Изучение влияния алиментарных факторов питания (пищевых волокон) на липидный обмен

МАГИСТЕРСКАЯ ДИССЕРТАЦИЯ

Изучение влияния алиментарных факторов питания (пищевых волокон) на липидный обмен.

Содержание

Введение …………………………..………………………………………………

1 Общее представление о пищевых волокнах ....................................................

1.1 Классификация пищевых волокон .................................................................

1.1.1 Крахмал и лигнин ........................................................................................

1.1.2 Целлюлоза и нецеллюлозные полисахариды ............................................

1.2 Превращение пищевых волокон в желудочно-кишечном тракте человека и их сорбционные и катионообменные эффекты ................................................

2 Общие сведения о липидном обмене .................................................................

2.1 Основные классы липидов и липопротеидов, участвующих в липидном обмене .........................................................................................................................

2.1.1 Липиды плазмы крови ......................................................................................

2.1.2 Липопротеиды плазмы крови ........................................................................

3 Материалы и методы ...........................................................................................

3.1 Лабораторные животные .................................................................................

3.2 Сыворотка крови ……………………………………………………..

3.3 Методы анализа ....................................................................................

3.3.1 Определение химического состава рациона для экспериментальных животных ………………………………………………………………………

3.3.2 Определение уровня общего холестерина сыворотки крови биохимическим методом ...............................

3.3.3 Биохимический метод определения уровня триглицеридов сыворотки крови …..………………………………………………………………………...

3.3.4 Определение уровня холестерина липопротеидов низкой плотности .......

4 Результаты и их обсуждение ....................................

Заключение ...............................................................................................................

Список использованных источников ....................................................................

Приложение А .....................................................................................................

Введение

Основной ценностью человека является здоровье. По данным Всемирной организации здравоохранения - это многофакторная зависимость, определяемая социальным, экономическим и политическим развитием общества, психофизиологическими и медицинскими аспектами. Состояние здоровья человека, в первую очередь, зависит от питания [1], которое является важнейшей социальной проблемой. Изменение образа и снижение уровня жизни, связанное с меньшими потребностями в энергозатратах и пищи, недостаточным поступлением в организм человека витаминов и минеральных веществ и наряду с этим раздельное употребление пищи и биологически активных веществ, повлекло за собой создание функциональных продуктов питания. В России появление функциональных продуктов питания на рынке значительно опережает знание о них и у медицинской общественности, и у технологов разрабатывающих и выпускающих эти продукты, и тем более у населения [2].

На сегодняшний день для коррекции возникающих метаболических нарушений пищевые волокна (ПВ) являются одним из самых востребованных и наиболее широко применимых пищевых ингредиентов в рационе человека. При этом, как общее, так и фракционное (растворимые, нерастворимые), содержание ПВ в продуктах, существенно различаются в зависимости от вида растительного сырья [3].

Использование ПВ в питании одобрено организациями здравоохранения многих стран, такими как Комиссия по надзору за продовольствием и лекарственными средствами (FDA), Американская ассоциация кардиологов (AHA), Европейская комиссия по функциональным пищевым продуктам (FUFOSE), Министерство здравоохранения Японии. В Российской Федерации вопросами применения данных нутриентов занимается Роспотребнадзор [4].

Так как процесс пищеварения представлен сложным комплексом взаимодействия пищевых субстратов между собой, то ведущим эффектом взаимодействия компонентов пищевого рациона принадлежит субстрат-связывающей способности. Наибольшей сорбционной емкостью обладают ПВ благодаря большому числу связывающих групп на поверхности биополимеров [5]. Однако, строение и свойства отдельных видов волокон могут существенно различаться в зависимости от некоторых особенностей, к которым относятся: состав и структура мономерных фрагментов, образующих молекулу волокна; степень разветвления молекул; число и вид функциональных групп; тип межмолекулярных связей; степень полимеризации (молекулярная масса); плотность упаковки биополимерных структур [6].

Устойчивый недостаток ПВ в суточном рационе современного человека способствует увеличению заболеваний сахарным диабетом, атеросклерозом, ишемической болезнью сердца, заболеваниями желудочно-кишечного тракта, а также различными злокачественными образованиями [7].

Все чаще среди взрослого населения встречается ожирение в той или иной форме (в России избыточная масса тела и ожирение выявлены у 55 % лиц старше 30 лет). Только во второй половине XX века у врачей и ученых разных стран, озабоченных проблемой неуклонного роста заболеваемости, начал накапливаться достоверный статистический материал, свидетельствующий о прочной взаимосвязи между количеством потребляемых ПВ и целым рядом заболеваний: чем меньше потребление волокон, тем выше риск заболеваний, и наоборот [8].

Важное свойство ПВ состоит и в том, что они устойчивы к действию амилазы и других ферментов, и поэтому в тонкой кишке не всасываются. Это свойство обеспечивает им своеобразное физико-химическое действие, в частности, обладают способностью связывать воду и желчные кислоты, а также адсорбировать токсические соединения [6].

Данные волокна, представляющие собой вещества различной химической природы (все они являются полимерами моносахаридов и их производных), подвергаются бактериальной ферментации в толстой кишке. Нормальной кишечной микрофлоре также приписывается значительная субстрат-связывающая активность. В частности, микроорганизмы используют целлюлозу, гемицеллюлозу и пектин, частично метаболизируя их в уксусную, пропионовую и масляную кислоты и частично гидролизуют пектиновые вещества с образованием олиго- и галактуроновой кислот, которые реабсорбируются в кишечнике и попадают в кровяное русло [9].

Использование различных видов ПВ приводит к разнонаправленному их влиянию на показатели липидного обмена: хитозан и пшеничные отруби – увеличивают концентрацию общего холестерина (ХС) и снижают концентрацию триглицеридов (ТГ) в сыворотке крови; целлюлоза в средних дозах - увеличивает концентрацию общего ХС и ТГ, а в высоких дозах – снижает их концентрацию в сыворотке крови [10].

Липидный обмен является одним из сложнейших обменов организма человека. Липиды составляют основу центральной нервной системы, образуют липидную матрицу клеточных мембран и органелл клеток, играют большую роль в энергетическом обмене. Некоторые липиды формируют особые комплексы, принимающие участие в иммунологических реакциях, свертывания крови, процессах пищеварения [11].

Степень выраженности окисления зависит от интенсивности генерации свободных радикалов и состояния системы антиоксидантной защиты. Нарушение активности этих систем приводит к интенсификации процессов перекисного окисления липидов, деструкции белков, нуклеиновых кислот и гликозамингликанов [12].

Изменения липидного состава крови формируются всегда на фоне глубоких микроэкологических нарушений в кишечнике. Микроорганизмы желудочно-кишечного тракта активно вмешиваются в холестериновый метаболизм, воздействуя непосредственно на ферментные системы клеток хозяина, участвующие в рециркуляции желчных кислот и синтезирующие эндогенный холестерин [13].

Усиленное размножение бактерий в тонкой кишке вследствие дисбиоза желудочно-кишечного тракта на фоне стресса (психоэмоционального, лекарственного, химического и т.д.) приводит к усиленной деконъюгации связанных желчных кислот и образованию их токсичных эндогенных солей, нарушающих микроциркуляцию в стенке кишки, увеличивающих всасывание и возврат в печень практически до 100% выделенных в просвет тонкой кишки желчных кислот [14].

В печени по принципу «обратной связи» компенсаторно уменьшается синтез желчных кислот в гепатоцитах, вследствие чего повышается содержание холестерина в плазме крови в связи с отсутствием необходимости восполнять ежедневные физиологические потери (фекальная экскреция) желчных кислот и холестерина в нарушенном цикле энтерогепатической циркуляции [15].

В последние годы активно изучается взаимосвязь нарушений липидного обмена и заболеваний гастродуоденальной зоны у взрослых пациентов [16, 17], у детей этот вопрос изучен недостаточно.

В настоящее время сложилась такая структура питания, что вместо необходимых 25 г ПВ в сутки современный человек потребляет немного больше половины этого количества [18, 19]. Поэтому обеспечить нужный уровень поступления пищевых волокон в организм может употребление продуктов, обогащенных этим компонентом.

Все выше сказанное определило у нас интерес к изучению данного аспекта. Поэтому целью работы стало изучение влияния уровня поступления пищевых волокон на динамику показателей липидного обмена. По существующим представлениям поставленная цель будет нами достигнута путем создания модели рациона питания экспериментальных животных с различным содержанием пищевых волокон (дефицитное, адекватное, избыточное); определения химического состава корма; оценки динамики веса лабораторных животных; определения уровня общего холестерина, триглицеридов сыворотки крови с помощью биохимического анализа; определения расчетным способом холестерина липопротеидов низкой плотности (ХС ЛПНП). Для решения поставленных задач используются колориметрический, нефелометрический вычислительные и другие методы.

За последние несколько лет механизмы действия ПВ и целесообразность их применения были изучены во множестве исследований, в том числе и в рамках рандолизированных контролируемых испытаний [9]. А по данным литературы в настоящее время изучение метаболизма липидов при введении в рацион ПВ носят описательный характер без достаточного экспериментального обоснования. В связи с чем, взятая на рассмотрение тема является актуальной на данном этапе развития человечества.

1 Общее представление о пищевых волокнах

Термин «пищевые волокна» впервые введен в научный обиход Е.Н. Hipsley в 1953 году. Он характеризовал их как остатки растительных клеток, способные противостоять гидролизу, осуществляемому пищеварительными ферментами человека [10].

Концепция ПВ имеет длинную историю и восходит еще к временам Гиппократа, который в 430 г. до н.э. описал слабительный эффект пшеничных отрубей. «Ренессанс» клетчатки приходится на конец 60-х – начало 70-х годов, когда статистика показала, что в странах, где население потребляет большое количество этих компонентов, значительно реже встречаются рак и другие заболевания толстой кишки. Тогда же оказалось, что больные с дивертикулезем толстой кишки вопреки общему мнению лучше чувствуют себя на диете богатой, а не бедной, клетчаткой. В то же время появилось множество исследований химических и физико-химических свойств ПВ, их количества в разных рационах, физиологических эффектов и пр [20].

Пищевые волокна представляют собой вещества различной химической природы (все они являются полимерами моносахаридов и их производных), которые не расщепляются в тонкой кишке, а подвергаются бактериальной ферментации в толстой кишке[21].

В зерновых, бобовых, овощах содержится большое количество ПВ. Они занимают значимое место в рационе питания [22], играя важнейшую роль в процессах пищеварения и в жизнедеятельности организма человека в целом, обладая низкой калорийностью. ПВ оказывают положительное воздействие на сосуды, предохраняя их от отложения холестерина, стимулируют перистальтику кишечника, снижают уровень сахара в крови [23]. Из полученных данных о связи между характером питания и частотой сердечно-сосудистых заболеваний в экономически развитых странах следует, что существует четкая отрицательная корреляция последней с уровнем потребления ПВ [24]. Рекомендуемое суточное потребление ПВ должно составлять 30-35 г. [25].Во многих странах, в том числе и в нашей, отмечается недостаточное потребление ПВ (24-26,3 г/сут.) [18, 26].

1.1 Классификация пищевых волокон

По физико-химическим свойствам ПВ подразделяют на 2 вида: растворимые в воде (их также называют «мягкими» волокнами), и нерастворимые (их часто называют «грубыми» волокнами) [27].Растворимые пищевые волокна содержатся преимущественно в овощах, фруктах, бобовых; нерастворимые волокна – в зерновых продуктах [28]. Растворимые пищевые волокна впитывают воду и формируют гель, понижают уровень холестерина и сахара в крови. К этим «мягким» волокнам относятся пектины, камеди, декстраны, слизи, некоторые фракции гемицеллюлозы [9, 27].

Нерастворимые ПВ проходят через желудочно-кишечный тракт практически в неизмененном виде, адсорбируют большое количество воды, влияют на моторику кишки. К таким «грубым» волокнам относятся целлюлоза, лигнин и часть гемицеллюлозы (рисунок 1) [29].

Рисунок 1 - Основные типы пищевых волокон

В структуре первичной и вторичной клеточной стенки растений пространство между элементарными фибриллами целлюлозы заполняют гемицеллюлоза и неуглеводное вещество лигнин. Макромолекулярными компонентами стенки являются волокнистые полисахариды (в основном целлюлоза), межклеточные полисахариды (пектиновые субстанции, гемицеллюлозы и гликопротеины) и отвердевающие полисахариды. Молодые, развивающиеся ткани растений в основном состоят из полисахаридов и белковых веществ. По мере роста идет формирование лигнина [10, 30].

1.1.1 Крахмал и лигнин

Растения синтезируют из простых сахаров несколько углеводных полимеров. Крахмал (C₆H₁₀O₅)_n — полисахариды амилозы и амилопектина, мономером которых является альфа-глюкоза. Крахмал, синтезируемый разными растениями в хлоропластах, под действием света при фотосинтезе, несколько различается по структуре зёрен, степени полимеризации молекул, строению полимерных цепей и физико-химическим свойствам (рисунок 2) [31]

Рисунок 2 - Структурные формулы: 1 - a-D-глюкопираноза; 2 - амилоза; 3 - амилопектин

Крахмал является запасной источник энергии растений, почти полностью переваривается и адсорбируется в верхних отделах кишечника человека Лишь малая часть крахмала, окруженная волокнистой тканью, проходит до слепой кишки. Волокнистые и клейкие полисахариды придают растениям их структуру и форму. Они не перевариваются в тонкой кишке, проходя неизменными в толстую кишку, где ферментируются в разной степени [32].

Лигнин является полимерным остатком древесины после ее перколяционного гидролиза, который проводится с целью выделения целлюлозы и гемицеллюлозы.

Лигнины – группа веществ безуглеводных клеточных оболочек, состоящие из полимеров ароматических спиртов (рисунок 3). Они сообщают структурную жесткость оболочке растительной клетки, обволакивают целлюлозу и гемицеллюлозу, способны ингибировать переваривание оболочки кишечными микроорганизмами, поэтому наиболее насыщенные лигнином продукты (например, отруби) плохо перевариваются в кишечнике [33].

Рисунок 3 - Фрагмент молекулы лигнина

1.1.2 Целлюлоза и нецеллюлозные полисахариды

Целлюлоза представляет собой неразветвленный полимер глюкозы, содержащий до 10 тысяч мономеров (рисунок 4). Разные виды целлюлозы обладают разными свойствами и различной растворимостью в воде.

Рисунок 4 - Химическая формула целлюлозы

Целлюлоза широко распространена в растительных тканях. Она входит в состав клеточных оболочек и выполняет опорную функцию. Вследствие различий в пространственном расположении кислородного «мостика», соединяющего остатки глюкозы, крахмал легко расщепляется в кишечнике, тогда как целлюлоза не атакуется ферментом поджелудочной железы - амилазой. Целлюлоза принадлежит к числу чрезвычайно распространенных в природе соединений. На ее долю приходится до 50 % углерода всех органических соединений биосферы [34].

Кроме целлюлозы, в состав клеточных оболочек входят ещё несколько других углеводов, известных под общим именем гемицеллюлоз. Гемицеллюлозы - полисахариды клеточной оболочки, весьма обширный и разнообразный класс растительных углеводов. Гемицеллюлоза образована конденсацией пентозных и гексозных остатков, с которыми связаны остатки арабинозы, глюкуроновой кислоты и ее метилового эфира. В состав различных типов гемицеллюлоз входят разнообразные пентозы (ксилоза, арабиноза и др.) и гексозы (фруктоза, галактоза и др.) (рисунок 5) [9].

Рисунок 5 - Основные черты химического строения гемицеллюлозы твердой древесины: Х – ксилоза, А – ацетильная группа, GA – глюкуроновая кислота, М – метоксильная группа

Также как и целлюлоза, разные типы гемицеллюлозы обладают различными физико-химическими свойствами. Гемицеллюлоза способна удерживать воду и связывать катионы. Она преобладает в зерновых продуктах, а в большей части овощей и фруктов ее мало [35].

К пищевым волокнам также относят фитиновую кислоту – вещество, сходное по строению с целлюлозой. Фитин содержится в семенах растений [36].

Хитин – полисахарид, имеющий сходную с целлюлозой структуру. Из хитина состоят клеточные стенки грибов и панцири раков, крабов и остальных членистоногих [35].

Пектинами называют сложный комплекс коллоидных полисахаридов. Пектин представляет собой полигалактуроновую кислоту, в которой часть карбоксильных групп эстерифицирована с остатками метилового спирта (рисунок 6).

Пектины способны в присутствии органических кислот и сахара образовывать желе. Это свойство широко используется в кондитерской промышленности. Они входят в клеточный скелет ткани фруктов и зеленых частей растений. Важны сорбирующие свойства пектинов – способность связывать и выводить из организма холестерин, радионуклеиды, тяжелые металлы (свинец, ртуть, стронций, кадмий и др.) и канцерогенные вещества [37].

Рисунок 6 - Фрагмент цепи пектиновой кислоты: R = H, CH₃; R¹ = H, CH₃, реже — углеводная цепь; R²= H, углеводная цепь

Пектиновые вещества в заметных количествах находятся в продуктах, из которых можно сварить желе. Это слива, черная смородина, яблоки и другие фрукты. В них содержится около 1% пектина. Столько же пектина присутствует и в свекле [38, 39].

Камеди (гумми) являются разветвленными полимерами глюкуроновой и галактуроновой кислот, к которым присоединены остатки арабинозы, маннозы, ксилозы, а также соли магния и кальция.

Камеди – сложные неструктурированные полисахариды (рисунок 7), не входящие в состав клеточной оболочки, растворимые в воде, обладающие вязкостью; они способны связывать в кишечнике тяжелые металлы и холестерин [40].

Рисунок 7 - Структурная формула гуара камеди

Слизи представляют собой разветвленные сульфатированные арабиноксиланы. Слизи, как пектин и камеди, – это сложные смеси гетерополисахаридов. Слизи широко представлены в растениях. Применяются в тех же случаях, что пектины и камеди. В пищевых продуктах наибольшее количество слизей содержатся в овсяной и перловой крупах и рисе. Слизей много в семенах льна и подорожника [41].

Протопектины - это пектиновые вещества, группа высокомолекулярных соединений, входящих в состав клеточных стенок и промежуточного вещества высших растений. Протопектины представляют собой особые нерастворимые комплексы пектина с клетчаткой, гемицеллюлозой, ионами металлов. При созревании фруктов и овощей, а также при их тепловой обработке эти комплексы разрушаются с освобождением из протопектина свободного пектина, с чем связано происходящее при этом размягчение фруктов [42].

Альгинаты - соли альгиновых кислот, в большом количестве содержащихся в бурых водорослях, молекула которых представлена полимером полиуроновых кислот [41].

1.2 Превращение пищевых волокон в желудочно-кишечном тракте человека и их сорбционные и катионообменные эффекты

В соответствии с теорией сбалансированного питания в желудочно-кишечном тракте происходит разделение ПВ на нутриенты и балласт. Полезные вещества расщепляются и всасываются, а балластные вещества выводятся из организма. Однако, в ходе естественной эволюции питание сформировалось таким образом, что становятся полезными не только утилизируемые, но и неутилизируемые компоненты пищи [42].

ПВ не являются источниками энергии. У человека они могут только частично расщепляться в толстой кишке под действием микроорганизмов. Было показано на людях с удаленным толстым кишечником, что инулин и олигофруктоза не перевариваются в тонком кишечнике и поступают в толстый практически количественно, где превращаются под действием кишечных бактерий в летучие жирные кислоты (пропионовую, масляную и уксусную) и газы, необходимые для регуляции функции толстой кишки (водород, метан и др.) [43]. Так было установлено, что по этой причине инулин и олигофруктоза имеют пониженную энергетическую ценность – 1 и 1,5 ккал/г, соответственно, по сравнению с величиной, которую следовало бы ожидать исходя из их углеводного состава. Так целлюлоза расщепляется на 30-40%, гемицеллюлоза - на 60-84%, пектиновые вещества - на 35%. Практически всю освобождающуюся при этом энергию бактерии кишечника используют на собственные нужды [44].

Наличие у ПВ гидроксильных и карбоксильных групп способствует, кроме гидратации, ионообменному набуханию, то есть удержанию и последующему выведению воды из организма, в большей степени выражена у аморфных ПВ.

Эти вещества могут частично всасываться через стенки кишечника, но в организм человека поступает лишь около 1% питательных веществ, образованных при расщеплении ПВ. В энергетическом обмене эта доля ничтожна, и обычно этой энергией пренебрегают при изучении энергозатрат и калорийности рационов. Лигнин, которого довольно много в клеточных оболочках растительных продуктов, в организме человека совершенно не расщепляется и не усваивается [45].

Функции ПВ в организме человека разнообразны и многогранны, отличаются по составу и по своим свойствам. Важное свойство волокон состоит в том, что они устойчивы к действию амилазы и других ферментов и поэтому в тонкой кишке не всасываются [6]. Растворимые волокна лучше выводят тяжелые металлы, токсичные вещества, радиоизотопы, ХС. Нерастворимые волокна лучше удерживают воду, способствуя формированию мягкой эластичной массы в кишечнике и улучшая ее выведение. Например, целлюлоза абсорбирует воду, помогает вывести из организма токсины и шлаки и регулировать уровень глюкозы. Лигнин помогает удалять ХС и желчные кислоты, находящиеся в желудочно-кишечном тракте. Камедь и гуммиарабик растворяются в воде, создавая чувство сытости. Пектин предотвращает попадание в кровь избыточного ХС и желчных кислот [46].

ПВ начинают действовать еще во рту: пока мы пережевываем пищу, богатую клетчаткой, стимулируется слюноотделение, что способствует перевариванию пищи. Пищу с клетчаткой мы вынуждены пережевывать долго, что способствует тщательному пережевыванию пищи, улучшая работу желудка и очищению зубов [47].

Растительные волокна играют первостепенную роль в формировании каловых масс. Это обстоятельство, а также выраженное раздражающее действие клеточных оболочек на механорецепторы слизистой оболочки кишечника определяют их ведущую роль в стимуляции перистальтики кишечника и регуляции его моторной функции. Так ПВ удерживают воду в 5-30 раз больше собственного веса. Гемицеллюлоза, целлюлоза и лигнин впитывают воду за счет заполнения пустых пространств их волокнистой структуры. У неструктурированных неперевариваемых веществ (пектин и другие) связывание воды происходит путем превращения в гели. Таким образом, благодаря увеличению массы кала и прямому раздражающему действию на толстую кишку, нарастает скорость кишечного транзита и перистальтики, что способствует нормализации стула [48].

Растительные волокна сокращают то время, которое пища проводит в желудочно–кишечном тракте. Длительная задержка каловых масс в толстой кишке вызывает накопление и всасывание канцерогенных соединений, что повышает вероятность развития опухолей не только в кишечном тракте, но и в других органах. Дефицит ПВ в питании человека ведет к замедлению кишечной перистальтике, развитию стазов и дискинезии; является одной из причин учащения случаев кишечной непроходимости, аппендицита, геморроя, полипоза кишечника, а также рака его нижних отделов [47].

ПВ оказывают нормализующее влияние на моторную функцию желчевыводящих путей, стимулируя процессы выведения желчи и препятствуя развитию застойных явлений в гепатобилиарной системе. В связи с этим больные с заболеваниями печени и желчных путей должны получать с пищей повышенные количества клеточных оболочек [49].

Растительные волокна повышают связывание и выведение из организма нейтральных стероидов, в том числе холестерина (ХС), снижая его синтез (рисунок 8), а также липопротеидов (ЛП) и жирных кислот в печени, ускоряют синтез в жировой ткани липазы - фермента, под действием которого происходит распад жира, то есть положительно влияют на жировой обмен. Клетчатка способствует снижению уровня ХС, а вместе с ним риска атеросклероза. Особенно выражено влияние на обмен ХС у пектинов, в частности, яблочного и цитрусового [50].

Обогащение диеты нерастворимыми веществами уменьшает литогенность желчи, нормализуя холатохолестериновый коэффициент и литогенный индекс путем адсорбции холевой кислоты и торможения ее микробной трансформации в дезоксихолевую, ощелачивает желчь, усиливает кинетику желчного пузыря, что является особенно полезным профилактическим мероприятием у лиц с риском развития холелитиаза [51].

Рисунок 8 - Метаболизм холестерина в организме

ПВ замедляют доступ пищеварительных ферментов к углеводам. Углеводы начинают усваиваться только после того, как микроорганизмы кишечника частично разрушат клеточные оболочки. За счет этого снижается скорость всасывания в кишечнике моно- и дисахаридов, и это предохраняет организм от резкого повышения содержания глюкозы в крови и усиленного синтеза инсулина, стимулирующего образование жиров [52].

Пищевые компоненты и продукты их переработки находятся в тесном контакте с обширной иммунной системой кишечника (лимфоидной тканью, связанной с кишечником) и наличие пищи в тонкой кишке может быть необходимо для адекватной функции и развития этой ткани. Хотя известно, что специфические питательные вещества важны в развитии и функции иммунной системы, потенциал пищевых волокон, влияющий на иммунную функцию, менее изучен и этот факт не дает сделать точный вывод о воздействии различных волокон на иммунитет. Однако, исследования, показывающие более низкую частоту бактериальной транслокации через барьер кишки при введении ПВ, дают возможность предположить, что это питательное вещество моделирует иммунитет [53].

В состав нормальной микрофлоры кишечника входит несколько сотен видов бактерий. Преобладающие в толстой кишке анаэробные микроорганизмы (Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Bifidobacterium) являются сахаролитиками и способны переваривать многие виды некрахмальных полисахаридов. При электронной сканирующей микроскопии отмечено, что волокна, обнаруженные в фекалиях, плотно окружены бактериями и вокруг последних имеются зоны разрушения клеточных стенок.

По результатам изучения рубца (первого отдела желудка жвачных животных) и толстой кишки человека, которые в отношении метаболизма могут быть сравнимы, выведено уравнение ферментации в кишечнике человека:

Во время ферментации в больших количествах вырабатывается водород, который экскретируется. У 30-40% людей продуцируется метан. Имеются три важнейших продукта ферментации: короткоцепочечные жирные кислоты, газы, энергия (рисунок 9) [54].

Может быть желательным обеспечить восстановление или определенное размножение lactobacilli в кишечной среде так, чтобы продлить эффект облегченного всасывания минеральных веществ. Этого можно достичь при добавлении к пищевой композиции волокон, которые облегчают специфическое размножение lactobacilli в кишечной среде. Эти волокна можно выбрать из, например, растительных пектинов, хито-, фрукто-, гентио-, галакто-, изомальто-, манно- или ксило-олигосахаридов или олигосахаридов из сои (например, Playneetal., Bulletinofthe IDF 313. Group B42, Annual Sessionof September 95, Vienna) [55].

Рисунок 9 - Последствия метаболизма пищевых волокон в толстой кишке

Количество волокон в пищевой композиции зависит от их способности улучшать развитие lactobacilli. В виде общего правила, пищевая композиция может содержать от 1 до 50% таких волокон (по массе относительно сухого вещества). Концентрация lactobacilli может составлять, по меньшей мере, 10³ КОЕ lactobacilli на грамм волокон, предпочтительно от 10⁴ до 10⁷ КОЕ на грамм волокон [53].

Другое преимущество, обеспечиваемое волокнами, состоит в том, что под их действием замедляется прохождение через кишечник. Это особенно проявляется в случае, если количество волокон является большим, порядка 20-50% относительно массы композиции. Становится возможным, когда lactobacilli постепенно выделяются при прохождении через кишечник, удлинить таким способом полезное действие этих бактерий на всасывание минеральных веществ в кишечнике. При этом полезными бактериями образуются необходимые для организма человека вещества (витамины: В1, В2, В6, РР, фолиевая кислота; аминокислоты; особые короткоцепочечные жирные кислоты: уксусная, пропионовая и масляная), которые используются клетками кишечника, предохраняющие ее от дистрофических изменений, способствующие повышению абсорбции витамина К и магния. Также неусвояемые углеводы уменьшают бактериальное расщепление защитной слизи кишечника. Практически не влияют на обмен минеральных веществ ПВ злаковых. Следует учитывать тот факт, что при длительном введении ПВ в организме происходят адаптивные реакции, восстанавливающие исходный уровень микроэлементов [55].

Так как часть условно патогенных бактерий усваивает питательные вещества с помощью биохимических процессов гниения и брожения, то пектины подавляют жизнедеятельность этих микроорганизмов, что способствует нормализации состава кишечной микрофлоры. А ПВ, в свою очередь, стимулируют рост лактобацилл, стрептококков и уменьшают рост колиформ [56].

В основе очень многих клинических и физиологических эффектов, которые связаны с действием пищевых волокон, лежат процессы и механизмы энтеросорбции. Волокнисто-капиллярное строение нерастворимых веществ делает их натуральными энтеросорбентами. В желудочно-кишечном тракте человека в процессах пищеварения сорбционные механизмы играют одну из ведущих ролей. Они лежат в основе ферментативного гидролиза пищевых веществ, который происходит в просвете желудка, тонкой и толстой кишки, в пристеночной зоне эпителия и на поверхности эпителиальных клеток кишечника. Сорбционные механизмы определяют транспортные потоки пищевых веществ на различных этапах пищеварительно-транспортного конвейера, всасывания и переноса пищевых субстратов через эпителиальный барьер кишечника [57]. Благодаря адсорбционной способности, ПВ адсорбируют на себе или растворяют токсины, тем самым уменьшая опасность контакта токсинов со слизистой оболочкой кишечника, выраженность интоксикационного синдрома и воспалительно-дистрофических изменений слизистой оболочки (рисунок 10). ПВ уменьшают уровень свободного аммиака и других канцерогенов, образующихся в процессе гниения или брожения или содержащихся в пище. Поскольку растительные волокна быстро выводятся с каловыми массами из организма, одновременно из организма эвакуируются и сорбированные ими соединения. Благодаря своим ионообменным свойствам, ПВ выводят различные чужеродные вещества, содержащихся в пищевых продуктах, включая канцерогены и различные экзо- и эндотоксины, а также продуктов неполного переваривания ПВ, ионы тяжелых металлов (свинца, стронция), влияют на электролитный обмен в организме, электролитный состав фекалиев [10].

Рисунок 10 – Адсорбционная способность пищевых волокон в желудочно-кишечном тракте

Токсические продукты, прежде чем покинуть организм, многократно всасываются и вновь перерабатываются печенью и пищеварительной системой. Несомненно, что эта многократная циркуляция токсинов в организме способствует зашлакованности внутренней среды. Идея использования кишечных сорбентов (энтеросорбентов) и, в частности, клетчатки заключается в прерывании этого «порочного круга» путём фиксирования токсинов на поверхности клетчатки с последующим их выведением [57].

ПВ являются источником калия и оказывают диуретическое действие, то есть способствуют выведению воды и натрия из организма.

Дефицит ПВ в питании считается одним из многих факторов риска развития различных заболеваний: синдрома раздраженной кишки, гипомоторной дискинезии толстой кишки, синдрома функциональных запоров, рака толстой и прямой кишки, дивертикулеза кишечника, грыжи пищеводного отверстия диафрагмы, желчнокаменной болезни, атеросклероза и связанных с ним заболеваний, ожирения, сахарного диабета, метаболического синдрома, варикозного расширения и тромбоза вен нижних конечностей и ряда других заболеваний.

Важно учитывать, что ПВ способны усиливать газообразование у больных с метеоризмом и болевым синдром у пациентов с выраженной кишечной перистальтикой. При воспалительных заболеваниях кишечника и ускорении кишечной перистальтики необходимо ограничение поступления с пищей ПВ [58].

Рафинированные пищевые продукты приобрели широкое распространение, особенно в экономически развитых странах. В 20-ом веке стали производить и производят до сих пор рафинированные продукты, полностью или почти полностью освобожденные от ПВ: сахар, многие кондитерские изделия, мука тонкого помола, осветленные соки фруктов, ягод и овощей и т.д. Как следствие этого, в настоящее время у большинства населения Земли наблюдается «вестернизация» диеты: 60% и более от суточного рациона составляют рафинированные продукты, при таком питании в организм поступает 10-25 г ПВ в сутки. При таком рационе использование ПВ снижено на фоне увеличенного потребления белков и животных жиров. В нашей стране за последние 100 лет потребление ПВ уменьшилось более, чем в два раза.

По мнению диетологов, от дефицита клетчатки в наши дни страдают практически все жители планеты. Чрезмерное увлечение рафинированными продуктами века явилось причиной значительного увеличения распространенности так называемых болезней цивилизации: ожирения, сахарного диабета, атеросклероза, заболеваний толстой кишки [59].

В Гигиенических требованиях безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов, утвержденных Минздравом России в 2001 году, расчетная физиологическая потребность в ПВ определена в 30 г/сут при энергоценности рациона в 2500 ккал. По рекомендациям ВОЗ, принятой нормой считается поступление в организм со съедаемой пищей 25-35 г ПВ в сутки [60].

Особое значение приобретает обогащение рационов растительными волокнами в пожилом возрасте и у лиц с наклонностью к запорам. При хронических заболеваниях толстой кишки требуется увеличение содержания в рационе количества ПВ [61].

90% нашего рациона составляют продукты, не содержащие ПВ вообще: мясо, молочные продукты, рыба, яйца и т.д. Лишь 10% суточного рациона дают шанс получить столько ПВ, сколько необходимо организму. Растительные продукты существенно разнятся по количеству и качественному составу, содержащихся в них ПВ. Только при разнообразном питании, т.е. при введении в рацион нескольких видов растительной пищи (крупы, хлеб из цельного зерна, овощи, фрукты, зелень), организм получает как необходимое количество ПВ, так и волокна с разным механизмом действия.

К продуктам с наиболее высоким содержанием клеточных оболочек относятся: хлеб из муки грубого помола, пшено, бобовые (зеленый горошек, фасоль), сухофрукты (в особенности чернослив), свекла. Значительные количества клеточных оболочек содержат также гречневая и ячневая крупы, морковь. Наибольшие количества пектиновых веществ содержатся в яблоках, сливах, черной смородине и свекле. К продуктам, богатым различными ПВ, относятся также: орехи (миндаль, арахис, фисташки), капуста, абрикосы, ежевика, кокос, киви, петрушка, попкорн, водоросли.

Низким содержанием клеточных оболочек характеризуются: рис, картофель, томаты, кабачки (приложение А) [3].

Одной из причин трудности определения эффектов ПВ является то, что волокна представляют собой комплекс веществ, а не единое химическое соединение. Различные типы ПВ могут оказывать разные физиологические эффекты. Кроме того, волокна потребляются не изолировано. Пища, богатая ими, содержит большое количество других веществ, некоторые из которых могут препятствовать развитию заболевания.

Некоторые из полезных для здоровья свойства ПВ обусловлены влиянием витаминов, минеральных веществ, микроэлементов, всегда присутствующих в растительной пище [44].

Теперь не вызывает сомнения, что применение ПВ следует рассматривать как наиболее физиологический подход к профилактике патологии ЖКТ, ишемической болезни сердца, так и лечению функциональных заболеваний пищеварительной, сердечно-сосудистой и других систем. Разнообразие растительного мира, использование новых, выведенных селекционерами сортов злаковых, овощей, фруктов и ягод, специальное извлечение ПВ из нетрадиционных источников - все это причина непрекращающихся исследований по данному вопросу.

2 Общие сведения о липидном обмене

Липидный обмен – выработка и расщепление липидов в организме.

Объем экспериментальных данных по различным особенностям функционирования транспортной системы в последние годы стремительно возрастает, в том числе - по регуляции липидного метаболизма. С пищей в организм ежедневно поступает от 80 до 150 г липидов, а вместе с ними незаменимые жирные кислоты и жирорастворимые витамины. Синтез и разрушение липидов происходят практически во всех тканях организма. Вместе с тем, ряд тканей выполняют специализированные функции. Так, поглощение экзогенных липидов происходит в стенках тонкого кишечника; запасание – в жировой ткани; выведение продуктов распада липидов – в кишечнике, почках, легких (рисунок 11) [62, 63]. Центральное место в липидном метаболизме занимает печень, в которой происходит пересечение путей метаболизма липидов, углеводов и белков. Здесь же синтезируется основная масса белков транспорта липидов, также продукты деградации липидов, выводящиеся из организма [64].

Липиды выполняют самые разнообразные функции. Они входят в состав клеточных мембран, служат предшественниками стероидных гормонов, желчных кислот, простагландинов и фосфоинозитидов. В крови содержатся отдельные компоненты липидов (насыщенные жирные кислоты, мононенасыщенные жирные кислоты и полиненасыщенные жирные кислоты), триглицериды (ТГ), ХС, его эфиры и фосфолипиды (ФЛ). Все эти вещества не растворимы в воде, поэтому в организме имеется сложная система транспорта липидов. Свободные (неэтерифицированные) жирные кислоты переносятся кровью в виде комплексов с альбумином. ТГ, ХС, эфиры ХС, ФЛ транспортируются в форме водорастворимых ЛП [65].

Существуют два пути метаболизма липидов и ЛП: экзогенный или пищевой и эндогенный. Более 95 % липидов, поступающих с пищей, являются ТГ, остальное количество составляют ФЛ, свободные жирные кислоты, ХС (в пищевых продуктах присутствует в виде этерифицированного ХС) и жирорастворимые витамины. Пищевые ТГ в желудке и двенадцатиперстной кишке под влиянием желудочной и панкреатической липаз превращаются в моноглицериды и свободные жирные кислоты. Эфиры ХС, содержащиеся в пище, подвергаются диэтерификации в свободный ХС по тому же механизму. Моноглицериды, свободные жирные кислоты и свободный ХС под действием желчных кислот растворяются и абсорбируются энтероцитами, затем соединяются с ТГ и вместе с ХС включаются в хиломикроны (рисунок 12) [66].

Рисунок 11 - Ключевые процессы в системе липидного метаболизма

Рисунок 12 – Метаболизм липопротеидов

Хиломикроны почти полностью (на 80-95%) состоят из ТГ и поэтому являются основной транспортной формой экзогенных ТГ, перенося их из энтероцитов тонкого кишечника в кровоток. В плазме крови апопротеин C-2 на хиломикронах активирует эндотелиальную липопротеинлипазу, под действием которой 90 % ТГ в хиломикронах расщепляется до глицерина и свободных неэтерифицированных жирных кислот, которые используются в жировой и мышечной ткани в качестве энергетического субстрата [67]. Изменения липидного состава крови формируются всегда на фоне глубоких микроэкологических нарушений в кишечнике. Микроорганизмы желудочно-кишечного тракта активно вмешиваются в холестериновый метаболизм, воздействуя непосредственно на ферментные системы клеток хозяина, участвующие в рециркуляции желчных кислот и синтезирующие эндогенный ХС. Остатки хиломикронов, содержащие ХС захватываются гепатоцитами и быстро удаляются из кровотока. Этот процесс опосредован аполипопротеином Е [68].

В печени из эндогенных ТГ и ХС синтезируются липопротеиды очень низкой плотности (ЛПОНП). Он находятся в кровотоке до тех пор, пока ТГ, содержащиеся в них, не поступят в периферические ткани. Остатки ЛПОНП захватываются гепатоцитами. В результате образуются липопротеиды низкой плотности (ЛПНП), которые транспортируют ХС в периферические ткани [69]. Освобожденный ХС участвует в синтезе мембран и в метаболизме. В то время как в клеточных мембранах происходит обмен веществ, неэтерифицированный ХС высвобождается в плазму, где связывается с липопротеидами высокой плотности (ЛПВП). Сложные эфиры ХС ЛПВП превращаются в ЛПОНП и, в итоге, в ЛПНП. Посредством этого цикла ЛПНП доставляет ХС в клетки, а из внепеченочных зон ХС возвращается с помощью ЛПВП (рисунок 13) [70, 69, 64, 66].

Вновь синтезированные ЛПОНП секретируются из печени в кровоток и получают дополнительно аполипопротеины C-2 и E (апоC-2 и апоE) от ЛПВП. Основной аполипопротеин, стабилизирующий структуру частицы - это одна из изоформ апоB (апоB-100). В процессе циркуляции в крови ЛПОНП подвергаются гидролизу под действием фермента липопротеинлипазы, находящейся на стенках сосудов многих тканей организма (жировая ткань, сердечная мышца, скелетные мышцы). При этом ТГ расщепляются и переносятся в соответствующие ткани, где используются либо как источник энергии либо как жировые отложения для более позднего использования [71].

Гидролиз ЛПОНП приводит к существенному уменьшению размера частицы, амфифильные аполипопротеины (апоC2 и апоE) переносятся обратно на ЛПВП. Кроме этого так называемые эфиры холестерина-переносящий белок переносит на ЛПОНП эфиры ХС от ЛПВП в обмен на ФЛ и ТГ [66, 70, 71].

Рисунок 13 - Полная схема липидного обмена

По мере гидролиза под действием липопротеинлипазы ЛПОНП превращаются в липопротеины промежуточной плотности (ЛППП). Около 50 % ЛППП удаляется посредством взаимодействия апоB и апоE с рецептором. Остальные ЛППП подвергается дальнейшему гидролизу под действием печeночной липазы, теряют апоE и превращаются в ЛПНП, который содержит одну молекулу апоB-100 в качестве белковой компоненты частицы. ЛПНП взаимодействуют с ЛПНП-рецептором и поглощаются печенью, где полностью деградируют [71, 72].

В печени по принципу «обратной связи» компенсаторно уменьшается синтез желчных кислот в гепатоцитах, вследствие чего повышается содержание ХС в плазме крови в связи с отсутствием необходимости восполнять ежедневные физиологические потери (фекальная экскреция) желчных кислот и ХС в нарушенном цикле энтерогепатической циркуляции (рисунок 14) [66, 73].

ЛПОНП переносят триацилглицеролы, а также ФЛ, ХС и его эфиры из печени в другие ткани.

Рисунок 14 - Схема внутрисосудистого и тканевого метаболизма липопротеидов разных классов

Синтез ЛПОНП прямо коррелирует с повышением содержания свободных жирных кислот в гепатоцитах, что наблюдается при поступлении в организм больших количеств жиров с пищей, а в случаях усиления высвобождения адипоцитами свободных жирных кислот, которые поступают в кровоток (при ожирении, сахарном диабете, резистентном к терапии) [74].

В свою очередь, ЛПВП обеспечивают обратный транспорт ХС из внепечeночных тканей к печени. В новообразованных ЛПВП содержатся апопротеины А1 и А2. Апопротеин А1 синтезируется также в кишечнике, где входит в состав хиломикронов, но при липолизе в крови быстро переносятся на ЛПВП. Апопротеин С синтезируется в печени, выделяется в кровоток и уже в кровотоке переносится на ЛПВП, который похож на диск: фосфолипидный бислой, включающий свободный ХС и апопротеин. Апопротеин А1 - активатор фермента лецитин-холестерин-ацилтрансферазы. Этот фермент связан с поверхностью ЛПВП в плазме крови. Лецитин-холестерин-ацилтрансфераза катализирует реакцию между ФЛ, ЛПВП и свободным ХС [75, 76]. При этом образуются эфиры ХС и лизолецитин. Неполярные эфиры ХС перемещаются внутрь частицы, освобождая место на поверхности для захвата нового ХС, лизолецитин - на альбумин крови. Неполярное ядро раздвигает бислой, ЛПВП приобретает сферическую форму. Этерифицированный ХС переносится с ЛПВП на ЛПОНП, ЛПНП и хиломикроны специальным белком ЛПВП - переносчиком эфиров холестерола (апопротеин D), в обмен на ФЛ и ТГ. ЛПВП поглощается клетками печени с помощью рецепторного эндоцитоза через рецептор апопротеина Е [77].

Специфичности рецепторов апопротеинов Е и В-100 частично пересекаются. Они находятся на поверхности мембран клеток в клатриновой кавеоле. При соединении с лигандами кавеола замыкается в везикулу и ЛП эндоцитируется. В лизосомах эфиры ХС гидролизуются и ХС поступает в клетку [71, 78].

Нарушения обмена липидов приводят к развитию многих заболеваний.

2.1 Основные классы липидов и липопротеидов, участвующие в липидном обмене

Липиды - это жиры, которые синтезируются в печени или поступают в организм с пищей.

Все липиды гидрофобны и большинство из них не растворимы в крови. Основной транспортной формой липидов являются сферические гидрофильные структуры, липопротеиды (ЛП), в которых ХС, ТГ и ФЛ связаны с поверхностными белками, аполипопротеинами, которые также являются кофакторами и лигандами для липид-содержащих энзимов. ЛП классифицируются по размеру и плотности [78].

Все ЛП имеют сходную структуру. Они состоят из центральной части («ядра»), содержащей нерастворимые в воде липиды (эфиры, ХС, ТГ, жирные кислоты) и из оболочки, состоящей из особых белковых молекул (апопротеинов) и растворимых в воде липидов – нестерифицированного ХС и ФЛ. Молекулы апопротеинов имеют неполярный гидрофобный участок, который связан с липидами, и полярный гидрофильный участок, расположенный на поверхности сферической частицы ЛП, и обращенный к окружающей липопротеид - водной среде (плазме крови). Гидрофильный участок апопротеина образует водорастворимые связи с молекулами воды. Такая структура ЛП определяет их свойство быть частично водорастворимыми, а частично – жирорастворимыми [70, 79].

В тканях человека количество разных классов липидов существенно различается. В жировой ткани жиры составляют до 75% сухого веса. В нервной ткани липидов содержится до 50% сухого веса. Общее количество липидов в норме не превышает 10 - 13% [66].

2.1.1 Липиды плазмы крови

В плазме (сыворотке) крови присутствуют три основных класса липидов: ХС и его эфиры; ТГ; ФЛ (таблица 1).

ХС - органическое соединение, природный жирный (липофильный) спирт, содержащийся в клеточных мембранах всех живых организмов за исключением прокариот. Нерастворим в воде, растворим в жирах и органических растворителях. Представлен молекулой, содержащей четыре конденсированных кольца, разветвленную боковую цепь из восьми углеродных атомов и гидроксильную группу (рисунок 15) [81].

Рисунок 15 - Структурное строение холестерина

ХС выполняет важные биохимические функции в человеческом организме. Он необходим для синтеза стероидных и половых гормонов, образования желчи, выработки витамина D3. Он входит в состав всех клеточных мембран организма. В крови две трети ХС находится в свободной форме. Нарушение его обмена приводит к развитию атеросклероза.

ХС синтезируется главным образом в печени из ацетата. Важным этапом синтеза ХС является превращение 3-гидрокси-3метилглютарил коэнзима А (ГМГ-КоА) в мевалоновую кислоту при участии фермента ГМГ-КоА редуктазы. Помимо печени, ХС в меньших количествах синтезируется во многих других органах. 20-30% ХС поступает в организм с пищей. ХС, поступивший в просвет тонкого кишечника в составе желчных кислот, подвергается обратному всасыванию и вновь поступает в печень (энтеропеченочный путь обмена ХС) [82]. Он бывает свободным и этерифицированным. Свободный ХС метаболически активен, в то время как его эфиры являются его транспортируемой и депонируемой формой. Этерифицированный ХС преобладает в составе коры надпочечников, в плазме, в атеросклеротических бляшках. В составе клеточных мембран ХС находится в свободном состоянии.

ХС нерастворим в воде и в чистом виде не может доставляться к тканям организма при помощи крови. Вместо этого холестерин в крови находится в виде хорошо растворимых комплексных соединений с особыми белками-транспортерами, так называемыми аполипопротеинами [83].

Таблица 1 - Основные липиды и липопротеиды, участвующие в метаболизме жиров

Показатель	Локализация	Функция
Апопротеины
Апопротеины А-1	Липопротеины низкой плотности (ЛПНП)	Основной компонент ЛПНП
Апопротеины А-2	ЛПНП	Не известна
Апопротеины В-100	Липопротеиды очень низкой плотности (ЛПОНП), липопротеиды промежуточной плотности (ЛППП), ЛПНП, липопротеид (а)	Лиганд рецептора ЛПНП
Апопротеины С-2	Хиломикроны, ЛПОНП, ЛПНП	Кофактор ЛП-липазы
Апопротеины Е	Хиломикроны, ЛПОНП, ЛПНП	Лиганд рецептора ЛПНП
Апопротеин (а)	Липопротеид (а)	Не известна
Энзимы
АВСА1	В пределах клеток	Участие во внутриклеточном транспорте ХС к мембране
СЕТР	ЛПНП	Опосредует перемещение эфиров ХС ЛПНП к ЛП очень низкой плотности
LCAT	ЛПНП	Этерификация свободного ХС для транспорта на ЛПНП
Apo E	Хиломикроны, ЛПОНП, ЛПНП	Лиганд рецептора ЛПНП
Apo (a)	Липопротеид (а)	Не известна

К периферийным тканям ХС транспортируется хиломикроном, ЛПОНП и ЛПНП. К печени, откуда затем он удаляется из организма, его транспортируют аполипротеины группы ЛПВП [77].

ТГ - это эфиры жирных кислот и спирта глицерина, которые входят в состав различных липопротеидов, постоянно подвергаясь гидролизу под действием липопротеидлипазы плазмы крови (рисунок 16). ТГ входят в состав практически всех ЛП, преобладают в хиломикронах и ЛПОНП. После приема жирной пищи концентрация ТГ в крови быстро повышается, но в норме через 10-12 часов возвращается к исходному уровню. В настоящее время для оценки нарушения обмена ТГ предложены тесты с пищевой нагрузкой жиром (сливочное масло, сметана) [84].

Рисунок 16 – Структура триглицеридов: радикалы R¹, R² и R³ могут быть различны

У больных сахарным диабетом, метаболическим синдромом, ожирением концентрация ТГ длительное время (более 12 часов) не приходит к норме. Этот феномен в мировой литературе обозначается термином постпрандиальная дислипидимия. Больные с постпрандиальной дислипидимией предрасположены к развитию атеросклероза [83].

ТГ вместе с ХС являются основными источниками жира, циркулирующего у нас в крови. Все они нужны: ХС - для построения сильных клеток, ТГ - для энергии. Но когда в течение длительного времени они остаются на высоких уровнях, возникает проблема. При высоком содержании ХС в крови проблема заключается в том, что он закупоривает артерии. Суть же проблемы с ТГ пока не ясна [77].

ФЛ - сложные эфиры многоатомных спиртов и высших жирных кислот. Получили свое название из-за остатка фосфорной кислоты, придающего им свойства амфифильности, [66] который соединен с добавочной группой атомов различной химической природы (рисунок 17). Они состоят из полярной «головки», в состав которой входит глицерин или другой многоатомный спирт, отрицательно заряженный остаток фосфорной кислоты и часто несущая положительный заряд группа атомов, и двух неполярных «хвостов» из остатков жирных кислот. Главная особенность ФЛ состоит в том, что «головка» у них гидрофильна, а «хвосты» гидрофобны. Это позволяет при нахождении в толще водной среды образовывать бислой - двойной слой фосфолипидных молекул, где гидрофильные головы с обеих сторон соприкасаются с водой, а гидрофобные хвосты упрятаны внутрь бислоя и тем самым защищены от контакта с водой. Клетки или отделы клеток, окруженные таким бислоем, отличаются по составу и набору молекул от окружающей среды, поэтому химические процессы в клетке разделены и ориентированы в пространстве, что необходимо для регуляции метаболизма [85].

Рисунок 17 – Общее структурное строение фосфолипидов

Они содержатся в нервной ткани, участвуют в транспорте жиров, жирных кислот и ХС. Благодаря своим свойствам ФЛ не только являются основой всех клеточных мембран, но и выполняют другие функции: образуют поверхностный слой ЛП крови, выстилают поверхность альвеол, предотвращая слипание стенок во время выдоха. Между плазмой и эритроцитами происходит обмен ФЛ, которые играют важнейшую роль, поддерживая в растворимом состоянии неполярные липиды. Некоторые ФЛ участвуют в передаче гормонального сигнала в клетке [86].

2.1.2 Липопротеиды плазмы крови

Изучение ЛП начинается с 1929 г., когда М. Mashboeuf во Франции выделил из лошадиной плазмы методом многократного высаливания сложный белок, содержащий 59 % белка и 41 % липидов. Проведенные почти сорок лет спустя исследования Климова А.Н. и Петрова-Маслакова Л.Г. показали, что сложный белок один из классов плазменных ЛП, а именно ЛПВП [87].

ЛП плазмы крови – транспортная форма липидов в организме человека. Они осуществляют транспорт липидов как экзогенного (пищевого), так и эндогенного происхождения [88]. Поскольку жиры и другие липиды нерастворимы или очень малорастворимые в воде и в жидкостях организма, необходимы специальные механизмы для транспорта этих веществ кровью. Транспорт осуществляется в составе особых частиц – ЛП [89], представляющие собой водорастворимые липидно-белковые глобулярные структуры, в состав которых входят молекулы белков, свободного ХС, эфиров ХС и ФЛ, связь между которыми осуществляется посредством гидрофобных и электростатических взаимодействий. Белки, входящие в состав ЛП частиц, называют аполипопротеинами или апобелками (рисунок 18). Апобелки выполняют структурную и адресную функции. Благодаря высокоспецифичному взаимодействию между апобелками ЛП и белками-рецепторами на клеточной мембране, осуществляется рецепторопосредованное связывание ЛП с клетками. Полярные части молекул апобелков, ФЛ и свободного ХС образуют внешний, гидрофильный слой ЛП частиц, в то время как эфиры ХС и ТГ составляют их гидрофобное ядро. Основными ЛП в зависимости от их плотности, размеров и состава входящих липидов и апобелков являются: хиломикроны, ЛПОНП, ЛППП, ЛПНП, ЛПВП [90].

Рисунок 18 – Общая структура липопротеидов

ЛПОНП содержат около 55% ТГ, 19% ХС и 8% белка (апопротеинов В-100, Е, С-I и C-II). Этот класс ЛП синтезируются в печени. Их плотность варьирует от 0,95 до 1,006 г/мл. ЛПОНП транспортируют эндогенные ТГ, ФЛ, ХС и его эфиры. Благодаря ЛПОНП из печени удаляются ремнанты хиломикронов и ТГ, образовавшиеся из свободных жирных кислот плазмы. Таким образом, эти ЛПОНП выполняют роль переносчика липидов в организме. Так как они в основном состоят из эндогенных ТГ и в меньшей степени из эфиров ХС, поэтому их повышенное содержание в плазме крови проявляется гипертриглицеридемией. Она часто диагностируется у больных с инсулин-независимым сахарным диабетом, гипотиреозом, ожирением. Гипертриглицеридемия в сочетании с низким уровнем ЛПВП служит фактором риска развития атеросклероза [91].

ЛПОНП подвергаются липолизу в плазме и превращаются в ЛППП.

ЛППП содержат в своем составе больше эфиров ХС, нежели ЛПОНП. Основные транспортные и функциональные белки ЛППП - апоВ-100 и апоЕ. Благодаря этим белкам ЛППП связываются с соответствующими рецепторами печени. Плотность ЛППП - 1,006-1,019 г/мл. Повышенная концентрация в крови ЛППП проявляется гиперхолестеринемией им гипертриглицеридемией. Довольно редко в клинической практике встречается изолированное повышение ЛППП, которое связано с наследственным дефектом печеночной липопротеидлипазы и сопровождается прогрессирующим атеросклерозом. В норме часть ЛППП захватывается рецепторами печени, а часть гидролизуется и превращается в ЛПНП.

ЛПНП - класс ЛП крови, являющийся наиболее атерогенным. Удельная плотность ЛПНП составляет 1,019-1,063 г/мл. Они содержат около 6% ТГ, 50% ХС и 22% белка. Они состоят в основном из эфиров ХС, их функциональным апопротеином является белок апоВ-100 [71].

Примерно две трети быстро обменивающегося пула ХС синтезируется в организме, преимущественно в печени (эндогенный ХС) и одна треть поступает в организм с пищей (экзогенный ХС). Ключевым ферментом, определяющим скорость синтеза эндогенного ХС, является гидроксил метил-глутарил-КоА-редуктаза (ГМГ-КоА-редуктаза). Примерно 40-60% всех ЛПНП захватываются гепатоцитами при участии аполипопротеина В и липопротеинлипазы печени [93]. Повышенное содержание в плазме ЛПНП отчетливо связано с развитием коронарного, каротидного и периферического атеросклероза. Однако для того чтобы ЛПНП стали атерогенными, они должны подвергнуться модификации. Причиной модификации чаще всего служит процесс перекисного их окисления. Окисленные ЛПНП изменяют свои свойства в двух направлениях: сначала, нарушается их взаимодействие с рецепторами печени, потом они становятся активными хемоатрактантами (раздражителями) для моноцитов. Активированные моноциты крови проникают в субэндотелиальное пространство сосуда, превращаясь в макрофаги, которые фагоцитируют модифицированные ЛПНП и превращаются в пенистые клетки, т.е. клетки, переполненные эфирами ХС. Активированные макрофаги и пенистые клетки высвобождают биологически активные вещества: факторы роста, провоспалительные цитокины, молекулы адгезии. В результате в большей мере усиливаются процессы проницаемости эндотелия и роста атеросклеротической бляшки, что в конечном итоге ведет к сужению просвета сосуда и разрыву покрышки бляшки с образованием внутрисосудистого тромба [94].

ЛПВП – самые мелкие и плотные частицы ЛП 8-11 нм в диаметре. Они содержат 5% ТГ, 22% ХС 40% аполипопротеинов А-I, A-II и С. Их называют антиатерогенные ЛП частицы, которые осуществляют обратный транспорт ХС из сосудистой стенки и макрофагов в печень, откуда он выводится из организма в составе желчных кислот [95].

Синтез полноценных ЛПВП происходит при обязательном участии хиломикронов, ЛПОНП и ЛПНП в энтероцитах и печени. Выделяют два подкласса ЛПВП: ЛПВП-2 и ЛПВП-3. ЛПВП- 3 имеют дискоидную форму, и как раз они начинают активный захват ХС из периферических клеток и макрофагов, превращаясь в ЛПВП-2 - сферические частицы, богатые эфирами ХС и ФЛ. Апобелки апоА-1 и апоА-2 представляют собой основные белки ЛПВП, посредством которых ЛПВП связываются с рецепторами печени и клетками сосудистой стенки.

Уровень ХС ЛПВП в плазме имеет обратную зависимость с развитием атеросклероза; чем ниже содержание ХС ЛПВП, тем выше вероятность развития атеросклероза [96].

Липопротеин (а) близок по своим физико-химическим свойствам к ЛПНП, отличаясь от них наличием в оболочке дополнительного белка - апопротеина (а). Последний близок по своим свойствам к плазминогену и поэтому может конкурировать с ним за места связывания на фибрине и, таким образом, ингибировать фибринолитическую активность крови. Липопротеин (а) относится к числу атерогенных ЛП: их повышенный уровень в крови почти всегда ассоциируется с развитием атеросклероза, ишемической болезни сердца и высоким риском тромботических осложнений [79].

Хиломикроны представляют собой соединение молекулы жиров, ФЛ и эфиров ХС со специфическим белком – апопротеином В. Образуются они в лимфатической системе ворсинок кишечника. Их диаметр составляет около 1 мкм. Хиломикроны содержат около 2% белка, 7% ФЛ, 6% ХС и его эфиров, 85% жиров.

Из-за своих относительно больших размеров хиломикроны не способны проникать из клеток кишечника в кровеносные сосуды, а диффундируют в лимфатические сосуды кишечных ворсинок. Они переносят до половины всех ТГ и ХС лимфы. Новосинтезированные хиломикроны содержат интегральный белок В-48. Апопротеин В встраивается в ЛП в гранулярном эндоплазматическом ретикулуме, где синтезируются триацилглицеролы. В аппарате Гольджи к белкам добавляются углеводы. Они высвобождаются из клеток кишечника обратным пиноцитозом. После этого хиломикроны поступают в лимфатические сосуды ворсинок и уносятся лимфой. Попадая в кровоток, они получают апопротеины С и Е от ЛПВП. На стенках капилляров находится липопротеинлипаза (прикрепляется к ним протеогликановыми цепями гепарансульфата). В печени также есть своя липаза, но она менее эффективно атакует хиломикроны. Апопротеин С2 активирует липопротеинлипазу, которая расщепляет ТГ хиломикрона до ди- и моноглицеридов, а затем — до свободной жирной кислоты и глицерола [97]. Жирные кислоты транспортируются в мышечные и жировые ткани или связываются с альбумином в крови. По мере липолиза хиломикроны теряют большинство своих триацилглицеролов, относительное содержание ХС и его эфиров увеличивается. Диаметр остатка хиломикрона уменьшается. Апопротеин С2 возвращается на ЛПВП, апопротеин Е сохраняется. Остатки хиломикронов поглощаются печенью. Поглощение осуществляется через рецепторный эндоцитоз, с помощью рецепторов апопротеина Е. В печени эфиры ХС и триацилглицеролы окончательно гидролизуются [98].

3 Материалы и методы исследования

Для получения в эксперименте объективных и воспроизводимых данных необходимо иметь генетически стандартных животных, определенного микробиологического статуса, необходимы стандартные условия их содержания и кормления.

3.1 Лабораторные животные

В настоящее время доклинические токсикологические исследования при применении ПВ и их готовых пищевых добавок проводят на здоровых животных [Новые биометоды].

В работе использовано 54 белых растущих крыс свободных от возбудителей патогенных заболеваний. В зависимости от рациона питания экспериментальные животные были разделены на 3 группы: первая группа получала корм с адекватным количеством ПВ, вторая – с избытком ПВ, третья – с явным дефицитом в рационе ПВ. При этом было произведено еще разделение на самцов и самок, тем самым образовано 6 групп по 9 особей в каждой. Нечетные номера присвоены самцам, четные – самкам.

Стандартность кормления животных обеспечить на все 100 % практически невозможно, но надо стремиться максимально приблизиться к этой цифре. Стандартизировать состав рациона очень сложно, так как в разных странах есть свои особенности по типу и виду использования кормов. Это обуславливается климатическими условиями, традициями в области сельскохозяйственного производства и экономической целесообразностью.

Во всем мире принята система стандартизации рационов не по составу отдельных видов ингредиентов, а по нормам кормления [Регламентация экспериментов на животных – этика, законодательства, альтернативы. / Под ред. Н. А. Горбуновой. – М., 1998.]. [Международные рекомендации по проведению медико-биологических исследований с использованием животных // Ланималогия. – 1993. - №1. – С.29.]

Продукты питания закупались на продуктовом рынке, путем случайной выборки, частично в оренбургской розничной торговой сети. Источниками ПВ служили свежие яблоки, отруби и цветная капуста. Источником воды служила дистиллированная вода, лишенная примесей солей.

Лабораторные животные получали корм один раз в сутки в утренние часы. Перед первым кормлением и забоями для отслеживания динамики веса производилось взвешивание крыс на электронных весах.

Длительность эксперимента составила 56 дней, а «балансового» периода - 2 дня ( -го, -го дни эксперимента).

3.2 Сыворотка крови

В качестве источника ХС, ТГ, ЛП использовали сыворотку крови лабораторных животных, представляющую собой плазму крови, лишённую фибриногена и потому не свертывающуюся в присутствии коагулазы, в том числе бактериальной.

Сыворотки получали путём естественного свёртывания плазмы (нативные сыворотки). В сыворотках сохранена большая часть Ат, а за счёт отсутствия фибриногена резко увеличивается стабильность.

Для получения сыворотки стерильно взятую кровь ставили в термостат от 30 до 60 минут, пастеровской пипеткой отслаивали сгусток от стенки пробирки и помещали в холодильник до следующего дня. Отстоявшуюся сыворотку отсасывали стерильным дозатором в стерильную микропробирку.

Нами были использованы 54 индивидуальных образцов сывороток крови крыс различного компонентного состава. Компонентный состав каждой из которых был исследован с помощью наборов реагентов.

3.3 Методы анализа

Более 80 % используемых в клинико-диагностических лабораториях методов биохимического исследования базируется на принципе абсорбционной фотометрии.

Абсорбционный анализ основан на физическом свойстве веществ избирательно поглощать монохроматический поток световой энергии. С его помощью измеряется «светопоглощение» раствора или интенсивность окраски, которая непосредственно связана с концентрацией вещества в растворе.

Измерение интенсивности потока световой энергии, прошедшей через исследуемый раствор, всегда производится относительно раствора сравнения, при приготовлении и исследовании которого применяются растворитель и кюветы, аналогичные используемым в опытном образце. Вследствие этого поглощение светового потока стенками кюветы и отражение его в окружающую среду кюветой и растворителем могут не приниматься во внимание.

Весьма важное условие получения надежных результатов при выполнении абсорбционной фотометрии – достижение монохроматизации светового потока. Для этой цели наиболее часто применяются светофильтры. При выполнении клинико - биохимических исследований фотометрия чаще всего проводится в области длин волн 400–700 нм [Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике / В.С.Камышников. – 3-e изд. – М. : МЕДпресс-информ, 2009. – 896 с. : ил.].

Атомно – абсорбционная спектрометрия используется для количественного определения концентраций порядка 70 элементов в растворах, в том числе следы металлов в микропробах крови и тканей. Его применяют в централизованных и специализированных лабораториях, лабораторных отделениях диагностических центров, токсикологических лабораториях для определения общего кальция, железа, меди, хрома, кобальта, селена, свинца и других [Меньшикова, В. В. Клинико – лабораторные аналитические технологии и оборудование: учебное пособ. для студ. сред. проф. учеб. заведений / под ред. проф. В.В. Меньшикова. – М.: Издательский центр «Академия». – 2007. – 240 с.]. Данный метод наиболее распространен в Российской Федерации, странах СНГ и Балтии.

Принцип работы атомных абсорбциометров основан на поглощении ультрафиолетового или видимого излучения атомами газа. Для перевода образца растворенного вещества в газообразное состояние раствор впрыскивают в пламя. В качестве источника излучения применяют лампу с полым катодом из того же металла, что и определяется в данный момент и измеряют резонансное поглощение элемента в атомарном паре в области 200 – 800 нм фотоэлектрическим способом. Температура пламени определяется горючей газовой смесью (рисунок ).

Рисунок - Схема атомно – абсорбционной спектрометрии

Фотометры для атомной абсорбции – высокочувствительные приборы, но для каждого определяемого элемента должна быть своя лампа. Альтернативные источники излучения – безэлектродные шариковые лампы или лазеры. Для распыления используются разные эжекторы. Интенсивность распыления зависит от условий их работы, на что, в свою очередь, влияет вязкость раствора. Поэтому при работе с вязкими, богатыми белком жидкостями, такими, как сыворотка крови, разведение должно быть всегда одним и тем же. Поглощение А связано с концентрацией элемента с прямо пропорциональной зависимостью A=kcl (k – коэффициент чувствительности, а l – полый катод), исходя из которой, определяют концентрацию искомого элемента [В.М. Золотарев, Н.В. Никоноров, А.И. Игнатьев. «Современные методы исследования оптических материалов» Часть 1. Учебное пособие, курс лекций. СПб: НИУ ИТМО, 2010г. – 266 стр.

Барсуков В.И. Атомный спектральный анализ. М. Машиностроение, 2005.

Проспект Перкин Елмер. Руководство по атомной спектроскопии. Техника и Применения, 2008

Жукова Е.В., Золотарев В.М., Маргарянц Н.Б., Михайловский Ю.К. Оптические методы научных исследований. Учеб. пособие. Часть 1. СПб.: ИТМО, 2001, 66с.].

К достоинствам данного метода можно отнести чрезвычайно высокую специфичность при определении элементов (позволяющая использовать упрощенную пробоподготовку). В графитовых кюветах: низкие пределы обнаружения, малый расход пробы.

Недостатками метода перед традиционными методами анализа являются одноэлементный метод и ограниченная линейность области измерений (обычно 1:10). В графитовых кюветах: эффекты матрицы, летучесть соединений [Скальный, А. В. Биоэлементы в медицине / А.В. Скальный, И.А. Рудаков. – М.: Издательский дом «ОНИКС 21 век»: Мир. – 2004. – 272 с.]

Чтобы избежать необходимости измерять оптическую плотность растворов всегда в ультрафиолетовой области, применяют колориметрические методы.

Фотоэлектроколориметрическим методом определяют концентрации вещества в растворе по изменению силы тока в фотоэлементе при падении на него луча света, прошедшего через исследуемый раствор (прозрачный, окрашенный). Многие соединения, слабо поглощающие в видимой области, после реакции с другими веществами дают окрашенные продукты, количество которых однозначно связано с концентрацией исходного вещества.

При некоторых стандартных условиях и определенных концентрациях вещества проводится реакция, а затем измерение поглощения раствора. В качестве сравнения используется та же смесь, но без исследуемого вещества. Степень поглощения света, или коэффициент экстинкции, во многих случаях прямо пропорциональна интенсивности окраски раствора. Степень светопоглощения определяется в приборе – фотоэлектроколориметре – путем уравнения интенсивности света, прошедшего через исследуемый окрашенный раствор, и света, прошедшего через контрольный раствор [Руанет, В.В. Теория и техника лабораторных работ. Специальные методы исследования: Учебное пособие / Под ред. проф. А.К. Хетогуровой. – М.: ФГОУ «ВУНМЦ Росздрава». – 2007. – 176 с.].

Спектрофотометрическим методом определяется количество вещества в растворе или твердой среде по измерению светопоглощения волн строго определенной длины. Светопоглощение измеряется с помощью фотоэлемента по изменению силы тока, возникающего в нем, при падении на фотоэлемент светового потока, прошедшего через контрольный, а затем через исследуемые растворы или образцы. Измерение светопоглощения производится в приборе спектрофотометре, кварцевая призма которого выявляет монохроматические пучки спектра, соответствующие максимуму поглощения исследуемого вещества. Поэтому приборы данного класса имеют больший спектр возможностей, чем фотометры. Спектры поглощения в ультрафиолетовой (200 – 400 нм) и видимой (400 – 800 нм) областях отражают переходы связанных и несвязанных электронов в молекуле.

Схема работы со спектрофотометром похожа на работу с фотоэлектроколориметром, но на спектрофотометре работа осуществляется при монохроматическом свете и имеется возможность работы с неокрашенными растворами в разных областях спектра.

Нефелометрическим методом определяют концентрации, размеры и (или) формы частиц веществ, находящихся в состоянии тонких взвесей, эмульсий или коллоидных растворов, путем измерения интенсивности их светорассеяния.

Нефелометрия изучает свечение, которое возникает при освещении исследуемого объекта внешним источником, но в этом случае речь идет не о новом излучении, а о рассеянии света. Преимуществом данного метода заключается в том, что можно уловить как очень маленькие, так и очень большие величины рассеянного света.

Методы люминесцентного анализа широко применяются в различных областях клинической лабораторной диагностики вследствие высокой чувствительности и специфичности. Основанные на флюоресцентом анализе, они применяются для определения различных аналитов в скрининге и диагностике различных заболеваний, а также наблюдений за их течением и эффективностью лечения.

Различные виды флюорометрии и люминометрии и разработанные для них наборы биохимических и иммунохимических реактивов применяют для определения концентрации триглицеридов и холестерина в сыворотке крови, продуктов их биосинтеза и обмена и других элементов и продуктов их распада в организме.

Высокопроизводительный полуавтоматический биохимический анализатор CLIMA MC-15 (Испания). Предназначен для проведения биохимических и иммунотурбидиметрических исследований. Является открытой системой, в которой используется моно- и бихроматический режим измерения с высоким разрешением. Для монохроматизации светового потока используются интерференционные светофильтры: 340, 405, 500, 546, 578, 630 и 670 нм. Имеется термостат на 4 мультикюветы (37 ± 0,2 °С). Производительность прибора составляет: по конечной точке до 900 определений в час, по кинетике – до 600 определений в час. Методы измерений: абсорбция, конечная точка, кинетика, фиксированное время, дифференциальный и мультистандартный. Минимальный объем реактива – 0,5 мл. В анализаторе используются 15-секционные мультикюветы. Имеется возможность проводить одновременное измерение в 15 пробах по одному параметру (режим «batch»); разных проб по различным параметрам (режим «random»); одной пробы по 15 параметрам (режим «profile»). Количество программируемых методик в памяти – 60.

3.3.1 Методы исследования химического состава рациона для экспериментальных животных

При составлении рационов питания для трех экспериментальных групп лабораторных животных необходимо было исследовать его физико - химические показатели, содержание микроэлементов, соотношение белков, жиров, углеводов и пищевых волокон.

3.3.1.1 Метод определения содержания сухого вещества по ГОСТу Р52838-2007

Сущность метода заключается в высушивании навески корма до постоянной массы при температуре 105 ^оС.

Среднюю пробу корма измельчили. Далее алюминиевые бюксы высушили при температуре 105 ^оС в течение 1 часа, охладили в эксикаторе и взвесили.

Во взвешенный бюкс поместили навеску испытуемой пробы корма общей массой около 100 г и высушивали в сушильном шкафу при температуре 105 ^оС в течение 6 часов. После сушки бюкс закрыли крышкой, охлаждали в эксикаторе до комнатной температуры. Взвешивание проводили с точностью ± 0,01.

Пробы повторно подсушивали в течение 1 часа и после охлаждения снова взвесили. Массу считали постоянно, когда разница между первым и вторым взвешиванием высушенной и охлажденной пробы не превышает 0,5 % массы высушенной пробы.

Массовую долю сухого вещества у, %, в испытуемой пробе вычисляли по формуле

у=(m₃-m₁)/(m₂-m₁)*100,

где m₁ – масса бюкса, г; m₂ – масса бюкса с пробой до высушивания, г; m₃ – масса бюкса с пробой после высушивания, г; 100 – коэффициент пересчета в проценты.

3.3.1.2 Метод определения содержания сырой клетчатки по Геннебергу и Штоману

Метод основан на последовательной обработке навески испытуемой пробы растворами кислоты и щелочи, озолении и количественном определении органического остатка весовым методом.

Содержание сырой клетчатки выражают в виде массовой доли в % или в г на 1 кг сухого вещества.

Среднюю пробу корма измельчили на измельчителе проб и тщательно перемешали.

Пробы сушили в сушильном шкафу при температуре 65 ^оС до воздушно-сухого состояния, позволяющего размалывать их на лабораторной мельнице, и просеивали через сито с отверстиями диаметром 1 мм, тщательно перемешали.

Навеску измельченной воздушно-сухой пробы массой 2 г поместили в стакан вместимостью 600 мл, прилили 200 мл раствора серной кислоты, тщательно перемешали стеклянной палочкой.

Содержимое стакана довели до слабого кипения на электрической плитке и кипятили в течение 30 мин.

Далее содержимое стакана по стеклянной палочке переносили в нутч-фильтр. Жидкость фильтровали с помощью электрического вакуумного насоса. Промывание остатка и отсасывание жидкости проводили не менее пяти раз, добавляя каждый раз по 100 мл горячей дистиллированной воды.

Отключили вакуум и в нутч-фильтр налили ацетон в объеме, достаточном для покрытия остатка. Через некоторое время ацетон отсосали.

Содержимое нутч-фильтра перенесли снова в тот же стакан, тщательно смывая прилипшие частички горячим раствором гидроокиси калия, после чего этим же раствором объем жидкости довели до уровня 200 мл. Затем содержимое тщательно перемешали и кипятили на электрической плитке в течение 30 мин. После окончания кипения в стакан добавили не менее 50 мл дистиллированной холодной воды, содержимое перенесли в нутч-фильтр и фильтровали, как указано выше. Остаток на фильтре последовательно промывали горячей дистиллированной водой от щелочи и затем три раза ацетоном в объеме по 30 мл.

Нутч-фильтр с остатком сушили в течение 3 часов в сушильном шкафу при температуре 130 ^оС, охлаждали в эксикаторе, взвешивали и поместили на 3 часа в муфельную печь при 550 ^оС для озоления остатка. Охлажденный в эксикаторе нутч-фильтр снова взвешивали.

Одновременно с анализом испытуемых проб проводили холостой контроль, используя те же реактивы и те же процедуры, за исключением взятия навески пробы.

Массовую долю сырой клетчатки в сухом веществе испытуемой пробы у, %, вычисляли по формуле

y=((m₁-m₂)/m₃)*100,

где m₁ – масса нутч-фильтра с клетчаткой после высушивания, г; m₂ – масса нутч-фильтра после озоления, г; m₃ – масса навески, г; 100 – коэффициент пересчета в проценты.

3.3.1.3 Определение массовой доли жира по ГОСТу 13496.15-97

Метод основан на экстракции сырого жира из взвешенной анализируемой пробы растворителем и взвешивании обезжиренного остатка. Предназначен для испытания растительных кормов всех видов.

Для испытания кормов всех типов в качестве растворителя используют диэтиловый эфир.

Из фильтровальной бумаги размером 100 х 90 мм делали пакетик, обезжиривали в эфире в аппарате Сокслета в течение 1 ч, затем помещали в стеклянную бюксу и сушили в сушильном шкафу при температуре 105 ^оС в течение 1 ч, охладили в эксикаторе и взвесили. В высушенный и взвешенный пакетик поместили 1 – 2 г испытуемой пробы с погрешностью 0,001 г. Пакетик закрыли, поместили в ту же бюксу и высушили в сушильном шкафу при температуре 105 ^оС в течение 3 ч. Затем охладили в эксикаторе и взвесили.

Приготовленные таким образом пакетики с испытуемой пробой помещают в экстрактор аппарата Сокслета, в который налили эфир так, чтобы он покрывал пакетики. Эфир налили и в колбу аппарата Сокслета в таком количестве, чтобы после слива его из экстрактора общий объем растворителя не превышал 2/3 объема колбы. Затем собрали аппарат и оставили его в таком виде на ночь. Экстракцию проводили на следующий день, предварительно пустив воду в холодильник для охлаждения паров эфира.

Нагрели аппарат Сокслета на водяной бане. Экстракцию проводили 5 – 8 ч. По окончании экстракции пакетики вынимали из аппарата их так, чтобы дать испариться эфиру (в вытяжном шкафу), и сушили в тех же бюксах при температуре 105 ^оС в течение 1 ч. Затем их охладили в эксикаторе и взвесили. Последующее взвешивание проводили после повторной сушки в течение 30 мин. Сушку и взвешивание проводили до тех пор, пока разность результатов двух последних взвешиваний составило не более 0,001 г.

Массовую долю сырого жира в сухом веществе (х) в процентах вычисляли по формуле:

х=100(м₂-м₃)/(м₂-м₁),

где м₂ – масса бюксы с пакетиком и навеской до обезжиривания, г; м₃ – масса бюксы с пакетиком и навеской после обезжиривания, г; м₁ – масса высушенной бюксы с пакетиком, г; 100 – коэффициент пересчета в проценты.

3.3.1.4 Метод определения сырого протеина по ГОСТу

Взвесили навеску пробы с точностью 1 мг и перенесли в колбу Кьельдаля. Добавили 10 г сульфата калия и 0,3 г окиси меди (ǁ), а так же 25 мл серной кислоты. Тщательно перемешали, чтобы полностью смочить навеску. Сначала колбу нагревали умеренно, чтобы предотвратить поднятие пены до горла колбы или ее выбрасывание из колбы, поворачивая время от времени до тех пор, пока масса не обуглилась и не исчезла пена. Затем нагревание усилили до установления равномерного кипения.

После осветления жидкости продолжали нагревать в течение 2 часов и оставляли остыть.

Далее проводили отгонку аммиака. Для чего в остывшую колбу добавили 250 – 350 мл воды для полного растворения сульфатов, перемешали круговыми движениями и оставили остывать. Пипеткой перенесли в приемную колбу отгонного аппарата 25 мл раствора серной кислоты 0,05 моль/л. Добавили 100 – 150 мл воды и несколько капель смешанного индикатора.

Кончик трубки холодильника погрузили в жидкость, содержащуюся в приемной колбе, на глубину не менее 1 см. медленно по стенкам в колбу Кьельдаля ввели 100 мл раствора гидроксида натрия.

Колбу немедленно присоединили к отгонному аппарату и нагревали с такой интенсивностью, что за 30 мин собрали 150 мл дистиллята. После этого лакмусовой бумагой проверили рН дистиллята на кончике трубки холодильника (среда нещелочная).

Кончик трубки холодильника сразу после окончания дистилляции вынули из холодильника, чтобы предотвратить обратное засасывание.

В качестве контроля использовали сахарозу вместо испытуемой пробы. Контрольный анализ проводили в высушенном триптофане.

Массовую долю азота вычисляли по формуле

((V₁-V₂)T*0.014*100)/m=(1.4(V₀-V₁)T)/m ,

где V₀ – объем раствора серной кислоты, использованный при контрольном определении, мл; V₁ – объем раствора гидроокиси натрия, использованный при анализе пробы, мл; Т – нормальность раствора гидроокиси натрия, использованного для титрования; m – масса испытуемой навески, г.

Содержание протеина в корме вычисляли умножением содержания азота на коэффициент 6,25.

3.3.1.5 Методы определения сырой золы по ГОСТу 26226-95

Сущность метода заключается в определении массы остатка после сжигания и последующего прокаливания пробы.

Навески получали методами выше не менее 100г. Пробы высушивали при 60 – 65 ^оС до воздушно-сухого состояния.

Около 5 г испытуемой пробы взвесили в тигель, который предварительно прокаливали в течение не менее 30 мин в муфельной печи при температуре 550 ^оС, охладили в эксикаторе и взвесили с точностью 0,001 г.

Тигель, содержащий навеску, поместили на электрическую плитку и постепенно нагрели до обугливания испытуемой пробы. Тигель перенесли в муфельную печь и оставили его на 3 часа при 550 ^оС. После этого визуально проверяли наличие частиц угля в золе (их не должно быть). Затем тигель охлаждали в эксикаторе до комнатной температуры и быстро взвесили с точностью 0,001 г.

Массовую долю сырой золы (Х’) в процентах в испытуемой пробе вычисляли по формуле

X’=((m₂-m₀)*100)/(m₁-m₀),

где m₀ – масса пустого тигля, г; m₁- масса тигля с навеской испытуемой пробы, г; m₂ – масса тигля с сырой золой, г.

3.3.1.6 Метод определения кальция по ГОСТу 26570-95

Метод основан на сравнении поглощения резонансного излучения свободными атомами кальция, образующимися в пламени при введении в него анализируемых растворов золы (минерализата) и растворов сравнения с известной концентрацией данного элемента.

Спектрофотометрическим атомно-абсорбционным методом на «Формула ФМ-400» определяли содержание микроэлементов в пробе в мг/кг.

Навеску исследуемой пробы массой 0,5 – 2,0 г, взвешенную с точностью до 0,001 г, поместили в предварительно прокаленный и охлажденный тигель. Тигли поместили в холодную муфельную печь и повысили температуру до 200 – 250 ^оС. После прекращения выделения дыма температуру повысили до 525±25 ^оС и вели прокаливание в течение 4 – 5 ч при указанной температуре. Тигель охладили и золу смочили несколькими каплями дистиллированной воды, добавили 2 мл раствора соляной кислоты, разбавленной (1+1), и 5 – 10 мл дистиллированной воды, перемешали и перенесли раствор через воронку в мерную колбу вместимостью 100 мл.

Тигель и воронку тщательно обмыли дистиллированной водой и довели раствор в колбе водой до метки, тщательно перемешали, осадку дали отстояться.

Одновременно проводили контрольный опыт через все стадии анализа, кроме взятия навески анализируемого материала.

Пипеткой отобрали в пробирки по 1 мл растворов сравнения и раствора золы (минерализата), затем из бюретки прилили 10 мл раствора хлористого стронция с концентрацией стронция 5,5 мг/мл и перемешали. Определение кальция проводили на фотометре со светопропусканием 420 нм.

3.3.1.7 Определение содержания фосфора по ГОСТу 26657-97.

Сущность метода заключается в минерализации пробы способом сухого или мокрого озоления с образованием солей ортофосфорной кислоты и последующем фотометрическом определении фосфора в виде окрашенного в желтый цвет соединения – гетерополикислоты, образующейся в кислой среде в присутствии ванадат- и молибдатионов.

Высушивание проб проводили в сушильном шкафу при 60 – 65 ^оС до воздушно – сухого состояния. Затем пробу размололи на лабораторной мельнице и просеивали через сито и тщательно перемешали.

Приготовление растворов:

- раствор №1 – один объем концентрированной азотной кислоты разводили двумя объемами дистиллированной воды, перемешали;

- раствор №2 – 2,5 г аммония ванадат растворяли в нагретой до кипения дистиллированной воде, охлаждали, добавили 20 мл концентрированной азотной кислоты и довели объем раствора дистиллированной водой до 1000 мл, перемешали;

- раствор №3 – 50 г аммония молибдат растворили в горячей (свыше 75^оС) воде, охладили и довели объем раствора дистиллированной водой до 1000 мл, перемешали;

- раствор №4 (окрашенная смесь) – равные объемы растворов №1, 2, 3 последовательно смешали. Смесь хранили в темном месте при температуре 15 – 28 ^оС не более 6 мес;

- стандартный раствор фосфата – 4,393 г однозамещенного калия фосфорнокислого, высушенного при температуре 100 – 105 ^оС в течение 1 ч, растворили в стакане, объем раствора довели дистиллированной водой до 1000 мл, перемешали и хранили в стеклянной банке с притертой пробкой. В 1 мл основного раствора содержится 1 мг фосфора;

- растворы сравнения – в мерные колбы вместимостью 500 мл из бюретки на 50 мл прилили стандартный раствор фосфата (0, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50), в каждую пробу добавляют 5 мл разбавленного (1:1) раствора кислоты хлористоводородной, довели объем дистиллированной водой до метки, перемешали. Хранили не более 3 мес при температуре 15 – 28 ^оС в темном месте.

В предварительно прокаленный, охлажденный в эксикаторе и взвешенный с погрешностью не более 0,001 г тигель брали навеску испытуемой пробы массой 0,5 – 2,0 г (для кормов животного происхождения 0,3 – 0,4 г). Тигель поместили в холодную муфельную печь и повысили температуру до 200 – 250 ^оС (до появления дыма).

После прекращения выделения дыма температуру в печи увеличили до 525 ± 25 ^оС и вели прокаливание 4 – 5 ч, затем тигели с золой охладили. Затем золу смочили несколькими каплями дистиллированной воды, добавили 1 мл кислоты хлористоводородной (1:1) и 5 – 10 мл дистиллированной воды, тщательно перемешали и перенесли, не фильтруя, через воронку в мерную колбу вместимостью 100 мл. Тигель и воронку обмыли водой, доводя раствор водой до метки, перемешали и дали осадку отстояться. Аликвоту для анализа брали не взмучивая осадка. Подготовку контрольного раствора проводили аналогично без взятия навески.

Из раствора озолята анализируемых проб брали пипеткой по 10 мл раствора и переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавили 5 мл раствора №1 и 15 мл раствора №4, доводя дистиллированной водой до метки. После каждого добавления растворов и воды растворы тщательно перемешивали.

Через 30 мин окрашенные растворы сравнения фотометрировали против раствора №1, не содержащего фосфор, а исследуемые зольные растворы анализируемых образцов – относительно контрольного раствора.

Фотометрирование проводили используя синий светофильтр с максимумом светопропускания в области 440 – 405 нм. Если оптическая плотность испытуемого раствора превышала оптическую плотность раствора сравнения, анализируемый раствор разбавляли нулевым раствором шкалы до оптимальной для фотометрирования концентрации и проводили описанные выше операции в том же порядке. Полученные результаты увеличивали во столько раз, во сколько был разбавлен раствор анализируемой пробы.

По результатам фотометрирования растворов сравнения строили градуировочный график.

3.3.1.8 Атомно-абсорбционный метод определения содержания магния

Метод основан на сравнении поглощения резонансного излучения свободными атомами магния, образующимися в пламени при введении в него анализируемых растворов золы (минерализата) и растворов сравнения с известной концентрацией данного элемента. Влияние сопутствующих элементов устраняли добавление в растворы соединений стронция.

Навески исследуемых проб готовили, как показано выше. Далее готовили рабочие растворы:

- раствор хлористого стронция массовой концентрации стронция 10 мг/мл: 30,43 г 6-водного хлористого стронция растворили в 600 мл дистиллированной воды, приливая 45 мл концентрированной соляной кислоты, доводя дистиллированной водой до метки 1000 мл, и тщательно перемешали;

- раствор хлористого стронция массовой концентрации стронция 5,5 мг/мл: 16,73 г 6-водного хлористого стронция растворили в 300 мл дистиллированной воды, приливая 45 мл концентрированной соляной кислоты, доводя дистиллированной водой до метки 1000 мл, и тщательно перемешали;

- раствор сернокислого магния массовой концентрации магния 0,2 мг/мл: 2,028 г 7-водного сернокислого магния растворили в соляной кислоте, разбавленной дистиллированной водой 1:99 и этим же раствором довели объем до метки 1000 мл;

- растворы сравнения: в мерные колбы вместимостью 100 мл из бюретки прилили объемы от 0 до 10 мл раствора сернокислого магния массовой концентрации магния 0,2 мг/мл, долили до метки раствором соляной кислоты, разбавленной дистиллированной водой 1:99, и тщательно перемешали. Растворы готовили в день проведения анализа и использовали для градуировки атомно – абсорбционного спектрофотометра.

Параллельно тигель прокалили в муфельной печи при температуре 525 ^оС в течение 1 часа, охладили в эксикаторе и взвесили с погрешностью не более 0,001 г.

В тигель поместили навеску испытуемой пробы массой от 0,3 до 3,0 г. Пробу поместили в тигель без уплотнения, чтобы в ее нижние слои поступал воздух. Затем тигель с пробой поместили в холодную муфельную печь и повысили температуру до 200 – 250 ^оС (до появления дыма).

После прекращения выделения дыма температуру муфельной печи довели до 525 ^оС и вели озоление в течение 4 – 5 часов. Отсутствие частиц угля и равномерный серый цвет золы указывал на полное озоление материала.

Тигель с золой охладили вначале в выключенной муфельной печи, а затем на лабораторном столе. Золу смочили несколькими каплями дистиллированной водой 1:1, перемешали стеклянной палочкой, затем прилили 5 – 10 мл дистиллированной воды, снова перемешали и перенесли не фильтруя через воронку в мерную колбу вместимостью 100 мл. Тигель и воронку тщательно обмыли, раствор довели дистиллированной водой до метки, тщательно перемешали и осадку дали отстояться. Одновременно проводили в двух параллельных определениях контрольный опыт, включая все стадии анализа, кроме взятия навески.

3.3.1.9 Атомно – абсорбционный метод определения железа по ГОСТу 27998-88

Метод основан на сравнении поглощения резонансного излучения свободными атомами железа, образующимися в пламени при введении в него растворов золы кормов и растворов сравнения с известной концентрацией железа.

Навеску готовили методом описанным ранее. Высушивание проб проводили в сушильном шкафу при температуре 60 – 65 ^оС до воздушно – сухого состояния. После высушивания пробу размололи на лабораторной мельнице и просеяли через сито.

В тигле взвесили 2 г навески испытуемой пробы и поместили его в холодную муфельную печь, повышая температуру до 250 – 300 ^оС. После прекращения выделения дыма температуру печи подняли до 525 ^оС и вели прокаливание в течение 3 часов. Затем тигель охладили, золу смочили несколькими каплями дистиллированной воды и из бюретки прилили 2 мл соляной кислоты, разбавленной 1:1. Тигель поместили на кипящую водяную баню и упаривали кислоту до влажных солей. Из бюретки прилили в тигель 5 мл соляной кислоты, разбавленной 1:10, накрыли часовым стеклом и выдерживали на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Раствор золы, не фильтруя, с помощью палочки перенесли через воронку в пробирку, установленную в штатив. Тигель, палочку и воронку тщательно обмыли дистиллированной водой, доводя раствор дистиллированной водой до метки, перемешали и дали осадку отстояться. Пробу для анализа брали, не взмучивая осадка.

Определение железа в растворе золы проводили по аналитической линии 248 нм, используя для атомизации пламя ацетилен – воздух. Из раствора золя пипеткой брали пробы по 2 мл и помещали в пробирки. К пробам из бюретки приливали по 8 мл соляной кислоты, разбавленной 1:40, и перемешали.

При стабилизировавшемся режиме работы прибора в пламя внесли первый раствор сравнения, не содержащий железа, и установили начало отсчета (нулевое значение оптической плотности). Затем ввели в пламя пятый раствор сравнения с максимальной концентрацией железа и с помощью соответствующих регулировок установили размах шкалы. Снова ввели первый раствор сравнения для проверки. Затем ввели в пламя остальные растворы сравнения в порядке возрастания в них концентрации железа и регистрировали соответствующие им показания.

Отградуировав прибор по растворам сравнения, ввели в пламя растворы золы и регистрировали соответствующие им показания измерительного прибора. Одновременно проводя контрольный опыт.

Массовую долю железа в исследуемом корме (Х), млн^-1, вычисляли по формуле

Х=К(С-С₁) ,

где К – коэффициент, учитывающий дополнительное, не предусмотренное основной методикой разбавление анализируемого раствора; С – массовая концентрация железа в растворе золы в пересчете на массовую долю в растительном материале, млн^-1; С₁ – среднее арифметическое значение массовой концентрации железа, полученных в контрольном опыте, в пересчете на массовую долю в растительном материале, млн^-1.

3.3.1.10 Атомно – абсорбционный метод определения марганца по ГОСТу 27997-88

В тигле взвесили навеску испытуемой пробы массой 2 г и поместили в холодную муфельную печь, повышая температуру до 525 ^оС и вели прокаливание в течение 3 часов. Затем тигель охладили, золу смочили несколькими каплями дистиллированной воды и из бюретки прилили 2 мл соляной кислоты, разбавленной 1:1. Тигель поместили на кипящую водяную баню и упаривали кислоту до влажных солей. Прилили в тигель 5 мл соляной кислоты, разбавленной 1:10, накрыли часовым стеклом и выдерживали на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Раствор золы, не фильтруя, перенесли в пробирку, доводя раствор дистиллированной водой до метки. Пробу для анализа брали, не взмучивая осадка.

Определение марганца в растворе золы проводили по аналитической линии 279 нм, используя для атомизации пламя ацетилен – воздух. Отградуировав прибор по растворам сравнения, вводили в пламя растворы золы и регистрировали соответствующие им показания измерительного прибора. Одновременно ставили контрольный опыт.

Массовую долю марганца в воздушно – сухом материале (Х), млн^-1, вычисляли по формуле

Х=К(С-С₁) ,

где К – коэффициент, учитывающий разбавление анализируемого раствора, при анализе неразбавленных растворов К=1, разбавленных в два раза – 2 и т.д.; С – массовая концентрация марганца в растворе золы в пересчете на массовую долю марганца в материале, млн^-1; С₁ – среднее арифметическое значение массовой концентрации марганца, полученных в контрольном опыте, в пересчете на массовую долю в материале, млн^-1.

3.3.1.11 Метод определения меди по ГОСТу 30692-2000

Пробу готовили методом приведенным ранее. Масса высушенной при 65 ^оС пробы не менее 150 г.

В тигель поместили без уплотнения навеску испытуемой пробы массой 10 – 20 г и поместили в холодную муфельную печь, повышая температуру до 250 – 300 ^оС (до появления дыма). После прекращения дыма температуру муфельной печи довели до 525 ^оС и вели прокаливание в течение 4 – 5 часов.

Тигель с золой сначала охладили в выключенной муфельной печи, а затем на лабораторном столе. Золу смочили несколькими каплями дистиллированной водой 1:1. Тигель поместили на кипящую водяную баню и упаривали до влажного состояния, не допуская разбрызгивания и прокаливания осадка.

Дозатором прилили в тигель 10 – 15 мл раствора азотной кислоты, разбавленной дистиллированной водой 1:1, накрыли тигель часовым стеклом и нагревали на электроплитке до кипения.

После охлаждения раствор золы фильтровали в мерную колбу вместимостью 50 мл через бумажный фильтр. Фильтр предварительно тщательно промыли раствором азотной кислоты, разбавленной водой 1:1. Тигель несколько раз ополаскивали горячей дистиллированной водой и сливали на фильтр. Довели объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, перемешали. Жидкость над отстоявшемся осадком отобрали для анализа. Одновременно проводили контрольный опыт.

Определение массовой концентрации меди в растворе золы проводили используя для атомизации пламя ацетилен – воздух. После растворов сравнения в пламя вводили испытуемые растворы, включая раствор контрольного опыта.

Массовую долю меди в испытуемой пробе Х, млн^-1 (мг/кг), вычисляли по формуле

Х=(V(c₁-c₀))/m ,

где с₁ – массовая концентрация меди в растворе золы, найденная по градуировочному графику, мг/мл; с₀ – массовая концентрация меди в растворе контрольного опыта, мг/мл; V – объем исходного раствора золы, мл; m – масса навески, г.

3.3.2 Определение уровня общего холестерина в сыворотке крови биохимическим методом

Исследования обмена липидов и ЛП, ХС, в отличие от других диагностических тестов имеют социальное значение, так как требуют неотложных мероприятий по профилактике сердечно-сосудистых заболеваний [клиническая биохимия]. Этот факт на протяжении последних лет послужил причиной широких исследований в данной области. В последнее десятилетие изменились подходы к оценке нарушений липидного и липопротеинового обменов. Повышение уровней липидов крови, особенно ХСЛНП, ассоциируется со всеми подтипами ишемического инсульта. Соотношение уровней и концентрации трех основных составляющих липидов крови человека - ХС, ФЛ и ТГ - используются для диагностики и определения риска развития сосудистых заболеваний.

Нарушения липидного обмена проявляются изменениями основных липидных параметров в крови. Поэтому определение липидов – это первый, важный и необходимый шаг, позволяющий в дальнейшем нормализовать липидный спектр крови, а значит, в той или иной мере управлять течением атеросклероза и, как следствие, снизить риск смерти от связанных с ним сердечно - сосудистых заболеваний. Существует несколько методов определения ЛП в крови.

Определение уровня общего ХС проводили методом Илька, который заключается в следующем: в сильнокислой безводной среде ХС взаимодействует со смесью серной, уксусной кислот и уксусного ангидрида. В ходе реакции ХС последовательно окисляется. При этом каждая стадия реакции сопровождается образованием молекулы ХС, которая имеет на одну двойную связь больше, чем соединение, из которого она образовалась. В результате конечного окисления иона 3,5-холестодиена получается окрашенное соединение, растворенное в серной кислоте и дающее максимум абсорбции при 410 и 610 нм.

Реакция чувствительна на изменение температуры, поэтому необходимо было особенно соблюдать охлаждение реакционной смеси после добавки серной кислоты. Из-за неустойчивости окраски соединения время фотометрирования было точно выдержано.

Сыворотка крови негемолизированна.

Необходимые реактивы для определения ХС: 1) ледяная уксусная кислота; 2) концентрированная серная кислота; 3) уксусный ангидрид; 4) абсолютный этиловый спирт; 5) кислотная смесь: в сухую колбу налили 10 мл ледяной уксусной кислоты и 50 мл уксусного ангидрида, затем при постоянном перемешивании и охлаждении добавляли 10 мл концентрированной серной кислоты (соотношение кислот 1:5:1). При смешивании ингредиентов избегали нагревание смеси, которая должна быть бесцветной или слегка желтоватой. Для этого колбу, в которой готовили реактив, помещали в сосуд со льдом, а серную кислоту добавляли в последнюю очередь медленно по каплям, постоянно помешивая. Хранили реактив в холодильнике в темной склянке с притертой пробкой. 6) Калибровочный раствор: 232 мг ХС растворяют в 2—3 мг хлороформа и доводят до объема 100 мл абсолютным этиловым спиртом. Приготовленный раствор содержит ХС в концентрации 6 ммоль/л.

Для определения ХС к 2,1 (1,05) мл кислотной смеси медленно по стенке пробирки добавили 0,1 (0,05) мл сыворотки без признаков гемолиза, перемешали встряхиванием 10-12 раз и поставили на 20 минут на водяную баню при температуре 37 °С, затем фотометрировали в кювете с длиной оптического пути 0,5 см против контрольной пробы на реактивы (вместо сыворотки крови на первом этапе вносили 0,05 мл воды) при длине волны 625 нм. (рисунок )

Расчет вели по предварительно составленному калибровочному графику. К 0,05—0,2 (0,025) мл калибровочного раствора добавили такое количество кислотной смеси, чтобы общий объем был 2,2 (1,1) мл, перемешали и выдержали 20 минут при температуре 37 °С, так же как и опытные пробы, а затем фотометрировали. Окраска калибровочной пробы, в которую взято 0,05 (0,025) мл калибровочного раствора, соответствует содержанию ХС в плазме 3 (1,5) ммоль/л; пробы, в которую взято 0,1 (0,05) мл, — содержанию 6 (3) ммоль/л и так далее.

Рисунок - Схема анализа общего холестерина

Примечания:

1 попадание воды приводит к помутнению раствора;

2 следы гемолиза или желтушность исследуемой плазмы или сыворотки служат причинами завышенных результатов;

3 можно использовать для фотометрии и кюветы с длиной оптического пути 1 см, тогда количество кислотной смеси удваивают, а количество исследуемого материала остается прежним.

Гравиметрические методы определения холестерина в крови.

Принцип метода определения ХС с помощью холестеролоксидазной реакции.

ХС и его эфиры выделяются из ЛП детергентами. Холестеринэстераза гидролизует эфиры. В результате последующего ферментативного окисления ХС холестериноксидазой образуется перекись водорода Н2О2, количество которого определяется по цветной реакции:

Эфир ХС + Н2О2 альфа ХС + жирные кислоты;

ХС + О2 альфа холестен-З-ОН + Н2О2;

Н2О2 + n-хлорфенол + 4-аминоантипирин хинониминовый краситель + Н2О2.

Интенсивность окраски, развивающейся в ходе реакции, пропорциональна содержанию ХС в плазме крови.

Параллельно исследуемой сыворотки крови (образец исследуемый ОИ) проводят обработку стандартной пробы (образец стандартный ОС), в которую вместо сыворотки вносят такой же объем калибровочного раствора ХС (концентрация которого указана на этикетке бутылька, входящего в состав набора). Интенсивность развившегося окрашивания измеряют, фотометрируя при 550 нм против холостой пробы, которую ставят также, как и опытную, но вместо исследуемого материала берут воду. Расчёт результатов проводят по формуле:

Концентрация ₌ (оптическая плотность (ОИ)/ оптическая плотность (ОС) стандарта) х концентрации ХС.

Уровни нормы ХС, выявленные при обследовании «в целом здорового населения», относительно высоки. С точки зрения риска развития ишемической болезни сердца уровни ХС желательны:

- рекомендуемый — менее 5,18 ммоль/л;

- умеренный риск — 5,18—6,19 ммоль/л;

- высокий риск — более 6,22 ммоль/л.

Данный метод определения содержания ХС в крови широко используется в лабораторной практике.

Конверсионный фактор: мг/дл х 0,0259 = ммоль/л; ммоль/л х 38,67 = мг/дл.

Забор материала осуществляется в вакуумную систему без антикоагулянта или с активатором свертывания. Цельная кровь должна быть доставлена в лабораторию в течение 2 часов при температуре 2-8 °С.

Подготовка пациента к анализу на общий ХС.

Забор материала осуществляют в утренние часы натощак.

Факторы, влияющие на результат анализа.

Повышают: амиодарон, андрогены, катехоламины, хенодезоксихолевая кислота, циклоспорин, дисульфирам, диуретики (небольшое влияние), эргокальцифероп и высоких дозах, этретинат, глюкокортикостероиды, изотретиноин, леводопа.

Снижают: аминосалициловая кислота, аспарагиназа, карбутамид, холестирамин, кломифен, клонидин, колестипол, ципротерона ацетат, доксазоцин, эстрогены, фенфлюрамин, дериваты фибриновой кислоты (например, клофибрат, гемфиброзил), ловастатин, правастатин, симвастатин, гидралазин, интерферон, кетоконазол (высокие дозы), ниацин, неомицин, празозин, пробукол, тириксин.

Расшифровка анализа

Повышают уровень ХС: первичные гиперлипидемии, семейная гиперхолестеринемия, семейная комбинированная гиперлипидемия, полигенная гиперхолестеринемия, семейная дисбеталипопротеинемия, вторичные гиперлипидемии; болезни печени (внепеченочные желтухи), болезнь Гирке (болезнь накопления гликогена), первичный билиарный цирроз печени, нефротический синдром, хроническая почечная недостаточность, болезни поджелудочной железы, хронический панкреатит, рак поджелудочной железы, сахарный диабет, гипофункция щитовидной железы - гипотиреоз, дефицит соматотропного гормона, ожирение, беременность.

Снижают уровень ХС: гипо- и абеталипопротеинемии, цирроз печени в поздней стадии заболевания, острая дистрофия печени, инфекции, связанные с повреждением печени, голодание, сепсис, гиперфункция щитовидной железы, мегалобластическая анемия (В12-дефицитная анемия, фолиеводефицитная анемия), талассемия, лимфоангиэктазия кишечника.

Определение общих липидов в сыворотке крови с сульфофосфованилиновым реактивом (по Целнеру-Киршу в изложении Л. В. Орлова).

Метод основан на цветной реакции продуктов распада ненасыщенных липидов в серной кислоте с реактивом, состоящим из ванилина и ортофосфорной кислоты. Механизм цветной реакции заключается в том, что ненасыщенные липиды реагируют с серной кислотой при нагревании с образованием карбониевого иона, взаимодействие которого с активированной карбоксильной группой ванилина фосфата образует стабильный комплекс. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию общих липидов в сыворотке крови.

В пробирки с 0,01 мл сыворотки крови добавляли 0,5 мл концентрированной серной кислоты. Содержимое пробирок тщательно перемешали и поставили в термостат при температуре 130 ^оС на 20 мин (в кипящую водяную баню на 10 мин). Через 20 мин пробирки охладили под водопроводной водой, прилили 1,5 мл сульфофосфорного реактива, тщательно встряхивали и выдерживали в темноте при комнатной температуре 45 мин. Содержимое пробирок постепенно меняло желтый цвет на красный, который стабильно удерживается до 18 часов.

Через час определяли оптическую плотность на спектрофотометре при зеленом фильтре (500 – 560 нм) против контрольной пробы, которую готовили также, как и опытную, но вместо сыворотки брали 0,01 мл воды.

Расчет вели по калибровочному графику. Для его построения из стандартного раствора триолеина готовили рабочие калибровочные растворы и выполняли все операции, как с опытными пробами.

3.3.3 Биохимический метод определения уровня триглицеридов сыворотки крови

Для определения уровня ТГ в сыворотке крови определяли ферментативным методом, где ТГ ферментативно гидролизуются до глицерола в соответствии со следующей схемой реакции:

ТГ = глицерол + жирные кислоты;

глицерол + аденозина трифосфат (АТФ) = глицерол-З-Ф + аденозина дифосфат (АДФ);

глицерол-З-Ф + О2 = фосфоглицероальдегид + Н2О2;

Н2О2 + 4-аминоантипирин + n-хлорфенол = Н2О2 + хинонимин.

Образующаяся в ходе ферментативной реакции окраска пропорциональна содержанию ТГ. Референтные пределы для ТГ, установленные Национальной программой по ХС (США), широки.

Рекомендованы пороговые уровни для оценки триглицеридемии:

- норма — 0,45—2,83 ммоль/литр (44,9—282,7 мг/децилитр);

- пограничные величины — 2,82—5,65 ммоль/л;

- гипертриглицеридемия — выше 5,65 ммоль/л;

- высокий риск панкреатита — выше 11,3 ммоль/л.

Определение содержания ТГ в крови позволяет оценить степень риска развития атеросклероза, ишемической болезни сердца, стенокардии, инфаркта миокарда.

Определение содержания ТГ в крови с хромотроповой кислотой

ТГ гидролизуются с освобождением глицерина, который окисляется перйодатом натрия до формальдегида.

Образующиеся при этом йодаты и не прореагировавшие перйодаты восстанавливаются избытком бисульфита натрия, после чего формальдегид определяют по цветной реакции с хромотроповой кислотой.

Определение содержания ТГ в крови с ацетилацетоном

ТГ экстрагируются из сыворотки крови. Освобожденный в результате щелочного гидролиза глицерин окисляют до формальдегида с помощью метаперйодата натрия.

Образовавшийся формальдегид образует с ацетилацетоном в слабом уксусном растворе 3,5-диацетил-1,4-дигидролютидин, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию ТГ.

Необходимые реактивы для определения ТГ:

1 гептан;

2 изопропиловый спирт (изопропанол);

3 0,08 н серная кислота (примерно 2,2 мл концентрированной H2SO4 на 1 л воды);

4 едкий калий, 6,25 моль/л: 17,8 г гидроксид калия КОН растворяют в 50 мл, осторожно добавляя гранулы щелочи в воду, охлаждая и перемешивая;

5 уксусная кислота, 50 г/л;

6 йодная кислота: растворяют 0,6 г НО4 х 2Н2О (перйодная кислота) в 100 мл 5%-ной уксусной кислоты;

7 аммония ацетат, 2 моль/л: растворяют 154 г ацетата аммония в воде, объем доводят до 1 л;

8 ацетилацетоновый реактив: 1,5 мл ацетилацетона (СН3СО СН9СОСН3) разводят раствором уксуснокислого аммония до суммарного объема 200 мл. Хранят в сосуде из темного стекла;

9 калибровочный раствор триолеина, 2 ммоль/л. Содержит 170 мг триолеина в 100 мл изопропилового спирта. Можно использовать и другие калибровочные растворы, перечисленные в примечании.

Примечание.

Если использовать для калибровки раствор триолеина в изопропиловом спирте, то после экстракции и расслоения объем верхней фазы в калибровочных пробах оказывается больше, чем в опытных, что приводит к заниженным результатам анализа. Чтобы избежать этой ошибки, рекомендуют калибровочный раствор готовить по следующей прописи: 510 мг триолеина растворить в 100 мл изопропилового спирта, из полученного исходного калибровочного раствора с содержанием 6 ммоль/л готовить по мере необходимости рабочий калибровочный раствор с содержанием 1,2 ммоль/л, разводя 1 объем исходного калибровочного раствора 4 объемами воды.

Ход определения ТГ.

К 0,5 (0,05) мл сыворотки добавляют 2 (0,2) мл гептана, 3,5 (0,35) мл изопропилового спирта и 1 (0,1) мл 0,08 н серной кислоты, перемешивают и через 5 минут центрифугируют. Из верхнего (гептанового) слоя отбирают 0,4 (0,2) мл, добавляют 2 (1) мл изопропилового спирта и 1 каплю 6,25 н КОН. Перемешивают, закрывают пробкой и нагревают на водяной бане в течение 10 минут при температуре 70 °С. После охлаждения добавляют 0,2 (0,1) мл перйодатного реактива и 1 (0,5) мл ацетилацетонового реактива, после перемешивания снова закрывают пробкой и нагревают еще 10 минут при 70°С. Развивается желто-зеленое окрашивание, интенсивность которого измеряют, фотометрируя при длине волны 425 нм в кюветах с длиной оптического пути 0,5 см против холостой пробы, которую ставят так же, как и опытную, но вместо исследуемого материала берут 0,5 мл воды.

Калибровочную пробу ставят так же, как и опытную, но вместо сыворотки берут 0,5 (0,05) мл калибровочного раствора и 0,5 (0,05) мл воды; развивающаяся окраска соответствует окраске опытной пробы, в которую взята сыворотка с содержанием ТГ 2 ммоль/л. Расчет проводят по правилу пропорций или по калибровочному графику. Если используется калибровочный раствор, уже содержащий воду, то при постановке калибровочного опыта берут 0,5 мл рабочего калибровочного раствора, а воду не добавляют.

Примечание.

При отсутствии триолеина или трибутирина для калибровки можно использовать растительное масло, принимая, что образующие его ТГ имеют ту же молекулярную массу, что и триолеин. Можно проводить калибровку, используя раствор глицерина в этаноле, в этом случае его непосредственно добавляют к щелочному раствору едкого калия.

3.3.4 Определение уровня холестерина липопротеидов низкой плотности

Уровень ХС ЛПНП вычисляли по формуле Фридвальда:

ХС ЛПНП = общий ХС – ХС ЛПВП - ХС ЛПОНП,

где ХС ЛПОНП = ТГ/2,18 ммоль/л или ТГ/5 мг/дл.

Для этого необходимо было определить уровень ХС ЛПВП. После центрифугирования супернатант содержит ЛПВП — фракцию, содержание ХС в которой определяли ферментативной колориметрией.

В лабораторной практике из-за отсутствия доступных методов исследований роль ЛП в обмене веществ оценивают главным образом по сумме β-ЛП (ЛПНП + ЛПОНП) [Кондрахин, И.П. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник / Под ред. проф. И.П. Кондрахина. – М.: КолосС. – 2004. – 520 с. 5 и 8 источники].

ЛПОНП и ЛПНП осаждаются добавлением фосфорно-вольфрамовой кислоты и хлорида магния.

Метод основан на способности гепарина образовывать с β- и пре-β-ЛП сыворотки крови комплекс, который под действием хлористого кальция выпадает в осадок. Концентрацию β- и пре-β-ЛП сыворотки крови определяют по степени мутности, которая пропорциональна концентрации ЛП.

Реактивы:

хлористый кальций: 0,025 М раствор;
раствор гепарина (1 мл содержит 1000 МЕ).

Ход определения.

В пробирку отмерили 0,2 (0,02) мл сыворотки крови и прилили к ней 2 (0,2) мл 0,025М раствор хлористого кальция. Определили исходную величину оптической плотности (Д1) на фотоколориметре (ФЭКе) в кювете с рабочей длиной 5 мм при красном светофильтре (630-690 нм) против воды. К содержимому кюветы добавили точно 0,04 (0,004) мл 1 % раствора гепарина, несколько раз промыв пипетку содержимым пробирки. Ровно через 5 (10) мин измерили величину оптической плотности (Д2) на ФЭКе (рисунок ).

Рисунок - Схема определения ЛПНП

Содержание β- и пре-β-ЛП в сыворотки крови рассчитывают по формуле:

Х= (Д2 - Д1) х 12,

где Д1 – исходная величина оптической плотности,

Д2 – величина оптической плотности через 5 мин,

12 – эмпирический коэффициент для выражения β-ЛП в г/л. (1164 – кол-во в мг%)

По полученным данным рассчитали содержание β- и пре-β-ЛП в исследуемой сыворотке крови .[Методы изучения стрессовых и адаптационных реакций организма по показателям системы крови. Составители: Дерюгина А.В., Корягин А.С., Копылова С.В., Таламанова М.Н. - Нижний Новгород: Издательство Нижегородского госуниверситета, 2010.- 25 с.]

Материал для анализа на ХС ЛПВП исследования:

Сыворотка - 1 мл.

Условия хранения: < 7 дней при температуре 2-8 °С;

< 30 дней при температуре - 70 °С.

Факторы, влияющие на результат анализа

Повышают: карбамазепин, хлорированные углеводороды, циметидин, циклофенил, доксазозин, эстрогены, этанол, производные фибриновой кислоты (клофибрат, гемфиброзил), ловастатин, правастатин, симвастатин, никотиновая кислота, фенобарбитал, фенитоин, празозин, теразозин.

Снижают: андрогены, альфа-блокаторы, хенодезоксихолевая кислота, ципротерона ацетат (высокие дозы), даназол, диуретики, этретинат, интерферон, интерлейкин, изотретинон, медроксипрогестерон, пробукол, прогестины.

Расшифровка анализа

Повышение уровня холестерина липопротеидов высокой плотности: наследственная гипер-бета-липопротеинемия, первичный биллиарный цироз, хронический гепатит, алкоголизм, интоксикации.

Снижение уровня холестерина липопротеидов высокой плотности: А-альфа-липопротеинемия, недостаточность кофактора липопротеинлипазы, различные формы гипо-альфа-липопротеинемии, гипертриглицеридемии, декоменсированный сахарный диабет, раннее поражение коронарных артерий, заболевания печени, нефротический синдром, хроническая почечная недостаточности.

Скачать: disser.rar

Категория: Дипломные работы / Дипломные работы по биологии

Уважаемый посетитель, Вы зашли на сайт как незарегистрированный пользователь.
Мы рекомендуем Вам зарегистрироваться либо войти на сайт под своим именем.

Привет студент