Изучение количественных показателей эритроцитов оптическими методами на фоне дефицита питательных веществ в организме животных

 

Содержание

 

 

Введение. 7

1       Кровь. 10

1.1    Функции крови. 10

1.2    Объем циркулирующей крови. 11

1.3    Физико-химические свойства крови. 12

1.3.1 Осмотическое давление крови. 12

1.3.2 Плотность крови. 14

1.3.3 Вязкость крови. 14

1.3.4 Реакция крови и ее регуляция. 15

1.3.5 Скорость оседания эритроцитов. 21

1.3.6 Возрастные особенности физико-химических свойств крови. 21

1.4    Эритроциты.. 22

1.4.1 Гемоглобин. 24

1.4.2 Жизненный цикл эритроцитов. 26

1.4.3 Особенности энергетики эритроцитов. 27

1.4.4 Разрушение эритроцитов. 28

1.4.5 Изменение концентрации эритроцитов в крови. 30

2       Материалы и методы исследования. 32

2.1    Методика приготовления мазков крови для исследования. 32

2.1.1 Взятие крови. 32

2.1.2 Приготовление мазка крови. 33

2.2    Дифракция эритроцитов на мазке крови. 34

2.2.1 Определение размера эритроцита. 36

2.2.2 Оценка погрешности при определении размеров эритроцитов. 36

2.3    Осмотическая хрупкость эритроцитов. 37

2.3.1 Измерение осмотической хрупкости. 40

2.4    Определение количества эритроцитов. 44

3       Результаты исследований влияния голодания на физико-химические параметры крови  49

3.1    Результаты измерения диаметров эритроцитов. 49

3.2    Результаты измерения количества эритроцитов с помощью камеры Горяева  51

3.3    Результаты исследования осмотической хрупкости эритроцитов. 52

3.4    Нахождение концентрации гемоглобина в крови. 54

Заключение. 56

Список использованных источников. 58

Приложение А.. 62

Приложение Б. 63

Введение

 

 

Главным показателем здоровья человека является составная часть крови. Важным компонентом, которой являются эритроциты.

Актуальность работы заключается в недостаточности исследования воздействия голодания на качественные и количественные показатели крови.

Эритроциты - центральное звено в системе крови по транспорту кислорода. Благодаря наличию в них гемоглобина красные кровяные клетки способны практически без затрат энергии связывать и отдавать кислород. Однако кривая диссоциации гемоглобина не остается постоянной и зависит от физиологического состояния организма, внешних факторов, которые влияют на количество и качество эритроцитов (Рябов С.И., 1971). Гемоглобин, как составная часть эритроцита участвует в сохранении кислотно-щелочного равновесия, поддерживает постоянство pH крови (Surgenor D., Mac N., 1974). Эритроциты участвуют в процессе свертывания крови, транспорта многих питательных веществ, являются носителями агглютиногенов (белков вызывающих выработку антител). Применение в исследованиях новых современных методов позволило существенно расширить и углубить знания о значении и роли красных кровяных клеток. Установлено, что эритроциты принимают участие в процессах иммунитета, переносе нуклеотидов, различных ядов и вирусов, в депонировании, транспортировке и метаболизме гормонов, медиаторов и других биологически активных веществ (Катулина А.П., Терещенко И.П., 1985).

На показатели эритроцитов влияет количество поступления пищи в организм.

С питанием связаны такие чувства, как жажда, голод и насыщение. В связи с тем, что их возникновение не является функцией конкретных органов, они называются общими ощущениями (подобно усталости, половому влечению). Голод — ощущение необходимости приема пищи, которое сопровождается сложным комплексом проявлений, включая не только реакцию органов пищеварения, но и мотивацию поиска пищи.

Субъективным проявлением голода является появление таких неприятных ощущений, как «сосание под ложечкой», «жжения», тошнота, иногда — головокружение, головная боль, общая слабость. В результате формируется поведение, направленное на устранение испытываемого дискомфорта. В связи с биологической значимостью ощущений голода и особенно жажды, связанных с обеспечением выживания особи, они должны удовлетворяться. Хотя указанные мотивации являются врожденными, но в процессе жизни они могут модифицироваться. Это проявляется в способности подавлять их, правда, до определенной степени выраженности. Способность подавлять поведенческую реакцию тем больше, чем выше эволюционная организация животного, чем он становится взрослей. У человека потребление пищи и воды может приспосабливаться к конкретным меняющимся условиям существования.

Можно выделить механизмы кратковременной и долговременной адаптации. Последняя обусловлена соответствующим уровнем обменных процессов, поддержанием необходимой массы тела.

Появление чувства голода связано с формированием возбуждения в соответствующих нервных центрах. В гипоталамусе обнаружены структуры, относимые к центрам голода и насыщения.

Целью работы было: изучить влияние дефицита питательных веществ в организме животных на эритроциты.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

• Определить количество эритроцитов без ограничения в питании и при дефиците питания.
• Измерить диаметр эритроцитов дифракционным способом.
• Измерить осмотическую устойчивость эритроцитов методом спектрофотометрии.
• Определить концентрацию гемоглобина в крови с помощью градуировочной прямой.
• Сравнить экспериментальные данные для цыплят-бройлеров и крыс.

 

1 Кровь

 

 

Кровь является одной из разновидностей соединительных тканей. Межклеточное вещество ее находится в жидком состоянии и называется плазмой. В воде плазмы во взвешенном состоянии «плавает» огромное количество веществ и соединений, а также форменные элементы крови — эритроциты, лейкоциты и тромбоциты. Кровь, состоящая из плазмы и форменных элементов, формируется при взаимодействии многих органов и систем организма. Поддержание необходимого уровня компонентов плазмы зависит от функции печени, почек и функции других органов и тканей, водного режима организма. Форменные элементы образуются в кроветворном красном костном мозге.

 

 

• Функции крови

 

 

Функции крови многообразны, но практически все они связаны с ее циркуляцией по кровеносным сосудам. Благодаря этому кровь выполняет общую транспортную функцию. Каждую из ее разновидностей кровь выполняет совместно с другими органами, входя составной частью в соответствующие функциональные системы организма.

Функции крови:

• Дыхательная функция заключается в связывании и переносе О₂ от легких к тканям и СО₂— из тканей к легким.
• Трофическая функция крови связана с обеспечением всех клеток организма питательными веществами, приносимыми от органов пищеварения или других органов.
• Обеспечение водно-солевого обмена. В артериальной части большинства капилляров жидкость и соли поступают в ткани, в венозной — они возвращаются в кровь.
• Экскреторная функция. Кровь уносит из тканей конечные продукты метаболизма к органам выделения.
• Терморегуляторная функция. Кровь из энергоемких органов уносит тепло, отдавая его поверхностно лежащим органам, теряющим тепло.
• Защитная функция. Кровь является одним из органов, обеспечивающих защиту организма от различных паразитов, бактерий, вирусов и генетически чужеродных клеток и веществ.
• Гемостатическая функция.
• Гуморальная регуляция. Кровь переносит гормоны и другие биологически активные соединения от клеток, где они образуются, к другим клеткам организма. Тем самым обеспечивается химическое взаимодействие между всеми частями организма.

В связи с участием крови в выполнении столь разнообразных функций, а также с участием многих органов в формировании самой крови, врач, анализируя ее состав, может судить о состоянии большинства органов и систем организма. Поэтому современная медицина не обходится без того или иного объема таких исследований. Входя составной частью в разнообразные функциональные системы организма, кровь вместе с нервной системой объединяет органы в единый организм. В то же время можно выделить более узкую, собственную систему крови. К ней, наряду с циркулирующей в сосудах кровью, относятся: органы образования и разрушения форменных элементов, биосинтеза белков и других компонентов плазмы, а также нервные и гуморальные механизмы регуляции состава крови.

 

 

• Объем циркулирующей крови

 

 

Объем циркулирующей в сосудах крови (ОЦК) является одной из констант организма. Однако ОЦК не является строго постоянной величиной для всех людей, он зависит от возраста, пола, функциональных кондиций конкретного человека. Так, у взрослого молодого мужчины ОЦК около 7 % массы тела. У женщин в сосудистом русле крови несколько меньше, чем у мужчин (около 6 % массы тела). У людей, ведущих малоподвижный образ жизни, ОЦК ниже, а у физически тренированных, напротив, выше, чем указанный средний уровень. Например, у спортсменов, способных выполнять физическую нагрузку в течение длительного времени, ОЦК доходит до 10 % массы тела.

У новорожденных крови около 10% массы тела. Лишь к периоду по­лового созревания ОЦК постепенно приходит к уровню у взрослых.

 

 

• Физико-химические свойства крови

 

1.3.1 Осмотическое давление крови

 

 

Различные соединения, растворенные в плазме и в форменных элементах крови, создают в них осмотическое давление. В норме осмотическое давление плазмы крови около 7,6 атм (5700 мм рт. ст., 762 кПа). Осмоти­ческую активность плазмы можно выразить в мОсм/н. Она составляет около 282. Величина осмотического давления определяется количеством растворенных молекул, а не их размерами. Львиная доля (примерно 199/200) ионов плазмы — неорганические ионы. Их количество и определяет величину осмотического давления. Белки плазмы создают онкотнческое давление, равное лишь 0,03-0,04 атм. (25-30 мм рт. ст.). Но в то же время онкотическое давление играет важнейшую роль в регуляции распределения воды между плазмой и тканями. Из общего онкотического давления на альбумины (4,5 г %) приходится 21,8 мм рт. ст., глобулины (2,5 г %) — 6,0 мм рт. ст. и фибриноген (0,3 г %) — 0,2 мм рт. ст.

Участие онкотического давления в регуляции обмена воды обусловлено тем, что стенка обменных сосудов (капилляров) в большинстве органов непроницаема для белков. В тканевой жидкости свободных белков мало, поэтому имеется градиент их концентрации с кровью. В отличие от этого в крови и межклеточной жидкости содержание неорганических или небольших органических молекул, как правило, одинаково. Большее онкотическое давление крови служит основой механизма удержания воды в ней.

Осмотическое и онкотическое давления обеспечивают обмен воды между плазмой крови и форменными элементами. При нарушении осмотического или онкотического давления в плазме или клетках может изме­няться функция клеток крови и продолжительность их жизни. Так, при понижении осмотического давления плазмы вода будет поступать в клетки крови, что при достижении предела растяжимости приведет к разрыву их оболочки — осмотическому гемолизу. Особенно это опасно для эри­троцитов. Разрушение даже части их понизит возможность функциональной системы транспорта О₂.

Но не менее важно и то, что при поступлении в плазму большого количества гемоглобина может сказаться токсическое влияние, как самого гемоглобина, так и продуктов его метаболизма на многие жизненно важные органы (и в первую очередь на почки). Напротив, повышение осмотического давления плазмы приведет к выходу жидкости из клеток, потере упругости, сморщиванию их, как показано на рисунке 1. Это также отрицательно отразится на жизнедеятельности клеток и может привести к их разрушению макрофагами тканей.

 

                                         

Рисунок 1 - Эритроцит (сканирующая микроскопия): а — интактный эритроцит; б — эритроцит в гипертоническом растворе

Регуляция осмотического давления крови. Осмотическое и онкотическое давления плазмы относятся к одним из наиболее контролируемых гомеостатических констант организма, хотя в ряде случаев и они могут несколько изменяться. Ионный и водный составы крови зависят как от обмена ими с тканями, так и от деятельности органов выделения (почки, потовые железы). Эти процессы координируются системами регуляции, в основе которых лежит, главным образом, гормональная регуляция. Уровень этих гормонов и функция органов выделения контролируются при участии осморецепторов, которые активируются при изменении осмотического давления крови и межклеточной жидкости.

Онкотическое давление белков плазмы менее стабильно и во многом определяется активностью процессов биосинтеза белков в печени, их использованием или выделением. Эти процессы при заболевании соответствующих органов нарушаются, что, например, при поражении почек и поступлении белков в мочу может привести к отеку тканей.

 

 

1.3.2 Плотность крови

 

 

За счет наличия растворенных веществ, плотность крови несколько больше, чем воды. Плотность плазмы составляет 1,025-1,034 г/см³, плотность эритроцитов — около 1,09 г/см³, а цельной крови— 1,05-1,06 г/см³.

 

 

1.3.3 Вязкость крови

 

 

Вязкость крови обусловлена тем, что в сосудистом русле она находится в постоянном движении. В результате того, что отдельные слои ее продвигаются с различной скоростью, между ними возникает трение, а к то­му же крайние слои плазмы крови трутся еще и о стенку сосудов. Возникает внутреннее трение, обозначаемое понятием вязкость. Вязкость оказывает сопротивление кровотоку. Величину ее обычно определяют относительно воды, вязкость которой принимается за единицу. Растворение различных соединений, особенно крупных белковых молекул, присутствие форменных элементов увеличивает вязкость крови. Раствор плазмы в 1,7-2,2 раза более вязкий, чем вода. Вязкость цельной крови выше, чем воды, примерно в 5 раз. Основную долю в увеличение вязкости крови привносят эритроциты. Поэтому рост концентрации их в крови повышает вязкость, а анемия — понижает.

 

 

1.3.4 Реакция крови и ее регуляция

 

 

Реакция крови (рН) — обратный логарифм концентрации ионов водорода — обусловлена соотношением в ней водородных и гидроксильных ионов. рН артериальной крови 7,4, а венозной несколько ниже — 7,36. Указанные величины характерны для плазмы крови. Внутри эритроцитов рН колеблется от 7,27 до 7,29, а в клетках большинства тканей — от 6,8 до 7,0. Эти параметры являются одними из наиболее важных гомеостатических параметров, поддержание которых на постоянном уровне обеспечивается многими органами и системами организма. Согласно правилу Гэмбла плазма крови должна быть электронейтральной, то есть сумма катионов равна сумме анионов.

Описание кислотно-основного состояния основано на уравнении Хендерсона — Хассельбаха, в котором рассматривается соотношение трех основных переменных плазмы крови: рН, РСО₂, концентрации НСОз и двух констант (рК и S).

                                                                               (1)

 

где рК — обратный логарифм константы диссоциации угольной кислоты (равный 6,1);

S — константа растворимости двуокиси углерода в плазме (0,03 ммоль/л/мм рт.ст.).

В норме НСОз в плазе составляет 24 ммоль/л, а РСО₂ в артериальной крови — 40 мм рт.ст. Подставив эти цифры в уравнение, получаем указанную выше норму для плазмы артериальной крови — 7,4.

Содержание ионов водорода в плазме крови определяется соотношением между парциальным давлением углекислого газа (РСО₂) и концен­трацией анионов бикарбоната (НСОз). Это соотношение выражается уравнением:

                                                                                   (2)

 

то есть содержание Н⁺ прямо пропорционально уровню PCO₂ и обратно пропорционально концентрации НСОз. (В норме содержание НСОз в крови равно 22-25 мэкв/л).

Изменение концентрации водородных ионов на 1 мэкв/л приводит к изменению рН на 0,01. Следует особо подчеркнуть, что накопление в крови кислых или основных метаболитов буферными системами компенсируется лишь в плане снижения выраженности сдвига рН, но не предотвращает полностью их развития. Подключение к буферным системам таких органов, как легкие и почки, принципиально отличается во времени. Легкие включаются для быстрой компенсации, соответственно задерживая или удаляя углекислоту. Максимум компенсаторных реакций почек главным образом в виде подавления реабсорбции анионов бикарбоната, развивается постепенно, спустя не менее 6-12 часов или даже через несколько дней. Поэтому почечный компонент обеспечивает лишь хронические нарушения метаболизма. Исходя из этого, диктуется необходимость оказания врачебной помощи больному, которая должна быть направлена на поступление ионов противоположного типа, появляющимся в крови.

Постоянство рН крови необходимо для обеспечения нормальной функции большинства органов, их внутриклеточных ферментативных процессов. Многие продукты обмена, в том числе и СО₂, поступая в большом количестве в кровь, могут изменять рН. В норме эти отклонения незначительны. Однако при ряде состояний (интенсивная физическая нагрузка, некоторые виды патологий) они более заметны. Максимально возможные пределы колебания рН— от 6,8 до 7,8. Но эти колебания не должны быть продолжительными, так как само по себе отклонение рН от нормы может привести к гибели организма.

Постоянство кислотно-основного состояния крови (КОС) зависит от взаимодействия нескольких механизмов: активности процессов обмена, буферных свойств крови, газообмена в легких, функции выделительных органов. Так, участие легких обеспечивается выделением или удержанием углекислоты; почки выделяют кислую или щелочную мочу; потовые железы могут выделять некоторые недоокисленные продукты обмена (молочную кислоту); фосфаты могут выделяться через почки и пищеварительный тракт; печень использует молочную кислоту крови для биосинтеза гликогена; сердце использует молочную кислоту в качестве субстрата в окислительных реакциях. В поддержании КОС крови и организма в целом ведущая роль принадлежит хеморецепторам, которые возбуждаются при отклонении рН. В результате запускаются нервно-рефлекторные пути, изменяющие функцию органов.

Буферные системы. Буферные системы крови снижают выраженность сдвига рН крови при поступлении в нее кислых или щелочных продуктов. Они являются первым «рубежом обороны», поддерживающим рН, пока поступившие продукты не будут выведены либо использованы в метаболических процессах.

В крови имеются четыре буферные системы:

• гемоглобиновая;
• бикарбонатная;
• фосфатная;
• белковая.

Каждая из них состоит из двух соединений — слабой кислоты и сопряженного ей сильного основания. Буферный эффект обусловлен связыванием и нейтрализацией поступающих ионов соответствующим соединением буфера. В связи с тем, что в естественных условиях организм чаще всего встречается с поступлением в кровь недоокисленных продуктов обмена, то в буферной паре «кислота — основание» емкость щелочей больше.

Бикарбонатный буфер крови достаточно мощный и наиболее мобильный. Значимость его в поддержании параметров КОС крови возрастает за счет связи с дыханием. Система состоит из Н₂СО₃ и NaHCО₃, находящих­ся в определенной пропорции друг с другом. Принцип ее функционирова­ния заключается в следующем. При поступлении кислоты (например, мо­лочной), которая является более сильной, чем угольная, щелочной резерв обеспечивает реакцию обмена ионами с образованием слабо диссоцииру­ющей угольной кислоты:

.

Синтезировавшаяся угольная кислота пополняет пул, имеющийся в крови, и сдвигает реакцию вправо:

.

Особенно активно этот процесс совершается в легких, где образовавшийся СО₂ сразу выводится. Тем самым создается открытая система бикарбонатного буфера и легких, благодаря которой содержание свободного СО₂ в крови поддерживается на постоянном уровне. Это, в свою очередь, обеспечивает поддержание рН крови на постоянном уровне. В случае поступления в кровь щелочи происходит взаимодействие ее с кислотой буферной системы. Связывание НСОз приводит к дефициту СО₂ и уменьшению выделения его легкими. При этом увеличивается щелочной резерв буфера, что компенсируется ростом выделения NaCl почками.

Буферная система гемоглобина является самой мощной. На ее долю приходится более половины буферной емкости крови. Буферные свойства гемоглобина обусловлены соотношением восстановленного гемоглобина (ННЬ — слабо диссоциирующая кислота) и его калиевой соли (КНЬ). В слабощелочном растворе, каким является кровь, гемоглобин и оксигемоглобин обладают свойствами кислот, будучи донаторами Н⁺ или К⁺. Эта система может функционировать самостоятельно, но в организме она тесно связана с предыдущей. Когда кровь находится в тканевых капиллярах, откуда поступают кислые продукты, гемоглобин выполняет функции щелочи:

В легких гемоглобин, наоборот, ведет себя как кислота, предотвращающая защелачивание крови после выделения углекислоты. Оксигемоглобин — более сильная кислота, чем дезоксигемоглобин. Поэтому гемогло­бин, освобождающийся в тканях от О₂, приобретает большую способность к связыванию Н⁺. В результате венозная кровь может содержать больший объем СО₂ без существенного сдвига рН. Кроме того, в тканях гемоглобин, связывая часть поступающего СО₂ и образуя карбогемоглобин, предотвращает образование угольной кислоты, что также способствует сохранению КОС крови.

Белки плазмы благодаря свойствам аминокислот ионизироваться также выполняют буферную функцию (около 7% буферной емкости крови). В кислой среде они ведут себя, как щелочи, связывая кислоты. В щелочной — напротив, белки реагируют как кислоты, связывая щелочи. Эти свойства белков определяются боковыми группами, способными ионизироваться. Особенно выражены буферные свойства у конечных карбокси- и аминогрупп цепей.

Фосфатная буферная система (около 5 % емкости) образуется неорганическими фосфатами крови. Кислотные свойства проявляет одноосновный фосфат (Н₂РО₄), а щелочные — двухосновный фосфат (НРО₄). Функционируют они по тому же принципу, что и бикарбонаты. Однако в связи с низким содержанием в крови фосфатов емкость этой системы невелика.

Для характеристики КОС крови введен ряд понятий. Буферная емкость — величина, определяемая отношением между количеством ионов Н⁺ или ОН^-, добавленных к раствору, и выраженностью изменения его рН: чем меньше сдвиг рН, тем емкость больше. Сумма анионов всех слабых кислот именуется буферными основаниями (ВВ). Содержание их в крови составляет около 48 м моль/л. Отклонение концентрации буферных оснований от нормы обозначается понятием избыток оснований (BE). Значит, идеальным является BE около 0. В норме возможны колебания в пределах от -2,3 до +2,3 ммоль/л. Сдвиг в положительную сторону именуется алкалозом, а в отрицательную — ацидозом. При алкалозе рН крови становится выше 7,43, при ацидозе — ниже 7,36.

Механизм регуляции КОС крови в целостном организме заключается в совместном действии внешнего дыхания, кровообращения, выделения и буферных систем. Так, если в результате повышенного синтеза Н₂СО₃ или других кислот будут образовываться излишки анионов, то вначале они нейтрализуются буферными системами. Параллельно интенсифицируется дыхание и кровообращение, что приведет к увеличению выделения углекислого газа легкими. Нелетучие кислоты, в свою очередь, выводятся почками или с потом. Напротив, при увеличении содержания в крови щелочей снижается выделение СО₂ легкими (гиповентиляция) и усиливается выделение Н⁺ с мочой. Постоянное поступление кислот или щелочей истощает соответствующую часть буферных систем. Поэтому после прекращения их поступления (например, после прекращения интенсивной физической работы, при которой в кровь выводятся недокисленные продукты обмена) буферная емкость крови спустя какое-то время восстанавливается.

Подключение систем дыхания, кровообращения и выделения к поддержанию КОС обусловлено соответствующими механизмами регуляции функций этих органов. В результате в норме рН крови может измениться лишь на короткое время. Естественно, что при поражении легких или почек функциональные возможности организма, направленные на поддержание должного КОС, понизятся. И теперь в случае появления в крови большего количества кислых или щелочных ионов одни буферные системы, без помощи систем выделения, не удерживают рН на константном уровне, что приведет к ацидозу или алкалозу.

 

 

1.3.5 Скорость оседания эритроцитов

 

 

Если в пробирке поставить кровь, взятую с применением противосвертывающих веществ, то эритроциты, как более тяжелые клетки, постепенно оседают. В клинике в качестве одного из показателей состояния орга­низма широко применяют исследование скорости оседания эритроцитов (СОЭ). В норме СОЭ находится в следующих пределах: до 10 мм/ч у муж­чин, у женщин — до 15 мм/ч. Величина СОЭ во многом зависит от свойств плазмы, от содержания в ней крупномолекулярных белков — глобулинов и фибриногена. Полагают, что крупномолекулярные белки уменьшают электрический заряд эритроцитов, а это снижает их электроотталкивание друг от друга. При различных воспалительных процессах, как правило, концентрация крупномолекулярных белков в крови возрастает, что способствует увеличению СОЭ. В конце беременности содержание фибриногена может возрастать почти в два раза и СОЭ при этом достигает 40-50 мм/ч.

 

 

1.3.6 Возрастные особенности физико-химических свойств крови

 

 

У новорожденных и детей первого года жизни многие физико-химические свойства крови отличаются от взрослых. Так, у новорожденных выше плотность и вязкость крови, что обусловлено главным образом большей концентрацией эритроцитов. К концу первого месяца жизни указанные показатели снижаются и становятся близкими к взрослым или даже несколько меньшими.

Плацентарное кровообращение и особенно роды затрудняют газообмен. Поэтому перед рождением и у новорожденных наблюдается выра­женный ацидоз (рН до 7,13-7,23). При этом снижается емкость буферных оснований. В течение первых часов (или суток) после рождения ацидоз постепенно ликвидируется.

У новорожденных концентрация белков плазмы ниже (50-56 г/л). Уровня взрослых белки плазмы крови достигают лишь к 3-4 годам. Для новорожденных характерна высокая концентрация γ-глобулина иммунных тел, получаемых от матери. К концу третьего месяца содержание их снижается, но в последующем за счет образования собственных антител начинает постепенно увеличиваться. Концентрация α- и β-глобулинов достигает уровня взрослых к концу первого года жизни. При старении большинство показателей, характеризующих физико-химические свойства крови (рН, осмотическое давление, концентрация натрия и калия, вязкость крови), остаются постоянными. Другие показатели могут изменяться. Так, повышается СОЭ, осмотическая резистентность эритроцитов, снижается гематокрит, абсолютная и относительная концентрация альбуминов (в связи с малым изменением уровня глобулинов альбуминово-глобулиновый коэффициент уменьшается).

 

 

• Эритроциты

 

 

В крови у мужчин содержится 4,5-5,0-10¹²/л эритроцитов, у женщин — примерно на 0,55-10¹²/л меньше. Снижение концентрации эритроцитов ниже нормы называется эритроцитопенией (анемией), а увеличение — полиглобулией (полицитемией). Общий объем эритрона (сумма всех эритроидных элементов костного мозга и крови) в крови взрослого человека около 2000-3500 см³, а суммарная поверхность, которая во многом определяет выполнение почти всех ее функций, — 3000-3800 м², что в 1500-2000 раз больше кожного покрова. Циркулируя в крови между легкими (малый круг кровообращения) и тканями (большой круг), эритроцит выполняет свою основную — газотранспортную — функцию. Кроме того, он участвует: в регуляции КОС организма, агрегатного состояния крови, в белковом, липидном, водно-солевом обмене. Некоторые вещества способны вступать в легко обратимую связь со встроенными в мембрану молекулами и проходить через нее внутрь либо транспортироваться на мембране. За счет последнего типа связи эритроцит выполняет транспортную функцию. В связи с тем, что содержание этих веществ в эритроците может быть достаточно высоким, достигается высокая концентрация их и эритроцит выполняет концентрационную функцию для многих биологически активных веществ (например, для факторов свертывания крови, инсулина, ряда аминокислот и т. д.).

Эритроцит — яркий представитель узко специализированной клетки. Его округлая двояковогнутая форма, имеющая диаметр около 7,5 мкм, прекрасно способствует выполнению своей функции. Благодаря тому, что зрелый эритроцит лишен ядра, площадь его поверхности увеличилась, а расстояние от мембраны до самой отдаленной точки нахождения гемоглобина резко уменьшилось (максимум 1,2-1,5 мкм). Это обеспечивает хоро­шие условия газообмена. Кроме того, безъядерность при эластичной мем­бране позволяет эритроциту легко скручиваться и проходить через капил­ляры, имеющие диаметр, порой почти в 2 раза меньший, чем у клетки.

Большую роль в обеспечении жизнеспособности эритроцитов и выполнении их функций играет их эластичная мембрана. Ее толщина около 10 нм. Мембрана эритроцита примерно в миллион раз более проницаема для анионов, чем для катионов. Одним из важнейших периферических белков мембраны эритроцита является, так называемый, спектрин. Вместе с другими периферическими белками спектрин образует цитоскелет эритроцита, который, с одной стороны, обеспечивает сохранение формы, а с другой — придает эластичность плазматической мембране. Он составляет около 75 % всех белков цитоскелета эритроцита.

Газотранспортная функция эритроцитов. Наиболее важной функцией эритроцитов является транспорт кислорода, так как эта функция в организме человека выполняется практически только эритроцитами. Данная функция обусловлена наличием в нем кислородтранспортного белка — гемоглобина (34 % общего и 90 % сухого веса эритроцита). В 1 л крови находится 140-160 г гемоглобина. В норме среднее содержание Hb в одном эритроците у женщин 32-33 пг, а у мужчин — 36-37 пг.

Факторы, влияющие на физиологические параметры эритроцитов:

• возраст (у новорожденных животных количество эритроцитов в крови всегда больше , чем у взрослых);
• физические нагрузки (чем больше потребность организма в кислороде и питательных веществах, тем больше эритроцитов содержится в крови);
• заболевания (уменьшение количества эритроцитов ниже нормы - эозинопения);
• климатических условия (при подъеме в горы число эритроцитов увеличивается);
• питание.

 

 

1.4.1 Гемоглобин

 

 

Заключение гемоглобина внутрь специализированной клетки — эритроцита относится к существенному эволюционному приобретению. Если бы гемоглобин находился в крови в свободном состоянии, то это привело бы к ряду значительных нарушений: во-первых, большое количество свободного гемоглобина оказывает токсическое воздействие на многие ткани (нейроны, почки); во-вторых, в русле крови гемоглобин быстро окисляется в метгемоглобин, а в эритроците есть системы, препятствующие этому; в-третьих, тот уровень гемоглобина, который необходим для транспорта достаточного количества О₂, должен был бы резко повысить вязкость крови и затруднить работу сердца по продвижению ее через сосудистое русло, в то время как присутствие эритроцитов увеличивает вязкость лишь в 2-2,5 раза.

Гемоглобин участвует в транспорте газов, образуя различного рода соединения с ними. Гемоглобин, присоединивший кислород, превращается в оксигемоглобин (Hb О₂) ярко-алого цвета. Гемоглобин, отдавший в тканях кислород, именуется восстановленным или дезоксигемоглобином (НHb), имеющим более темный цвет. В венозной крови часть гемоглобина присоединяет СО₂ карбгемоглобин (HbСО₂). В оксигемоглобине железо гема остается двухвалентным. При действии других окислителей железо гема превращается в трехвалентное. Иногда и с О₂ образуется прочное соединение — метгемоглобин (MtHb). В норме метгемоглобин образуется в ничтожных количествах, чему препятствуют соответствующие ферменты, содержащиеся в эритроцитах.

При наличии во вдыхаемом воздухе угарного газа образуется прочное соединение карбоксигемоглобин (HbСО). Сродство гемоглобина к СО в сотни раз превышает сродство к О₂, и поэтому при отравлении угарным газом резко ухудшается возможность транспорта кислорода. Однако при дыхании свежим воздухом, а еще лучше — чистым кислородом СО медленно, но отщепляется, и кислородтранспортная функция гемоглобина восстанавливается.

Гемоглобин начинает синтезироваться еще на стадии базофильных эритробластов. Заканчивается биосинтез гемоглобина в ретикулоцитах уже в русле крови. В зрелом эритроците содержание гемоглобина постоянно. Оно может лишь уменьшаться при частичном гемолизе за счет выхода из эритроцита, что в норме практически не встречается. Существенную роль в биосинтезе гемоглобина играют витамины В12, фолиевая кислота и микроэлемент Fe , входящий в простетическую группу (гем). Белковая часть гемоглобина — глобин состоит из 4 цепей. Эритроциты взрослого человека со­держат 2 α- и 2 β-цепи. Такой гемоглобин именуется АНЬ. В крови плодов имеется FHb, имеющий 2 α- и 2 β-цепи. FHb отличается по способности транспортировать кислород. Он имеет более высокое сродство к кислороду. Поэтому в крови плода, несмотря на более низкое РО₂, образуется доста­точно большое количество оксигемоглобина. Перед рождением эритроциты с FHb из крови постепенно исчезают, заменяясь на содержащие АНb.

Структура глобина оказывает влияние и на устойчивость, резистентность эритроцитов. К примеру, эритроциты с FHb менее стойки и активно разрушаются в русле крови при легочном дыхании. Особенно значительно меняется устойчивость мембраны, и даже форма эритроцита, при наличии патологических типов гемоглобина — S, С и т. д. Эти разновидности ге­моглобина особенно часто встречаются у жителей экваториальных стран.

 

 

1.4.2 Жизненный цикл эритроцитов

 

 

Циркулирующий в крови зрелый эритроцит является дифференцированной тупиковой клеткой, не способной к дальнейшей пролиферации, как показано на рисунке 1. Клеткой его можно назвать сложно, так как он лишен одного из основных атрибутов клетки — ядра. Ядра содержат лишь предшественники эритроцитов — эритробласты костного мозга. При созревании ядро выталкивается через мембрану. Эритроцит в кровотоке способен циркулировать в течение 100-120 дней. После этого он погибает. Таким образом, в сутки обновляется около 1 % эритроцитов. Об интенсивности эритропоэза свидетельствует содержание в крови молодых эритроцитов — ретикулоцитов (от лат. rete — сеть, которая появляется при окраске особыми красителями. Основой ее являются иРНК). После выхода из костного мозга в русле крови в виде ретикулоцитов они сохраняются около суток. Поэтому их концентрация в крови около 0,8-1% всех эритроцитов.

Активация эритропоэза сопровождается увеличением числа ретикулоцитов в крови. Но в любом случае эритропоэз может стать интенсивнее не более чем в 5-7 раз по сравнению с исходным уровнем. То есть, если в обычных условиях за сутки производится около 25000 эритроцитов на каждый 1 мкл крови, то при самом интенсивном эритропоэзе из костного мозга в русло крови может поступить до 150000 эритроцитов в 1 мкл. Су­щественных запасов (депо) эритроцитов в организме человека практически нет. Поэтому ликвидация анемии (после кровопотери) происходит лишь за счет усиления эритропоэза. Но необходимо учитывать, что значительное увеличение образования эритроцитов в костном мозге начнется лишь спустя 3-5 дней. В периферической крови это станет заметным еще позднее. В результате после кровопотери или острого гемолиза для восстановления уровня эритроцитов до нормального требуется достаточно много времени (не менее 2-3 недель).

Эритропоэз становится более активным и при подъеме на высоту, за счет чего содержание эритроцитов и гемоглобина растет. У жителей гор наблюдается следующая зависимость: с каждым километром высоты концентрация эритроцитов возрастает на 0,7510¹²/л.

 

 

1.4.3 Особенности энергетики эритроцитов

 

 

Для выполнения газотранспортной функции эритроцит почти не расходует энергию (АТФ). Поэтому АТФ в нем образуется лишь в небольшом количестве. При практическом отсутствии митохондрий АТФ синтезируется за счет гликолиза. Используется также и пентозофосфатный путь, побочным продуктом которого является 2,3-дифосфоглщерат (2,3-ДФГ), участвующий в регуляции сродства гемоглобина к О₂. Это соединение находится в эритроците в трех формах: свободной, связанной с гемоглобином или с мембраной клетки. На фракцию связанного с мембраной, которая является основным источником свободной его формы, приходится около 30 % всего количества. Связанный с гемоглобином 2,3-ДФГ способствует ускорению дезоксигенации гемоглобина. Связь 2,3-ДФГ с гемоглобином возрастает под влиянием гипоксии, закисления крови. Таким путем внутри эритроцита осуществляется авторегуляция процесса доставки кислорода к тканям.

АТФ, синтезируемая в эритроците, расходуется:

• на поддержание эластичности мембраны;
• поддержание ионных градиентов;
• обеспечение некоторых биосинтетических процессов;
• восстановление метгемоглобина.

 

 

1.4.4 Разрушение эритроцитов

 

 

Жизненный цикл эритроцитов заканчивается их разрушением (гемолизом). В русле крови активность гемолиза эритроцитов обычно невелика, состарившиеся клетки погибают главным образом в макрофагальной системе (в основном в селезенке). Эти процессы, согласно рисунку 2, зависят от изменения свойств, как самого эритроцита, так и плазмы крови.

Внутри эритроцитов содержание белков намного выше, а низкомолекулярных веществ, напротив, меньше, чем в плазме. Суммарное осмотиче­ское давление, создаваемое высокой концентрацией белков и низкой концентрацией солей, внутри эритроцита несколько выше, чем в плазме. Это обеспечивает нормальный тургор эритроцитов. В связи с тем, что мембрана его для белков непроницаема, основным механизмом, обеспечивающим об­мен воды между эритроцитом и плазмой, являются низкомолекулярные ионы. Так, при повышении в крови концентрации низкомолекулярных сое­динений, которые легко проникают в эритроциты, внутри них осмотическое давление увеличивается. В результате вода поступает внутрь эритроцитов, они набухают и могут лопнуть. Произойдет осмотический гемолиз. Это может наблюдаться, например, при уремии за счет увеличения содержания в крови мочевины.

 

Рисунок 2 - Жизненный цикл эритроцитов

 

В ряде случаев в эритроците может нарушаться образование АТФ. При этом снижается скорость выкачивания ионов (работа ионных насосов), что приведет к увеличению концентрации ионов внутри клеток. Это также приведет к осмотическому гемолизу. Гемолиз наступает и в гипотоническом растворе. Мерой осмотической стойкости (осмотической рези­стентности) эритроцитов является концентрация NaCl в растворе, при которой происходит гемолиз. В норме гемолиз наименее стойких эритроцитов (минимальная резистентность) начинается при концентрации NaCl 0,4%, а в растворе 0,34% (максимальная резистентность) разрушаются все эритроциты. При некоторых заболеваниях осмотическая стойкость эритроцитов снижается, и гемолиз наступает при большей концентрации раствора.

При старении эритроцитов активность метаболических процессов снижается. В результате мембрана клеток постепенно теряет эластичность, и когда эритроцит проходит некоторые наиболее узкие участки сосудистого русла, то он в них может застревать. Одним из таких участков является селезенка, где расстояние между трабекулами около 3 мкм. Здесь эритроциты разрушаются, а их осколки, гемоглобин фагоцитируются макрофагами. Часть эритроцитов может разрушаться в русле крови. При этом вышедший в плазму гемоглобин соединяется с α₂-гликопротеином плазмы (гаптоглобином). Образующийся комплекс не проникает через мембрану почек и поступает в печень, селезенку, костный мозг. Здесь он распадается, а поступив в печень, превращается в билирубин. При поступлении в кровь большого количества гемоглобина часть его фильтруется в почечных канальцах. Здесь он может: выводиться с мочой, разрушаться либо возвращаться в кровоток, откуда затем поступать в печень.

 

 

1.4.5 Изменение концентрации эритроцитов в крови

 

 

Анемия. Снижение концентрации эритроцитов может быть следствием:

• повышенного гемолиза;
• кровопотери;
• ослабления или полного прекращения эритропоэза.

Следствием анемии является гипоксия.

Полиглобулия (полицитемия). Состояние противоположное анемии — полицитемии наблюдается при повышении концентрации эритроцитов выше 5,0 млн/мкл. Можно выделить два типа полиглобулии:

• физиологическая — обусловлена стимуляцией эритропоэза в ответ на пребывание человека в горах;
• патологическая («истинная»).

Последняя развивается вследствие ненормального возрастания образования эритроцитов в костном мозге. Это разновидность лейкоза. Более редко полиглобулия развивается в связи с гиперпродукцией эритропоэтина в почках (при их опухоли).

Рост концентрации эритроцитов приводит к увеличению вязкости крови. А это, в свою очередь, приводит к росту сопротивления кровотоку в сосудах микроциркуляторного русла. И здесь возникает несколько условий, изменяющих кровообращение.

Возрастание сопротивления кровотоку приводит к повышению нагрузки на сердце, особенно на левый желудочек (микроциркуляторные сосуды малого круга кровообращения имеют значительно больший диаметр, а значит, на них меньше сказывается возрастание вязкости крови). Согласно эффекту Анрепа, рост сопротивления приводит к более мощному сокращению желудочка. Но высокая вязкость может привести к снижению венозного возврата крови к сердцу, а значит, к снижению силы систолы желудочка. Однако при полиглобулии, как правило, резко увеличивается общий объем крови, что приведет к возрастанию венозного возврата. То есть в данном случае конечный результат зависит от исхода «борьбы» противоположных механизмов. И чаще всего у таких больных ударный объем сердца так же, как и артериальное давление, может оставаться в пределах нормы (если не присоединяются какие-либо сопутствующие нарушения системы кровообращения).

 

 

2 Материалы и методы исследования

 

 

Экспериментальные исследования проводились на базе экспериментально биологической клиники ФГБОУ «Оренбургский государственный университет» на крысах-самцах линии Wistar. Для эксперимента было отобрано 10 крыс живой массой 250±10 г. В течение 7 суток крысы находились в условиях подготовительного периода, после его окончания животных разделили на 2 группы: контрольная и опытная. Контрольная группа полноценный рацион, а опытная находилась на воде.

В процессе проведения для оценки намеченных параметров проводился отбор крови у контрольных и опытных крыс.

 

 

2.1       Методика приготовления мазков крови для исследования

 

2.1.1 Взятие крови

 

 

При взятии крови животных надежно фиксируют, потом выстригают или выбривают волосяной покров, протирают кожу спиртовым раствором эфира. Стерильной иглой прокалывают кожу, стенку сосуда и набирают соответствующее количество крови в стерильную колбочку или пробирку.

У кур небольшие порции крови берут, надрезая гребень или сережки. Большое количество крови в птицы берут из подкожной подкрыльцевой вены. При этом перо выдергивают, вену сдавливают пальцем в участке локтевого сустава, прокол делают под углом локтевого изгиба.

В связи с быстрым сворачиванием крови в птицы место прокола вены протирают антикоагулянтом. При этом капли крови, которые выступили, переносят пипеткой в бюкс с антикоагулянтом. После взятия крови место пункции на несколько минут зажимают тампоном, смоченным дезинфицирующей жидкостью.

У белых крыс для получения 0,5—1 мл крови приходится прибегать к ампутации кончика хвоста после продолжительного прогревания его в воде температуры 45—50°С или протирания ксилолом. Взяв кровь, рану прижигают перекисью водорода.

 

 

2.1.2    Приготовление мазка крови

 

 

Помещаем небольшую каплю крови на предметное стекло, с помощью стеклянной капиллярной пипетки (или непосредственно из места укола), перенесите выступившую каплю крови на конец стерильного предметного стекла. Следует избегать при этом всякого контакта между проколотым участком кожи и стеклом. Оставляем стекло в горизонтальном положении.

Размазываем каплю крови по стеклу с помощью чистого шлифованного стекла, помещая его под углом 45°; коротким ребром, подождав, пока вся кровь расплывется по нему.

 

Рисунок 3 - Расположение шлифованного стекла к предметному под углом 45°

Рисунок 4 – Растекание крови между шлифованным и предметным стеклами

 

Как только кровь растеклась по ребру, быстрым движением от капли проводим по предметному стеклу. Не следует сильно нажимать на стекло, так как при этом травмируются форменные элементы крови.

 

Рисунок 5 – Перемещение шлифованного стекла по предметному

 

 

2.2       Дифракция эритроцитов на мазке крови

 

 

Нормальный эритроцит по своей форме похож на двояковогнутую линзу со средней толщиной около 2 мкм и диаметром около 8,5 мкм. В мазке крови на стекле он лежит, как плоский диск. Внутри эритроцит содержит белок гемоглобин, который сильно поглощает свет. Поэтому как оптический объект одиночный эритроцит в первом приближении представляет собой непрозрачный диск, размеры которого сопоставимы с длиной волны.

На рисунке 6 показана соответствующая дифракционная картина, которая имеет вид чередующихся светлых и темных концентрических колец с ярким пятном – нулевым максимумом в центре. Если число эритроцитов на мазке велико, и они расположены случайным образом друг относительно друга, то картина не изменяется.

 

Рисунок 6 – Дифракционная картина эритроцитов

 

Экспериментально точнее измерять не радиусы ярких колец, а радиусы r₁, r₂ темных колец. Как показывают результаты точного решения, соответствующие им углы дифракции определяются формулами (для соответственно 1-го и 2-го минимумов):

 

                    ,                    (3, 4)

 

где D – диаметр эритроцитов.

Синус соответствующего угла дифракции вычисляется по формуле:

 

                           ,                                    (5)

где l – расстояние от образца до экрана.

2.2.1    Определение размера эритроцита

 

 

Установили на штативе вместо дифракционной решетки стекло с мазком крови [12]. Перемещая образец в плоскости, перпендикулярной лазерному лучу, находили место на краю мазка, для которого получается наиболее четкая дифракционная картина из светлых и темных колец – чередующихся максимумов и минимумов различных порядков.

Измерили радиусы середины темных колец. Расчет размера эритроцита производится по формулам (3, 4).

Если виден максимум только первого порядка, то надо трижды определить радиус кольца в разных направлениях и рассчитать три значения диаметра эритроцита.

 

                          ,                             (6)

 

где i=1,2,3;

     L – расстояние между покровным стеклом и дифракционной картиной;

     r_i – радиус кольца.

 

 

2.2.2    Оценка погрешности при определении размеров эритроцитов

 

 

Среднее значение диаметра подсчитывается по формуле:

 

                                     .                                        (7)

 

Среднеквадратическая ошибка данного измерения:

 

                                .                                    (8)

 

Доверительный интервал среднего арифметического измеряемой величины рассчитывается по формуле:

 

                                  ,                                      (9)

 

где t_n,p = 4,3 – коэффициент Стьюдента для n = 3 и доверительной вероятности, равной 0,95.

Окончательный результат записывается в виде:

 

                                  .                                    (10)

 

Относительная погрешность:

 

                                  .                                   (11)

 

 

2.3       Осмотическая хрупкость эритроцитов

 

 

Эритроциты млекопитающих в плазме крови или свежевыделенные эритроциты в изотоническом солевом растворе представляют собой двояковогнутые диски – дискоциты, как показано на рисунке 7. Дискоциты напоминают наполовину спущенную камеру футбольного мяча. Спущенный мяч можно надуть до объема сферы, если же продолжать надувать мяч, то он лопнет. Сходный процесс можно выполнить на эритроците-дискоците. Объем дискоцита можно увеличить до сферической формы без изменения площади поверхности мембраны. Если продолжать процесс "надувания" эритроцита далее, то для этого нужно уже увеличивать площадь поверхности мембраны.

 

Рисунок 7 – Набухание и лизис эритроцитов в гипотоническом солевом растворе

 

Но клеточные мембраны практически нерастяжимы, поэтому в мембране возникает механическое напряжение, она лопается и внутриклеточный гемоглобин выходит наружу, то есть происходит гемолиз.

"Избыток" площади поверхности по отношению к объему имеет очень большое значение для эритроцитов. Этим клеткам приходится в процессе циркуляции проходить через узкие капилляры. При этом на клетки оказывается значительное механическое воздействие. Однако благодаря дисковидной форме клетки легко выдерживают деформации, так как меняется только форма эритроцитов, но не происходит механическое растяжение мембраны. "Надуть" дискоцит до формы сфероцита с последующим разрывом мембраны легко. Для этого нужно воспользоваться тем, что биологические мембраны обладают очень резко отличающейся проницаемостью для разных веществ.

Плотность потока (J_м) диффундирующего через мембрану вещества определяется коэффициентом проницаемости (P) и разностью концентраций этого вещества в растворах, омывающих мембрану (C₁–C₂):

 

                               .                                 (12)

 

Основой любой мембраны является липидный бислой. Из значений коэффициентов проницаемости липидного бислоя для разных веществ, видно, что легче всего через бислой проходит вода, тогда как для катионов значения коэффициентов проницаемости примерно на 12 порядков ниже. В мембранах эритроцитов за счет наличия белковых каналов проницаемость для катионов примерно на два порядка выше, чем для чисто липидного бислоя.

Все же проницаемость мембраны эритроцитов для ионов и для воды очень сильно отличается. При помещении эритроцитов в гипотоническую среду в клетки в первую очередь входит вода, чтобы разбавить внутреннее содержимое и выровнять осмотическое давление внутри клетки и снаружи. Сначала при набухании эритроцита площадь мембран не меняется, растет только объем. Но после достижения сферической формы дальнейшее увеличение объема без увеличения площади цитоплазматической мембраны становится невозможным. На рисунке 7 видно, как мембрана растягивается, разрывается, гемоглобин выходит наружу – получаются "тени" эритроцитов.

При помещении эритроцитов в воду весь процесс от начала набухания до разрыва мембраны не превышает двух секунд. С уменьшением осмолярности среды объем эритроцитов увеличивается практически линейно. В среднем для превращения дискоцита в сфероцит объем должен увеличиться в 1,8 раза. Но эритроциты гетерогенны, они отличатся по возрасту и другим параметрам. Поэтому для каждой отдельно взятой клетки для достижения сферической формы объем может увеличиваться не только в 1,8 раза, но и чуть меньше или чуть больше. Для каждого эритроцита можно подобрать такую осмолярность среды, чтобы клетка только достигла формы сфероцита без разрыва мембраны.

Обычно осмотическую хрупкость определяют, помещая эритроциты в раствор поваренной соли. Изотононическим является 0,9%-ный раствор NaCl, в нем эритроциты не набухают и остаются дискоцитами. Минимальное значение концентрации NaCl, еще не приводящее к осмотическому гемолизу, является мерой осмотической хрупкости. Эритроциты в крови каждого индивидуума по критерию осмотической хрупкости распределены по нормальному закону (закону Гаусса). Поэтому одним из главных параметров, характеризующих клетки в суспензии, является среднее значение осмотической хрупкости, численно равное концентрации NaCl, при которой лизирует 50% клеток. Эту величину мы будем называть "осмотической хрупкостью".

 

 

2.3.1    Измерение осмотической хрупкости

 

 

Обычно используют упрощенную схему опыта. Несколько капель крови разбавляют в нескольких миллилитрах 0,9 %-ного NaCl, при этом стаканчик с физраствором покачивают так, чтобы кровь быстро перемешивалась. В этом случае сворачивание не происходит, и не нужно использовать цитрат натрия. Обычно для определения осмотической хрупкости эритроцитов кровь разводят в сотни или даже тысячи раз, поэтому плазма разводится очень сильно и эритроциты можно не отмывать центрифугированием. Присутствие следов плазмы мало влияет на результаты опыта. Полученную суспензию эритроцитов используют для определения осмотической хрупкости.

Для этого небольшие объемы суспензии эритроцитов смешивают с растворами NaCl разной концентрации, как это показано на рисунке 8, а. Далее в каждом из растворов следует определить, какая доля клеток осталась нелизированной по сравнению с контрольной пробой (суспензией в изотоническом 0,9 %-ном NaCl).

Исходную суспензию эритроцитов в изотоническом растворе разводят в одно и то же число раз различными гипотоническими растворами NaCl. Сразу после этого полученные образцы центрифугируют. Клетки оседают, для анализа используют надосадочную жидкость, представляющую собой раствор вышедшего из клеток гемоглобина. В спектрофотометре измеряют спектры поглощения полученных образцов надосадочной жидкости. Измерение поглощения монохроматического света проводят, сравнивая интенсивность ослабленного образцом пучка света (I) с интенсивностью падающего пучка света (I_o).

 

                    а                                                  б

Рисунок 8 – Схема типичного опыта по определению осмотической хрупкости эритроцитов (а) и вид суспензии нативных эритроцитов (дискоцитов) в изотоническом солевом растворе (б)

 

Поглощение света описывается законом Бугера-Ламберта-Бера:

 

                                   ,                                     (12)

 

где  ε – молярный коэффициент поглощения, л/(моль⋅см);

n – концентрация исследуемого вещества, моль/л;

l – толщина кюветы с раствором.

Количество вещества обычно определяют по оптической плотности раствора (D):

 

                            .                             (13)

 

Зависимость D от длины волны называют спектром поглощения. Спектр поглощения раствора гемоглобина показан на рисунке 9, б (нижняя кривая). Для количественного определения гемоглобина можно измерять оптическую плотность в любом из максимумов поглощения.

 

                    а                                                  б

1 – контрольный образец; 2 – эритроциты облучены УФ-излучением (366 нм) в присутствии 0,1 мМ псоралена и 1 час инкубировались при 37 градусов

 

Рисунок 9 – Кривые осмотической хрупкости эритроцитов (а) и спектры поглощения суспензии эритроцитов и полученного в результате гемолиза этих эритроцитов раствора гемоглобина (б)

 

Здесь важно учитывать то обстоятельство, что наивысшая точность определения оптической плотности получается в интервале ее значений 0,2–0,8. Для определения доли устойчивых клеток n сравнивают оптические плотности образцов надосадочной жидкости, полученных в результате суспендирования эритроцитов в 0,9 %-ном NaCl (D_0,9, нет осмотического гемолиза), в дистиллированной воде (D₀, полный лизис всех клеток в суспензии) и в каком-либо гипотоническом растворе NaCl (D_n, опытный образец, в котором произошел осмотический лизис части клеток) по формуле:

 

                              .                                (14)

 

Спектрофотометрический анализ дает хорошую точность измерений, но требует использования центрифуги и спектрофотометра.

Самый простой и быстрый метод определения доли осмотически устойчивых клеток – регистрация мутности суспензии эритроцитов. На рисунке 9, б приведены два спектра поглощения: верхняя кривая – спектр эритроцитов; нижняя – спектр гемоглобина, полученного в результате гемолиза эритроцитов. Содержание гемоглобина в обоих образцах одинаково. Раствор гемоглобина ослабляет свет только за счет поглощения части падающих на него фотонов, поэтому оптическую плотность раствора можно назвать оптической плотностью поглощения (D_погл). Видно, что при длинах волн более 600 нм гемоглобин совсем не поглощает свет и D_погл = 0. Другая ситуация наблюдается для суспензии эритроцитов. В этом случае D при всех длинах существенно выше нуля. Причина этого заключается в том, что эритроциты способны не только поглощать, но и рассеивать свет. В результате светорассеяния часть фотонов не доходит до фотоэлемента. Способность эритроцитов рассеивать свет практически не зависит от длины волны. Получается, что при длинах волн более 600 нм (красный свет) оптическая плотность суспензии обусловлена только рассеянием (D = D_рас), тогда как при длинах волн менее 600 нм – рассеянием и поглощением (D = D_рас + D_погл). Таким образом, оценив ослабление красного света, можно определить концентрацию неповрежденных эритроцитов в суспензии, так как получающиеся после гемолиза тени эритроцитов свет практически не рассеивают.

 

 

2.4 Определение количества эритроцитов

 

 

В настоящее время для определения количества эритроцитов (RBC, red blood cell) используют два метода: подсчет эритроцитов в счетной камере Горяева и с помощью автоматических счетчиков и анализаторов [21].

Мы делали подсчет в счетной камере. Подсчет форменных элементов проводят под микроскопом в строго определенном количестве квадратов камеры Горяева, после чего делают пересчет числа эритроцитов на 1 мкл и 1 л крови с учетом объема квадратов и разведения крови.

Для подсчета эритроцитов берут 0,02 мл крови, разведенной в 200 раз в 4,0 мл изотонического раствора натрия хлорида или раствора Гайема (смесь ртути хлористой, натрия сульфата, натрия хлорида и дистиллированной воды).

Счетная камера представляет собой толстую стеклянную пластину (предметное стекло) с углублением в центре, равным 0,1мм, как показано на рисунке 10. На дне камеры нанесены 2 сетки Горяева, разграниченные поперечной канавкой. Сбоку от сеток расположены стеклянные прямоугольные пластины, к которым притирается шлифованное покровное стекло.

Рисунок 10 - Камера Горяева

 

Каждая сетка Горяева, как показано на рисунке 11, состоит из 225 больших квадратов, 25 из которых разделены еще на 16 малых квадратов каждый. Сторона большого квадрата равна 0,2 мм, сторона малого квадрата — в 4 раза меньше (0,05 мм). Соответственно, площадь большого квадрата составляет 0,04 мм² (4x10^-2 мм²), малого квадрата — 0,0025 мм² (25x10^-4 мм²).

Рисунок 11 - Сетка Горяева для подсчета форменных элементов

 

Если учитывать глубину камеры, равную 0,1 мм, то объем одного малого квадрата сетки Горяева составит 2,5x10^-4 мкл.

Перед заполнением кровью счетную камеру и покровное стекло тщательно протирают и высушивают. Мякотью больших пальцев покровное стекло плотно прижимают к боковым пластинам камеры и слегка передвигают его вверх и вниз до тех пор, пока не появятся радужные полосы (“ньютоновые кольца”). Только в этом случае соблюдается должный объем камеры.

Перед заполнением камеры взвесью крови в изотоническом растворе или растворе Гайема содержимое пробирки несколько раз встряхивают. Пипеткой набирают небольшой объем взвеси крови и выпускают 1–2 капли на фильтровальную бумагу. После этого подносят каплю разведенной крови к краю покровного стекла, следя за тем, чтобы кровь равномерно заполняла всю поверхность камеры с сеткой, не затекая в боковые бороздки. Если это случится, взвесь крови удаляют фильтровальной бумагой.

После заполнения камеры ее оставляют на 1–2 минуты в горизонтальном положении для оседания эритроцитов.

Подсчет эритроцитов проводят при малом увеличении микроскопа (например объектив 8x, окуляр 10x), в несколько затемненном поле зрения (при прикрытой диафрагме и опущенном конденсоре).

Эритроциты подсчитывают в 5 расположенных по диагонали сетки квадратах, разделенных на малые, т. е. в 80 малых квадратах. Для этого под микроскопом находят верхний левый квадрат сетки (разделенный на 16 малых) и подсчитывают число эритроцитов в нем. При этом целесообразно придерживаться определенной последовательности подсчета эритроцитов: передвигаться из одного малого квадрата в другой по горизонтали, например, один ряд справа налево, другой ряд слева направо и т. д., как показано на рисунке 12, а.

В каждом малом квадрате подсчитывают эритроциты, находящиеся внутри него, а также расположенные, например, на левой и верхней границе квадрата, пропуская эритроциты, лежащие на нижней и правой границе как показано на рисунке 12, б. Это позволяет добиться того, чтобы форменные элементы, расположенные на границе квадратов, не попали в счет дважды.

 

 

Рисунок 12 - Методика подсчета эритроцитов в больших (а) и малых (б) квадратах сетки Горяева

 

Количество эритроцитов в 1 мкл (1 мм³) крови рассчитывают по следующей формуле:

 

X = a x 200/b x 80,                                    (15)

 

где Х — число эритроцитов в 1 мкл крови;

а — число сосчитанных эритроцитов;

b — объем малого квадрата (2,5x10^-4мкл);

200 — разведение крови;

80 — число малых квадратов, в которых производился счет.

Введя в эту формулу значение объема одного малого квадрата сетки Горяева, получим упрощенную формулу:

 

(16)

                                  

    

Количество эритроцитов в 1 мкл (Х) равно числу форменных элементов крови, подсчитанных в 80 малых квадратах, умноженному на 10⁴:                      

                              

                                                                                     (17)

 

Например, в 5 больших квадратах (80 малых) сосчитано 456 эритроцитов. Тогда количество эритроцитов в 1 мкл составит 4560000, или примерно 4,5x10⁶/мкл. Учитывая, что в 1 л жидкости содержится 10⁶ мкл, число подсчитанных эритроцитов можно выразить следующим образом: 4,5x10¹² /л.

 

 

3 Результаты исследований влияния голодания на физико-химические параметры крови

 

3.1  Результаты измерения диаметров эритроцитов

 

 

Бралась кровь у 12 цыплят. Затем по дифракционной картине с мазков крови находился диаметр эритроцитов. Наблюдалась дифракция на эритроците как на круглом непрозрачном диске. Цыплят кормили сбалансированной пищей.

После взятия крови у контрольной группы цыплят посадили на диетическую пищу – рис.

Затем через 3 недели бралась кровь у опытной группы цыплят.

Результаты измерения представлены в таблице 1.

Таблица 1- Диаметр эритроцитов в крови цыплят-бройлеров

 

Группа	Время, сутки	Диаметр, мкм
Контрольная (сбалансированное питание)	7	5,607±0,594
Опытная (диетическое питание)	28	5,3393±0,2565

 

У опытной группы оказался большой разброс в значениях диаметра. Он приведен в приложении А. У контрольной группы разброс в значениях был не слишком большой, поэтому подробные данные приведены только опытной группы.

Далее сопоставив результаты и данные из источников, выяснилось, что у цыплят форма эритроцитов в виде эллипса. Этим объясняется разброс в значениях, потому как нахождение диаметра этим методом возможен, только если форма эритроцитов в виде круглого непрозрачного диска.

Далее проводился забор крови у крыс для измерения диаметра эритроцита с помощью дифракционной картины. У них форма эритроцитов позволяет находить диаметр этим методом. Результаты расчетов представлены в приложении Б.

Контрольную группу крыс кормили сбалансированной пищей. На 8-е сутки опытную группу крыс не кормили, в их рационе была только вода.

Рисунок 15 – Изменение диаметра эритроцитов с течением времени

 

Из-за недостатка питательных веществ, организм вырабатывает большое количество эритроцитов. Они не успевают развиться, поэтому диаметр эритроцитов становиться меньше, как показано на рисунке 15.

 

 

 

 

 

 

 

3.2  Результаты измерения количества эритроцитов с помощью камеры Горяева

 

 

Для эксперимента были помечены 10 крыс, измерена их масса путем взвешивания. Был произведен расчет количества эритроцитов в 1 мкл крови с помощью камеры Горяева. Более подробные данные представлены в приложении Б.

Рисунок 15 – Зависимость количества эритроцитов от времени

При сбалансированном питании количество эритроцитов практически не изменялось. На 10-е сутки начало резко увеличиваться, затем уменьшаться, как показано на рисунке 15. Это объясняется тем, что при недостатке питания организм пытается восполнить недостаток компонентов необходимых для жизненных процессов организма. Эритроцитов становиться много, но меньшего диаметра и они не способны выполнять свои функции, и организму не хватает кислорода.

3.3 Результаты исследования осмотической хрупкости эритроцитов

 

 

Для нашего исследования мы измерили спектр поглощения суспензии эритроцитов в 0,9 %, 0,45 %, 0%-ных растворах NaCl у контрольной и опытной группы.

Интенсивность поглощения света с уменьшением концентрации NaCl в растворе (от 0,9 % до 0 %) постоянно уменьшается, согласно рисункам 13,14. Различие в значениях фоновой интенсивности (в интервале 600-650 нм) обусловлено рассеянием света эритроцитами, которые при концентрациях NaCl 0,9 % и 0,45 % еще остаются целыми, как видно по кривым на рисунках 13,14, а при более низких концентрациях – разрушаются.

Рисунок 13 – Концентрация гемоглобина в крови цыплят-бройлеров

Рисунок 14 – Концентрация гемоглобина в крови крыс

В спектрах поглощения опытной группы фоновая интенсивность меньше по сравнению с контрольной группой как при λ > 600 нм, так и в области максимального пика, что свидетельствует об уменьшении количества эритроцитов.

Как свидетельствуют рисунки 13,14, эритроциты опытной группы стали менее устойчивыми к распаду относительно контрольной группы (увеличение поглощения, при λ > 600нм).

Сравнив рисунки 13 и 14, сделали вывод, что голодание приводит к уменьшению устойчивости эритроцитов, как у цыплят, так и у крыс.

 

 

 

 

 

 

 

3.4 Нахождение концентрации гемоглобина в крови

 

 

По градуировочной кривой определили концентрацию гемоглобина у контрольной и опытной группы цыплят и крыс.

Рисунок 15 - Градуировочная кривая

 

Концентрация гемоглобина в крови крыс:

• для контрольной группы: С_Нb = 1,86 мкМ;
• для опытной группы: С_Нb = 0,242 мкМ.

Концентрация гемоглобина в крови цыплят-бройлеров:

• для контрольной группы: С_Нb = 2,15 мкМ;
• для опытной группы: С_Нb = 0,285 мкМ.

Затем по формуле 14 построили график зависимости доли устойчивых эритроцитов от времени, как показано на рисунке 16.

При увеличении времени голода уменьшается концентрация гемоглобина и доля устойчивых эритроцитов в крови цыплят и крыс. У цыплят концентрация гемоглобина уменьшается больше, чем у крыс.

 

Рисунок 16 - Доля устойчивых эритроцитов за период голодания

 

 

 

 

 

Заключение

 

 

В данной дипломной работе было проведено изучение количественных показателей эритроцитов на фоне дефицита питательных веществ в организме животных, а также выполнены измерения осмотической хрупкости и диаметров эритроцитов.

Для нормальной деятельности всех органов и систем организма необходимо постоянное снабжение их кровью. Прекращение кровообращения даже на короткий срок (в мозге всего на несколько минут) вызывает необратимые изменения. Это обусловлено тем, что кровь выполняет в организме важные функции, необходимые для жизни.

В крови непрерывно идут процессы разрушения и образования форменных элементов. Регуляция кроветворения происходит нейрогуморальным путём. Нервные и эндокринные влияния осуществляются за счёт специфических посредников – гемопоэтинов. Эритропоэтины – стимуляторы эритропоэза. Они образуются в печени, селезёнке, но главным местом их образования считаются почки. Эритропоэтины являются полипептидами относительно небольшой молекулярной массы. Их количество в крови увеличивается при уменьшении количества эритроцитов.

Кроме того для нормального созревания эритроцитов необходимы витамины (цианокобаломин, пиридоксин, фолиевая кислота) Цианокобаломин, так называемый внешний фактор кроветворения, поступает в организм с кормом. Он всасывается и усваивается только в том случае, если слизистая оболочка пилорической части желудка выделяет особое вещество – так называемый внутренний фактор кроветворения, или фактор Кэсла. При отсутствии этого вещества нарушается всасывания цианокобаломина и образование эритроцитов тормазится. Пиридоксин необходим для синтеза гемма. Фолиевая кислота для синтеза глобина. Рибофлавин участвует в процессе образования липидной стромы эритроцитов, пантотеновая кислота – в синтезе фосфолипидов. Для эритропоэза нужен также витамин С – усиливает всасывание железа из кишечника, способствыет образованию гемма, стимулирует действие фолиевой кислоты. Кроме витаминов, животные должны получать с кормом достаточно белков и минеральных веществ.

Следовательно, полноценное кормление – необходимое условие образования и созревания эритроцитов.

На основе полученных результатов были сделаны следующие выводы:

1              Диаметр эритроцитов у крыс с течением времени уменьшился, а количество эритроцитов увеличилось. Это означает, что организм начал вырабатывать эритроциты, но они не успевали развиться. Выполнять свою функцию они уже не могли. Из этого следует, что при несбалансированном питании происходит нарушение гомеостаза.

2              Диаметр эритроцитов у цыплят находился сложнее. Он был найден с большой разницей, этот факт мы связываем с формой эритроцита в виде эллипса.

3              Осмотическая устойчивость эритроцитов в контрольной группе выше, чем у опытной группы. Это означает, что голодание животных способствует уменьшению общей доли эритроцитов в крови, и как следствие может привести к анемии.

 

Список использованных источников

 

 

• Лабораторные методы исследования системы гемостаза / В. П. Балуда [и др.]. — Томск, — 314 с.
• Гомеостаз / под ред. П. П. Горизонтова. — М.: Медицина, — 325 с.
• Кассирский, Г. А. Клиническая гематология / Г.А.Кассирский, Г. А. Алексеев. — М.: Медицина, — 800 с.
• Кудряшов, Б. А. Биологические проблемы регуляции жидкого состояния крови и ее свертывания / Б.А.Кудряшов. — М.: Медицина, — 488 с.
• Кузник, Б. И., Форменные элементы крови, сосудистая стенка, гемостаз и тромбоциты / Б. И. Кузник, В. П. Скипетров. — М.: Медицина, — 308 с.
• Малышев, В. Д. Интенсивная терапия острых водно-электролитных нарушений / В. Д. Малышев. — М.: Медицина — 190 с.
• Петров, Р. В. Иммунология / Р. В. Петров. — М.: Медицина, — 288 с.
• Воробьева, А. И. Руководство по гематологии: в 2 т. / А. И. Воробьева. — М.: Медицина, - Т. 1. — 430 с.
• Черниговского, В. Н. Физиология системы крови / В. Н. Черниговского. — Л.: Наука, — 360 с.
• Фремолъ, X. Основы иммунологии / Фремолъ, Й. Брок. — М.: Мир, 1986. — 250 с.
• Харды, Р. Гомеостаз: пер. с англ. / Р. Харды. — М.: Мир, — 80 с.
• Антонов, В.Ф. Практикум по биофизике: учеб. пособие / В.Ф. Антонов, А.М. Черныш. — М.: Гуманит. изд. центр ВЛАДОС, — 352 с.
• Антонов, В. Ф. Биофизика мембран / В. Ф. Антонов // Соросовский образовательный журнал. -1996.- № 6. - С. 4-12.
• Антонов, В. Ф. Мембранный транспорт / В. Ф. Антонов // Соросовский образовательный журнал. -1997.- № 6. - С. 14-20.
• Тихонов, А. Н. Молекулярные преобразователи энергии в живой клетке / А. Н. Тихонов // Соросовский образовательный журнал. -1997.- № 7. - С. 10-17.
• Тихонов, А. Н. Трансформация энергии в хлоропластах - энергопреобразующих органеллах растительной клетки / А. Н. Тихонов // Соросовский образовательный журнал. - 1996.- № 4. - С. 24-32.
• Скулачев, В. П. Эволюция биологических механизмов запасания энергии / В. П. Скулачев // Соросовский образовательный журнал. - 1997.- № 5. - С. 11-19.
• Скулачев, В. П. Законы биоэнергетики / В. П. Скулачев // Соросовский образовательный журнал. - 1997.- № 1. - С. 9-14.
• Климов, В. В. Окисление воды и выделение молекулярного кислорода при фотосинтезе / В. В. Климов // Соросовский образовательный журнал. - 1996. - № 1. – С. 9-12.
• Полторак, О. М. Химические и биохимические механизмы обоняния и усиления первичных запаховых сигналов / О. М. Полторак // Соросовский образовательный журнал. - 1996. - № 1. - С. 13-19.
• Ройтберг, Г. Е. Внутренние болезни. Лабораторная и инструментальная диагностика / Г. Е. Ройтберг, А. В. Струтынский. - М.: БИНОМ, 1999. - 622 с.
• Любин, Н.А., Методические рекомендации к определению и выведению гемограммы у животных / Н.А. Любин, Л.Б. Конова.- Ульяновск, ГСХА, 2005.-113 с.
• Руководство к практическим занятиям по методам клинических лабораторных исследований: учеб. пособие / под ред. В.С. Ронин. -4-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1989. - 320 с.
• Науменко, В.В. Фізіологія сільськогосподарських тварин / В.В. Науменко, А.С. Дячинський.-Украина.: ЦУЛ, 2009. - 568 с.
• Лысов, В.Ф., Основы физиологии и этологии животных / В.Ф. Лысов, В.И. Максимов. – М.: Колос, 2004. – 248 с.
• Скорпичев, В.Г. Морфология и физиология животных: учебное пособие / В.Г. Скорпичев, Б.В. Шумилов. – СПб. : Изд. «Лань», 2004. - 416 с.
• Физиология сельскохозяйственных животных / под ред. А.Н. Голикова, Г.В. Паршутина. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: Колос, 1980. – 480 с.
• Скопичев, В.Г. Физиология и этология животных / В.Г. Скопичев, Т.А. Эйсымонт. - М.: Колос, 2005. – 456 с.
• Физиология сельскохозяйственных животных / А.Н. Голиков [и др.].– 3-е изд., перераб. и доп. – М.: Агропромиздат, 1991. – 432 с.
• Рожков, И.Н. Учебный физический эксперимент. Обработка результатов: учеб. пособие / И.Н. Рожков. - Оренбург: Изд-во ОГПУ, 2004.- 48 с.
• Karasek F.W. // Ind. Res. Develop. - 1978. – April. – P.356.
• Oswald E.O., Albro P.W., McKinney J.D. // J. Cromatogr. – 98. - 1974. - P.363-448.
• Eiceman G.A., Clement R.E., Karasek F.W. // Anal. Chem. – 51. - 1979.-P.2343-2350.
• Hau H., Biemann K. // Anal. Chem. – 46. -- P.426-434.
• Gates S.C., Smisko M.J., Ashendel C.I., Young N.D., Holland J.F., Sweeley C.C. // Anal. Chem. – 50. - 1978. - P.433-441.
• McLafferty F.W. // Acc. Chem. Res. – 13. - 1980. - P.33-39.
• McLafferty F.W. // Science. – 214. - 1981. - P.280-287.
• Cooks R.G., Glish G.L. // Chem. Eng. News, Nov.30, 1981.-P.40-52.
• Tong H.Y., Shore D.L., Karasek F.W. // Anal. Chem. – 56. - 1984. - 2442.
• Chance В. // Optical method. Arm. Rev. Biophys. Biophys. Chem. - - V. 20. - P.1-28.
• Special Issue Honoring Professor Britton Chance / Eds.D. Benaron, I. Bigio, E. Sevick-Muraca, A.G. Yodh //J. Biomed. Opt. - 2000. - V. 5. - P. 115-248; 269-282.
• Duck F.A. Physical Properties of Tissue: a Comprehensive reference book. L. - 1990. – 227.
• Selected papers on tissue optics applications in medical diagnostics and therapy / Ed. V.V. Tuchin. Bellingham: SPIE Press. - 1994. - V.6 - P. 102.
• Patterson M.S. Noninvasive measurement of tissue optical properties: current status and future prospects // Comments Mol. Cell. Biophys. - 1995. - V. 8. - P. 387-417.
• Yodh A.G. Spectroscopy and imaging with diffusing light / G. Yodh, B. Chance // Physics Today. - 1995. - V. 48. - P. 34-40.
• Ferrari, M. Special Section on Clinical Near Infrared Spectroscopy / Eds. M. Ferrari, D. Delpy, D.A. Benaron // J. Biomed. Opt. - 1996. - V. 1. - P. 361-434; 1997. - V. 2. - P. 7-41;147-175.
• Okada, K. Special Section on Medical Near- Infrared Spectroscopy / Okada, T. Hamaoka // J. Biomed. Opt. - 1999. - V. 4. - P. 391-428.
• Tuchin, V.V. Tissue optics: Light scattering methods and instruments for medical diagnosis / V. Tuchin // SPIE Tutorial Texts in Optical Engineering. Bellingham: SPIE Press. - 2000. - V. 7. - P.38.
• Quantitative Spectroscopy in Tissue / Eds. K. Frank, M. Kessler. Frankfiirt am Main: pmi-Verl. - 1992. – P. 354.
• Ozaki, Y. Medical application of Raman spectroscopy / Y. Ozaki // Appl. Spectroscopy Reviews. - - V. 24. - P. 259-312.
• Tu A.T. // Raman Spectroscopy in Biology. N. Y. - 1982. – P. 451.
• Gusev V.E., Karabutov A.A. // Laser Optoacoustics. - 1993. – P. 235.
• Tuchin, V. V. Lasers and fiber optics in biomedicine // Laser Physics. - 1993. - V. 3. - P. 767-820; 925-950.

 

Приложение А

(справочное)

 

 

Таблица А1 – Результаты вычисления диаметра эритроцитов у опытной группы цыплят-бройлеров

№	D, мкм
1	5,5556±0,2617
2	7,1828±0,2976
3	5,3393±0,2565
4	7,0224±0,2942
5	5,8742±0,2691
6	4,3241±0,2309
7	5,015±0,2486
8	5,3134±0,2559
9	5,6428±0,2637
10	4,6338±0,239
11	6,268±0,278
12	5,129±0,2514

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Приложение Б

(справочное)

 

 

Таблица Б1 – Результат показателей эритроцитов крыс

 

Время, сутки	№ образца	Диаметр, мкм	Масса, г	Количество эритроцитов
1 день	№1	4,8843±0,1214	250	233±8,8409
	№2	4,9065±0,5251	250	229±4,1678
3 день	№1	4,8257±0,6849	258	328,333±4,7095
	№2	4,77±0,2034	248	271,666±5,7675
5 день	№1	4,6969±0,4437	250	276,666±7,5421
	№2	4,6761±0,4741	244	270±6,2469
8 день	№1	4,6725±0,5553	248	284,666±7,0955
	№2	4,5135±0,4789	246	272,333±3,6367
10 день	№1	4,6323±0,9966	216	987,333±8,223
	№2	3,2471±0,3699	210	200,333±2,8226
12 день	№1	3,6579±0,9165	188	360,666±6,995
	№2	3,5907±0,8247	180	648,333±6,2124

 

 Скачать: diplom.docx