Привет студент

Скачать: Ispolzovanie-radioizotopnyh-metodov-primenitelno-k-mikroorganizmam.ppt

«Использование радиоизотопных методов применительно к микроорганизмам»

Содержание

Введение

Радиоизотопные методы

1.1 Получение изотопомеченых соединений

1.2 Радионуклид ³Н (тритий)

1.3 Радионуклид ¹⁴C

1.4 Радионуклид 35S

Заключение

Список используемой литературы

Введение

Эксперименты по измерению активности микроорганизмов в их природных местообитаниях или в свежих образцах с применением радиоизотопов являются наиболее чувствительными методами из всех существующих. Кроме того, они могут пролить свет на судьбу того или иного субстрата в микробных сообществах определенной экониши.

1. Радиоизотопные методы

Радиоизотопные методы — важный метод, позволяющий изучать распределение в клетках и тканях веществ, в состав которых искусственно введены радиоактивные изотопы (3Н, НС, 32Р и др.). Введенный в организм животного (или в среду культивирования клеток) изотоп включается в соответствующие структуры (например, меченый тимидин — в ядра клеток, синтезирующих ДНК). Метод основан на способности включенных в клетки изотопов восстанавливать бромистое серебро фотоэмульсии, которой покрывают срезы ткани или клетки. Образующиеся после проявления фотоэмульсии зерна серебра (треки) служат своего рода автографами, по локализации которых судят о включении в клетку примененных веществ. Применение меченных тритием предшественников нуклеиновых кислот (тимидина, аденина, цитидина, уридина) позволило выяснить многие важные аспекты синтеза ДНК, РНК и клеточных белков.

Для обнаружения и измерения скорости сульфатредукции применяют изотоп серы. Скорость метаногенеза можно проследить по превращению углекислого газа в аммиак в присутствии значительного количества водорода.

Во всех случаях, определяя скорости процессов потребления изотопа или его выделения, необходимо учитывать соотношение меченого и немеченого субстрата, внесенного в пробу для расчета специфической активности потребления субстрата или образования продукта.

В экологии микроорганизмов наибольшее распространение получили исследования, с трансформацией изотопов углерода и сера. Большинство углерода встречается в виде изотопа, но есть небольшое количество стабильного тяжелого, а также радиоактивного. Подобно этому соединения серы встречаются в виде изотопа, стабильного изотопа и радиоактивного изотопа.

Живые клетки в своих процессах вырабатывают соединения с более легкими изотопами, а более тяжелые изотопы остаются не прореагировавшими и их доля в субстрате увеличивается, а в продукте уменьшается. Этот феномен получил название «фракционирование изотопов».

Лабораторные эксперименты с чистыми культурами микроорганизмов показали, что продукты метаболизма заметно обогащаются легкими стабильными изотопами, а в остаточном субстрате происходит накопление тяжелых стабильных изотопов.

ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ ИЗОТОПОВ МИКРООРГАНИЗМАМИ— изменение изотопного состава конечных продуктов обмена веществ микроорганизмов сравнительно с использованными веществами среды. Так, сульфатредуцирующие бактерии с большей скоростью восстанавливают сульфаты с изотопом серы S³², благодаря чему в образуемом бактериями сероводороде избирательно концентрируется легкая сера, а в остаточных сульфатах накапливается тяжелая сера S³⁴. Этот процесс приводит к тому, что все молекулы серы, при образовании которых проходил процесс микробиологической редукции сульфатов, отличаются «облегченным» изотопным составом. Разделение изотопов происходит при некоторых др. микробиологических процессах (гниение, образование метана) и в процессе фотосинтеза.

При изучение проб различного происхождения оказалось, что наиболее «тяжелые» по углероду морские карбонаты ( химического происхождения с соотношением ∆¹³С=±5‰). Недавние (геологические) морские осадки имеют ∆¹³С= - 10-35‰. Что явно указывает на участие микроорганизмов в их формировании. Интересно отметить, что скальные породы возраста около 3,5 млрд. лет обеднены по ¹³С на 12-22‰, что свидетельствует об очень раннем возникновении автотрофии на планете.

Подобные измерения проведенные в отношении изотопов серы, показали, что метеоритный сульфид имеет ∆³5S от −3 до +3‰, тогда как залежи элементной серы от-18 до +18‰, а сульфит морских остатков до −30‰, что говорит о значительном вкладе сульфатредукторов в процесс глобального цикла серы.

1.1 Получение изотопомеченых соединений

Получении изотопномеченых соединений используют несколько подходов, один из которых заключается в униформном обогащении стабильными изотопами клеточных биологически активных соединений по всему углеродному скелету молекул. Это достигается за счёт выращивания микроорганизмов на средах, содержащих меченые субстраты высокого уровня изотопной чистоты и с последующим фракционированием компонентов биомассы на различные классы природных соединений. Так, аминокислоты с униформным характером включения изотопной метки 13С по скелету молекулы получают, в основном, при выращивании автотрофных микроорганизмов на ростовых средах, содержащих вместо обычных углеродных субстратов исключительно их низкомолекулярные [13С] аналоги, например 13СО2. Таким способом были получены многие [13C]белки, синтезируемые микроводорослями: ферридоксин из Anabaena , цитохром C-553 , цитохром C2 из Rhodospirillum , и флаводоксин из Anabaena 7120 и использованы для дальнейших исследований. Для структурных исследований белков методом спектроскопии, для которого необходимо, чтобы как можно больше атомов в молекуле были замещены на их стабильные изотопы, биосинтетические подходы по получению униформно меченых [13C]аминокислот могут обеспечить сравнительно недорогое получение нужного количества меченых [13C]продуктов. [15N]аминокислоты получают аналогичным путём за счёт выращивания микроорганизмов на водных средах, содержащих К15NO3 или другие 15N-содержащие соли, в то время как высокообогащённые дейтерием аминокислоты можно получать с использованием ростовых сред, содержащих вместо обычной воды 99,9% 2H2O. Однако при этом необходимо учитывать эффекты, связанные с клеточной адаптацией к 2Н2O. Известно, что 2Н2О действует токсически на клетки, ингибируя жизненно-важные функции роста и развития многих микроорганизмов.

Селективного включения стабильных изотопов в определённые положения молекул аминокислот и белков можно достичь за счёт применения комбинации меченых и немеченых субстратов в ростовых средах, меченых предшественников аминокислот, или при использовании ауксотрофных по определённым аминокислотам штаммов микроорганизмов. Для этих целей очень хорошо подходит такая распространённая бактерия как E. coli, биосинтез аминокислот в которой к настоящему времени изучен наиболее детально и для которой получен многочисленный набор мутантных форм.

Очень часто, разветвлённые пути метаболизма меченых аминокислот в клетке приводят к специфическому мечению других биосинтетически родственных аминокислот за счёт использования клеткой многочисленных минорных путей биосинтеза и сопряжённых реакций метаболизма. В некоторых случаях этот фактор может существенно облегчить процесс получения селективно меченых белков и аминокислот. Таким способом был получен [15N]Т4-лизоцим, с селективным характером включения метки 15N лишь по остаткам глутамата, глутамина и аргинина.

1.2 Радионуклид ³Н (тритий)

Тритий — радиоактивный изотоп водорода, «чистый» β-излучатель, который легко нарабатывается в реакторе в значительном количестве.

Можно добавить биосинтез — выращивание микроорганизмов на среде, содержащей ³Н-предшественник (например, [метил-³H] тимидин, для получения меченой ДНК), с последующим выделением целевого соединения. Однако этот способ достаточно специфический и обычно применяется только в лабораторной практике для получения биополимеров.

Принцип этого метода очень прост, он повторяет метод Беккереля, открывшего радиоактивный распад. При радиоавтографическом исследовании в среду с находящимися там клетками вводится предшественник одного из макромолекулярных соединений (например, аминокислота или нуклеотид), один из атомов которого замещен радиоактивным изотопом. Например, вместо ¹²С введен атом ¹⁴С, вместо водорода — тритий (³Н) и др. В процессе синтеза в биополимер включится и меченая молекула предшественника. Регистрировать ее место в клетке можно с помощью фотоэмульсии. Если клетки в пласте или на срезе покрыть фотоэмульсией, то через некоторое время в результате распада изотопа β-частицы, разлетающиеся хаотично в разных направлениях, попадут в зону чувствительного фотослоя и активируют в нем зерна бромистого серебра. Чем больше будет время экспозиции, т.е. контакта такой меченой клетки с фотоэмульсией, тем больше зерен AgBr будет засвечено. После экспозиции надо проявить препарат, при этом происходит восстановление серебра только в засвеченных гранулах, при фиксации препарата незасвеченные гранулы AgBr растворяются. В результате из массы гранул, которые покрывали объект, останутся только те, которые были активированы β-излучением. Просматривая в микроскоп такие препараты, поверх которых нанесен слой фотоэмульсии, исследователь находит места локализации зерен серебра, которые располагаются напротив мест, где содержится меченое вещество.

Этот метод имеет ограничения: точность его будет зависеть от величины зерна AgBr и от энергии частицы. Чем больше величина зерна, тем с меньшей точностью можно узнать место расположения изотопа. И чем выше энергия частицы и длиннее ее пробег, тем дальше от места распада будет происходить активация зерен AgBr. Поэтому для метода радиоамтографии используют особые мелкозернистые фотоэмульсии (0,2–0,3 мкм) и изотопы с малой энергией β-частиц, главным образом изотоп водорода — тритий (³Н). Тритием могут быть мечены любые предшественники биологических макромолекул: нуклеотиды, аминокислоты, сахара, жирные кислоты.

1.3 Радионуклид ¹⁴C

Радионуклид ¹⁴C получают облучением нитрида алюминия по реакции:

¹⁴N + ⁰n —> ¹⁴C + ¹p

В виде ¹⁴C-карбида. Из него ¹⁴C выделяют в виде ¹⁴CО₂, который обычно поглощают Ba(OH)₂, и полученный ¹⁴C-карбонат является основным радиоактивным сырьем для всех синтезов ¹⁴C-соединений.

Биосинтез. В питательную среду к микроорганизмам (обычно это водоросли типа хлореллы) добавляют ¹⁴CО₂ в качестве единственного источника углерода. После выращивания из биомассы выделяют равномерно меченые ¹⁴C-соединения. Таким путем получают аминокислоты, нуклеозиды, сахара, липидные компоненты и другие природные соединения. Иногда ¹⁴C-биомассу водорослей используют как источник углерода (своего рода меченый пептон) для выращивания штамма-продуцента какого-нибудь важного соединений.

Скорость фотосинтеза измеряют обычно в водных образцах в светлых и темных склянках с введенной порцией 14СО2. Образцы инкубируют в течение нескольких часов или всего светового периода in situ и определяют скорость включения меченой углекислоты (обычно в течение первых 1-2 ч инкубации), что отражает скорость фотосинтеза и общее включенное количество 14СО2 (за более длительный период), что соответствует чистой продукции фотосинтеза (т.е. разнице между количеством включенного 14СО2 и количеством органического вещества, минерализованного до 14СО2 в результате дыхания).

1.4 Радионуклид 35S

Наработка радионуклида серы-35 проводится в ректоре облучением KCl или NaCl по реакции 35Cl + 0n —> 35S + 1p в виде 35S-сульфата. Некоторые специфические методики приготовления образцов KCl для облучения позволяют получать 35S в виде элементарной серы. Схема распада серы-35: 35S —> 35Cl + e . Удобный период полураспада и вполне приемлемая энергия β-излучения делают серу-35 очень популярным радионуклидом в своей «нише», вызывая досаду малой распространённостью соединений серы в живых организмах.

Сера-35 используется, в основном, для введения «метки» в белок за счет 35S-метионина или (реже) 35S-цистеина. Аминокислоты, меченные серой-35, получают биосинтезом, выращивая бактериальную биомассу на среде, содержащей 35S-сульфат. После кислотного гидролиза 35S-биомассы из белкового гидролизата выделяют аминокислоты. Иногда фирмы-производители вместо индивидуальных 35S-аминокислот предлагают просто 35S-белковый гидролизат, который может быть использован для выращивания культуры клеток в 35S питательной среде.

Заключение

Эксперименты с радиоактивными изотопами широко применяются в экологии микроорганизмов, однако, поскольку в гетерогенных природных местообитаниях всегда могут проходит и химические превращения субстратов, необходимо проводить опыты с соответствующими контрольными образцами: ключевые из них — пробы с убитыми клетками. Этот метод один из основных методов, позволяющих изучать динамику синтетических процессов, сравнивать их интенсивность в разных клетках на одном и том же препарате. Так, с помощью этого метода при использовании меченых предшественников РНК было показано, что вся РНК синтезируется только в интерфазном ядре, а наличие цитоплазматической РНК является результатом миграции синтезированных молекул из ядра.

Скачать: izotopy.doc