – бактерицидный [47].

 

 

Рисунок 6 – Электронно–микроскопическое изображение Escherichia coli W3110(А, Б) и Shewanella oneidensis MR–1(В, Г) после воздействия различных производных С60–фуллерена [47].

Серия новых производных фуллерена с триазиновой группой  проявляла бактерицидную активность в отношении как грамположительных (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus pumilis) так грамотрицательных (E.coli, Pseudomonas aeruginosa) бактерий. Причем эффект такого воздействия может быть сопоставим с антибактериальным препаратом из группы ципрофлоксацинов [48].

В определенное противоречие с приведенными выше результатами вступают данные о способности анионоидных карбоксифуллеренов подавлять развитие экспериментального энтеробактериального менингита у мышей [49]. Однако, в данном случае подобный эффект был обусловлен не прямым антибактериальным действием данного соединения, но его влиянием на процесс перехода нейтрофилов через гемато–энцефалический барьер. С другой стороны, некоторые карбоксифуллерены все–таки могли оказывать и прямое антибактериальное действие, при этом реализующееся преимущественно в отношении грамположительных микроорганизмов, например – Streptococcus pyrogens. Грамотрицательные же бактерии, клеточная стенка которых имеет иное строение и состоит из липопротеинов, липополисахаридов и фосфолипидов, оказывались  устойчивыми к карбоксифуллеренам [37], что вновь не согласуется с приведенными выше данными о сравнительной чувствительности грамотрицательных и грамположительных бактерий к нефункционализированному С60–фуллерену [38].

Одновременно следует указать, что отнюдь не любая функционализация, в том числе ведущая к увеличению водорастворимости С60–фуллерена, сопровождается увеличением его антибактериальной активности. Иллюстрацией сказанного является работа [50], в которых контакт Bacillus subtilis с фуллеренолом не вел к подавлению клеточного дыхания и не сопровождался развитием бактерицидного эффекта, в то время как нефункционализированный С60–фуллерен вызывал подобные эффекты в концентрациях 4,8 мг/л и 7,5 мг/л соответственно.

 

1.3.1Механизмы бактерицидного действия фуллеренов

 

1.3.1.1 Ингибиция ферментов

 

Уникальные мембранотропные свойства позволяют функционализированным молекулам  фуллеренов транспортироваться через  барьерные структуры клеток и взаимодействовать с внутриклеточными мишенями. Один из эффектов подобного взаимодействия связан с ингибированием работы ряда ферментов [51].

Еще в 1993 г проф. Ф. Вудлом и сотрудниками обнаружено, что размер фуллеренового каркаса достаточно точно соответствует по размеру активному центру фермента ВИЧ–1 протеазы. Активный центр фермента представляет собой гидрофобную полость, куда способны внедряться фуллерен С60 и некоторые его производные и таким образом аллостерически ингибировать ВИЧ–1 протеазу. Это указывает на возможность использования производных фуллеренов как лекарственных препаратов в борьбе с вирусом СПИДа. Проведен ряд биологических исследований, направленных на выявление анти–ВИЧ активности различных производных фуллерена.

Противовирусная активность выявлена у  некоторых солей аминопроизводных фуллеренов, проявляющих ингибирующую активность по отношению к цистеиновым (папаин, катепсин) и сериновым (трипсин, плазмин, тромбин) протеазам. Механизм ингибирования пока не ясен, но предполагается, что гидрофобность и электрофильность фуллеренового сфероида очень важны для ингибирования.

         Именно эти свойства могут быть ответственны за анти–ВИЧ активность фуллереновых циклоаддуктов. Активная сторона ВИЧ–протеазы представляет собой квазисферическую гидрофобную полость, диаметр которой около 10Å. На ее поверхности два аминокислотных остатка аспартат 25 и аспартат 125 катализируют гидролиз субстрата, поэтому ингибирование аспартатной активности может приводить к закрытию протеинового слоя и, как следствие, к остановке внутреннего репликативного цикла вируса. На основе молекулярного моделирования было установлено, что фуллереновый сфероид координируется преимущественно с гидрофобной стороны этого фермента, т.е. при достаточно сильном взаимодействии можно ожидать ингибирования ВИЧ–протеазы.

Иллюстрацией взаимодействия катионного производного фуллерена с ферментами является работа, в которой исследована способность функционализированных фуллеренов ингибировать энзимы за счет конформационных взаимодействий, в основе которых лежат размерные и структурные особенности молекула фуллерена по размерам совпадающей с  гидрофобной полостью активного центра фермента. При этом адденды  фуллерена взаимодействуют  с аминокислотными  остатками  активного центра (рис. 7), среди которых His64, His94, His96, Val121, и Thr200, блокируя доступ субстратов для каталитического центра фермента [52].

 

 

 

Рисунок 7– Взаимодействие фуллерена с ВИЧ–протеазой[52].

 

Существуют другие работы демонстрирующие возможность взаимодействия производных фуллеренов с вирусами. В частности, функционализация С60 фуллерена пироллидином с двумя аммонийными  группами ведет к появлению активности данного производного в отношении ВИЧ–2 [53]. Важным преимуществом фуллереновых анти–ВИЧ препа­ратов является практически полное отсутствие выработки к ним резистентности у вирусов.

Исследования других авторов показывают, что аминокислотные производные С60 – фуллерена ингибируют репликацию цитомегаловируса человека [54]. Установлено что производные фуллерена С60  (Nа соль аминомасляной – С60–Na–АМК и Nа соль аминокапроновой кислот – С60–Na–АКК) являются высокоэффективными ингибиторами репродукции цитомегаловируса в системе in vitro и действует более эффективно, чем коммерческий антибиотик ганцикловир[55].

 

1.3.1.2 Генотоксическое действие

После проникновения через барьерные структуры клетки фуллерены встречаются с потенциальными мишенями. В подобном качестве могут выступать любые структуры обладающие анионными свойствами, например ферменты или  нуклеиновые кислоты Способность молекул катионоидных фуллеренов взаимодействовать с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами ведет к развитию генотоксического эффекта [56]. 

В частности известно, что сферические углеродные молекулы весьма активно соединяются с двойной спиралью ДНК. Энергия связи между С60 и нуклеотидами равна от 27 до 42 ккал/моль, причем молекулы C60 могут присоединяться к ДНК сбоку, вызывая искривление молекулы [Zhao X., Striolo А., Cummings Р.Т., C60 Binds to and Deforms Nucleotides. Biophysical Journal, Volume 89, Issue 6, 3856-3862, 1 December 2005]. Кроме непосредственного взаимодействия с нуклеотидами фуллерены способны опосредованно, за счет генерации активных форм кислорода, повреждать генетический материал клеток.

Dhawan et al предлагают два механизма расщепления полинуклеотидной цепи.

Механизм первого типа заключается в фотоиндуцированном переносе электрона с гуанина на С60 – фуллерен. Основу второго механизма составляет реакция с синглетным кислородом, фотохимически порожденого С60 – фуллереном. Эти два механизмы были определены путем сравнения результатов в аэробных и анаэробных условиях. Образование линейной ДНК в аэробных условиях составило 63%, а в анаэробной среде 66%. Полученные результаты свидетельствуют о действии механизмов первого типа, что и было подтверждено авторами [57].

Было установлено, что разрыв цепи ДНК производные фуллерена осуществляют региоспецифично по гуаниновым остаткам (рис.8), авторы считают, что синглетный кислород реагирует по пятичленному имидазольному кольцу гуанозиновых остатков ДНК по механизму [4+2] или [2+2] циклоприсоединения, что и приводит к нарушению последовательности нуклеотидов в ДНК [58].

 

 

Рисунок 8–Взамодействие модифицированного С60–фуллерена с ДНК [58].

 

Впоследствии данные о генотоксичности фуллеренов были подтверждены другими экспериментами, демонстрирующими расщепление ДНК в отсутствии синглетного кислорода.

Проведена детальная сравнительная характеристика конъюгата С60–фуллерена с олигонуклеотидом и аналогичного конъюгата, в котором к олигонуклотидной цепи присоединен фрагмент эозина (известный сенсибилизатор для генерации синглетного кислорода). Исследование показало, что эффективность разрушения ДНК возрастает в дейтерированной воде в случае эозин–содержащего олигонуклеотида (благодаря повышению времени жизни синглетного кислорода), но эффект отсутствует в случае фуллерен–содержащего конъюгата. В то же время, азид натрия (дезактиватор синглетного кислорода) подавляет активность эозин–содержащей биомолекулы, но не влияет на разрушение ДНК фуллереновым производным. Эти результаты указывают на то, что механизм действия фуллерена на ДНК может и не включать образование синглетного кислорода.

Достаточно высокая эффективность фотоиндуцированного разрушения ДНК наблюдается при присоединении к каркасу С60 фрагментов, способных связываться с цепями ДНК. Такими фрагментами могут быть малые моле­кулы, способные к интеркаляции в двуцепочечную структуру ДНК. Примером может быть производное фуллерена с присоединенным акридиновым фрагментом. Акридин является достаточно эффективным интеркалянтом, обеспечивающим высокое сродство производного фуллерена к ДНК и, следовательно, высокую эффективность разрыва цепей ДНК.

Однако есть данные и в пользу механизма разрушения ДНК, связанного с образованием синглетного кислорода. Ряд производных фуллерена эффективно разрушают цепи ДНК при облучении видимым светом. Предполагалось, что разрушение ДНК является следствием фотохимической генерации синглетного кислорода в присутствии фуллерена в качестве сен­сибилизатора (квантовый выход реакции для  С60 – фуллерена приближен к 100%) [59]. Синглетный кислород является чрезвычайно цитотоксичным и разрушает все биологические молекулы, в частности ДНК (рис. 9).

 

 

Рисунок 9– Влияние С60–фуллерена на бактериальную клетку [59].

 

Детальное изучение процессов взаимодействия активных форм кислорода с нуклеиновыми кислотами было исследовано на примере плазмиды pBR322. После совместной инкубации суперспирализованной pBR322 с производными фуллеренов выявлено, что при облучении видимым светом происходит расщепление ДНК [58].

Другими исследователями оценивалась способность функционализированных С60 – фуллеренов к фотоиндуцированному расщеплению плазмиды ColE1. В темновых условиях, ДНК в присутствии этих реагентов не повреждается. При облучении видимым светом в присутствии фуллеренов было зафиксировано расщепление ДНК. Так суперспиральная ДНК преобразуется в линейные. Следовательно, можно заключить, что производные С60 – фуллеренов электростатически взаимодействуют с анионной ДНК, что в некоторых случаях ведет к расщеплению молекулы нуклеиновой кислоты при фотооблучении [60].

 

Заключение к первой главе

 

Важным направлением исследований фуллеренов является разработка на их основе противоинфекционных средств. В этом случае основной мишенью их действия является липидная мембрана патогена: фуллерены накапливаются в липидном бислое благодаря высокому сродству к его внутренней гидрофобной части и вызывают нарушения в структуре и функционировании мембраны. Уникальные мембранотропные свойства фуллеренов, благоприятствуют созданию эффективных лекарственных средств на основе этого класса соединений. Кроме того, фуллерены могут быть использованы в качестве средств доставки других лекарственных препаратов в живые ткани и клетки.

Противомикробное действие производных фуллеренов может быть усилено при одновременном воздействии ультрафиолетового или видимого света, что связано со способностью фуллеренов выступать в качестве фотосенсибилизаторов, переводящих содержащийся в среде кислород в его активные формы. Фотохимическая генерация активных форм кислорода, осуществляемая производными фуллерена в непосредственной близости к липидной мембране или молекулам нуклеиновых кислот, приводит к окислительному повреждению этих структур и в конечном итоге к потере жизнеспособности микробной клетки [61].

 

2 Материалы и методы исследований

2.1 Материалы

2.1.1 Фуллерены

При выполнении исследований использовались производные С60 –фуллерена, ковалентно функцианализированных различными химическими группировками (аддендами): тетрааминофуллерен C60[амин]₄O (мол. вес 1384) с четыремя солюбилизирующими N–(2–пиридил) пиперазиновыми аддендами и пентакарбоксифуллерен С60[карбокси]₅Сl (мол. вес 1555) с пятью солюбилизирующими N–(2–пиридил)пиперазиновыми группами. Адденды исследуемых соединений расположены вокруг одного пятичленного цикла фуллеренового каркаса. При их синтезе использован метод радикального присоединения аминных и соответственно карбоксильных групп к фуллереновому каркасу с последующим превращением образующихся аминофуллеренов и карбоксофуллеренов в водорастворимые четвертичные аммонийные соли путем кватернизации метилйодидом или обработки соответствующими кислотами. Перечисленные образцы были синтезированы и любезно предоставлены П.А.Трошиным (Институт проблем химической физики РАН, Черноголовка, Россия)[62]. Химические формулы соединений, их молекулярные массы и используемые обозначения приведены в таблице 3.

 

Таблица 3 – Исследованные соединения С60–фулленена

 

Наименование (шифр) соединения	Структура	Молекулярный вес
C60[амин]4O		1384
C60[карбокси]5Cl		1555

 

Значимым результатом проведенной функционализации являлось выраженное повышение растворимости полученных соединений в воде и других полярных растворителях, что позволяло отнести их к «истинно» или так называемым «условно водорастворимым» [63] производным С60–фуллерена (в последнем случае наилучшие результаты (>10 мг в 1 мл) достигались при первичном суспендировании в диметилсульфоксиде с последующим разбавлением водой).

Обсуждая особенности химического строения исследуемых соединений следует также отметить, что функционализирующие адденды располагались на одном полюсе исходного С60–фуллерена. Соответственно, достигнутая относительно высокая водорастворимость при одновременной доступности углеродной сферы для взаимодействия с различными клетками–мишенями стали важнейшими параметрами, отличающими исследуемые соединения от большинства известных производных С60–фуллерена и лежащими в основе регистрируемой биологической активности.

 

2.1.2 Объект исследования бактерии Escherichia coli

Escherichia coli – распространенный объект микробиологических и биофизических исследований. Простота культивирования кишечной палочки и неприхотливость к среде обитания позволяет использовать её для самых различных задач. Одинаково хорошо культура растёт как на агарах и питательных бульонах, так и в синтетических питательных средах.

Escherichia coli – это грам–отрицательные палочковидные бактерии, принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae, роду Escherichia.  Названы в честь открывшего их в 1885 году немецкого ученого Т. Эшериха. Эти микроорганизмы являются постоянными обитателями толстого отдела кишечника человека и животных.

Температурный оптимум для роста 37˚С, не устойчивы к высокой температуре, при 60°С гибель их наступает через 15 минут, при 100^°С – мгновенно. Сохраняемость кишечной палочки при низких температурах и в различных субстратах внешней среды изучена недостаточно. По некоторым данным в воде и почве кишечная палочка может сохраняться несколько месяцев. Кишечные палочки рассматривают как санитарно–показательные микроорганизмы при анализе воды и пищевых продуктов.

Бактерии рода Escherichia представлены прямыми палочками шириной от 1,1 мкм до 1,5 мкм и длиной от 2,0 мкм до 6,0 мкм. Встречаются отдельно или в парах. Различаются подвижные, передвигающиеся при помощи перитрихиальных жгутиков, и неподвижные формы. (рис. 10) [64].

 

 

Рисунок 10–Фотография Escherichia coli через сканирующий электронный микроскоп [65].

При выполнении работы в качестве объекта воздействия использован рекомбинантный штамм Escherichia coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE–генами природного морского люминесцирующего микроорганизма Photobacterium leiognathi [66], выпускаемый НВО «Иммунотех» (Россия) под коммерческим названием «Эколюм». Биосенсор "Эколюм" представляет собой лиофилизированные культуры люминесцентных бактерий, содержащиеся в среде инертных газов в специальных стеклянных флаконах. Биосенсор, содержащийся при температуре 2– 4 °С, имеет гарантированный срок хранения не менее 6 мес.

 

 

Рисунок 11– Препарат «Эколюм–9»

 

Обоснованиями использования данного объекта являлись ранее показанная чувствительность к повреждающему действию наноуглерода [67], а также положительный опыт его использования для исследования биологической активности углеродных наноматериалов [68].

Для анализа воздействия изучаемых агентов на структурно–функциональные системы клетки использовались рекомбинантные люминесцирующие штаммы Escherichia coli несущие кассету luxCDABE–генов созданных, в «ГосНИИГенетика» и характеризующихся индуцибельным характером свечения. В их основе лежит штамм E.coli К12 TG1, а в качестве донора использован люминесцирующий микроорганизм Photorhabdus luminescence Zm1 с секвенированным luxCDABE – опероном, гены которого сшиты с соответствующим стресс – промотором. В нашей работе использовались два штамма каждый из которых отвечает на то или иное воздействие, так fabA – позволяет оценивать повреждение мембра, recA – повреждения ДНК.

 

2.1.3 Объект исследования препарат ДНК pUC19

Плазмида pUC19 выделена из штамма E.coli XL1–Blue, широко используется в качестве вектора для клонирования в E.coli, представляет собой кольцевую двухцепочечную молекулу ДНК длиной 2686 пар оснований, молекулярный вес – 1.75х10⁶ дальтон (рис.12).

 

 

Рисунок 12– Векторная карта pUC19 [69].

 

Рисунок 13–Электрофоретическая подвижность плазмиды pUC19.

 

Коммерческий препарат ДНК pUC19(«Сибэнзим», Россия) представлен совокупностью кольцевых суперскрученных, кольцевых релаксированных и линеаризованных молекул ДНК.

 

 

 

 

 

2.2 Методы исследований

2.2.1 Микробиологические методы

Группа методов, включающая в себя различные приемы искусственного выращивания микроорганизмов на питательных средах с различными целями.

Выращивание микроорганизмов на питательных средах называется культивированием (лат. cultus – выращивание), развившиеся микроорганизмы – культурой. При развитии в жидкой среде культуры образуют суспензии, осадок или пленку, при развитии в плотной среде – колонии. Культуры могут быть чистыми (содержат потомство клеток только одного вида) и накопительными (состоят преимущественно из клеток одного вида микроорганизма).

Обычно микроорганизмы культивируют при определенной постоянной температуре в термостатах или термостатных комнатах [70].

Методика культивирования бактериальных клеток. Используемые штаммы Escherichia coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE–генами природного морского люминесцирующего микроорганизма Photobacterium leiognathi выращивали на LB–бульоне («Sigma–Aldrich», USA) в течение 18–24 часов при 37°С в присутствии соответствующего селективного антибиотика (ампициллина), после чего клетки осаждали центрифугированием (3000 об/мин, 10 мин), однократно отмывали дистиллированной водой и стандартизовали до оптической плотности 0,5 ед. при длине волны 640 нм, что соответствовало количеству 3,5×10⁹  колониеобразующих единиц в 1 мл.

Оценка бактерицидного эффекта. При оценке бактерицидного эффекта C60[амин]₄O и С60[карбокси]₅Сl в отношении E.coli K12 TG1 формировали их смеси в диапазоне концентраций от 5 до 100 мкМ, после чего из опытных и контрольных проб по истечении 60,120 и 180 минут контакта отбирали аликвоты по 100 мкл, из которых создавали серии 10–кратных разведений. Полученные образцы в объеме 10 мкл высевали на чашки с LB–агаром («Sigma–Aldrich», USA) с добавлением ампициллина в конечной концентраци 200 мкг/мл (селективный маркер для использованного рекомбинантного штамма E.coli).Учет количества КОЕ проводили после дополнительной 18–24–часовой инкубации при 37ºС и рассчитывали количество бактерий, сохранивших свою жизнеспособность при контакте с фуллеренами, выражая его в процентах от контрольных значений

Определение количества клеток высевом на плотные питательные среды (метод Коха). Метод широко применяют для определения численности жизнеспособных клеток. В его основе лежит принцип Коха, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки. Это позволяет на основании числа колоний судить об исходном содержании в ней клеток микроорганизмов. Результаты количественного определения микроорганизмов выражают в колониеобразующих единицах (КОЕ). Определение числа микроорганизмов этим методом включает три этапа: приготовление разведений; посев на плотную питательную среду в чашке Петри и подсчет выросших колоний.

Количество клеток в 1мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле:

 

                                            (1)

 

где М–количество клеток в 1 мл;

а– среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения;

10ⁿ–коэффициент разведения;

V–объем суспензии,взятый для посева, мл [70].

 

2.2.2 Методы подсчета клеток

Подсчет клеток в счетных камерах. Этот метод рекомендуется при подсчете более крупных объектов –дрожжей, одноклеточных водорослей, форменных элементов крови. Для подсчета используют счетную камеру Горяева–Тома. Камера внешне представляет толстое предметное стекло, разделенное бороздками. Центральная часть стекла содержит выемку глубиной 0,1 мл, на дно которой нанесена сетка, глубина камеры и площадь больших и малых квадратов сетки указаны на предметном стекле. Количество клеток в исследуемой суспензии вычисляют по формуле:

 

М=a*10³*n/hS                                                (2)

 

где М–количество клеток в 1 мл; а– среднее количество клеток в квадрате сетки,мм²; 10³–коэффициент перевода см³ в мм³; n––коэффициент разведения суспензии; h–высота камеры; S–площадь квадрата сетки,мм² [70].

 

2.2.3 Биолюминесцентный анализ

 

Биолюминесцентный анализ основан на регистрации светового сигнала (люминесценции), возникающего в результате протекания специфических химических реакций в биологических системах и получающих все большее распространение в различных приложениях наук о жизни [71]. При этом на основе закономерностей формирования свечения подобные тест–системы могут быть принципиально разделены на две основные группы: «сенсорные» –биотестирование основано на уменьшении интенсивности свечения в зависимости от концентрации воздействующего агента [72], и «репортерные» действующим началом которых являются рекомбинантные микроорганизмы с индуцибельной экспрессией lux–генов, клонированных под контролем стрессовых промоторов. В подобном случае исходный уровень свечения тест–систем минимален, но многократно возрастает при воздействии специфического фактора, активирующего транскрипцию соответствующего гена [73].

Методика проведения биолюминесцентного анализа. В качестве биолюминесцирующих систем использовались вышеупомянутые штаммы fabA и recA. Репортерный люминесцирующий штамм, несущий гены fabA::luxCDABE, сконструирован для детекции агентов, вызывающих мембранное повреждение. Ген FabA кодирует фермент синтеза несатурированных жирных кислот β–гидроксидеканоил–ACP–дегидразу, который отвечает за формирование двойной связи в жирных кислотах, используемых в мембране E.coli. В результате генетическая конструкция fabA’::luxCDABE позволяет на основе анализа динамики свечения оценивать транскрипционную активность соответствующего гена, индуцируемого при различных мембраноповреждающих воздействиях. Генноинженерный штамм Escherichia coli, несущий индуцибельную генетическую конструкцию recA'::luxCDABE, применяется для анализа воздействия исследуемых соединений на генетический аппарат клетки. Ген RecA играет ключевую роль при SOS–ответе и позволяет на основе динамических количественных характеристик свечения оценивать выраженность SOS–ответа, отражающего интенсивность повреждения ДНК.

Перед проведением анализа взвесь используемого репортерного штамма в объеме по 190 мкл распределяли в лунки, куда также вносили по 10 мкл разведений исследуемых соединений С60–фуллерена. Затем проводили инкубацию исследуемых и контрольных проб в течение 120 минут при 37°С в кюветном отделении микропланшетного люминометра, динамически измеряя уровень биолюминесценции с интервалом 5 минут. На основании полученных данных рассчитывали количественные характеристики люминесцентного отклика каждого из использованных репортерных штаммов по сравнению с соответствующими контролями (те же микроорганизмы, инкубируемые в аналогичных условиях, но в отсутствие С60–фуллеренов). Биолюминесценцию регистрировали на приборе микропланшетный люминометр LM–01Т («Immunotech», Чехия). Результат исследования выражали величиной прироста биолюминесценции. Для характеристики нормированного значения прироста биолюминесценции (I_норм) с учетом фонового уровня свечения репортерного штамма и изменения данных параметров в динамике эксперимента принятым является вычисление по формуле:

                                         (3)

 где I_n^опыт – уровень люминесценции опытной пробы на n–минуте; I₀^опыт – уровень люминесценции опытной пробы на 0–минуте; I_n^контр  – уровень люминесценции контрольной пробы на n–минуте; I₀^контр – уровень люминесценции контрольной пробы на 0–минуте [71].

 

2.2.4 Фотометрические методы

 Высокая чувствительность и производительность фотометрических методов исследования делают их весьма перспективными для качественного и количественного анализа молекулярных систем

Среди большого разнообразия оптических методов широко используются фотометрия и флуориметрия. Большинство оптических методов исследования основаны на регистрации безызлучательных или излучательных электрон–ных переходов между основным состоянием S₀ и возбужденными синглетными или триплетными состояниями.

 

2.2.4.1Спектрофотометрический анализ

Спектрофотометрия – метод основанный на способности вещества поглощать энергию электромагнитного излучения. Интенсивность поглощения света веществом определяется законом Бугера – Ламберта – Бера:

,                                       (4)

 

где l – толщина слоя образца;

с – концентрация молекул;

 ε – коэффициент пропорциональности, который называется молярным коэффициентом поглощения (экстинкции).

Или после интегрирования:

 

I/I₀ = e^–εcl                                          (5)

 

где I₀, I– соответственно падающий и прошедший через образец толщины l световые потоки.

Фотометрическое измерение заключается в оценке различий в интенсивности двух потоков излучения: падающего на исследуемый объект (I₀) и прошедшего через него (I) на определенной длине волны.

Методика измерения спектров поглощения и флюоресценции. Перед исследованием спектров поглощения и флюоресценции производилась подготовка образцов С60[карбокси]₅Сl и C60[амин]₄O. Для создания суспензий фуллеренов их навески 3,4мг помещали в стеклянные емкости, вносили 1,015 мл химически чистой дислилированой воды, интенсивно перемешивали пипетированием, после чего в  течение 30 минут  обрабатывали ультразвуком частотой 35 кГц в источнике ванного типа «Сапфир ТТЦ» (ЗАО ПКФ «Сапфир», Россия). Водные суспензии исследуемых соединений помещали в кварцевые кюветы (НПФ «Люмекс», Россия), с оптическим путем 1 см и объёмом 3 мл. Кюветы зполнялись до уровня обеспечивающего прохождение светового излучения через весь слой раствора. Измерение спектров поглощения исследуемых соединений проводили на спектрофлуориметре «Флюорат–02 Панорама» (НПФ «Люмекс», Россия) в диапазоне 220–400 нм.

 

2.2.4.2 Спектрофлуориметрический анализ

 

Флуориметрия основана на регистрации свечения, возникающего

после поглощения света и связана с электронным переходом из возбужденного состояния молекулы в основное [75].

Для измерения спектров флюоресценции C60[амин]₄O возбуждали светом длиной волны возбуждения λ_возб.=240и 300 нм, регистрация спектров производилась от 300 до400 нм;

Так возбуждение амино – производного фуллерена  при 240 нм в идентичных условиях позволяло достичь интенсивности флюоресценции в 1,8 раза превышающую таковую при возбуждении с длиной волны 300 нм. При этом в диапазоне концентраций тетрааминофуллерена от 0 до 2 мкМ интенсивность флюоресценции линейно зависела от его присутствия в растворе (рисунок 14 Б), что позволяло прямо конвертировать значения свечения в свободные концентрации данного соединения. Одновременно, аппаратно–регистрируемые значения флюоресценции превышали абсолютные значения поглощения эквимолярных количеств C60[амин]₄O, что подтверждало представления о высокой чувствительности спектрофлюориметрического метода анализа.

 

 

 

Рисунок 14 – Оптические характеристики производных С60–фуллерена: А – спектры поглощения C60[карбокси]₅Cl С=2*10^–6М (1) и  C60[амин]₄O С=2*10^–5М (2) и флуоресценции C60[амин]₄O при возбуждении 300нм (3), 240 нм (4);

Б – Зависимость интенсивности флюоресценции C60[амин]₄O от длины волны возбуждающего света: 300 нм (5), 240 нм (6) и концентрации в растворе.

 

2.2.5 Методы разделения

           2.2.5.1 Электрофорез занимает в настоящее время центральное место среди методов исследования белков и нуклеиновых кислот. Метод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пространственная конфигурация, вторичная структура и электрический заряд, причем эти параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности [76].

Методика проведения гель–электрофореза. Электорофорез производных С60–фуллерена проводили в 1,5% агарозном геле (Агароза тип 1, «Panreac», Испания), в буфере ТБЕ, имеющем состав: 54 мг трис–борат, 27,5 мг борная кислота, 0,02 мг ЭДТА (камера для горизонтального электрофореза SE–2 «Helicon») при напряжении на электроде 150 В и силе тока 100 мА (источник питания «Эльф–8», Россия). При этом на 1 см геля приходилось 5 В/см. После 20 мин электрофореза миграцию исследуемых соединений оценивали в видимом и ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе (УВТ–1 с кабинетом, система Vitran для регистрации гелей «Vilber Lourmat», Франция).

Электрофоретическое разделение препарата ДНК pUC19 проходило в тех же условиях (при тех же параметрах) за исключением внесения в агарозу и буфер раствора бромистого этидия до концентрации 0,5 мкг/мл. Время течении которого происходило разделение ДНК pUC 19 составило 60 минут.

 

Таблица 4 – Электрофоретическая подвижность и характеризующие её величины дзетта–потенциала производных С60–фуллерена

 

Наименование соединения	Подвижность в электрическом поле (катод слева, анод справа)	ζ,mV
C60[амин]4O		+ 90,5
C60[карбоксо]5Cl		– 127,7

 

2.2.5.2 Центрифугирование

Центрифугирование – разделение неоднородных веществ на фракции по плотности при помощи центробежных сил. Скорость седиментации зависит от массы, размера, формы и плотности, а также от ускорения силы тяжести и действующих на частиц центробежных сил [76].

Для исследования процессов десорбции фуллерена с поверхности бактерий осуществляли последовательные циклы центрифугирования. В  центрифужные пробирки Eppendorf помещали смесь бактерий с фуллеренами, осаждали центрифугированием («Eppendorf MiniSpin», Германия) при 3000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре (18–25 °С), после чего отбирали супернатант для последующего флюориметрического исследования и восполняли его объем равным количеством 0,85% раствора NaCl.

 

2.2.6 Атомно–силовая микроскопия

 

Принцип действия атомно – силовой микроскопии, являющейся разновидностью cканирующей зондовой микроскопии, базируется на взаимодействие зонда–иглы закрепленной на гибкой балке – кантилевере с радиусом кривизны острия порядка 10 нанометров с поверхностью исследуемого объекта. На дистанции равной 1 Ǻ между атомами иглы и атомами поверхности образца устанавливаются межатомные взаимодействия оталкивания и притяжения. Возникающие колебания передаются на кантилевер и регистриуются с помощью лазерного луча спроецированного на фотодиод. [77]

 

 

Рисунок 15– Кантилеверы (А) и схематическое изображение компонентов атомно – силового микроскопа (Б) [78].

 

Таким образом, с помощью атомно – силовой микроскопии можно получать истинно трехмерные изображения при минимальном воздействии на структуру образца.[77].

Методика приготовления образцов для АСМ. Визуализацию контакта фуллеренов с бактериальной поверхностью проводили методом атомно–силовой микроскопии с использованием мульти–микроскопа SMM–2000 (ЗАО «КПД», Россия). Для этого интактные клетки E.coli K12 TG1 и их смеси с фуллеренами в объеме 20 мкл наносили на свежий скол слюды, высушивали при относительной влажности 95 % и температуре 20–22°С. Образцы ДНК pUC 19 после опытного воздействия в объеме 2 мкл наносили на поверхность слюды до полного высыхания на воздухе, после чего проводилось сканирование.

Полученные образцы сканировали в контактном режиме с использованием кантилеверов MSCT–AUNM («Park Scientific», США) с жесткостью балки 0,01 Н/м и радиусом кривизны иглы порядка 300–600 Ǻ.

 

Количественный морфометрический анализ полученных изображений проводился с помощью набора инструментов, входящих в состав программного обеспечения микроскопа, представленного программой «Scan Master». Программа предназначена для обслуживания сканирующего микроскопа SMM–2000, математической обработки полученных при сканировании кадров.

 

 

3.Экспериментальная часть

 

3.1Спектральные исследования производных С60 фуллерена

 

Водные растворы С60[карбокси]₅Сl и C60[амин]₄O являлись окрашенными с одним (230 нм)в случае карбокси–производного или двумя (240 и 300 нм) в случае амино–производного максимумами поглощения в ультрафиолетовой области спектра (рисунок 13А).

Интересной особенностью стало то, что возбуждение амино–, но не карбокси – производного в указанных максимумах вело к развитию флюоресценции в ближней ультрафиолетовой области  спектра с максимумом при 360 нм, симметричным основному максимуму поглощения, но имеющим различную интенсивность в зависимости от длины волны возбуждения (рисунок 13А). В частности, обнаруженная особенность исследуемого соединения к флюоресценции явилась основой для исследования количественных характеристик его сорбции/десорбции на поверхности клеток прои эукариот, разделяемых из смесей центрифугированием при 1000 g с последующим анализом флюоресцентных характеристик супернатанта. С другой стороны, отсутствие способности к флуоресценции С60[карбокси]₅Сl  потребовало проведения фотометрического анализа его связывания с поверхностью бактериальных клеток с использованием на порядок больших концентраций данного производного С60–фуллерена.

 

3.2 Исследование электрических свойств производных С60 фуллерена

Следствием проведенной функционализации стало формирование как у амино –, так и у карбокси – производного С60 – фуллерена электрических зарядов, охарактеризованных при проведении электрофореза.

При этом для С60[карбокси]₅Сl , водный раствор которого имеет характерную интенсивную красно–коричневую окраску, наблюдения результатов электрофореза проводились в видимом свете и показали перемещение в сторону анода. В свою очередь для оценки миграции C60[амин]₄O была использована его способность к флюоресценции, при детекции на трансиллюминаторе позволившая зарегистрировать единое «пятно», удаленное от места старта в сторону катода.

Итоговым результатом формализации приведенного выше эксперимента стал расчет значений электрофоретической подвижности исследованных производных С60–фуллерена (μ_p), вычисляемой по формуле:

μ_p=L/t_r×L_t/V                                                (6)

 где L – расстояние от точки старта до места детекции;

 t_r – время, затраченное анализируемой молекулой на достижение точки детекции;

L_t – расстояние между катодом и анодом;

 V – напряжение электрического поля.

При этом значение μ_p выражалось величиной см²/B*c принимало положительный (при движении к катоду) или отрицательный (к аноду) знак. Проведенный на этой основе расчет дзета–потенциала (ζ) C60[амин]₄O и С60[карбокси]₅Сl с учетом условий эксперимента приводил к значениям +90,5 mV и –127,7 mV соответственно (таблица 4). Это позволяло ожидать электростатического (кулоновского) взаимодействия амино–, но не карбокси–производного С60–фуллерна с отрицательно заряженной поверхностью про– и эукариотических клеток, характеризуемой значениями дзета–потенциала равными ζ = –50,0 мВ у E. coli [79] и ζ = –13,5 мВ у эритроцитов человека [80].

Рисунок 16– Электростатическое взаимодействие амино– и карбокси–производных С60–фуллерна с отрицательно заряженной поверхностью про– и эукариотических клеток

3.3 Исследование сорбционных свойств производных С60 – фуллерена

 

Обнаруженная особенность исследуемого соединения к флюоресценции явилась основой для исследования количественных характеристик его сорбции/десорбции на поверхности клеток про– и эукариот.

Экспериментальные доказательства подобного взаимодействия были получены при седиментационном разделении смесей C60[амин]₄O в концентрации от 0,03 до 1 мкМ с про– или эукариотическими клетками, стандартизованными по площади поверхности 0,02 м²/мл.

Смеси выдерживали при 37°С в течение 60 мин, после чего несвязанные производные С60–фуллерена отделяли центрифугированием при 1000 g в течение 10 мин, после чего автоматической пипеткой отбирали верхнюю фракцию (супернатант).

При этом спекрофлюориметрический анализ супернатантов позволил оценить количество несвязанного амино–производного С60–фуллерена с последующим расчетом величины гибсовской адсорбции.

Величину гиббсовской адсорбции (Г) рассчитывали с учетом разности исходных и равновесных концентраций тетраминофуллерена по формуле:

 

Г=V(С₀– С_р)/ S ,                                              (7)

 

где V – объем раствора;

C₀ – концентрация до адсорбции;

 С_р – равновесная концентрация после адсорбции;

S – площадь поверхности клеток [81].

Полученные результаты (таблица 5) свидетельствовали о том, что увеличение концентрации C60[амин]₄O вело к линейному увеличению показателей его связывания с клеточными поверхностями в сравниваемых модельных системах. В свою очередь выявлялось и большее сродство к поверхности E.coli K12 TG1, нежели к поверхности эритроцитов человека, что могло объясняться предполагаемой выше различной силой электростатического взаимодействия. Так при использовании C60[амин]₄O в концентрации 1 мкМ присутствующие в смеси бактериальные клетки связывали 91,0±2,3% вносимого соединения, в то время как эквивалентные им по площади эритроциты человека обеспечивали сорбцию только 65,1±1,5% от его общего количества (P<0,05). Соответственно, расчетные значения адсорбции амино–производного С60–фуллерена в подобных экспериментальных условиях характеризовались значениями Г=2,7×10^–14 л×М/м² и Г=1,9×10^–14 л×М/м² (P<0,05) на поверхности бактерий и эритроцитов соответственно.

 

Таблица5 – Показатели адсорбции C60[амин]₄O  на поверхности E.coli K12 TG1 (А) и эритроцитов человека (Б).

 

Количество C60[амин]4O, мкМ			Величина гибсовской адсорбции (Г) ×10–14, л×М/м2
внесённого в суспензию	связавшегося с клетками
	А	Б	А	Б
0,030	0,028±0,005	0,021±0,004	0,140	0,100
0,060	0,056±0,010	0,055±0,011	0,280	0,280
0,120	0,105±0,018	0,100±0,021	0,520	0,490
0,250	0,180±0,013	0,160±0,012	1,000	0,700
0,500	0,400±0,022	0,230±0,029	2,000	1,110
1,000	0,540±0,165	0,390±0,114	2,700	1,950

 

С другой стороны, седиментационное разделение смеси С60[карбокси]₅Сl в концентрации 10 мкМ с клетками E. сoli K12 TG1 или эритроцитами с последующим спектрофотометрическим исследованием супернатантов свидетельствовало о значительно более слабом связывании карбокси–производного С60–фуллерена с расчетным значением Г=9,0×10^–14 л×М/м².

 

3.3.1 Исследование адсорбции производных С60 фуллерена на поверхности E.coli K12 TG1 посредством АСМ

 

Формирование прямого физического контакта C60[амин]₄O, но не С60[карбокси]₅Сl с бактериальной поверхностью дополнительно было подтверждено с использованием атомно–силовой микроскопии. Полученные изображения интактных бактериальных клеток, а также клеток после контакта с фуллеренами приведены на рисунке 17

При этом анализ морфологических характеристик модельных микроорганизмов после контакта с амино–производным С60–фуллерена свидетельствовал о выраженном увеличении показателя шероховатости поверхности (с 1,80±0,67 нм до 9,45±7,56 нм; P<0,001), связанного с формированием на ней гранул диаметром 98,09±66,98 нм, предположительно представляющих собой ассоциаты молекул C60[амин]₄O (рисунок 17 Б). Кроме того, регистрируемые морфологические изменения клеток E.coli K12 TG1 включали изменение длины, ширины и высоты, отражающее их «уплощение» при подобном воздействии, но без признаков излития цитоплазматического содержимого во внешнюю среду.

С другой стороны, морфометрический анализ модельных микроорганизмов после контакта с С60[карбокси]₅Сl не позволил зафиксировать выраженных изменений характеристик шерховатости поверхности или размеров. Одновременно сканирование подложки (слюды) вокруг клеток E.coli K12 TG1 позволяло выявлять значительное количество свободно расположенных округлых образований диаметром в среднем 217,90±89,71 нм, по своим морфологическим и размерным характеристикам соответствующих ассоциатам карбокси–производного С60–фуллерна (рисунок 17 В).

 

 

Рисунок 17 – Фазовые АСМ–изображения клеток E.coli K12 TG1 в контроле (A) и после контакта с С60[амин]₄O (Б) и C60[карбокси]₅Cl (B) производными С60–фуллерена.

 

 

3.3.2 Исследование десорбции производных С60 фуллерена с поверхности E.coli K12 TG1

 

Продолжение исследований в данном направлении заставило констатировать частично обратимый характер связывания C60[амин]₄O с клетками E.coli K12 TG1, что было продемонстрировано при проведении последовательных циклов центрифугирования при 1000 g в течение 10 мин с отбором супернатанта для флюориметрического исследования и восполнением объема равным количеством 0,85% раствора NaCl (рисунок 4а).

Одновременно установлена обратная зависимость десорбции от концентрации амино–производного С60–фуллерена, первично взаимодействующего с бактериальной поверхностью. Так если для обеспечения полной десорбции C60[амин]₄O, использованного в исходной концентрации 0,12 мкМ, оказывалось достаточным 4 циклов отмывки, то аналогичные манипуляции с клетками E.coli K12 TG1 в концентрации 1 мкМ вели к высвобождению только 28,0±1,8% первично связанного соединения. Более того, даже после 10 циклов центрифугирования в контакте с ними оставалось более половины (64,7±1,6%) первично адсорбированного амино–производного С60–фуллерена, что примерно соответствовало прочному связыванию с одной клеткой E. coli K12 TG1 до 1,1×10⁵ молекул C60[амин]₄O. При этом подобное наблюдение может свидетельствовать в пользу возможности частичного проникновения амино–производного С60–фуллерена внутрь микробной клетки, первично развивающегося по градиенту концентраций данного соединения, а в последующем ведущего к электростатическому взаимодействию с присутствующими там полианионами (в т.ч. ДНК).

На этом фоне связывание С60[карбокси]₅Сl с бактериальной поверхностью являлось значительно менее прочным, что было показано при проведении последовательных циклов центрифугирования смеси карбокси–производного С60–фуллерна с клетками E. сoli K12 TG1 с последующим спектрофотометрическим исследованием супернатантов. В этом случае для обеспечения эффективной десорбции С60[карбокси]₅Сl с концентрацией 10 мкМ достаточными были только 4 цикла отмывки, что суммарно приводило к высвобождению 95,7±4,3% первоначально внесенного соединения.

 

Рисунок 18 – Показатели десорбции C60[амин]₄O (А) и C60[карбокси]₅Cl (Б) с поверхности E.coli K12 TG1при последовательных циклах центрифугирования.

 

3.4 Исследование антибактериальной активности производных С60 фуллерена в отношении E.coli K12 TG1

 

Для оценки бактерицидного эффекта фуллеренов в отношении используемых клеток–мишеней из опытных и контрольных проб по истечении 60 минут контакта отбирали аликвоты по 100 мкл, из которых создавали серии 10–кратных разведений. Полученные образцы в объеме 10 мкл высевали на чашки с плотной питательной средой Учет количества КОЕ проводили после дополнительной 18–24 часовой инкубации при 37ºС.

Интегральным результатом взаимодействия C60[амин]₄O с клетками E.coli K12 TG1 стала утрата их жизнеспособности, выявляемая при прямом высеве соответствующих смесей на плотные питательные среды (таблица 3).

 При этом увеличение действующих концентраций амино–производного С60–фуллерена в диапазоне от 5 до 100 мкМ вело к пропорциональному росту бактерицидного эффекта, к 60–й минуте контакта развивающегося в отношении от 50,6 до 87,4% клеток E.coli K12 TG1. Увеличение времени контакта до 120 и 180 минут также вело к достижению более выраженного бактерицидного эффекта C60[амин]₄O, развивающегося в отношении 93,7% и 99,3% клеток E.coli K12 TG1 соответственно.

Одновременно регистрируемые значения принципиально отличались от таковых для С60[карбокси]₅Сl, даже в самой высокой использованной концентрации 100 мкМ не вызывающего развития бактерицидного эффекта ни в одном из режимов контакта.

В отдельной серии экспериментов бактерицидную активность C60[амин]₄O исследовали в смесях «бактерии : эритроциты», перед высевом на BCP–агар вызывая лизис эритроцитов добавлением 0,05% сапонина. 

Установлена зависимость формирования бактерицидного эффекта C60[амин]₄O от присутствия в реакционной смеси эритроцитов человека, использованных в концентрации, формирующей поверхность, эквивалентную суммарной площади поверхности клеток E.coli K12 TG1. При этом в зависимости от использованной концентрации амино–производного С60–фуллерена выраженность бактерицидного эффекта снижалась в среднем в 1,8 раз, что могло объясняться частичным связыванием данного соединения с поверхностью эритроцитов и соответствующим снижением относительного количества C60[амин]₄O, вовлекаемого во взаимодействие с поверхностью микроорганизмов.

 

Таблица 6 – Бактерицидный эффект C60[амин]₄O в отношении E.coli K12 TG1 в отсутствии (А) и в присутствии (Б) эритроцитов человека.

 

 

Концентрация C60[амин]4O в суспензии, мкМ	Количество клеток E.coli K12 TG1,утративших жизнеспособность после  60 минут контакта
	А	Б
5	50,64±2,50	38,83 ±2,00
12,5	61,35±2,90	42,49±2,40
20	76,88±3,30	44,94±2,47
50	80,26±3,40	53,73±2,81
100	87,40±3,60	80,59±3,55

 

3.5 Исследование механизмов антибактериального действия с применением биолюминесцентного анализа и репортерных штаммов

 

Полученные результаты явились основанием для постановки вопроса о механизме повреждающего действия производных С60–фуллерена на бактериальные клетки.

Решить этот вопрос можно с помощью биолюминесцентного анализа с использованием репортерных клеточных тест–систем, основанных на генетических вариантах Escherichia coli с индуцибельной экспрессией lux–генов Photorhabdus luminescence, клонированных под контролем различных стрессовых промоторов.

В результате подобные генноинженерные штаммы позволяют на основе анализа динамики свечения оценивать транскрипционную активность соответствующего гена, индуцируемого при различных воздействиях на бактериальную клетку.

При проведении первой серии экспериментов развитие «мембранного стресса» модельного микроорганизма при контакте с фуллеренами изучали с использованием производного от E.coli K12 TG1 генноинженерного люминесцирующего штамма, несущего кассету luxCDABE–генов P.luminescence, клонированных под промотором гена fabA [82].

Так, следствием взаимодействия тетраминопроизводного С60–фуллерена с поверхностью бактериальных клеток явилась развивающаяся во времени индукция свечения, интенсивность которой отражала выраженность формирующегося в подобных условиях «мембранного стресса».

При этом тетраамино–С60 фуллерен в концентрации 2 мкМ, начиная с 30 минуты контакта, вызывал 2–кратную индукцию свечения репортерного штамма Escherichia coli fabA’::luxCDABE, пропорциональную уровню транскрипции/трансляции вовлеченного в процесс восстановления его клеточных мембран фермента β–гидроксидеканоил–ACP–дегидразы.

В то же время продолжение исследований в данном направлении не позволило связать формирование биологического эффекта C60[амин]₄O только с мембраноповреждающим действием, но предположить возможность  частичного проникновения внутрь бактериальных клеток–мишеней и электростатического взаимодействия с присутствующими там полианионами (в том числе с ДНК)

Для изучения возможности повреждения ДНК бактериальных клеток in vivo были использованы репортерные клеточные системы на основе штаммов Esherichia coli, несущих полные кассеты luxCDABE–генов Photorhabdus luminescence, клонированные под индуцибельным промотором гена recA, участвующего в SOS–ответе на генотоксические воздействия [83]. Детектирование люминесценции репортерных штаммов позволяет обнаруживать повреждение ДНК бактериальных клеток.

Экспериментальные исследования механизмов действия с использованием репортерных люминесцирующих клеточных тест–систем, несущих генетические конструкции recA'::lux позволили выявить развивающаяся во времени многократную индукция свечения, что может интерпретироваться как следствие развивающегося в условиях окислительного стресса повреждения ДНК бактериальных клеток–мишеней.

 

Рисунок 19– Уровень биолюминесценции E.сoli pfabA'::luxCDABE (1) и E.coli precA'::luxCDABE (2) в присутствии тетрааминопроизводного С60–фуллерена

 

 

3.5.1 Исследование генотоксического воздействия производных С60 фуллеренов

 

Повреждающее воздействие производных фуллерена на молекулы ДНК было установлено в экспериментах in vitro с помощью гель–электрофореза.

Доказательства возможности прямого взаимодействия производных С60 фуллерена с ДНК были получены при анализе параметров электрофоретической подвижности плазмиды pUC19 до и после контакта с данными соединениями. Анализ электрофоретической подвижности свидетельствовал состоянии данной молекулы ДНК в трех основных формах: суперскрученная (полоса I), а наиболее близкая к старту кольцевая релаксированная форма (полоса III) и линеаризованная форма (полоса II)

(дорожка 1 на рисуноке 20).

 

 

Рисунок 20– Электрофоретическая подвижность pUC19 в присутствии фуллеренов.

 

После контакта с производным С60[амин]₄O наблюдалось изменение ее электрофоретической подвижности, интерпретируемой как исчезновение суперскрученной конформации, переход значительного количества кольцевых молекул ДНК в линеаризованные (дорожка 3,4 на рисунке 21).

 

 

Рисунок 21–Механизмы действия катионоидных и анионоидных производных С60 фуллерена.

 

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о существовании у аминопроизводного С60 фуллерена ДНК–повреждающей способности, ведущей к формированию двуцепочечных разрывов данного биополимера, что согласуется с представлениями о механизмах биологической активности некоторых водорастворимых производных С60–фуллерена [84].

Заключение

В дипломе представлены результаты исследований, бактерицидного действия производных С60–фуллерена и выявления механизмов подобной биологической активности.

Для достижения указанной цели были поставлены и полностью решены задачи, связанные с установление зависимости подобной активности от их заряда, что хорошо согласуется с имеющимися данными о выраженности исследованных свойств у катионоидных производных С60–фуллерена.

Полученные результаты явились основанием для решения второй задачи, связанной с исследованием механизмов антибактериальной активности производных С60–фуллерена и осуществленной на примере катионоидного тетрааминофуллерена С60[амин]₄O. При этом выбор данного соединения  определялся не только его выраженным антимикробным потенциалом, но и дополнительными особенностями, заключающимися в способности при возбуждении светом с длиной волны 240 или 300 нм флюоресцировать с максимумом при 360 нм. Указанная особенность сформировала возможность для высокочувствительного исследования сорбции/десорбции данного производного С60–фуллерена на поверхности клеток про– и эукариот, в результате которого выявлено относительно большее сродство тетрааминофуллерена к бактериям Escherichia coli, нежели к эритроцитам человека, а также частичная обратимость подобного связывания. С использованием репортерного люминесцирующего  штамма с кассетой  fabA’::luxCDABE  генов показано, что результатом пространственного контакта тетраминофуллерена с бактериальными клетками–мишенями является развитие у последних «мембранного стресса», ранее детектированного с использованием других моделей и являющегося важным механизмом бактерицидного эффекта подобных соединений. Однако, неспецифический характер взаимодействий катионоидного производного С60–фуллерена как с про–, так и с эукариотическими клетками, обусловил  снижение его бактерицидной активности в присутствии эритроцитов человека и заставил рассматривать тетраминофуллерен и его аналоги скорее как перспективные дезинфектанты, нежели химиотерапевтические средства.

В целом итогом стала характеристика молекулярных механизмов, лежащих в основе антибактериальной активности призводных С60–фуллерена (рис. 21). При этом первичным условием для формирования подобного эффекта представляется электростатическое взаимодействие данных соединений с бактериальной поверхностью, реализуемое катионоидными, но не анионоидными производными. В свою очередь следующим важным этапом представляется диффузия амфифильных функционализированных соединений С60–фуллерена через цитоплазматическую мембрану с последующим электростатическим взаимодействием с внутриклеточными полианионами, в том числе ДНК. Формирование же подобного контакта сообщает производным С60–фуллерена свойства фотосенсибилизаторов, в условиях УФ–облучения инициирующих эффективное повреждение генетического аппарата бактериальных клеток–мишеней.

Сказанное позволяет определить прикладной аспект выполненного этапа, заключающийся в выявлении реализующих описанные выше механизмы наиболее биологически активных производных С60–фуллерена с перспективой их возможного использования в реальном секторе экономики в качестве антибактериальных нанодезинфектантов.

 

Список использованных источников

 

1. Kroto H. W., Heath J. R., O'Brien S. C., Curl R. F., Smalley R. E. C60: buckminsterfullerene // Nature. 1985. Vol. 318. P.162-163.
2. Dugan L. L., Turetsky D. M., Du C., Lobner D., Wheeler M., Almli C. R., Shen C. K-F., Luh T-Y., Choi D. W., Lin T-S. Carboxyfullerenes as neuroprotective agents // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. Vol. 94. P. 9434-9439.
3. Chueh S.C, Lai M.K, Lee M.S. Decrease of free radical level in organ perfusate by a novel water-soluble carbon-sixty, hexa (sulfobutyl) fullerenes. Transplant Proc. 1999. Vol. 31. № 5. P.1976-1977.
4. Tabata Y., Murakami Y., Ikada Y. Antitumor effect of poly(ethylene glycol)modified fullerene // Fullerene Sci. Technol. 1997. Vol. 5. P. 989-1007.
5. Kasermann F., Kempf C. Photodynamic inactivation of enveloped viruses by buckminsterfullerene // Antiviral Res. 1997. Vol. 34. P. 65–70.
6. 6. Troshina O.A., Troshin P.A., Peregudov A.S., Kozlovski V.I., Lyubovskaya R.N. Photoaddition of N-substituted piperazines to C60: an efficient approach to the synthesis of water-soluble fullerene derivatives // Eur. J. 2006. Vol. 12. P. 5569-5578.
7. The Inventions of Daedalus: A Compendium of Plausible Schemes / Ed D.Jones Oxford, San Francisco:WH Freeman, 1982.
8. Osawa E. Superaromaticity //Chem. Abstr. 1971. Vol.74. P. 854–863.
9. Бочвар Д.А., Гальперин Е.Г. О гипотетических системах: карбододекаэдре, S-икосаэдре // Докл. А.Н. СССР. Сер. Химия. Т. 209. № 3. с. 610-612.
10. Керл Р.Ф. Истоки открытия фуллеренов: эксперимент и гипотеза. Нобелевская премия по химии // Успехи физических наук. 1996. Т. 168. № 3 с. 323-358.
11. Мастеров В.Ф. Физические свойства фуллеренов // Соровский образовательный журнал. 1997, №1. С. 92-99.
12. Соколов В.И, Станкевич И.В. Фуллерены - новые аллотропные формы углерода: структура, электронное строение и химические свойства // Успехи химии. 1993. Т. 62. № 5 с. 455-473.
13. Wada Y., Tsukada M., Fujihira M.,. Matsushige K, Ogawa T. Prospects and Problems of Single Molecule Information Device// Jpn. J. Appl. Phys. 2000 Vol. 39. Part 1. P. 3835-3849
14. Kratschmer W., Lamb L.D., Fostiropoulos K., Huffman D.R. // Nature. 1990. Vol.347. P. 354-358.
15. Ширинкин С.В., Чурносов М.И., Андриевский Г.В., Васильченко Л.В. Перспективы использования фуллеренов и их производных в качестве антиоксидантов в патогенетической терапии бронхиальной астмы // Клиническая медицина. 2009. № 5. С.56-58.
16. Семёнов К. Н. Растворимость легких фуллеренов в органических растворителях. АВТОРЕФЕРАТ Санкт-Петербург 2010г.
17. Безмельницын В.Н, Елецкий А. В, Окунь М.В. Фуллерены в растворах // Успехи Физических Наук. 1998. №168. С.1195–1220
18. Фуллерены / Л.Н. Сидоров, М.А. Юровская, А.Я. Борщевский и др. М.: Изд-во «Экзамен», 2005. 687 с.
19. Baltog I., Baibarac M., Mihut L., Preda N., Velula T., Lefrant S. Spectroscopic studies on C60 fullerene solutions in binary solvent mixstures //Romanian Reports in Physics. 2005. Vol. 57. №. 4, P. 837–844.
20. Arbogast J.W., Foote C.S. Photophysical properties of C70 // J. Am. Chem. Soc. 1991. Vol. 113. № 23. P. 8886–8889.
21. Jensen A.W., Daniels C. Fullerene-coated beads as reusable catalysts // J.Org. Chem. 2003. Vol. 68. No 2. P.207-210.
22. Фуллерены в биологии / Л.Б Пиотровский, О.И. Киселев. СПб.: Изд-во «Росток», 2006. 336 с.
23. Arbogast J.W., Foote C.S, M. Kao. Electron Transfer to Triplet C60// . Am. Chem. Soc. 1992. Vol. 114. P.2277–2279.
24. Fullerenes: Principles and Applications / Ed. F. Langa, J.-F. Nierengarten. RSC: Cambridge, U.K. 2007. 398 p.
25. Функциональные производные фуллеренов: методы синтеза и перспективы использования в органической электронике и биомедицине / под ред. В.Ф. Разумова, М. В. Клюева. - Иваново: ИвГУ, 2010. 340 с.
26. Tabata Y, Murakami Y, Ikada Y. Antitumor effect of poly(ethylene glycol)modified fullerene // Fullerene Sci. Technol., 1997.Vol. 5. P. 989-1007.
27. Nakajima N., Nishi C., Li F-M., Ikada Y. Photo-induced cytotoxicity of water-soluble fullerene // Fullerene Sci. Technol., 1996. Vol. 4. P. 1–19.
28. Функциональные производные фуллеренов: методы синтеза и перспективы использования в органической электронике и биомедицине / П.А.Трошин, О.А. Трошина, Р.Н. Любовская, В.Ф. Разумов. – 2-е изд., перераб. и доп. – Иваново : ИвГУ, 2010. 337 с.
29. Brettereich M., Hirsch A. A highly water-soluble dendro[60]fullerene // Tetrahedron Letters. 1998. № 39. P. 2731-2734.
30. Troshina O., Troshin P., Peregudov A., Kozlovskiy V., Balzarini J., Lyubovskaya R. Chlorofullerene C₆₀Cl₆: a precursor for straightforward preparation of highly water-soluble polycarboxylic fullerene derivatives active against HIV //Org. Biomol. Chem. 2007. № 5. P. 2783-2791.
31. Perspectives of Fullerene Nanotechnology / Ed. E. Osawa. Norwell, MA: Kluwer Academic. 2002. 385 p.
32. Lyon D.Y., Adams L.K., Falkner J.C., Alvarez P.J. Antibacterial аctivity of fullerene water suspensions: effects of preparation method and particle size // Environ. Sci. Technol. 2006. Vol. 40. № 14. Р. 4360-4366.
33. Патент РФ № 2129436 от 27.04.99. «Адъюванты». Парнес З.Н.; Романова В.С.; Андреев С.М.; Петрухина А.О.; Вольпин М.Е.
34. Патент РФ № 2196602 от 20.01.03. «Средство для ингибирования ВИЧ и ЦМВ-инфекций и способ их ингибирования». Миллер Г.Г.; Кущ А.А.; Романова В.С.
35. Patent EA010483 30.10.2008 «Аgent for inhibiting membrane virus production, method for the production thereof, pharmaceutical composition and method for inhibiting viral infections». Rasnetsov L.D., Shvartsman I.Y. Lyalina I.K., Rasnetsova B.E.
36. Tsao, N., Luh, T.Y., Chou, C.K., Wu, J.J., Lin, Y.S., Lei, H.Y. Inhibition of group A streptococcus infection by carboxyfullerene // Antimicrob. Agents Chemother. 2001. Vol. 45. № 6. P.1788-1793.
37. Lyon D.Y., Fortner J.D., Sayes C.M., Colvin V.L., Hughe J.B. Bacterial cell association and antimicrobial activity of a C60 water suspension // Environ. Toxicol. Chem. 2005. Vol. 24. № 11. Р. 2757–2762.
38. Gallo M., Favila A., Glossman-Mitnik D. DFT studies of functionalized carbon nanotubes and fullerenes as nanovectors for drug delivery of antitubercular compounds // Chem. Phys. Lett. 2007 Vol. 44. №1-3. P.105-109.
39. Ros T. Da, Spalluto G., Prato, M., Biological Applications of Fullerene Derivatives: A Brief Overview // Croatiсa Chemica Acta. 2001. Vol. 74. P. 743-755.
40. Mashino T., Okuda K., Hirota T., Hirobe M., Nagano T., Mochizuki M. Inhibition of E. coli growth by fullerene derivatives and inhibition mechanism // Bioorg. Мed. Сhem. Lett. 1999. Vol. 9. № 20. P. 2959-2962.
41. Spesia M.B., Milanesio M.E., Durantini E.N. Synthesis, properties and photodynamic inactivation of Escherichia coli by novel cationic fullerene C₆₀ derivatives // Eur. J. Med. Chem. 2008. Vol. 43. № 4. P. 853-861.
42. Shuster D.I., Wilson S.R., Kirschner A. N.Evaluation of the anti-HIV potency of water-soluble dendrimeric fullerens // Electrochemical Society Proceedings. 2001. Vol. 11. P. 267-275.

43 Marchesan S., Da Ros T., Spalluto  G. Anti-HIV properties of cationic fullerene derivatives // Bioorganic & Medical chemistry letters. 2005. Vol. 15:15. P. 3615-3618/

44. Williams K.A., Veenhuizen P.T.M., de la Torre B.G., Eritja R., Dekker C. Carbon nanotubes with DNA recognition // Nature. 2002. Vol.420. P.761.
45. Mashino T., Usui N., Okuda K., Hirota T., Mochizuki M. Respiratory chain inhibition by fullerene derivatives: hydrogen peroxide production caused by fullerene derivatives and a respiratory chain system // Bioorg. Med. Chem. 2003. Vol. 11. № 7. P.1433-1438.
46. 46. Huang L., Terakawa M., Zhiyentayev T., Huang Y.-Y., Sawayama Y., Jahnke A., Tegos G.P., Wharton T., Hamblin M.R. Innovative cationic fullerenes as broad-spectrum light-activated antimicrobials // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 2010. 6. № 3. P. 442-452.
47. Tang Y.J., Ashcroft J.M., Chen D. Charge-associated effects of fullerene derivatives on microbial structural integrity and central metabolism // Nano Lett. 2007. Vol.7 №3. P.754–760.
48. Kumar A, Menon SK. Fullerene derivatized s-triazine analogues as antimicrobial agents // European Journal of Medicinal Chemistry. 2009, Vol. 44. P. 2178-2183.
49. Tsao N., Kanakama P.P., Luh T.Y., Chou C.K., Lei H.Y. Inhibition of Escherichia coli-Induced Meningitis by Carboxyfullerence // Antimicrob. Agents Chemother. 1999, Vol. 43, P. 2273-2277.
50. 5 Lee J., Mackeyev Y., Cho М., Li D, Kim J.-H., Wilson L.J., Alvarez P.J.J. Photochemical and аntimicrobial рroperties of novel C₆₀ derivatives in аqueous systems // Environ. Sci. Technol. 2009. Vol. 43 Is.17. Р. 6604–6610.
51. Stromc T. A., Barronc A. R., Supurana C. T. Nanoscale enzyme inhibitors: Fullerenes inhibit carbonic anhydrase by occluding the active site entrance // Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2010. Vol. 18. Is. 8. P. 2822-28.
52. Shuster D.I., Wilson S.R., Kirschner A. N.Evaluation of the anti-HIV potency of water-soluble dendrimeric fullerens // Electrochemical Society Proceedings. 2001. Vol. 11. P. 267-275.
53. Kotelnikova R.A., Bogdanov G.N., Frog E.C., Kushch A.A., Fedorova N.E., Miller G.G. Nanobionics of pharmacologically active derivatives of fullerene C60. // Jornal of Nanoparticle Research, Netherlands - 2003, Vol. 5. P.561-566.

54 Фрог Е.С., Котельникова Р.А., Богданов Г.Н. и др. Влияние аминокислотных производных фуллерена С60 на развитие цитомегаловирусной инфекции // Технология живых систем. 2006.Т. 3. №2. C. 42-46.

55. Zhao X., Striolo A., Cumming P.T. C60 Binds to and Deforms Nucleotides // Biophysical Journal. 2005. Vol. 89, Is. 6. P. 3856-62.
56. Ikeda A., HatanoT., Kawaguchi M. Water-soluble [60]fullerene–cationic homooxacalix[3]arene complex which is applicable to the photocleavage of DNA // Chem. Commun. 1999 Vol. 15. P.1403–1404
57. Dhawan A., Taurozzi S. Stable Colloidal Dispersions of C60 Fullerenes in Water: Evidence for Genotoxicity // Environ. Sci. Technol. 2006. Vol. 40. P.7394-7401.
58. Ikeda A., Sato T., Kitamura K. Efficient photocleavage of DNA utilising water soluble lipid membrane incorporated [60]fullerenes prepared using a [60]fullerene exchange method // Org. Biomol.Chem. 2005. Vol. 3. P. 2907–2909.
59. Tsao N., Luh T, Chou C., Chang T. In vitro action of carboxyfullerene // J. Antimicrobial Chemother. 2002. Vol 49. P. 641-649.
60. Lee J., Mackeyev Y., Cho M. Photochemical and antimicrobial properties of novel C60 derivatives in aqueous systems // Environ. Sci. Technol. 2009.Vol.43. 6604-6610.
61. Nakamura E, Tokuyama H., Yamago S. Photoinduced biochemical activity of fullerene carboxylic acid // J. Am. Chem. Soc. 1993. Vol.17. P. 7918–7919.

62 Трошин П.А., Корнев А.Б., Хакина Е.А., Разумов В.Ф. Аминофуллерены и способ их получени.  Заявка на изобретение № 2010127788 от 07.07.2019, РФ

63. Troshina O.A., Troshin P.A., Peregudov A.S., Kozlovski V.I., Lyubovskaya R.N. Photoaddition of N-substituted piperazines to C60: an efficient approach to the synthesis of water-soluble fullerene derivatives // Chem. Eur. J. 2006. Vol. 12. P. 5569-5578.
64. Медицинская микробиология: учебное пособие/ О.К. Поздеев; Под ред. В.И.Покровского. 4-е изд.испр.М.:ГЭОТАР-Медиа, 2005.786с.
65. http://ru.vlab.wikia.com/wiki/ Кишечная палочка.
66. Данилов В.С., Зарубина А.П., Ерошников Г.Е., Соловьева Л.Н., Каташев Ф.В., Завильгельский Г.Б. // Сенсорные биолюминесцентные системы на основе lux-оперонов разных видов люминесцентных бактерий. Вестник Московского Университета. Сер. 16: Биология. 2002. № 3.С. 20-24.
67. Зарубина А.П., Лукашев Е.П., Деев Л.И., Пархоменко И.М., Рубин А.Б. // Биотестирование биологических объектов одностенных углеродных нанотрубок с использованием тест-систем люминесцентных бактерий. Российские нанотехнологии. 2009. T. 4. № 11–12. P. 152-155.
68. Дерябин Д.Г., Васильченко А.С., Алешина Е.С., Тлягулова А.С., Никиян А.Н. // Исследование взаимодействия углеродных наноматериалов с клетками Escherichia coli методом атомно-силовой микроскопии. Российские нанотехнологии. 2010. Т. 5. № 11-12. С. 103-108.
69. http://en.wikipedia.org/wiki/PUC19

70.Практикум по микробиологии: Учеб.пособие для студ.высш.учеб.заведений /А.И.Нетрусов, М.А.Егорова, Л.М.Захарчук и др.; Под ред. А.И.Нетрусова.-М.:Издательский центр «Академия», 2006.-608 с.

71. Дерябин Д.Г. Бактериальная биолюминесценция: фундаментальные и прикладные аспекты. М.: Наука. 2009. 246 с.
72. 72. Backhaus T., Grimme L.H. The toxicity of antibiotic agents to the luminescent bacterium Vibrio fischeri // Chemosphere. 1999. Vol.38. №14. P.3291-3301.
73. Daunert S., et al. Genetically engineered whole-cell sensing systems: coupling biological recognition with reporter genes // Chem. Rev. 2000. Vol.100. №7. P.2705 -2738.
74. Левшин Л.В., Салецкий А.М. Оптические методы исследования молекулярных систем. Ч. 1. Молекулярная спектроскопия. – М.: Изд-во МГУ, 1994. – 320 с.
75. Лакович Д. Основы флуоресцентной спектроскопии. Пер. с англ. – М.: Мир, 1986. – 496 с.
76. Уильямс Б.,Уилсон К. Методы практической биохимии. Пер. с англ. – М.: Мир, 1978. 260 с.

77.Миронов В.Л.Основы сканирующей зондовой микроскопии: Учеб. пособие. – Н-Н .:РАН, Институт физики микроструктур, 2004. 110 с.

78. http://popnano.ru/studies/index.php?task=view&id=252&limitstart=2
79. Schwegmann H., Feitza A.J., Frimmela F.H. Influence of the zeta potential on the sorption and toxicity of iron oxide nanoparticles on S. cerevisiae and E. coli // J. Colloid Interface Sci. 2010. Vol. 347. №1. P. 43-48.
80. Guzelsu N., Wienstien C., Kotha S. P. A new streaming potential chamber for zeta potential measurements of particulates // Rev. Sci. Instrum. 2010. Vol. 81. ID 015106. doi:10.1063/1.3284510
81. Пальтиель Л. Р., Зенин Г. С., Волынец Н. Ф. Физическая химия. Поверхностные явления и дисперсные системы: Учеб. пособие. – СПб. : СЗТУ, 2004. 68 с.
82. Bechor O., Smulski D.R., Van Dyk T.K. at al. Recombinant microorganisms as environmental biosensors: pollutants detection by Escherichia coli bearing fabA′::lux fusions // J. Biotechnol. 2002. Vol.94. №1. P.125-132.
83. Davidov Y., Rozen R., Smulski D.R. at al. Improved bacterial SOS promoter :: lux fusions for genotoxicity detection // Mutat. Res. 2000. Vol.466. №1. P.97-107.
84. Takenaka S., Yamashita K., Takagi M., Hatta T., Tsuge O. Photo-induced DNA cleavage by water-soluble cationic fullerene derivatives // Chem. Lett. 1999. Vol. 28. P. 321-322.

 Скачать: Diplom.doc