Морфо-физиологические особенности и систематическое положение нового галофильного вида жгутиконосцев

Нашу планету населяет огромнейший мир живых существ - растений, животных, микроорганизмов, простейших – образующих разнообразные сочетания. Все это результат органической эволюции, который можно назвать одним словом – биоразнообразие. Изучение биологического разнообразия является одной из важнейших современных задач биологии [1].

Водоемы с повышенной соленостью широко распространены по земному шару и характеризуются разнообразием химического состава и населяющих их организмов [2]. В то же время галофильные микроорганизмы, населяющие гипергалинные водоёмы, остаются слабо изученными. Особенно актуально это для эукариотических микроорганизмов – протистов, галофильные гетеротрофные представители которых были выделены из соленых водоемов в чистой культуре и описаны только в XX веке.

Гетеротрофные флагеллаты являются обязательной составной частью микробиоценозов во всех типах водных экосистем, где вносят значительный вклад в потоки вещества и энергии. Гетеротрофные жгутиконосцы представляют собой полифилетическую группу протистов, включающую в себя все одноклеточные свободноживущие организмы, использующие для движения и питания жгутики и обладающие гетеротрофным типом питания [2].

Сообщества галофильных гетеротрофных флагеллат практически не исследованы, а данные по их составу и распределению в российской литературе практически отсутствуют.

Исходя из перечисленного, целью нашего исследования было изучение морфо-физиологических и экологических особенностей нового вида галофильного гетеротрофного жгутиконосца, выделенного из гипергалинного озера.

Для достижения этой цели перед нами были поставлены следующие задачи:

описание морфологических особенностей изучаемой культуры и сравнение их со схожими изолятами (по данным литературы);
изучение жизненного цикла изучаемой культуры;
оценка диапазона экологической толерантности, характеризующегося ростом культуры;
оценка изменения жизненного цикла изучаемой культуры в зависимости от разных экологических факторов (температура, минерализация, концентрация питательных веществ, перемешивание).

1 Характеристика соленых водоемов

Среди водных объектов нашей планеты широко распространены и наименее изучены соленые озера с различной степенью минерализации. Соленые озера встречаются, практически, на всех континентах [3]. Они очень важны с точки зрения эстетической, культурной, экономической, рекреационной, научной и экологических ценностей [4].

Солёных озера чаще всего представляют собой бессточные озера в регионах с засушливым климатом, сформировавшиеся в местах континентальных разломов тысячи, а иногда и миллионы лет назад. Довольно часто эти озера пополняются водой из пресноводных рек, но минералы и соли при испарении воды оседают на дно озера, растворяясь в новоприбывшей пресной воде, таким образом, поддерживается уровень минерализации и солености озер. Многие из этих озер имеют уникальную экосистему. Также соленые озера служат местом добычи поваренной соли (в хлоридных озерах), соды (в карбонатных озерах) и мирабилита (в сульфатных озерах) [5].

Соленые озера, благодаря особенностям своей физико-химической и биологической структуры, быстрее, чем пресные озера, реагируют на изменения внешних условий, приводящих к "мгновенному" (для естественных условий) формированию нового химического состава, изменению уровня воды, накоплению автохтонного и аллохтонного материала, что позволяет рассматривать их как удобные индикаторы внешних естественных и антропогенных изменений [6, 7].

Фауна соленых озер ранее рассматривалась более или менее однородной, но эта точка зрения уже не актуальна. Есть, например, много различий между австралийской фауной соленых озер в различных местах. Также существуют и региональные различия в Австралии, о чем свидетельствует сравнения фауны между солеными озерами на юго-западе Западной Австралии и на юго-востоке Южной Австралии [8].

Общий объем соленой воды в мире эквивалентен совокупному объему внутренних пресноводных озер и рек. Уровень концентрации солей в гипергалинных водоемах колеблется от 0,12 г/л (среднее содержание солей водного мира) до 332 г/л (по Финли, 1990) [9].

Самыми экстремальными природными средами с повышенной соленостью являются внутренние озера, такие как Мертвое море и Большое Соленое озеро [10].

1.1 Экологические особенности соленых водоемов

Существует два типа соленых водоемов: континентальные и морские. Если водоемы морского происхождения представляют типичное явление и сходны по своему химическому составу, то континентальные водоемы значительно отличаются по гидрохимическим условиям, и как результат комплекса взаимодействий геологических, климатических и биогеохимических условий, могут быть нейтральными, щелочными и кислотными [11, 12]. Нейтральные озера с рН от 6 до 8,5 обычно содержат Na⁺ и Mg²⁺ как главные катионы, Cl и SO₄^2- как главные анионы. Щелочные или содовые озера (рН от 9 до 11) содержат большое количество Na₂CO₃, NaHCO₃ и обладают высокой буферной емкостью Примером природных местообитаний с высокими концентрациями солей могут быть Большое Соленое озеро (США), Мертвое Море (Израиль), Ассал (Сомали), Солнечное озеро (Синай), Шира (Хакассия) и другие. Микрофлора этих водоемов в последнее время широко изучается и описана в ряде работ [13].

Водоемы с повышенной минерализацией традиционно рассматриваются как местообитания с экстремальными условиями существования. Гиперосмотическая среда является ведущим фактором формирования специфического биоценоза, структура которого значительно отличается от пресноводной биоты [14]. Лимитирующее влияние высокой солености связано со снижением активности воды, так как растворенные соли притягивают на себя молекулы воды и таким образом снижают их подвижность, конкурируя с клеточными компонентами за доступные молекулы [13, 15].

Гипергалинные озера являются экстремальными природными водоемами со специфическим составом биоты. В силу своей редкости и уникальности сообщества гипергалинных водоемов представляют исключительную ценность для изучения биоразнообразия планеты [16].

1.2 Распространение соленых водоемов

Внутренние озера соли находятся на всех континентах (рисунок 1). Некоторые из них были зарегистрированы и исследованы много лет назад, другие были открыты и изучены в последнее время. Особые свойства соленых озер привлекали внимание исследователей и ученых на протяжении многих веков [5].

На территории Евро-Азиатского континента гипергалинных водоемов единицы – это озеро Эльтон, Баскунчак, Старорусские, Крымские, Соль-Илецкие, Славгородские, Шира и Мертвое море, находящиеся в Израиле [17].

(1) – Большое соленое озеро, США; (2) – озеро Волкер,Калифорния, США; (3) – залив Сан-Франциско, Калифорния; (4) – пустыня Моджаве, Калифорния; (5) – горы Гвадалупе, Техас; (6) – озеро Адхихика, Мексика; (7) – Лима, Перу; (8) – море Хиувита, Аргентина; (9) – внутренние солеварни, Испания; (10) – Мертвое море, Израиль/Иордания; (11) – Эйлат, Израиль; (12) – Бург-эль-Араб, Египер; (13) – озеро Эльментита, Кения; (14) – озеро Соначи, Кения; (15) – соленое озеро Брэила, озеро Финдата, озеро Текиргел и Озеро Амара, Румыния; (16) – Солотвин, Украина; (17) – Каспийское море, Азербайджан; (18) – Аральское море, Казахстан/Узбекистан; (19) – нефтяное месторождение Наниишан, Китай; (20) – озеро Забуе, Тибет, Китай; (21) – внутренне содовое озеро Дагеноер, Монголия, Китай; (22) - Ослоу, Северо-Западная Австралия; (23) – Каррата, Северо-Западная Австралия; (24) – порт Хедленд, Северо-Западная Австралия; (25) – Эсперанс, Западная Австралия; (26) – Восточный Голдфилдс, Западная Австралия; (27) – озеро Кэри, Западная Австралия; (28) – площадь Пароо, Новый Южный Уэльс/Квинсленд, Австрали.

Рисунок 1 – Континентальные соленые водоемы [7]

1.3 Микрофлора соленых водоемов

Организмов, населяющих соленые водоемы, огромное множество. Среди них можно выделить: галофильных бактерий, водорослей, грибов и простейших [18].

Обзор литературы показывает, что из большинства эукариот и микроорганизмов, живущих в экстремальных гипергалинных условиях, доминирующими являются галофильные бактерии и археи [19].

Гетеротрофные жгутиконосцы, инфузории и амебы являются основными группам простейших, приспособленных к жизни в условиях повышенного содержания солей [20].

1.3.1 Галофильные микроорганизмы соленых водоемов

Микроорганизмы по отношению к соли классифицируются следующим образом:

экстремальные галофилы – лучше растут в средах, содержащих от 2,5 до 5,2 М NaCl;
галотолерантные – не требуют высокого содержания солей, но способны расти при достаточной концентрации соли (от 1,5 до 4,0 М NaCl);
умеренные галофилы – лучше растут в средах, содержащих от 0,5 до 2,5 М NaCl [21].

Галофильных микроорганизмов можно найти во всех трех царствах живой природы: археи, бактерии и эукариоты (рисунок 2). В большинстве случаев галофилы и не галофильные родственники находятся рядом в филогенетическом дереве. Среди многих родов и семейств есть представители с сильно отличающимися требованиями по отношению к соли и температуре. В царстве археи микроорганизмы, требующие высоких концентраций солей, располагаются в порядке Halobacteriales, который содержит одно семейство Halobacteriaceae. Halobacterium и большинство его родственников требуют от 100 до 150 г/л соли для роста. Также в рамках класса Methanothermea (Methanococci) в порядке Methanosarcinales есть галофильные либо галотолерантные представители (роды Methanohalophilus, Methanohalobium). Все они принадлежат к типу Euryarchaeota. Не галофильные представители до сих пор не определены в Crenarchaeota [22].

Галофилы широко распространены и в бактериальном царстве: филум Cyanobacteria, Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria, Spirochaetes, и Bacteroidetes.

Рисунок 2 – Филогенетическое древо, построенное на основе 16S рРНК, отражающее распределение галофильных микроорганизмов внутри трех царств Archaea, Bacteria и Eukarya [21]

Для того чтобы существовать в средах с повышенным содержанием соли у галофильных микроорганизмов существуют специфические механизмы адаптации [23].

Основным свойством всех галофильных микроорганизмов является то, что их цитоплазма должна быть схожа с изотонической средой, которая их окружает. Биологические мембраны должны быть проницаемы для воды и активной энергии, чтобы компенсировать потерю воды по осмотическому градиенту. Более того, клетке необходимо сохранить тургор и свое внутриклеточное осмотическое давление выше, чем у окружающей среды.

Есть две принципиально разные стратегии, используемые галофильными микроорганизмами, чтобы осмотически сбалансировать свою цитоплазму с окружающей средой. Первая связана с накоплением молярной концентрации калия и хлора. Эта стратегия требует обширных адаптации внутриклеточных ферментативных механизмов для наличия соли, а именно, белки должны поддерживать свою надлежащую конформацию и проявлять активность в ближней насыщенной концентрации соли. Протеома таких организмов является очень кислой, и большинство белков денатурируют при низкой концентрации соли.

Гораздо более распространенной является вторая стратегия галоадаптации, основанная на биосинтезе и/или накоплении органических осмотически растворенных веществ. Клетки, которые используют эту стратегию, должны исключить соль из их цитоплазмы как можно больше. Такие организмы могут приспосабливаться к широкому диапазону концентраций солей.

Галофильный микробный мир является чрезвычайно разнообразным, и новые типы галофилов обнаруживаются со все возрастающей скоростью [21].

Основными или единственными первичными производителями углерода во многих гиперсоленых средах выступают водоросли [24]. Их можно условно разделить на три группы:

типичные представители соленой воды, не встречающиеся в пресных водоемах. Эта группа является малочисленной;
водоросли, приспособившиеся к галофильному образу жизни. Это пресноводные виды, которые временно адаптировались к жизни в соленых водоемах;
формы, обитающие в пресной воде и случайно попавшие в соленые водоемы, где некоторые из них могут переносить высокие концентрации солей, не изменяя своей морфологии [17].

Одноклеточные зеленые водоросли рода Dunaliella являются наиболее характерными представителями альгологического сообщества соленых водоемов. Их можно встретить в Большом Соленом озере (США), Мертвом озере (Израиль), гиперсоленых лагунах Западной Австралии, озере Развал (Оренбургская область) и другие [25].

Dunaliella – это удобная модель для изучения адаптаций к высоким концентрациям соли у водорослей. Создание концепции органически совместимых растворенных веществ, обеспечивающих осмотическое равновесие, во многом основывается на изучении видов Dunaliella. Кроме того, некоторые штаммы при соответствующих условиях роста способны к накоплению огромного количества β-каротина, который широко используется в биотехнологии.

Водоросли рода Dunaliella (рисунок 3) – это одноклеточные жгутиковые формы, живущие в высококонцентрированных рассолах. Клетки водоросли не имеют жесткой клеточной стенки и размножаются путем продольного разделения подвижных клеток или путем слияния двух подвижных клеток для формирования зиготы. Для водорослей рода Dunaliella характерна смена жизненных форм вследствие изменяющихся условий окружающей среды. Эта смена заключается в том, что в начале зимы присутствуют несколько красных подвижных клеток («эритроспоры») и большое количество мелких зеленых подвижных клеток («хлороспоры»). Разбавление воды за счет дождей (весенний период) вызывает образование красных цист («эритроцисты»), но «хлороспоры» быстро развиваются и формируют «хлороцисты». Когда концентрация соли увеличивается в летний сезон, начинают появляться красные подвижные клетки, но также присутствуют и зеленые клетки.

Водоросли рода Dunaliella способны синтезировать высокие концентрации внутриклеточного глицерина, чтобы сбалансировать внешнее осмотическое давление и таким образом контролировать водный баланс клетки.

Рисунок 3 - Dunaliella salina [25]

Как уже было отмечено ранее, Dunaliella содержит большое количество пигментов разного цвета. В частности красный пигмент располагается в виде маленьких капель. Эти пигменты является ценным химическим веществом в качестве природного красителя пищи. Также Dunaliella содержит витамин (ретинол), который используют в косметологии и медицине [25].

Литературные данные подтверждают факт наличия экстремальных галофильных грибов в соленых водоемах. Большинство таких грибов относятся к роду Hortaea, которые были выделены из солнечной солеварни Пуэрто-Рико (рисунок 4). Это черные дрожжеподобные гифомицеты [19].

Изоляты рода Hortaea (SC1, SC8, SC9, SC10, SC12, SC13, SC14, SC15, SC16, SC18, SC19 и SC29) способны расти при максимальной концентрации NaCl (25 %). Тестирование данных штаммов показало, что оптимальной концентрацией соли для них является 10 %, а оптимальной температурой 29 °C [26].

Рисунок 4 – Микрофотография гриба рода Hortaea (штамм SC29) [19]

Грибы рода Hortaea способны вызывать опоясывающий черный лишай у человека [27]. Эта инфекция проявляется в виде коричневых или черных пятен на руках и ногах.

Солнечная солеварня, в которой были найдены грибы рода Hortaea, формируется за счет испарения морской воды и, следовательно, в ионном составе преобладают главным образом соли натрия и хлора, что делает эту эконишу чрезвычайно галофильной. Концентрация NaCl этих антропогенных бассейнов может колебаться от 3 % до насыщения (35 %). К другим свойствам этой окружающей среды относятся:

низкая концентрация кислорода;
высокая интенсивность света;
достаточное количество питательных веществ;
нейтральный рН.

Существует множество данных, свидетельствующих о появлении галофильных и чрезвычайно галотолерантных грибов в экстремальных соленых условиях (Карибский бассейн). Так например в соленых прудах Словении было выделено несколько видов черных дрожжеподобных грибов из родов Phaeotheca и Trimmatostroma, Aureobasidium pullulans, и галофильных дрожжей Trimmatostroma salinum [19].

1.3.2 Простейшие соленых водоемов

Микрофлора соленых водоемов относительно простейших является самой многочисленной и разнообразной. Эукариотические организмы не способны адаптироваться к высоким концентрациям солей в отличии от протистов [28].

Галофильные гетеротрофные представители гипергалинных водоемов относятся к автохтонной микрофлоре и представлены различными группами простейших, в частности, это инфузории, амебы и жгутиконосцы [17].

На сегодняшний день выделено и описано около 130 видов ифузорий, обитающих в соленых водоемов. Кроме того, некоторые ученые считают, что инфузории являются доминирующей группой экстремальных гипергалинных мест обитания, по сколько имеют более крупные размеры [29].

Несколько видов инфузорий широко распространены в гиперсоленых средах, а именно Fabrea salina, Euplotes sрр., (в том числе Е.balteatus и Е.rariseta) и Ciliophrya (Procodon). Инфузория Ciliophrya (Procodon) utahensis была выделена из Хатт лагуны Западной Австралии, Большого Соленого озера и Мертвого моря. Fabrea salina имеет уникальную устойчивость к высокой концентрации солей и была найдена в Хатт Лагуне Западной Австралии, гиперсоленых прудах около Солтон-Си в Калифорнии. Exportadora обитает в соленой солеварни в Мексике, в озере в Канаде, Калифорнии, Саудовской Аравии. Другая распространенная инфузория рода Euplotes spp. была выделена из шести гиперсоленых мест обитания по всему миру [30].

В планктоне Антарктики доминируют инфузории рода Mesodinium (необычные инфузории с фотосинтетической способностью), которые достигли обилия 2,7·10⁵ клеток/мл при градиенте солености до 6,3 % [31].

Инфузории рода Paramecium широко распространены в соленых местах обитания и имеют ряд особенностей [32].

Все виды рода Paramecium способны существовать в пресной воде биотопов. Тем не менее, морские биотопы для парамеций являются естественным местом обитания. Эти инфузории обитают в олигогалинной части водоемов, но некоторые из них могут существовать как в полигалинных так и в пресных водах. Среди многочисленных видов Paramecium только четыре, а именно P.woodruffi, P.calkinsi, P.nephridiatum и P.duboscqui можно считать эвригалинными. Эти виды были найдены на берегах северных морей.

Ряд исследователей протестировали способность Paramecium приспосабливаться к морской воде, а именно к изменяющимся концентрациям солей. По их результатам, инфузории рода Paramecium могут жить, когда концентрация солей в культуральной среде постепенно увеличивается примерно до 1 %. Максимальная концентрация соли, при которой Paramecium могут существовать колеблется от 0,3 % до 0,75 %.

Представители рода Paramecium доминируют в большинстве исследованных биотопов вместе с инфузориями родов Frontonia и Prorodon в пределах градиента солености от 4 % до 45 %.

В настоящее время представители рода Paramecium изолированы от пресных и солоноватых водоемах (побережье Балтийского, Северного, Белого, Баренцева, Средиземного морей, Тихий и Атлантический океаны).

Амебофлагеллаты также распространены в гиперсоленых средах. Некоторые протозоологи относят этих амебоидных простейших (гетеролобозные амебы) к гетеротрофным жгутиконосцам, так как они имеют жгутиковые стадии [33].

A. Rogerson и G. Hauer (2002) обнаружили двенадцать видов голых амеб в гиперсоленых прудах вокруг Солтон-Си (от 16 % до 18 % соли) и показали, что они могут расти при солености 3,2 % [34].

Oren в своей публикации описал три неизвестных вида амеб, выделенных из соленых прудов в Эйлате (соленость около 30 %). Эти культуры поддерживались при солености от 21 % до 31 % в течение двух месяцев.

Другой эвригалинный амебофлагеллат рода Paratetramitus был выделен из гиперсоленой лагуны в Солтон-Си (16 % соли), Калифорнии и из соленых прудов в Эйлате и Израиле, при солености от 16 % до 21 %.

B. Elazari-Volcani (1943) обнаружил галофильных Dimastigamoeba (амебофлагеллаты) в водах Мертвого моря (соленость от 15 % до 18 %) и показали, что эти виды способны выжить в диапазоне солености от 6 % до насыщения [35].

Все амебы гипергалинных водоемов поедают цианобактерий. Некоторые веерообразные амебы имеют сильно вакуолизированную цитоплазму, другие (трубчатые) с вялыми движениями и складчатыми лобоподиями. Все эти изоляты являются новыми для науки.

Из воды соленого пруда в Эйлате (около 21 % соли) выделены амебы рода Echinamoeba от 13,0 до 17,5 мкм в длину. Эти амебы росли при солености 11 %. Saccamoeba - трубчатая амеба от 18,0 до 37,5 мкм в длину с устойчивыми передвижениями выделен также из воды соленого пруда в Эйлате. Эта амеба росла при солености около 7 %. Были также изолированы трубчатые амебы, имеющие длину 12,5 мкм.

Морфологические изменения у простейших в ответ на повышение концентраций солей являются следствием адаптации или прямым результатом градиента солености. Изменения были продемонстрированы в морфологии амеб при различном диапазоне солености. Как правило, амебы являются активными при более низкой солености и заметно вялыми при высокой солености. Это хорошо видно на примере недавно описанной амебы Platyamoeba pseudovannellida, которая росла в диапазоне солености от 0 % до 13,8 %. При самой низкой солености Platyamoeba pseudovannellida активна и имеет веерообразную форму, а при самой высокой солености она меняет свою морфологию и становится морщинистой и округлой [36].

Другой морфологической особенностью, встречающейся у амеб при высокой солености, является появление многочисленных цитоплазматических вакуолей (21 % соли).

В настоящее время общее количество видов простейших в морских водах (3,2 % соли) составляет около 409 видов, примерно 10 видов в пределах от 10 до 20 % солености и до 1 или 2 видов при самой высокой солености (30 %) [37].

1.3.3 Гетеротрофные жгутиконосцы соленых водоемов

Гетеротрофные жгутиконосцы в солоноватых и соленых водоемах характеризуются максимальным разнообразием и распространением, что объясняется широкой экологической валентностью этих организмов [38, 39]. Они играют важную роль с точки зрения численности и экологии водных экосистем как в толще жидкости, так и на дне водоема [40].

Гетеротрофные жгутиконосцы являются крупными потребителями бактерий, цианобактерий и микроводорослей в большом разнообразии водных экосистем [41]. Следовательно, они играют важную роль в питательной цепочке и в основном ответственны за передачу углерода в качестве бактериальной продукции высшим трофическим уровням в соленых водоемах. В природных комплексах планктона содержание гетеротрофных жгутиконосцев колеблется в диапазоне от 10² до 10⁵ кл/л это в основном связано с обилием бактерий [25].

Главной особенностью микробной петли является то, что значительная часть первичной продукции фитопланктона выделяется в виде растворенного органического вещества, который затем обеспечивает субстратом для роста бактерий, обеспечивая тем самым источником пищи для гетеротрофных жгутиконосцев [19].

Существуют сезонные изменения размеров различных групп гетеротрофных жгутиконосцев в соленых озерах и в прибрежных водах. Галофильные жгутиконосцы крупных размеров, как правило, наиболее обильны во время весеннего цветения фитопланктона, тогда как более мелкие формы доминируют в условиях высокого давления в летнее время или в зимний период, когда концентрация пищи низкая [42].

Для выживания в период голода гетеротрофные жгутиконосцы соленых водоемов обладают специфическими стратегиями. Такие стратегии включают быстрое инцистирования и эксцистирование, изменения в использовании пищевых источников, а также значительные изменения в обменных процессах и другие физиологические и цитологические особенности [9].

Простейшие регулируют состав электролитов в цитоплазме и осмотическое давления с помощью трех механизмов:

активного транспорта ионов через клеточную мембрану;
регулирование концентраций низкомолекулярных растворенных веществ, в основном аминокислот в цитоплазме;
активного выведения натрия и поглощение воды.

Еще одним приспособлением к экстремальной окружающей соленой среде является развитие различных биохимических приспособлений, которые позволяют им справляться с осмотическим и ионным стрессом. Инфузории Paramecium calkinsi, амебы Acanthamoeba castellanii и жгутиконосцы Ochromonas malhamensis изменяют состав внутриклеточных аминокислот в ответ на изменение солености. Ochromonas помимо этого увеличивает количество углеводов в ответ на увеличение внешнего осмотического давления [6].

Гетеротрофные жгутиконосцы имеют широкий диапазон толерантности по отношению к солености. Также температура является важным фактором для распределения жгутиконосцев. Так, например, темпы роста жгутиконосцев увеличиваются с повышением температуры. Немало важным фактором для существования гетеротрофных жгутиконосцев соленых водоемов, особенно донных обитателей, является устойчивость к низкой концентрации кислорода. Некоторые аэробные формы могут выжить и в анаэробных условиях, благодаря физиологическим адаптациям. Давление ограничивает распределение гетеротрофных жгутиконосцев в морских глубинах. Несмотря на данный факт, большое число гетеротрофных жгутиконосцев зарегистрированы в глубоких отложениях моря. Например, на глубине 1200 м в Средиземном море можно встретить жгутиконосцев [6].

1.3.3.1 Описание основных представителей гетеротрофных жгутиконосцев соленых водоемов

Отряд Kinetoplastida. Все свободноживущие кинетопластиды входят в подотряд Bodonida [43].

В подотряд Bodonida объединены в основном одиночные (редко колониальные) жгутиконосцы с двумя гетеродинамичными жгутиками, отходящими от переднего конца тела из жгутикового кармана. Плавающий жгутик направлен вперед, рулевой – назад. Жгутики имеют параксиальный тяж. На переднем конце имеется оформленное ротовое отверстие (цитостом).

У всех представителей хорошо развита митохондриальная сеть и имеется кинетопласт. Митохондрии с пластинчатыми кристами. Цитостом из фибриллярных микротрубочковых образований развит хорошо, особенно в зоне переднего конца. Ядро пузырьковидного типа расположено в передней трети тела. Сократительная вакуоль обычно в передней части тела и опорожняется в жгутиковый карман.

Жизненный цикл простой, состоит из трофической стадии и цисты. Размножение продольным делением.

Bodo cygnus (рисунок 5) – тело эллиптической формы от 8 до 12 мкм в длину, есть два гетеродинамических жгутика, выходящие из субапикального кармана. Передний жгутик примерно такой же длины как сама клетка, перемещается широкими движениями когда клетка плавает и может обворачиваться вокруг переднего конца клетки. Задний жгутик акронематический в два раза длиннее тела, ответственен за скользящее движение. На переднем конце клетки тонкая линия в виде рта [44].

Рисунок 5 – Bodo Cygnus [44]

Другие представители отряда Kinetoplastida, обитающие в гиперсоленых водоемах: Bodo designis, Bodo saliens, Bodo saltans, Rhynchobodo simius, Rynchomonas nasuta [45].

Отряд Euglenida. Жгутиконосцы со жгутиками в количестве от 1 до 2, выходящими апикально из глоточного резервуара. Жгутики гетеродинамичные. Сократительная вакуоль опорожняется в глоточный резервуар. Тело слабометаболирующее, покрыто плотной пелликулой в разной степени структурированной [43].

Большинство представителей отряда Euglenida типичные водоросли, но часть является безхлоропластными гетеротрофами.

Dinema validum (рисунок 6) – клетки от 27 до 38 мкм в длину эллиптической формы с 20 равномерно расположенными продольными полосками. Сферические ядра расположены в задней части клетки. Передний жгутик немного длиннее, чем сама клетка. Задний жгутик толще и выходит из жгутикового кармана в виде крюка, он в три раза длиннее клетки. Пищеварительные вакуоли содержат цианобактерий [46].

Рисунок 6 – Dinema validum [46]

Другие представители отряда Euglenida, обитающие в гиперсоленых водоемах: Dolium sedentarium, Heteronema exaratum, Notosolenus apocamptus, Notosolenus canellatus, Notosolenus ostium, Peranema fusiforme, Petalomonas minuta, Ploeotia azurina, Ploeotia corrugate [45, 46].

Отряд Bicosoecida. Многообразие форм среди бикозоецид образуется за счет домиков, их формы, архитектоники и разновидностей колоний. Яйцевидное или овальное тело жгутиконосцев помещается в домике. Имеется два гетеродинамических жгутика, один (апикальный) направлен вперед (вверх), другим (задним) клетка прикрепляется ко дну домика. Ядро расположено в передней трети тела, пузырьковидного типа. Митохондрии с трубчатыми кристами. Сократительная вакуоль расположена в базальной части клетки. Сильно развита система микротрубочек, расположенная под мембраной клетки, обеспечивает ее сократимость [47, 43].

Среди бикозоецид существуют формы одиночные и колониальные, свободноплавающие и прикрепленные, с домиками прозрачными, бесцветными или окрашенными с четкими кольцевыми структурами [48].

Cafeteria ligulifera (рисунок 7) – маленькие двужгутиковые клетки от 6 до 5 мкм в длину. Задний жгутик в два раза превышает длину клетки, а передний – в три раза. Жгутики располагаются субапикально, выходят от передней части клетки из небольшого углубления [46].

Рисунок 7 – Cafeteria ligulifera [46]

Самым распространенным галофильным жгутиконосцем отряда Bicosoecida является Halocafeteria seosinensis. В течение почти столетия этот гетеротрофный жгутиконосец наблюдается часто в естественных насыщенных рассолах и питается бактериями (корейская солнечная солеварня) [44].

Halocafeteria seosinensis (рисунок 8) имеет два акронематических равных жгутика, выходящие из передней части клетки под острым углом. Жгутики не скользят по поверхности и в два раза превышают длину клетки. Клетки округлой, бобовидной или треугольной формы от 3 до 5 мкм в длину. Митохондрии с трубчатыми кристами и располагаются вблизи ядра. Прикрепленные клетки иногда отображают «прыгательные» движения, вызванные изгибом заднего жгутика. Одинокие клетки, наиболее часто наблюдаемые, плавают с двумя жгутиками за счет биения, но в некоторых клетках только передний жгутик осуществляет биение, и в этом случае клетки падают. Ядро расположено в середине передней части клетки. Цитостом располагается в передней части клетки напротив жгутиковой вставки. Диктиосомы Гольджи имеют от 3 до 5 цистерн. Парануклеарные микротельца в виде органелл не наблюдаются. Пищеварительные вакуоли содержат переваренных бактерий и находятся на заднем конце клетки. Основная часть аксонемы имеет стандартный набор микротрубочек (9+2) без каких-либо заметных иных структур. Отсутствуют экструсомы, домики, поверхностные чешуйки и цитофаринкс.

CY – цитостом, AF – передний жгутик, PF – задний жгутик.

Рисунок 8 – Электронная микрофотография Halocafeteria seosinensis [44]

Оптимальная температура Halocafeteria seosinensis при солености 30 % составляет от 30 °C до 35 °С, близкой к температуре окружающей среды в летний период. При оптимальной температуре Halocafeteria seosinensis растет с удвоением времени до 18 часов. Halocafeteria seosinensis не растет (то есть уменьшается в количестве) ниже солености 7,5 %, но выживает при солености 3,63 %. При оптимальной температуре и солености (т. е. 35 °С и 30 % соответственно) начальная концентрация клеток составляет 4·10⁷ на мл, а время удвоения 12 часов [44].

Другие представители отряда Bicosoecida, обитающие в гиперсоленых водоемах: Cafeteria roenbergensis, Pseudobodo tremulans [46].

Отряд Choanoflagellida. Гетеротрофные свободноживущие протисты с одним жгутиком, который окружен цитоплазматическим воротничком. Тело клетки имеет грушевидную или овальную форму. Из апикальной части клетки отходит единственный жгутик, окруженный воротничком. Воротничок состоит из отдельных выростов – тентакул, или микровиллей. У некоторых форм отмечено два воротничка – внутренний и наружный [49, 50]. Тентакулы воротничка – довольно ригидная структура, заключающая в себе микрофиламенты. Между тентакулами воротничка образуются временные анастомозы. Многие виды образуют колонии различной формы: древовидные, нитевидные, пластинчатые и шаровидные. Часто имеют домики из целлюлозы или кремния.

Размножение бесполое путем продольного деления клетки. Митохондрии с пластинчатыми кристами.

Морские, пресноводные, солоноватоводные. По молекулярным данным, образует сестринскую ветвь по отношению к кластеру, объединяющему грибы и животных.

Acanthoeca speciabilis имеет размер от 4 до 6 мкм в длину и от 2 до 3,5 мкм в ширину. Живые клетки удлиненные с заостренным задним концом, который вытягивается в виде мелкой резьбы на одной из стороне домика. Псевдоподиальный воротничок, как правило, короткий, хотя может достигать длины как у обыкновенной клетки человеческого организма. Домик конический с толстой ножкой и с многочисленными передними шипами [46].

Другие представители отряда Choanoflagellida, обитающие в гиперсоленых водоемах, относятся к семействам Acanthoecida, Salpingoecida и Codosigidae.

Класс Heterolobosea – включает в себя амебофлагеллаты со сложным жизненным циклом [51].

Трофическая стадия обычно амебоидная, часто трансформирующаяся в жгутиковую. Редко присутствует только жгутиковая стадия. Амебы голые, как правило, цилиндрические, моноподиальные с эруптивными псевдоподиями. Обычно одноядерные, иногда многоядерные. Кристы в митохондриях различной формы. Многие гетеролобозные амебы могут формировать в жизненном цикле плодовые тела, другие плодовых тел не образуют [51].

Percolomonas denhami имеет три жгутика разной длины (один длинный и два коротких), выходящих из небольшой вставки на вентральной стороне. Все три жгутика направлены назад. Два жгутиков слиты вместе. Клетки от 5 до 8 мкм в длину [45].

Клетки Percolomonas denhami передвигаются по субстрату медленно либо рывками при помощи двух прикрепленных к субстрату жгутиков. Оставшаяся часть клетки свисает ниже по субстрату. Самый короткий жгутик осуществляет вибрационные движения, заставляя тем самым клетку передвигаться вверх и вниз. Клетки Percolomonas denhami также способны прикрепляться к субстрату спинной стороной со всеми тремя жгутиками, осуществляющими биения синхронно [45].

1.3.3.1.1 Характеристика галофильных гетеротрофных жгутиконосцев схожих с исследуемым изолятом

Pharyngomonas kirbyi (рисунок 9) растет при солености от 10 % до 20 %. J.S. Park и A.G.B. Simpson (2011 год), описавшие этого галофильного жгутиконосца, выделили две монофилетические культуры данного вида – SD14 из воды солнечной солеварни в Калифорнии и AS12B из гиперсоленой воды Западной Австралии [48]. Оба изолята являются экстремальными галлофилами и не растут при солености ниже 7,5 %. Данные филогении подтверждают сходство Pharyngomonas kirbyi с Macropharyngomonas halophila.

Рисунок 9 – Фазово-контрастная фотография Pharyngomonas kirbyi [48]

Тело Pharyngomonas kirbyi веретеновидной формы, один из концов округлый, другой – заострен. Спинная сторона более выпуклая, чем брюшная. Штамм SD14 имеет размер от 9 до 14 мкм в длину и от 3 до 6 мкм в ширину. Штамм AS12B несколько больше – от 11 до 18 мкм длина и от 3 до 8 мкм ширина. Есть четыре жгутика: два передних, располагающиеся апикально и являющиеся рулевыми во время плавания и активных ударов, и два задних, отвечающих за медленные удары. Передние жгутики имеют такую же длину, как сама клетка, а задние жгутики в 1,5 раза превышают длину клетки. Клетка передвигается совершая вращательные движения (около 30 ударов в минуту). Были обнаружены клетки, прикрепленные к субстрату передними жгутиками, в то время как задние обычно выполняли функции питания. Ядро овальной формы и расположено в передней части клетки около места прикрепления жгутиков. Имеется тонкая вентральная борозда, начинающаяся возле переднего конца клетки и продолжающаяся по все длине клетки.

Пищеварительные вакуоли содержат переваренные клетки бактерий и располагаются на заднем конце клетки. Амебоидные формы не наблюдались в культуральной жидкости в ходе данного исследования, и попытки вызвать амебоидные формы на пластинах были неудачными. Наблюдались многочисленные пустые вакуоли, которые, как правило, были меньше, чем пищеварительные. Цитоплазма по мимо вакуолей включала немногочисленные пероксисомы и липидные капли. Цитостом находился немного позади ядра.

Macropharyngomonas sp. (рисунок 10) выделен из воды озера Развал [13]. Имеет веретеновидную форму, уплощенную с боков, длиной от 10 до 25 мкм, ширина в среднем от 3 до 5 мкм. Передний конец округлый, задний конец заострен. На заднем конце клетки возможно образование цитоплазматических выростов и нитей, которыми клетки прикрепляются к субстрату, особенно в условиях нарастающей солености.

Рисунок 10 - Macropharyngomonas sp. [13]

Жгутики, в количестве от 3 до 5 (чаще 4), отходят апикально на переднем полюсе клетки, акронематические, длиной в два раза превышают длину клетки. Погибающие клетки теряют жгутики, что может привести к неправильному подсчету их количества.

Цитоплазма сильно вакуолизирована, насыщена фагосомами, содержащими бактерий, и мелкими светопреломляющими гранулами. Ядро округлое, пузырьковидное, расположено в передней трети клетки, ближе к переднему полюсу клетки. В переднем конце тела непосредственно у места отхождения жгутиков находятся от 2 до 4 (чаще 3) палочковидных светопреломляющих гранул, возможно – трихоцисты или базальные тела жгутиков.

В средней и дистальной частях клетки расположена вентральная бороздка. Из углубления в переднем конце вентральной борозды образуется цитостом воронковидной формы, который переходит во внутриклеточный канал. Канал, загибаясь, идет от цитостома к заднему концу клетки, располагаясь ближе к дорсальной поверхности тела. Бактерии и пищевые частицы, проходя по внутриклеточному каналу, выходят в цитоплазму в составе образующихся пищеварительных вакуолей. Жгутиконосец – гетеротрофный, бактериоядный организм. При нарастании солености до степени насыщения, а также в анаэробных условиях простейшее погибает.

Tulamoeba peronaphora (рисунок 11) является экстремальной галофильной амебой, растущей при солености от 7,5 % до 25 % [45]. Длина и ширина активно передвигающейся амебы от 6 до 17 мкм и от 2 до 6 мкм соответственно. Среднее отношение длины к ширине составляло 2,2 мкм. Амебы, как правило, моноподиального типа. Цитоплазма содержит пищеварительные вакуоли с частично переваренными клетками бактерий и немногочисленные липидные капли. Ядро расположено близко к клеточной мембране. Жгутиковые стадии не наблюдались, но клетки старой культуры иногда содержали флагеллат округлой формы, не имеющих цитостома.

Рисунок 11 - Фазово-контрастная фотография Tulamoeba peronaphora [45]

В старой и молодой культуре Tulamoeba peronaphora располагались одиночные сформированные цисты сферической или эллипсоидной формы диаметром от 6 до 10 мкм. Стенка цист содержит единственную пору, проникающую внутрь клетки. Стенка же самой цисты слегка утолщена. Иногда наблюдается цитоплазма в пределах границ стенки цист.

Euplaesiobystra hypersalinica (рисунок 12) – экстремальный галофильный амебоидный изолят, имеющий длину от 19 до 41 мкм и ширину от 9 до 16 мкм [45]. Среднее отношение длины к ширине составляет примерно 2,6 мкм. Амебы (трофозиты), как правило, моноподиальные и имеют эруптивные псевдоподиальные образования. Цитоплазма заполнена пищеварительными вакуолями и большими округлыми включениями, возможно являющиеся каплями масла. Интересен тот факт, что иногда обнаруживались жгутиковые форм, которые не характерны для растущей культуры. Жгутиконосцы имели два равной длины жгутика, но превышающие длину клетки и осуществляющие гомодинамичные движения. Тело флагеллат сферической формы с диаметром 20 мкм. Цитоплазма таких клеток не содержала вакуоли с переваренными клетками бактерий.

Рисунок 12 - Фазово-контрастная фотография Euplaesiobystra hypersalinica [45]

Euplaesiobystra hypersalinica образует сферические цисты, диаметр которых колеблется от 14 до 20 мкм, а толщина – от 1 до 2 мкм. На цистах находились поры от 2 до 4, округлой или овальной формы, окруженные утолщенной мембраной. В культуре наблюдались округлые клетки с цистами представляющие собой эктоцисты.

Pleurostomum flabellatum (рисунок 13) обитает в гиперсоленых водах и был изолирован в корейской солеварни, соленостью 31 % [52]. Этот изолят имеет два жгутика, выходящих из цитостомного углублением. Наблюдения световой микроскопии и электронной микроскопии показывают, что Pleurostomum flabellatum – жгутиконосец, способный питаться и делиться, но имеющий и амебоидные стадии. Оптимальная температура для роста культуры составляет 40 °С. Интересно, что Pleurostomum flabellatum растет лучше при 30 % солености и не растет ниже 20 % солености. Время удвоения Pleurostomum flabellatum при оптимальных условиях составляет около 40 ч. Эти результаты позволяют предположить, что энергетические расходы осморегуляции высоки, как это предложено ранее для экстремальных галофилл.

Живые клетки Pleurostomum flabellatum веретеновидной формы, от 10 до 14 мкм в длину. У них есть два равных гемодинамичных жгутика, в два раза превышающих длину тела, выходящих из переднего конца клетки, около рострума. Движение жгутиков осуществляется медленными ударами. Цитостом располагается около вставки, откуда выходят жгутики, и простирается в виде спирали на половину длины клетки. Пищеварительные вакуоли сформированы в следующем конце цитостома и могут занимать большинство следующей части клетки. Апикальная область клетки (то есть предшествующий вставке жгутиков) заканчивается рострумом. У некоторых клеток было одно ядро, тогда как другие клетки были с двумя ядрами и двумя дополнительными жгутиками, по-видимому, представляя стадии перед делением. Просмотр электронной микрограммы подтверждает, что у Pleurostomum flabellatum есть цитостом с расширением в передней половине клетки. Ядро расположено на заднем конце клетки.

Ros – рострум, FV – пищеварительная вакуоль

Рисунок 13 – Фазово-контрастная фотография Pleurostomum flabellatum [52]

Pleurostomum salinum – организм, который полностью соответствует описанию рода [26, 27]. Это гетеротрофные простейшие с двумя параллельными, гомодинамическими, апикально отходящими жгутиками, направленными латерально и двигающимися синхронно. Жгутики от 1,5 до 2,0 раза длиннее тела, акронематические. Клетка простейшего размерами от 15 до 22 мкм в длину и в ширину от 4 до 7 мкм, палочковидной или цилиндрической формы, в сечении округлая. Цитостом выявляется в виде широкого, субапикального отверстия, находящегося непосредственно под основаниями жгутиков и продолжается в спиралевидную цитостомальную бороздку, занимающую от 1/3 до 2/3 длины тела. Ядро находится в передней трети клетки, непосредственно у цитостома. Цитоплазма вакуолизирована, особенно много пищевых вакуолей, формирующихся в области цитостомальной бороздки, скапливается в задней половине клетки. Тело не метаболично, но может изгибаться.

В культуре клетки преимущественно прикрепляются жгутиками к поверхностной пленке или к покровному стеклу. Жгутики совершают синхронные волнообразные движения, при этом клетка маятникообразно колеблется вдоль своей продольной оси. Некоторые клетки прикрепляются цитоплазматическими выростами на заднем конце к субстрату. Свободные жгутики совершают медленные гомодинамические волнообразные или огибающие движения, при этом передняя губа цитостома движется вместе со жгутиками и цитостом расширяется. Для подвижных клеток характерно спиралевидное толчкообразное движение, за счет волнообразных колебаний жгутиков.

Существует 3 работы, в которых описаны представители рода Pleurostomum, все они выявлялись исключительно в гипергалинных водоемах. Первоначально 4 вида Pleurostomum: P.caudatum, P.salinum, P.parvulum, P.gracile были описаны B. Namyslowski. J. Ruinen в 1938 году выделила еще один вид – P.flabellatum из гипергалинных озер Индии и Австралии. D.J Patterson и A.G.B. Simpson дополнили видовую характеристику P.flabellatum на основе наблюдений протистов в прибрежном гипергалинном озерце на побережье Западной Австралии, а также дополнили род новым видом P.turgidum.

Pleurostomum gracile представленный на рисунке 14 [27]. Клетка без клеточной стенки, от 9 до 14 мкм в длину и от 2 до 3 мкм в ширину; на одном конце заужена, на другом закруглена. Ротовой аппарат в передней части четко виден, расположен сбоку. Два равно функционирующих жгутика, один длиной с клетку, другой длиннее клетки. Плазма гомогенна, внутри видны сильно светопреломляющие тела (масло), в небольшом количестве в виде волнистой светлой полосы. Ядро в живом состоянии не видно. Слегка метаболичны, но без изменения формы тела, оно может быть несколько длиннее или короче, более плотным или худым, но, тем не менее, не изменяет характерную форму.

Рисунок 14 - Pleurostomum gracile [27]

Tetramitus salinus (рисунок 15) - мелкий жгутиконосец, описанный Entz, как Trichomastix salina, был получен им в Турда Румыния из соленого озера с водой около 10 градусов в плотности (соленость около 11 %) [8, 9]. Entz установил, что наиболее близок к Trichomastix lacertae, который благодаря Grasse, сейчас известен, как Eutrichomastix colubrorum. Этот паразит встречается у ящериц и змей. Entz предположил возможность того, что солеводный жгутиконосец в свободноживущей стадии является паразитом. Жгутиконосцы, которые могут быть приписаны к этому виду, описанному Entz, были обнаружены профессором Baas-Becking в культуре с соленостью около 15 %, взятой из соленого пруда в Марина, Калифорния.

В соответствии с наблюдением Entz структура этого жгутиконосца соответствует следующему описанию: клетка длиной от 20 до 30 мкм, спереди округлая, часто переходящая в заостренный хвост сзади, в дорзальной поверхности выгнутая, вентральная плоская; две бороздки на вентральной поверхности, правая из которых имеет позади ядра изгиб, который ведет к маленькому отверстию рта; четыре жгутика, три короче чем его тело, один длиннее; два коротких жгутика направлены вперед, один назад; четвертый жгутик волочится, прикреплен к телу в точке у основания хвоста; ядро располагается около рта; две маленькие сократительные вакуоли у точки начала жгутиков; анальное отверстие у основания хвоста.

Рисунок 15 - Tetramitus salinus [8]

Grasse установил, что жгутиконосец обладает аксостилем, ясно обозначенным, как он заявляет, на рисунках Entz. На этих рисунках одна из вентральных бороздок напоминает аксостиль, но сам Entz не отнес ее к этой структуре и, по-видимому, не знал о важности аксостиля для систематического статуса Trichomastix. Описание Trichomastix lacertae в статье Blochmann, которую Entz цитирует, не содержит ни каких цитологических деталей.

Достаточное количество Tetramitus было получено для исследований на поверхности культуры в течение ночи. Амебы около 12 мкм в длину были многочисленными на этих покровных стеклах, они были достаточно активными; широкие четкие псевдоподии формировались в различных точках в схожей текучей манере.

Дорзальная поверхность выпуклая, вентральная уплощенная, и вдоль середины вентральной поверхности идет глубокая желобовидная бороздка. Передний конец этой бороздки имеет короткое расстояние до переднего конца тела, ограничивая пространство для ядра между бороздкой и концом клетки.

Ядро расположено ближе кпереди, чем у большинства видов Tetramitus, в нем имеется относительно большое ядрышко, что похоже на ядро Tetramitus и не похоже на ядро Eutrichomastix.

В материале, находящемся в распоряжении автора, тело жгутиконосца варьирует по длине от 15 до 19 мкм и по ширине от 6 до 8 мкм.

Имеется четыре жгутика, два передних и два задних волочащихся. Каждый из этих жгутиков имеет одинаковую толщину вплоть до закрученного конца клетки. И все четыре, по-видимому, имеют одинаковый диаметр.

Передние жгутики обычно длиной соответствуют длине тела, но эта длина вариабельна и они иногда короче. Два волочащихся жгутика обычно длиннее, чем длина тела и часто примерно на 50 % длиннее передних жгутиков. Часто они не одинаковой длины, как было в случае с флагеллатами описанные Entz.

Жгутики выходят практически вместе в небольшом углублении сразу позади от конца клетки. Активное движение передних жгутиков может вовлекать всю их длину или только передние две трети или половину. Волочащиеся жгутики остаются отделенными друг от друга четвертью или более окружностью тела, сразу начиная от места их прикрепления. Они слабо вибрируют по всей их длине, этот зоофлагеллат двигается вперед резкими толчками, медленно поворачиваясь по спирали.

Позади ядра ближе к переднему концу вентрального углубления находится ротовое отверстие, оно ведет в длинную изогнутую суживающуюся к концу глотку, которая варьирует по длине и диаметру. Иногда видно только начало глотки, тогда как в других случаях она простирается до половины или более расстояния до заднего конца. Ее края выглядят светлыми при темнопольном освещении. По-видимому, та маленькая правая бороздка показанная Entz в реальности представляет собой глотку.

Этот жгутиконосец питается бактериями. Пищеварительная вакуоль формируется в конце глотки и, как правило, множество их присутствует в клетке. В одном случае было подсчитано 12 вакуолей; нейтрально красным эти вакуоли окрашиваются в различные оттенки оранжевого и красного.

Бесцветная цитоплазма содержит дополнения к пищевым вакуолям, многочисленные мелкие гранулы и несколько мелких вакуолей не одна из которых не окрашивается нейтральным красным. Сократительные вакуоли, анальные отверстия и точка прикрепления одного из волочащихся жгутиков, описанные Entz не обнаружены. Схожая бороздка, простирающаяся на всю длину тела, была описана Klebs у Tetramitus pyriformis [8].

2 Материалы и методы

1 Характеристика места отбора проб

Пробы отбирали из озера Дунино, находящегося на территории города Соль-Илецк (рисунок 15). Соль-Илецкие озера имеют провальное происхождение и образовались на месте пустот, вызванных растворением пластов каменной соли грунтовыми водами. За время существования озер подробно изучен химический состав их вод, температурный режим, тогда как сведения о видовом составе обитающих в них гидробионтов незначительны [47].

Рисунок 15 – Карта расположения озер города Соль-Илецка

Озеро Дунино, иначе называется Бромным. Оно располагается в нескольких десятках метрах от озера Развал. Данное озеро является огромным бассейном, содержащим двадцать тысяч кубометров лечебной грязи и большое количество брома.

Согласно Венецианской классификации озеро Дунино является гипергалинным [50]. Данное озеро карстового происхождения, его отличительной гидрохимической особенностью является высокая соленость, достигающая 170 г/л, а также значительное содержание магния и кальция. Жесткость воды в данном озере на порядок выше, чем в остальных. Глубина озера – 13 м.

2.2 Материалы, используемые в экспериментах

Объектом исследования была культура нового вида галофильного жгутиконосца, выделенная из воды озера Дунино ведущим научным сотрудником Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН в 2008 году.

Так же в ходе работы использовали культуру «Macropharyngomonas sp.», выделенную из воды оз. Развал.

В качестве питательной среды для культивирования галофильного жгутиконосца использовали синтетическую минерализованную среду Шмальца-Прата. Состав среды: NaCl – 28,15 г; KCl – 0,67 г; MgСl₂·6H₂0 – 5,51 г; MgSO₄·7H₂0 – 6,92 г; CaСl₂·6H₂0 – 1,45 г; KNO₃– 0,025 г; K₂HPO₄– 0,013 г, дистиллированной воды до 1000 мл. Минерализация среды - 36 ‰.

В качестве среды в опытах с разной минерализацией использовали среду «AS» следующего состава.

Состав среды: 243,2 г NaCl, 7,6 г KCl, 54,4 г MgCl₂·6H₂O, 59,4 г MgSO₄·7H₂O, 1,4 г CaCl₂·2H₂O на 1000 мл дважды дистиллированной воды. Минерализация среды - 306 ‰.

В качестве подкормки применяли культуру бактерий Pseudomonas fluorescens (штамм получен из Института биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН).

2.3 Культивирование галофильного жгутиконосца

В чашку Петри с 5 мл среды добавляли 0,1 мл культуры галофильного жгутиконосца и далее инкубировали при комнатной температуре в течение месяца, при этом каждый день вели наблюдение под микроскопом. В качестве подкормки использовалась бактерия Pseudomonas fluorescens. Так как соленая вода быстро кристаллизуется, немаловажным условием в ходе исследования являлось предотвращение испарения воды путем помещения чашки Петри в полиэтиленовый пакет.

2.4 Оценка морфологии и численности галофильного жгутиконосца

Гетеротрофные жгутиконосцы – группа протистов, требующая при изучении своеобразных методик. Имея размеры, в среднем от 5 до 20 мкм, то есть близкие к размерам некоторых бактерий и водорослей, они, однако, не могут быть учтены и определены с помощью методик используемых микробиологами и альгологами. Мелкие размеры, эластичность оболочки клетки, метаболия тела у некоторых форм и одновременно отсутствие пигментов вызывают определенные трудности при определении и учете численности. Следует так же подчеркнуть чувствительность многих жгутиконосцев к различным фиксаторам. Большая часть жгутиконосцев, с простой клеточной мембраной, даже при очень строгом подборе фиксатора через некоторое время округляется, теряет жгутики и вообще лизируется.

Требуется определенный навык при работе со световой микроскопической техникой [48].

Для определения, учета численности и изучения особенностей морфологии жгутиконосцев на уровне световой микроскопии достаточно использование обычных микроскопов на базе «Биолам» с соответствующим набором оптики, желательно фазового контраста.

2.4.1 Световая микроскопия

Световые микроскопы используются для наблюдений уже около 350 лет. Они позволяют наблюдать объекты размером меньше бактерий, однако имеют предел разрешения, который определяется длиной световой волны.

Степень разрешения микроскопа равна примерно половине длины волны используемого излучения. Длина волны видимого света около 0,4 мкм следовательно, степень разрешения любого светового микроскопа не может превышать 0,2 мкм. Сложность оценки численности и морфологии жгутиконосцев заключается в том, что клетки имеют прозрачные для проходящего света. Получить более четкое изображение можно путем усиления контраста объекта. Это достигается применением дополнительных устройств (фазово-контрастное, дифференционно-контрастное, электронные контрастирующие устройства).

Дополнительные данные, в частности о ядре и других органеллах, можно так же получить с помощью люминесцентного микроскопа.

2.4.2 Фазово-контрастная микроскопия

Метод фазово-контрастной микроскопии основан на том, что живые клетки и микроорганизмы, слабо поглощающие свет, тем не менее, способны изменять фазу проходящих через них лучей (фазовые объекты).

В разных участках клеток, отличающихся показателем преломления и толщиной, изменение фаз будет неодинаковым. Эти разности фаз, возникающие при прохождении видимого света через живые объекты, можно сделать видимыми с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Фазово-контрастная микроскопия осуществляется с помощью обычного светового микроскопа и специального приспособления, куда входят фазово-контрастный конденсор с кольцевыми диафрагмами и фазовая пластинка, имеющая форму кольца. Для первоначальной наводки используют вспомогательный микроскоп, с помощью которого добиваются того, чтобы через кольцевую диафрагму конденсора в объектив проникало лишь кольцо света. Луч света, пройдя через прозрачный объект, расщепляется на два луча: прямой и дифрагированный (преломленный). Прямой луч, проникнув через частицу, фокусируется на кольце фазовой пластинки, а дифрагированный луч как бы огибает частицу, не проходя через нее. Поэтому оптические пути их различны и между ними создается разность фаз. Она сильно увеличивается с помощью фазовой пластинки и благодаря этому контрастность изображения повышается, что позволяет наблюдать не только фазовые объекты целиком, но и детали строения, например, живых клеток и микроорганизмов.

2.4.3 Метод учета численности галофильного жгутиконосца

Культивированных простейших ежедневно подсчитывали методом прямого счета под микроскопом Микромед – 5 с увеличением в 40 раз в двадцати полях зрения чашки Петри. В каждом поле зрения подсчитывались отдельно цисты, амебы и жгутиковые формы.

Полученная численность переводилась на 1 мл среды. Для этого сначала вычисляли площадь поля зрения (), мм², используя камеру Горяева по формуле:

(1)

где - площадь одного малого квадрата (0,0025 мм²);

- количество малых квадратов в одном поле зрения.

Далее вычисляли общую площадь (), мм² по формуле:

(2)

где - количество полей зрения.

Измеряли радиус () чашки Петри и рассчитывали площадь чашки Петри (), мм²по формуле:

(3)

где - радиус чашки Петри, мм².

На последнем этапе находили отношение к по формуле:

(4)

Полученное число () умножали на сумму клеток в двадцати полях зрения.

2.5 Метод оценки диапазона экологической толерантности галофильного жгутиконосца

Для оценки диапазона экологической толерантности галофильного жгутиконосца в лабораторных условиях, мы изучили несколько факторов влияния на простейшее: влияние температуры, влияние минерализации среды, влияние концентрации питательных веществ, влияние перемешивания среды на жизненный цикл исследуемой культуры.

2.5.1 Влияние температуры на жизненный цикл галофильного жгутиконосца

Для оценки жизненного цикла галофильного жгутиконосца по отношению к температуре был проделан следующий эксперимент: было взято три чашки Петри, с культивированными в них простейшими (0,1 мл культуры в 5 мл среды) и было взято три температуры: 7 °C (в холодильнике); 27 °C и 30 °C (в термостате). Каждый день производили подсчет численности и динамики роста галофильного жгутиконосца под микроскопом.

2.5.2 Влияние минерализации среды на динамику численности галофильного жгутиконосца

Для определения оптимальной минерализации был проведен эксперимент, в котором изначально были сделаны восемь разведений среды специального состава (AS среда, соленость 306 ‰) со следующей минерализацией: 306, 244,8, 183,6, 122,4, 91,8, 61,2, 30,6 и 15,3 г/л.

Далее производили культивирование простейшего в полученных разведениях с добавлением подкормки Pseudomonas fluorescens.

Каждый день производился подсчет жизненных форм галофильного жгутиконосца под микроскопом.

2.5.3 Влияние концентрации питательных веществ на динамику численности галофильного жгутиконосца

В ходе опыта было сделано пять разведений бактерий Pseudomonas fluorescens и были получены следующие концентрации бактерий от 0,5·10⁷ до 0,5·10³ КОЕ/мл (колониеобразующие единицы).

Предварительно бактерии убивали нагреванием на водяной бане при температуре 100 °C в течении двадцати минут. В качестве контроля использовался физиологический раствор.

Далее производили культивирование и подсчет численности жизненных форм галофильного жгутиконосца под микроскопом.

2.5.4 Влияние перемешивания среды на динамику численности галофильного жгутиконосца

С помощью магнитной мешалки был исследован рост галофильного жгутиконосца и динамика его жизненного цикла в условиях перемешивания (рисунок 16).

Рисунок 16 - Прибор магнитная мешалка MHS-20A с подогревом

Культивировали простейшее в синтетической минерализованной среде в трех чашках Петри. Далее через неделю брали одну чашку с культурой с наибольшим количеством жгутиковых форм, переливали ее содержимое в плоскодонную колбу, для дальнейшего перемешивания на магнитной мешалке. Позже еще через восемь дней проделывали аналогичную манипуляцию, но уже с культурой с наибольшим количеством амебоидных форм. К концу месяца брали третью чашку Петри, с наибольшим количеством цист и проделывали ту же манипуляцию.

Скорость перемешивания была 250 оборотов в минуту. Через каждый час производился подсчет клеток в культуре галофильного жгутиконосца.

3 Результаты и их обсуждение

3.1 Морфология клеток галофильного жгутиконосца

Тело веретеновидной формы, уплощенное с боков, длиной от 6 до 10 мкм, ширина тела в среднем от 3 до 6 мкм. Передний конец заострен, задний конец округлый и может образовывать нитевидные псевдоподии (рисунок 17).

внутриклеточный канал

цитостом

вентральная бороздка

пищеварительные вакуоли

ядро

цитофаринкс

Рисунок 17 – Схема строения клетки галофильного жгутиконосца

Вентральная сторона уплощена, дорсальная сторона округлая. Половину вентральной стороны занимает вентральная бороздка, переходящая в цитостом, который, в свою очередь, переходит в цитофаринкс, продолжающийся во внутриклеточный канал, оканчивающийся на заднем конце клетки. Цитофаринкс формирует изгиб к дорсальной поверхности клетки.

В области вентральной бороздки через цитостом поступают пищевые частицы, проходят по цитофаринксу и переходят в фагосому в дистальной части цитофаринкса и во внутриклеточном канале.

Жгутики, в количестве 2, отходят апикально на переднем полюсе клетки, акронематические, длиной в 2 раза превышают длину клетки. Движение жгутиков гетеродинамическое (не синхронное). Если клетка делится, то образуются по два жгутика на каждой стороне.

Цитоплазма сильно вакуолизирована, насыщена фагосомами, содержащими бактерий, и мелкими светопреломляющими гранулами. Ядро округлое, пузырьковидного типа, расположено сразу за местом прикрепления жгутиков. В переднем конце тела непосредственно у места отхождения жгутиков находятся палочковидные светопреломляющие гранулы, по-видимому базальные тела жгутиков.

По своим морфологическим и культуральным характеристикам описанный вид имеет много черт сходства с представителями отряда Heterolobosea.

3.2 Жизненный цикл галофильного жгутиконосца

Цикл развития включает жгутиковую форму, амебоидные клетки, и цисты. Цисты с толстой оболочкой имеют одну крышечку, устойчивы к колебаниям солености, но разрушаются при быстром высушивании. После добавления к цистам свежей среды, мгновенно начинается процесс эксцистирования и амебоидные клетки быстро начинают выходить из цист.

Полный жизненный цикл галофильного жгутиконосца составляет 28 дней (рисунок 18).

1 - жгутиковая клетка, 2, 3, 4 - амебоидные формы, 5 - циста.

Рисунок 18 - Зарисовка жизненного цикла галофильного жгутиконосца

Общая численность простейшего повышается до 15 суток включительно и потом уже не снижается (рисунок 19).

Рисунок 19 – Динамика численности галофильного жгутиконосца

Нами была подсчитана динамика численности различных морфологических вариантов клеток в периодической культуре галофильного жгутиконосца (рисунок 20). Развитие вегетативных форм простейшего (жгутиковых и амебоидных) происходит в течение 28 дней и на 29 сутки вегетативные клетки в культуре не выявляются.

Рисунок 20 – Жизненный цикл галофильного жгутиконосца

По результатам было установлено, что в жизненном цикле преобладают амебоидные формы, которые появляются на вторые сутки, затем их численность увеличивается, достигают своей максимальной численности они на 15 сутки, далее их численность снижается, и к 28 суткам они совсем исчезают из культуры.

Жгутиковые клетки появляются на 4 сутки, достигают своей максимальной численности на 7 сутки, затем их численность постепенно снижается, и к 25 дню они совсем исчезают из культуры.

Цисты видны уже с первых дней и численность их превышает численность амебоидных и жгутиковых форм. К 29 дню вся культура состоит из цист. Образование цист связано по-видимому с расходованием пищевых ресурсов.

3.3 Влияние экологических факторов на развитие культуры галофильного жгутиконосца

3.3.1 Описание влияния температуры на жизненный цикл галофильного жгутиконосца

В эксперименте изначально изучалось влияние следующих значений температуры культивирования: 27 ºC и 30 ºC.

Выяснено, что развитие культуры происходило при 27 °C и 30 °C (рисунок 21).

Для того чтобы выяснить, как влияет температура на скорость роста общей численности галофильного жгутиконосца и на динамику численности его отдельных морфологических форм, нами был проведен анализ графиков численности.

Рисунок 21 - Динамика общей численности галофильного жгутиконосца при разной температуре

На основании полученных данных, справедливо утверждать, что общая численность галофильного жгутиконосца максимальна при температуре 27 °C. Таким образом, данная температура является оптимальной для исследуемой культуры.

Рисунок 22 отражает динамику численности жгутиковой формы галофильного жгутиконосца при разной температуре. Мы видим, что жгутиковые клетки быстрее появляются при температуре 30 °C, но численность их остается незначительной (рисунок 22). Оптимальной температурой для жгутиковых клеток является 27 °C, т. к. при данной температуре общая численность жгутиковых клеток максимальна.

Рисунок 22 - Динамика численности жгутиковой формы галофильного жгутиконосца при разной температуре

На рисунке 23 изображен рост численности амебоидной стадии галофильного жгутиконосца при двух данных температурах. Из графика видно, что при 30 ºC амебы появляются быстрее, но значение их численности незначительно. При 27 ºC рост численности амеб начинается на третьи сутки и максимальной численности они достигают на 17 сутки, затем их численность постепенно уменьшается.

Рисунок 23 - Динамика численности амебоидной формы галофильного жгутиконосца при разной температуре

Рисунок 24 иллюстрирует рост численности цист галофильного жгутиконосца при двух данных температурах (рисунок 24). Из графика видно, цисты при 27 °C и 30 °C появляются на пятые сутки, затем наблюдается увеличение их количества.

Рисунок 24 - Динамика численности цист галофильного жгутиконосца при разной температуре

Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что оптимальной температурой для исследуемой культуры является 27 °C. Установлено, что температура влияет на динамику жизненного цикла, на численность и скорость роста культуры.

3.3.2 Описание влияния минерализации среды на динамику численности галофильного жгутиконосца

В эксперименте изначально были сделаны восемь разведений среды специального состава (AS среда, соленость 306 ‰) со следующей минерализацией: 306, 244,8, 183,6, 122,4, 91,8, 61,2, 30,6 и 15,3 г/л.

При минерализации среды 306, 244,8 и 183,6 г/л роста и жизнедеятельности галофильного жгутиконосца не наблюдалось.

Для того чтобы выяснить, как влияет минерализация среды на динамику общей численности галофильного жгутиконосца, нами был составлен график (рисунок 25). На данном графике представлена общая численность галофильного жгутиконосца при пяти значениях минерализации среды.

Рисунок 25 - Динамика общей численности галофильного жгутиконосца в условиях различной минерализации

Из графика видно, что при минерализации среды 91,8 г/л рост культуры идет быстрее и нарастание численности культуры выше, чем при других значениях минерализации. При минерализации среды 61,2 г/л также наблюдается значительный рост культуры.

На рисунке 26 отображена численность жгутиковой формы галофильного жгутиконосца при пяти значениях минерализации среды.

Рисунок 26 - Динамика численности жгутиковой формы галофильного жгутиконосца при разной минерализации

Исходя из полученных данных, наблюдается следующая динамика. При минерализации среды 61,2 г/л рост численности жгутиконосца идет быстрее и наблюдается максимальная концентрация простейшего. При минерализации среды 91,8 г/л наблюдается также рост культуры и максимальной численности жгутиковые формы достигают на 14 сутки. При минерализации среды 122,4 г/л развитие жгутиковой формы минимально.

На рисунке 27 представлена численность амебоидной формы галофильного жгутиконосца при данных значениях минерализации.

Рисунок 27 - Динамика численности амебоидной формы галофильного жгутиконосца при разной минерализации

При минерализации среды 91,8 г/л рост и концентрация численности амеб выше, чем при других значениях минерализации. Из графика видно, что при 122,4 и 61,2 г/л нет значительного отличия в численности амеб и по их динамике. При минерализации среды 30,6 и 15,3 г/л концентрация амеб минимальна.

Рисунок 28 отражает численность цист галофильного жгутиконосца при данных значениях минерализации. Из графика видно, что при минерализации среды 91,8 и 61,2 г/л нет отличия в численности цист, и при этих значениях минерализации их формируется больше. При минерализации среды 30,6 и 15,3 г/л концентрация цист минимальна.

Рисунок 28 - Динамика численности цист галофильного жгутиконосца при разной минерализации

В ходе работы был проведен эксперимент по минерализации с Macropharyngomonas sp. для сравнения с исследуемым изолятом. На рисунке 29 изображена динамика численности жгутиковой формы Macropharyngomonas sp при разной минерализации.

Рисунок 29 ‒ Динамика численности жгутиковой формы Macropharyngomonas sp. при разной минерализации

Исходя из полученных данных, наблюдается следующая динамика. При минерализации среды 306, 244,8, 183,6 и 15,3 г/л роста и жизнедеятельности Macropharyngomonas sp не наблюдалось. При минерализации среды 122,4 г/л наблюдается максимальная численность жгутиковых форм Macropharyngomonas sp. При минерализации среда 91,8 и 61,2 г/л нет значительного отличия в численности жгутиковых форм.

Рисунок 30 отражает динамику численности амебоидных форм Macropharyngomonas sp.

Рисунок 30 ‒ Динамика численности амебоидных форм Macropharyngomonas sp.

Из графика видно, что максимальной численности амебоидные формы Macropharyngomonas sp. достигают при минерализации среды 122,4 г/л, на десятые сутки, но наибольшая численность наблюдается при минерализации 91,8 г/л.

Таким образом, из описанного эксперимента можно сделать вывод о том, что общая численность галофильного жгутиконосца уменьшается с уменьшением минерализации среды. При уменьшении минерализации среды укорачивается период экспоненциального роста жгутиковых форм, уменьшается их численность и ускоряется переход в амебоидные клетки и цисты. Оптимальной минерализацией для жгутиковых форм является содержание солей равное 61,2 г/л, при которой они достигают максимальной численности. Для амебоидных форм оптимальной минерализацией является содержание солей равное 91,8 г/л. При сравнении исследуемого изолята с Macropharyngomonas sp. относительно минерализации наблюдаются явные различия. На основании данных результатов справедливо утверждать, что исследуемый штамм является истинным галофилом.

3.3.3 Описание влияния концентрации питательных веществ на динамику численности галофильного жгутиконосца

В эксперименте было сделано пять разведений суспензии бактерий Pseudomonas fluorescens со следующей концентрацией: 0,5·10⁷, 0,5·10⁶ , 0,5·10⁵ , 0,5·10⁴ и 0,5·10³ КОЕ/мл.

Для того чтобы выяснить из проделанного эксперимента, как влияет концентрация питательных веществ на скорость роста общей численности галофильного жгутиконосца, нами был составлен график (рисунок 31).

Рисунок 31 - Динамика общей численности галофильного жгутиконосца в условиях разной концентрации питательных веществ

Из графика мы видим, что при уменьшении концентрации питательных веществ снижается общая численность галофильного жгутиконосца.

На рисунке 32 представлен рост численности жгутиковых форм галофильного жгутиконосца при разных концентрациях питательных веществ.

Рисунок 32 - Динамика численности жгутиковой формы галофильного жгутиконосца при разной концентрации питательных веществ

Исходя из полученных данных, наблюдается следующая динамика. При концентрации бактерий 0,5·10⁷ и 0,5·10⁶ КОЕ/мл жгутиковые формы достигают своей максимальной численности на седьмые сутки. При концентрации бактерий 0,5·10⁵ и 0,5·10⁴ КОЕ/мл жгутиковые формы достигают своей максимальной численности на одиннадцатые сутки. При минимальной концентрации бактерий численность жгутиковых форм остается незначительной.

Рисунок 31 отражает рост численности амебоидных форм галофильного жгутиконосца при разных концентрациях питательных веществ. Мы видим, что с уменьшением концентрации питательных веществ уменьшается численность амеб.

Рисунок 33 - Динамика численности амебоидных клеток галофильного жгутиконосца при разной концентрации питательных веществ

Данный график иллюстрирует численность цист галофильного жгутиконосца при разных концентрациях питательных веществ (рисунок 34).

Рисунок 34 - Динамика численности цист галофильного жгутиконосца при разной концентрации питательных веществ

Полученные результаты отображают следующую динамику. При концентрации бактерий 0,5·10⁷, 0,5·10⁶ и 0,5·10⁵ КОЕ/мл цисты начинают образовываться на седьмые сутки. При концентрации бактерий 0,5·10⁴ и 0,5·10³ КОЕ/мл цисты начинают образовываться на двенадцатые сутки.

Таким образом, из описанного эксперимента можно сделать вывод о том, что при уменьшении концентрации питательных веществ снижается как общая численность клеток, так и численность жгутиковых форм и амебоидных клеток.

3.3.4 Описание влияния перемешивания на динамику численности галофильного жгутиконосца

Для того чтобы изучить влияние перемешивания на динамику численности и соотношение жизненных форм галофильного жгутиконосца, культура была подвержена действию магнитной мешалки. Эксперимент проводился в трехкратной повторности и на графиках представлено усредненное процентное соотношение жизненных форм.

Рисунок 35 демонстрирует рост культуры галофильного жгутиконосца с большим количеством жгутиковых форм.

Обозначения: - амебоидная стадия, - цисты, - жгутиковая стадия

Рисунок 35 - Динамика численности морфологических форм галофильного жгутиконосцав культуре с высокой концентрацией жгутиковых клеток в условиях перемешивания

Из указанного графика мы видим, что соотношение жизненных форм изменилось за 12 часов. Численность жгутиковых форм в ходе перемешивания стала уменьшаться и через 12 часов они совсем исчезли.

Амебоидные клетки в ходе перемешивания стали интенсивно увеличивать свою численность, через 7 часов их численность была равна численности жгутиковых форм, а после превысила их.

Цисты в ходе перемешивания появились через 2 часа от начала перемешивания, далее их численность начала увеличивалась и через 7 часов сравнялась с численностью жгутиковых форм, а после превысила их.

На рисунке видно, что через 12 часов перемешивания в культуре остались только амебоидные клетки и цисты. Амебоидных клеток больше чем цист.

В соответствии с рисунком 36 представлен график, демонстрирующий рост культуры галофильного жгутиконосца с большим количеством амебоидных клеток.

Обозначения: - амебоидная стадия, - цисты, - жгутиковая стадия

Рисунок 36 - Динамика численности морфологических форм галофильного жгутиконосцав культуре с высокой концентрацией амебоидных клеток в условиях перемешивания

Из данного графика мы видим, что соотношение жизненных форм изменилось за 15 часов. Численность амебоидных клеток в ходе перемешивания стала уменьшаться и через 15 часов они исчезли совсем.

Жгутиковые формы, имеющиеся изначально в культуре в меньшем количестве, стали увеличиваться в численности, через 8 часов сравнялись с численностью амебоидных форм, а после превысили их. Интенсивный рост жгутиковых форм происходил в течение 9 часов, а после началось их постепенное деградирование.

Цисты в ходе перемешивания появились только через 3 часа, далее их численность начала расти. К 9 часу перемешивания они сравнялись по численности с амебоидными клетками.

В соответствии с рисунком 37 представлен график, демонстрирующий рост культуры галофильного жгутиконосца с большим количеством цист.

Обозначения: - амебоидная стадия, - цисты, - жгутиковая стадия

Рисунок 37 - Динамика численности морфологических форм галофильного жгутиконосцав культуре с высокой концентрацией цист в условиях перемешивания

Из данного графика мы видим, что соотношение жизненных форм изменилось за 7 часов. Численность цист в ходе перемешивания постепенно начала снижаться и через 7 часов исчезла совсем.

Жгутиковые формы появились через час после начала перемешивания, далее их численность начала расти. Через 3 часа численность жгутиковых клеток сравнялась с численностью цист, а позже превысила их.

Амебоидные клетки появились сразу после начала перемешивания, далее наблюдался их рост. Через 3 часа их численность сравнялась к численностью цист, а позже превысила их.

На графике видно, что через 7 часов перемешивания в культуре остались только жгутиковые формы и амебы. Амебоидных клеток больше, чем жгутиковых форм.

Таким образом, из сделанного эксперимента можно сделать выводы о том, что механическое воздействие резко ускоряет преобразование жизненных форм, динамика изменений которых зависит от стадии жизненного цикла галофильного жгутиконосца.

Заключение

В результате проведенного исследования нами были изучены морфо-физиологические особенности галофильного гетеротрофного жгутиконосца, впервые найденного на территории России сотрудниками Института клеточного и внутриклеточного симбиоза в 2008 году.

Цитологические особенности включают в себя наличие двух гетеродинамичных жгутиков, вентральной бороздки, цитостома, цитофаринкса, внутриклеточного канала.

Было установлено, что у изучаемого простейшего жизненный цикл включает в себя жгутиковую форму, амебы и цисты, которые последовательно сменяют друг друга.

Установлено, что изучаемая культура гетеротрофного жгутиконосца относится к представителям класса Heterolobozea.

Из признаков, характерных для данного класса, которые обнаружены у изучаемой культуры, следует отметить сложный жизненный цикл, состоящий из жгутиковых, амебоидных клеток и цист, эруптивное движение псевдоподий у амеб, наличие акронематичных жгутиков.

Установлен диапазон экологической толерантности изучаемой культуры, оптимальные экологические условия включают в себя температуру 27 °C, минерализация 91,8 г/л, концентрацию питательных веществ цельную, с перемешиванием.

При уменьшении минерализации среды укорачивается период экспоненциального роста жгутиковых форм, уменьшается их численность и ускоряется переход в амебоидные клетки и цисты.

При уменьшении концентрации питательных веществ снижается общая численность клеток и численность жгутиконосцев, ускоряется инцистирование.

Установлено, что эффект механического воздействия резко ускоряет преобразование жизненных форм и зависит от стадии жизненного цикла.

При изучении литературных источников и сравнении исследуемого штамма с известными аналогами, представленными в таблице 1, можно сделать следующее заключение, что исследуемая культура по морфологическим признакам наиболее схожа с Macropharyngomonas sp. Оба простейших имеют веретеновидную форму жгутиковых клеток, содержащих жгутики, цитостом, цитофаринкс и вентральную бороздку. В цикле рассматриваемых простейших присутствуют жгутиковые формы, амебоидные клетки и цисты. В среднем жизненный цикл составляет от 28 до 30 дней. Оба протиста характеризуются идентичной динамикой жизненных форм при изменении концентрации питательных веществ и при механическом воздействии. Механическое воздействие резко ускоряет преобразование жизненных форм как исследуемого изолята, так и Macropharyngomonas sp., динамика изменений которых зависит от стадии жизненного цикла простейших. Очевидно, сходство указанных характеристик связано с одинаковой таксономической принадлежностью исследуемого изолята и Macropharyngomonas sp. к одному классу Heterolobosea.

Таблица 1 - Описание морфологически схожих галофильных протистов

Вид галофильного организма	Признаки
Вид галофильного организма	Жизненые формы	Длина клетки, мкм	Форма жгутиковых клеток	Жгутики	Длина жгутиков / длина клетки	Вентральная бороздка	Цисты
Euplaesiobystra hypersalinica	А, Ц	19-41	-	-	-	+, спиралевидная	+, с порами
Pleurostomum flabellatum	Ж	10-14	веретеновидная	2, гомодинамичные	1,5-2,0	+, спиралевидная	-
Pleurostomum salinum	Ж	20-22	палочковидная	2, гомодинамичные	1,0-1,5	+, спиралевидная	-
Pharyngomonas sp. (Macropharyngomonas sp.)	Ж, А, Ц	10-25	веретеновидная	3-5	2,0	+	+, без пор
Pharyngomonas kirbyi	Ж	9-14	веретеновидная	4	1,0-1,5	+, уплощённая	-
Tetramitus salinus	Ж, А	15-19	веретеновидная	4, гомодинамичные	1,0-1,5	+, желобовидная	-
Tulamoeba peronaphora	А, Ц	6-17	-	-	-	-	+, с порами
Исследуемый штамм	Ж, А, Ц	6-10	веретеновидная	2, гетеродинамичные	1,5-2	+, уплощенная	+, с порами
А - амебы, Ж - жгутики, Ц - цисты

Исследуемый изолят и Macropharyngomonas sp. имеют различия в морфологии и уровне оптимальной минерализации. По размерам Macropharyngomonas sp. превышает исследуемый изолят почти в 2 раза. Количество жгутиков у Macropharyngomonas sp. в 2 раза больше относительно исследуемого галофильного жгутиконосца. Цисты изучаемого изолята имеют поры, по сравнению с цистами Macropharyngomonas sp., у которых в свою очередь поры отсутствуют. Кроме того, исследуемый изолят и Macropharyngomonas sp. имеют различия по диапазону экологических факторов. В частности были установлены оптимумы по минерализации, которые для исследуемого галофильного жгутиконосца составляют 91,8-61,2 г/л, а для Macropharyngomonas sp. - 122,4-91,8 г/л.

По проделанной работе можно сделать вывод о том, что различные стадии жизненного цикла гетеролобозных галофильных жгутиконосцев приспособлены к разным экологическим условиям, что повышает их адаптацию к колебаниям экологических факторов. На основании анализа литературных источников и сравнении исследуемого изолята с морфологически схожими галофильными протистами, можно с высокой вероятностью предположить, что изучаемый галофильный жгутиконосец является новым видом.

Список использованных источников

Brock, T. D. Ecology of saline lakes, in: Strategies of Life in Extreme Environments / T.D Brock // Ed. M. Shilo. Dahlem Conferenzen, Berl. Verlag Chemic, Weinheim. – 1979. – P. 29-47.
Butschinsky, P. Die Protozoen-Fauna der Salzsee-Limane bei Odessa / P. Butschinsky // Zool. Anz. – 1897. – № 20. – P. 1-4.
Егоров, А. Н. Соленые озера Южного Урала / А.Н. Егоров, С.Г. Захаров // География и природные ресурсы. - - № 1. - С. 146-148.
Williams, W. D. Inland salt lakes: An introduction / W.D. Williams // Hydrobiologia. - - №. 81. - Р. 1-14.
saltlive. ru
Gunde-Cimerman, N. Adaptation to Life at High Salt Concentrations in Archaea, Bacteria, and Eukarya / N. Gunde-Cimerman, A. Oren, A. Plemenitas // Springer. – 2005. – P. 521-549.
Oren, A. Saline lakes around the world: Unique systems with unique values, 10th Isslr conference and 2008 Friends of Great Salt Lake forum, May 11-16, 2008, University of Utah, Salt Lake City / A. Oren et al. // Natural Resources and Environmental Issues. – 2009. - № 15. - 1.
Deckker, P. Chemical and Biological Features of Tasmanian salt Lakes / P. Deckker, W.D Williams // Aust. J. Mar. Freshm. Res. – 1982. - № 33. – P. 1127-32.
Oren, A. Microbial life at high salt concentrations: phylogenetic and metabolic diversity / A. Oren // Saline systems. - - № 4:2. – P. 1-13.
Post, F. J. Microbiology of the Great Salt Lake north arm / F.J. Post // Hydrobiologia. – 1981. – № 81. – P. 59-69.
Тихоненко, Д. В. Распределение гетеротрофных жгутиконосцев на литорали экстуария реки Черной (Кандалакшский залив, Белое море) / Д. В. Тихоненков, Ю. А. Мазей // Биология моря. – 2006. - № 5. – С. 333-340.
Селиванова, Е. А. Симбиотические связи микроорганизмов в планктонных сообществах соленых водоемов. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук – Оренбург: – 2007. - С. 47.
Калмыкова, А. А. Морфо-физиологические особенности галофильных гетеротрофных жгутиконосцев на примере «Macropharyngomonas sp.». Дипломная работа ‒ Оренбург: ‒ 2011. ‒ С. 51.
Мыльников, А. П. Адаптации пресноводных зоофлагеллат к повышенной солености / А.П. Мыльников // Биол. внутр. вод. –1983. – C. 134.
Блюмина, Л. С. Биология соленых Соль-Илецких озер / Л.С. Блюмина – Оренбург : – 1958. – C. 231.
Мазей, Ю. А. Гетеротрофные жгутиконосцы сублиторали и литорали юго-восточной части Печорского моря / Ю.А. Мазей, Д.В Тихоненков // Океанология. –2006. – № 6 – C. 151-156.
Немцева, Н. В. Планктонные сообщества уникальных гипергалинных и мезогалинных озер Оренбуржья / Н.В Немцева, А.О. Плотников, Е.А Селиванова // Вестник ОГУ. – № 5. - – C.13-31.
Абдрахманов, А. Р. Микрофлора соленого водоема (озеро Развал Оренбургской области) / А.Р. Абдрахманов – Оренбург: –2002. – C. 13.
Diaz-Munoz, G. Halophilic Black Yeast Hortaea werneckii in the Cabo Rojo Solar Salterns: Its First Record for this Extreme Environment in Puerto Rico / G. Diaz-Munoz, R. Montalvo-Rodriguez // Caribbean Journal of Science. – 2005. - № 41. – P. 360-365.
Baati, H. Prokaryotic diversity of a Tunisian multipond solar saltern / H. Baati // Extremophiles. – 2008. - № 12. – P. 505-518.
Karen, J. Temperature and pH optima of extremely halophilic archaea: a mini-review / J. Karen // Extremophiles. – 2011. - № 15. – P. 119-
Селиванова, Е. А. Структура и динамика бактериопланктона Соль-Илецких гипергалинных и мезогалинных озер / Е.А. Селиванова // Вестник ОГУ. – 2011. – С. 56-59.
Rodriguez-Valera, F. Characteristics of the Heterotrophic Bacterial Populations in Hypersaline Environments of Different Salt Concentrations / F. Rodriguez, F. Ruiz-Berraquero, A. Ramos-Cormenzana // Microb. Ecol. – 1981. - № 7. – P. 235-243.
Кашнер, Д. Жизнь микробов в экстремальных условиях / Д. Кашнер – М.: Мир, – 1981. – C.56.
Oren, A. A hundred years of Dunaliella research: 1905–2005 / A. Oren // Saline Systems. – 2005. - № 1:2. - 1-14.
Namyslowski, B. Uber unbekannte halophile Microorganismen aus dem Innern des Salzbergwerkes Wieliczka / B. Namyslowski // Bull. internat. Acad. Sci. Cracovie, Series B. – 1913. – P. 88-104.
De Hoog, G. S. Nutritional-pattern and eco-physiology of Hortaea werneckii, agent of human tinea nigra. / G.S. De Hoog, A.H.G. Gerrits van den Ende // Antonie van Leeuwenhoek. - - № 62. - P. 321-329.
Finlay, B. J. Ciliated Protozoa and other Microorganisms from Two African Soda Lakes (Lake Nakuru and Simbi, Kenya) / B.J. Finlay // Arch. Protistenkd. – 1987. – № 133. – P. 81-91.
Hausmann, K. Cryptic Species in a Morphospecies Complex of Heterotrophic Flagellates: the Case Study of Caecitellus / K. Hausmann // Acta. Protozool. – 2006. - № 45. - P. 415 - 431.
Pochmann, A. Uber Choanogaster, einen neuen farblosen Salzflagellaten vom Urmia- See / A. Pochmann // Arch. Protistenkünde. – 1959. – № 103. – P. 507.
Post, F. J. The protozoa of a Western Australian hypersaline lagoon / F.J. Post, L.J. Borowitzka, M.A. Borowitzka, B. Mackay, T. Moulton // Hydrobiologia. – 1983. - № 105. – P. 95-113.
Smurov, A. O. Resistance of Paramecium Species (Ciliophora, Peniculia) to Salinity of Environment / A.O. Smurov, S.I. Fokin // Protistology. – 1999. - № 1. – P. 43-53.
Smurov, A. O. On the methods for the estimation of salinity tolerance of ciliates / A.O. Smurov // Protistology. – 2000. - № 1. – P. 124-132.
Willams, W. D. Chinese and Mongolian saline lakes: a limnological overview / W. Willams // Hydrobiologia. –1991. – № 210. – P. 39-66.
Arndt, H. Functional diversity of heterotrophic flagellates in aquatic ecosystems / H. Arndt, D. Dietriech, B. Auer , E. J. Cleven, T. Grafenhan, M. Wietere, A. Mylnikov // Chapter 12, London. – 2000. – P. 240-268.
Зданович, В. В. Гидробиология и общая экология: словарь терминов / В.В. Зданович – М.: Дрофа, – 2004. – C.45.
Селиванова, Е. А. Экологическо-трофическая характеристика микробиоценоза гипергалинного водоема на примере Соль-Илецкого озера Развал (Оренбургская область) / Е.А. Селиванова, Н.В. Немцева – Оренбург: - 2010. – С. 1-4.
Al-Qassabi, S. Flagellates from Stromatolites and Surrounding Sediments in Shark Bay, Western Australia / S. Al-Qassabi, W.J. Lee, S. Murray, A.G.B. Simpson, D.J. Patterson // Acta Protozool. – 2002. - № 41. - 91-144.
Entz, G. Uber die Rhizopoden des Salzteiches zu Szamosfalva / G. Entz // Termesz. Fuzetek. – 1877. – № 3. – P. 38-39.
Smurov, A. O. On the methods for the estimation of salinity tolerance of ciliates / A.O. Smurov // Protistology. – 2000. - № 1. – P. 124-132.
Ruinen, J. Rhizopods living in unusual environments / J. Ruinen, L. G. Baas-Becking // Arch. Neerland. Zool. – 1938. – № 3. – P. 181-198.
Алимов, А. Ф. Протисты. Руководство по протозоологии / А.Ф. Алимов, М.В. Крылов, А.О. Фролов – Санкт-Петербург: Наука, – 2007. – C. 18.
Жуков, Б. Ф. Атлас пресноводных гетеротрофных жгутиконосцев / Б.Ф. Жуков – Рыбинск: – 1993. – C. 23-28.
Park, JS. Halocafeteria seosinensis gen. et sp. nov. (Bicosoecida), a halophilic bacterivorous nanoflagellate isolated from a solar saltern / JS. Park, B.C. Cho, A.G.B. Simpson // Extremophiles. – 2006. - № 10. – P. 493–504.
Park, JS. Ultrastructureand Molecular Phylogeny of two Heterolobosean Amoebae, Euplaesiobystra hypersalinica gen. etsp.nov.and Tulamoeba peronaphora gen. etsp.nov.,Isolatedfroman ExtremelyHypersalineHabitat / JS. Park, A.G.B. Simpson, Brown, B.C. Cho // Protist. – 2009. - № 160. – P. 265-283.
Patterson, D. J. Heterotrophic Flagellates from coastal marine and hypersaline sediments in Western Auatralia / D.J. Patterson, G.B. Simpson // Protistology. – 1996. - № 32. – P. 423-448.
Горячева, Н. В. Биология свободноживущих бодонид. Биология и систематика низших организмов / Н.В. Горячева – С.-Петербург: Наука, –1978. – C. 112-200.
Park, JS. Characterization of Pharyngomonas kirbyi (= “Macropharyngomonas halophila” nomen nudum), a Very Deep-branching, Obligately Halophilic Heterolobosean Flagellate / JS. Park, AGB. Simpson // Protist. – 2011. - № 20. – P. 19.
Карпов, С. А. Строение клетки протистов / С. А. Карпов – Санкт-Петербург: Тесса, – 2001. – C.56-72.
Карпов, С. А. Система простейших: история и современность. Учебное пособие для студентов-биологов / С.А. Карпов – С.-Петербург: Тесса, – 2005. – C. 46-60.
Ruinen, J. Notizen über Salzflagellaten. II. Über die Verbereitung der Salzflagellaten / J. Ruinen // Arch. Protistenkünde. – 1938. – № 90. – P. 210-258.
Park, JS. Ultrastructure and Phylogenetic Placement within Heterolobosea of the Previously Unclassified, Extremely Halophilic Flagellate Pleurostomum flabellatum (Ruinen 1938) /JS. Park // Protist. – 2007. - №1 58. – P. 397-413.
Entz, G. Die Fauna der Kontinentalen Kochsalzwasser. IV Beschreibung zweier neuer Salzwasser-Protozoen / G. Entz // Mathematische und Naturwissenchaftliche Berichte aus Ungarn. – 1904. – № 19. – P. 115-117.

Скачать: Diplom.doc

Категория: Дипломные работы / Дипломные работы по биологии

Уважаемый посетитель, Вы зашли на сайт как незарегистрированный пользователь.
Мы рекомендуем Вам зарегистрироваться либо войти на сайт под своим именем.

Привет студент