Влияние алкилоксибензолов на систему «чувства кворума» и образование биопленки у Chromobacterium violaceum

Химико-биологический факультет

Кафедра микробиологии

МАГИСТЕРСКАЯ ДИССЕРТАЦИЯ

Влияние алкилоксибензолов на систему «чувства кворума» и образование биопленки у Chromobacterium violaceum

Аннотация

В магистерской диссертации рассматриваются два феномена, такие как «чувство кворума» (QS) и образование биопленки у микроорганизмов. Биопленка – это непрерывный мультислой бактериальных клеток, прикрепленных к поверхности раздела фаз и друг к другу и заключенных в биополимерный матрикс. Показано, что межклеточные коммуникации в биопленке осуществляются при участии QS. Особое внимание уделено изучению средств, направленных на подавление QS-регуляции и, как следствие этого, на подавление патогенности бактерий.

Практическая часть посвящена изучению развития QS и образования биопленки Chromobacterium violaceum, анализу связи данных феноменов с морфологическими характеристиками клеток C. violaceum, выявляемыми методом атомно-силовой микроскопии. Были оценены эффекты алкилоксибензолов в тестах ингибирования биосинтеза виолацеина, образования биопленки C. violaceum и биолюминесценции Escherichia coli. Поставленные цели и задачи в ходе данной работы были достигнуты.

Магистерская диссертация выполнена печатным способом на 69 страницах с использованием 135 источников, содержит 4 формулы, 9 таблиц, 22 рисунка, 2 приложения.

Adstract

In the master′s thesis we consider two phenomena, such as "quorum sensing» (QS) and biofilm formation in microorganisms. Biofilm is a continuous multilayer of bacterial cells attached to the interface and to each other and enclosed in the biopolymer matrix. It is shown that cell-to-cell communication in a biofilm are carried out with the participation of QS. Particular attention is paid to means aimed at inhibition QS-regulation and, as a result, the suppression of pathogenic bacteria.

The experimental part is devoted to the study of the development of QS and biofilm formation in Chromobacterium violaceum, the analysis of these phenomena due to morphological characteristics of the cells of C. violaceum, investigated by atomic force microscopy. The effects of alkylresorcinols in inhibition tests of violacein biosynthesis, biofilm formation by C. violaceum and bioluminescence of Escherichia coli were estimated. The goals and objectives in this work have been achieved.

Master′s dissertation is done by printing and contains 69 pages, including four formulas, 9 tables, 22 figures, two appendices and 135 literature sources.

Содержание

Введение.................... 7

1 Коллективное поведение бактерий и способность к формированию биопленки Chromobacterium violaceum.. 9

1.1 Общая характеристика бактерий вида C. violaceum.. 9

1.1.1 Открытие и классификация. 9

1.1.2 Морфологические и биохимические свойства C. violaceum.. 10

1.1.3 Патогенность C. violaceum.. 11

1.2 Физиологические особенности C. violaceum.. 14

1.2.1 Биосинтез пигмента виолацеина. 14

1.2.2 Биопленки: общее представление. 18

1.2.2.1 Роль целлюлозы в формировании биопленки C. violaceum.. 20

1.2.2.2 Формирование биопленки микроорганизмом C. violaceum.. 21

1.3 Система quorum sensing (QS) и пути ее ингибирования. 23

1.3.1 Регуляторная система QS и ее роль в различных процессах. 23

1.3.2 Пути ингибирования QS-систем. 25

1.3.2.1 Ингибирование синтеза ацил-гомосеринлактонов (АГЛ) 25

1.3.2.2 Деградация АГЛ.. 27

1.3.2.3 Подавление связывания АГЛ с рецепторными белками. 28

1.3.2.4 Нарушение экспрессии целевых генов QS. 31

2 Материалы и методы.. 33

2.1 Штаммы бактерий и условия выращивания бактериальных культур. 33

2.1.1 Штаммы C. violaceum.. 33

2.1.2 Люминесцирующий штамм Escherichia coli pAL 103. 34

2.2 Ауторегуляторные d₁-факторы бактерий. 34

2.3 Методы, используемые в работе. 36

2.3.1 Количественная оценка роста. 36

2.3.2 Виолацеин-анализ. 36

2.3.3 Анализ формирования биопленок. 36

2.3.4 Атомно-силовая микроскопия (АСМ) 37

2.3.5 Оценка ингибирования QS. 38

2.3.6 Биолюминесцентный анализ. 38

2.3.7 Статистическая обработка результатов. 39

3 Результаты и обсуждение. 41

3.1 Морфологическая дифференцировка клеток C. violaceum, ассоциированная с ростом биопленки и направляемая АГЛ.. 41

3.1.1 Рост, биосинтез виолацеина и формирование биопленки диким штаммом C. violaceum ATCC 31532. 41

3.1.2 АСМ изображения планктонных и клеток в биопленке дикого штамма C. violaceum ATCC 31532. 42

3.1.3 Рост, биосинтез виолацеина и формирование биопленки мутантным штаммом C. violaceum NCTC 13274. 44

3.1.4 АСМ изображения клеток, сформированных в биопленке C. violaceum NCTC 13274 45

3.1.5 АСМ изображения зрелых биопленок C. violaceum, сформированных в присутствии и в отсутствие аутоиндуктора. 46

3.2 Влияние АОБ на рост, биосинтез пигмента и формирование биопленки С. violaceum.. 49

3.3 Влияние АОБ на восприятие гомосеринлактонов в тесте индукции люминесценции Escherichia coli luxR+ luxI_luxCDABE. 56

Заключение. 58

Список использованной литературы.. 60

Приложение А (справочное) Пути ингибирования QS C. violaceum.. 69

Приложение Б (рекомендуемое) Список опубликованных работ по теме исследования 70

Введение

За последние несколько лет достижения в микробиологии показали, что бактерии для своего выживания так же, как и люди, широко используют преимущества, которые дает коллективное поведение. Современный взгляд на микробные сообщества предполагает их существование в качестве сложных сетевых структур, использующих для межклеточной коммуникации специализированные малые молекулы [1]. Одним из примеров является плотностно-зависимая коммуникация, получившая название «чувство кворума» (англ. – quorum sensing, QS) и более чем у 450 видов грамотрицательных бактерий опосредованная системами образования и восприятия ацил-гомосеринлактонов (АГЛ) [2]. По мере того как популяция бактерий увеличивается и достигает критического уровня, АГЛ накапливаются до необходимого порогового значения и взаимодействуют с регуляторными белками системы QS. Итоговым следствием этих событий является димеризация комплекса «регуляторный белок – АГЛ» и его связывание с промоторами целевых генов с последующим запуском транскрипции ферментных систем биолюминесценции, образованием факторов вирулентности и формированием биопленок [3].

Способность бактерий формировать биопленки является существенным фактором патогенности. По современным представлениям, от 95 % до 99 % микроорганизмов существуют в природной среде и в организмах хозяев в виде сложно организованных сообществ – биопленок. Такой образ жизни бактерий является одной из основных стратегий, повышающих их выживание [4]. Изучение биопленок вызывает огромный интерес исследователей в последние года в силу того, что этот способ существования бактерий создает большие проблемы в медицинской практике. Установлено, что биопленки являются одним из патогенетических факторов формирования хронических инфекционных заболеваний, возникновение которых связано с использованием имплантируемых устройств (линз, катетеров, протезов, искусственных клапанов сердца). Причем, будучи интегрированными в биопленку, бактерии проявляют большую устойчивость к действию антибактериальных препаратов, в том числе антибиотиков, факторов иммунной защиты организма и неблагоприятных факторов среды [5, 6].

Если АГЛ «оценивают» минимальную плотность клеточной популяции, достаточную для активации экспрессии генов стационарной фазы, то другие малые молекулы контролируют максимально возможную для данных условий численность клеток в пролиферирующей культуре. У значительного количества микробных видов этот тип ауторегуляторов представлен изомерами и гомологами алкилоксибензолов (АОБ) [7], механизм действия которых обусловлен способностью к физико-химическим взаимодействиям и комплексообразованию с функциональными биополимерами и мембранными структурами [8]. В результате при достижении порогового концентрационного уровня, коррелирующего с увеличением численности клеток в развивающейся культуре, АОБ индуцируют остановку клеточного деления и переход в стационарную фазу роста, а при дальнейшем повышении концентрации – образование гипометаболических и покоящихся форм [9].

Сказанное позволяет утверждать, что исследование взаимодействия двух названных ауторегуляторных молекул, а также влияние АОБ на формирование бактериями биопленки имеет как собственное научное значение, так и важные прикладные аспекты, определяемые перспективой использования естественных механизмов межклеточной коммуникации для контроля и управления «чувством кворума» бактериальных патогенов.

В этой связи целью настоящей работы стало исследование эффектов АОБ на систему «чувства кворума» (на примере биосинтеза пигмента виолацеина) и образование биопленки у Chromobacterium violaceum с определением взаимоотношений между этими феноменами.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1) изучить в динамике развитие «чувства кворума» и образование биопленки диким и мутантным штаммом C. violaceum, имеющим инсерцию в гене биосинтеза автоиндуктора (С₆-АГЛ);

2) проанализировать связь развития кворум-эффекта и образования биопленки с морфологическими характеристиками клеток C. violaceum, выявляемыми методом атомно-силовой микроскопии (АСМ);

3) оценить эффекты АОБ на рост, биосинтез пигмента виолацеина и образование биопленки C. violaceum;

4) определить природу возможных регуляторных эффектов АОБ в luxI-luxR-подобных системах регуляции «чувства кворума» у бактерий.

Экспериментальная часть исследования осуществлялась на базе микробиологической лаборатории химико-биологического факультета ОГУ.

В работе использовали традиционные микробиологические методы выращивания культур, АСМ для морфологической дифференцировки планктонных клеток и клеток в составе биопленки C. violaceum ATCC 31532 и CV026, биолюминесцентный анализ для репортерной клеточной тест-системы Escherichia coli JLD271, pAL 103; luxR+ luxI_luxCDABE; TetR p15A.

1 Коллективное поведение бактерий и способность к формированию биопленки Chromobacterium violaceum

1.1 Общая характеристика бактерий вида C. violaceum

1.1.1 Открытие и классификация

В 1882 году во французском научном журнале «Comptes Rendus» была опубликована статья Boisbaudran, в которой автор описал фиолетовую окраску препаратов из цветков риса, отнесенных им к «малым организмам», ссылаясь на микроорганизмы. Это наблюдение было сделано приблизительно в 1867 году, за 15 лет перед опубликованием статьи. Оно, вероятно, послужило информацией, опубликованной Gessard, одним из современников Boisbaudran, связавшего это исследование с экстракцией синего материала из некоторых патологических жидкостей, что мотивировало Boisbaudran опубликовать свои наблюдения.

В своем исследовании в 1880 году, Bergonzini сделал случайное открытие, работая в университете Модена, в Италии. В конце марта 1880 года им было приготовлено растворы овальбумина для изучения действия механизмов, которые вызывают замедление разложения. После своих экспериментов исследователь забыл уничтожить контрольные растворы, и в конце апреля он пронаблюдал особый аспект образцов, который описал, как фантастический. Итальянский исследователь сократил объем растворов путем испарения и получил раствор, покрытый тонкой, очень плотной пленкой фиолетового цвета. Сначала он подозревал, что это Cromococcus violaceus, который был единственным в то время микроорганизмом, известным по проявлению такой окраски; однако эта возможность была исключена из-за нерастворимости всех компонентов. Bergonzini после некоторых опытов пришел к выводу, что это был новый вид бактерии, который он назвал Cromobacterium violaceum (без Сh), и опубликовал о нем статью в 1881 году, как об открытии "новой цветной бактерии" [10].

Что касается "мелких организмов" и пигмента, о которых упоминал Boisbaudran, De Moss [11] сообщил, что они, вероятно, относились к Chromobacterium violaceum и виолацеин, соответственно, основан на видимом спектре поглощения, отмеченным Boisbaudran. В 1881 году Zimmerman исправил название Cromobacterium, данное Bergonzini, на Chromobacterium [12]. Примерно в то же время, название Bacillus violaceus больше не использовалось. На сегодняшний день, род Chromobacterium, описанный микробиологом Sneath, находится в справочнике Берджи по бактериологической систематике [13].

В 1976 году на станции водоочистки в городе Манаус (Амазонас –Бразилия) были выделены две различные колонии бактерий: белые и фиолетовые. Профессор Wilson Chagas de Araujo в Институте микробиологии Федерального университета Рио-де-Жанейро идентифицировал фиолетовые колонии, как у Chromobacterium violaceum. Этот вид микроорганизма был выделен в Бразилии в первый раз. Подозрение о том, что виолацеин должен быть солнечной защитой для бактерии, было сообщено профессором R. Caldas, сделавшим ряд исследований, которые показали, что виолацеин обладает терапевтическим потенциалом [14].

Таким образом, с 1880-х годов и на сегодняшний день одной из самых отмеченных характеристик C. violaceum является продукция фиолетового пигмента, известного как виолацеин.

1.1.2 Морфологические и биохимические свойства C. violaceum

violaceum среди представителей рода Chromobacterium является наиболее интересным и загадочным микроорганизмом. Бактерии C. violaceum представляют собой прямые клетки, с закругленными концами, часто кокковой формы, но обычно встречаются в виде палочек, размером от 0,6 до 0,9 мкм в ширину и от 1,5 до 3,0 мкм в длину. Встречаются поодиночке, иногда парами или короткими цепочками (рисунок 1 А). Это грамотрицательный подвижный микроорганизм, снабженный полярными жгутиками, как правило, один или несколько жгутиков – субполярны. C. violaceum является факультативным анаэробом. Растет на обычных пептонных средах; температурный оптимум роста от 30 °C до 35 °C, оптимальный рН роста от 7 до 8. Определенные органические требования к фактору роста отсутствуют. На агаровой среде образует гладкие (также могут встречаться шероховатые варианты) выпуклые маслянистые колонии фиолетового цвета (рисунок 1 Б), легко растворим в воде и хлороформе.

Рисунок 1 – Морфология клеток (А) и колоний (Б) бактерии C. violaceum

Большинство штаммов продуцируют фиолетовый пигмент виолацеин, но встречаются штаммы, образующие непигментированные колонии, и субкультуры пигментных штаммов часто содержат частично или полностью непигментированные колонии. Рост на питательном бульоне производит фиолетовые кольца на поверхности с хрупкой пленкой. Хемоорганотрофы; большинство штаммов (80 %) разрушают углеводы ферментативным путем, некоторые (20 %) – окислительным путем, продуцируют небольшое количество кислоты, но обычно без выделения газа. Обычно оксидазоположительны по методу Sivendra и Lo (1975). Не растут на среде, содержащей 6 % или более NaCl. Каталазоположительны, но очень чувствительны к перекиси водорода. Не продуцируют индол. Обладают нитратредуктазной активностью (рисунок 2) [13].

А – ферментация глюкозы (+); Б – каталазный тест (+); В – редукция нитратов (+); Г – продукция индола (–); Д – подвижность (+).

Рисунок 2 – Биохимические свойства бактерии C. violaceum

1.1.3 Патогенность C. violaceum

С. violaceum описан как сапрофитный микроорганизм, который обычно считают непатогенным для людей, чувствителен к температуре, поэтому в большинстве случаев его выделяют из почвы и воды тропических и субтропических регионов некоторых континентов [15, 16]. Стоит отметить, что последствия глобального потепления может увеличиться, и географическое распределение этого микроорганизма может измениться в будущем [15].

На рисунке 3 представлено международное распределение пациентов с инфекцией, вызванной C. violaceum, и их демографические данные.

Иногда эта бактерия может выступать в качестве оппортунистического патогена для животных и людей и вызывать смертельную септицемию, включая поражения кожи и абсцессы в печени и легких [16, 17]. Несмотря на то, что инфекции, вызванные С. violaceum, редки среди млекопитающих, ее потенциальная патогенность была впервые описана в 1905 году Wooley, который идентифицировал микроорганизм как причину септицемии у буйволов на Филиппинах. В 1927 году Lesslar в Малайзии сообщил о первых инфекциях

Индия (10), Корея (3), Япония (1) и др. – демографические данные пациентов

Рисунок 3 – Международное распределение пациентов с инфекцией,

вызванной C. violaceum

у людей, вызванных этим микроорганизмом [10, 18]. В 1988 году Miller с коллегами провели исследование, в котором сравнивали вирулентные и авирулентные штаммы C. violaceum, где вирулентные штаммы имели повышенные уровни супероксиддисмутазы и каталазы, которые могут защитить микроорганизм от фагоцитарной атаки в организме человека, что может привести к его крайней вирулентности. Таким образом, возможно, что инфекция, развивавшаяся у пациентов, может зависеть от точного штамма, которым они инфицировались.

Наиболее распространенные симптомы инфекции, вызванные C. violaceum: лихорадка, боль над зараженным местом, связанным с различными поражениями кожи, боль в животе и быстрое прогрессирование сепсиса. Последнее, угрожающее жизни, связанное с метастатическим абсцессом, является наиболее характерной чертой в инфекции.

Серьезные и в некоторых случаях смертельные инфекции были обнаружены у людей в Аргентине, Австралии, Индии, Бразилии, на Кубе, в Нигерии, Сингапуре, Тайване, США и во Вьетнаме (рисунок 3) [15]. C. violaceum может также вызывать инфекции у животных и среди них зарегистрированы случаи у свиней, обезьян, овец и собак [19, 20].

В 1984 году Petrillo с соавторами отметили, что хотя C. violaceum часто встречается в природе и вызывает серьезные инфекции у людей, его действие очень низкое. Четырнадцать лет спустя Midadi и Rathore практически пришли к такому же выводу [17]. После анализа инфицированных лиц, диагностированных в США, Petrillo с соавторами констатировали, что C. violaceum является низким по степени патогенным агентом, способным вызывать тяжелые инфекции в основном у пациентов с ослабленным иммунитетом. Тем не менее, согласно недавним исследованиям, такое обобщение является сомнительным. Bilton и Jonson описали тяжелую инфекцию, вызванную C. violaceum, у 12-летнего ребенка, у которого не было выявлено иммунодефицита [21].

Sureisen с соавторами сообщили о рецидивирующей инфекции, вызванной C. violaceum, у 20-летнего пациента с хронической гранулематозной болезнью (ХГБ), с повторными эпизодами сепсиса, полиорганного абсцесса и инфицированных незаживающих язв за последние восемь лет [22]. На тот момент это был первый случай заболевания рецидивирующей инфекцией у лиц с врожденным и приобретенным иммунодефицитом, включая ХГБ. Механизм такой чувствительности неизвестен, но прямым следствием инфекции является молниеносный сепсис и нарушение полиорганной системы, что приводит к ее быстрому распространению и высокой смертности пациентов.

Данная патология описана в 1957 году H. Berendes и сотр. как заболевание, развивающееся у мальчиков и проявляющееся труднозаживающими гнойными инфекциями самой различной локализации: кожные и висцеральные абсцессы, легочные инфильтраты, гнойные отиты, менингиты, остеомиелиты и др. ХГБ является генетическим предопределенным (наследственным) заболеванием, характеризующимся неспособностью фагоцитов организма производить перекись водорода и другие окислительные вещества для уничтожения некоторых микроорганизмов [22, 23]. Это наследственное заболевание с Х-сцепленным и аутосомно-рецессивным типом наследования, обусловленное дефектом генов [23].

Несмотря на то, что заражение бактерией C. violaceum встречается редко, уровень смертности, связанной с этой инфекцией, чрезвычайно высока. В США, 73 % зарегистрированных случаев закончились летальным исходом [21]. Тем не менее, несмотря на высокий уровень смертности, пациент, о котором было описано выше, пережил три эпизода рецидивирующей инфекции и выжил. По мнению Sureisen с соавторами наиболее важной частью лечения явилось высокие клинические симптомы, раннее обнаружение и адекватное лечение соответствующими антимикробными агентами. Благодаря этому можно эффективно вылечить эту инфекцию и снизить смертность даже у пациентов с ослабленным иммунитетом [22].

Все эти случаи включают в себя пигментированные бактерии, но есть также случаи инфекций, вызванных непигментированным штаммом (дефицит в синтезе виолацеина). Это говорит о том, что патогенность этой бактерии не зависит от виолацеина [10].

Клинический спектр инфекций C. violaceum многообразный, включает в себя инфекции мочевыводящих путей, пневмонию, желудочно-кишечные инфекции, локализованные кожные повреждения, локализованные или метастатические абсцессы, остеомиелит, менингит, перитонит, абсцесс мозга, эндокардит, гемофагоцитарный синдром, синдром респираторного дистресса и молниеносный сепсис [15]. Диагностика инфекции, вызванной С. violaceum, в настоящее время базируется на культуре клинических образцов с последующей биохимической идентификацией. В 2006 году Scholz с коллегами [24] разработали метод для обнаружения C. violaceum с помощью многократной полимеразной цепной реакции, но он не был широко признан до настоящего времени.

1.2 Физиологические особенности C. violaceum

1.2.1 Биосинтез пигмента виолацеина

Как уже упоминалось выше, с 1867 года один из штаммов C. violaceum производит пигмент виолацеин. Начиная с начала десятилетия 1930 г., Reilly и Pyne были первыми, кто подробно изучил химическую структуру фиолетового пигмента. С тех пор появлялось несколько предложений по химической структуре виолацеина, которые позднее оказались неправильными. В университете Ливерпуля в 1958 году, путем деградации исследований и с помощью повторного химического синтеза была выведена правильность структуры этого соединения (рисунок 4) [25]. Эти данные были подтверждены с помощью спектроскопического анализа в 1984 году [26].

Рисунок 4 – Химическая структура виолацеина

Виолацеин состоит из трех структурных единиц – 5-гидроксилиндол, оксиндол, 2-пирролидон, и включает в себя два индольных кольца, поэтому этот пигмент также называется бисиндольным соединением, а также ребеккамицином и стауроспорином (рисунок 5) [27].

Рисунок 5 – Химическая структура виолацеина, дезоксивиолацеина, ребеккамицина, стауроспорина

Ребеккамицин является мощным ингибитором ДНК топоизомеразы, стауроспорин является одним из сильных ингибиторов протеинкиназ. Таким образом, эти аналоги индолкарбазола хорошо изучались в качестве противоопухолевых препаратов [27]. Также сообщалось, что виолацеин имеет несколько интересных биологических активностей: антибактериальную активность против Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, и так далее [10, 28]; активность против вируса простого герпеса и вируса полиомиелита [10, 29] и противоязвенную активность [30]. Виолацеин также показывает цитотоксические эффекты против нескольких линий опухолевых клеток, влияние апоптоза на лейкозные клетки HL60 [31, 32]. Эти виды активностей могут быть предложены в качестве перспективного клинического применения для лечения рака. Другие интересные наблюдаемые активности включают иммуномодулирующее, анальгетическое и жаропонижающее действия [33], а также антиоксидантную деятельность [34]. DeMoss в 1967 году предложил, что виолацеин также может защищать от ультрафиолетового излучения.

В 1959 г. De Moss и Evans обнаружили, что для синтеза виолацеина бактериям необходим молекулярный кислород и L-триптофан. Они также показали, что синтез не начинается с D-триптофана или с L-триптофана в отсутствие кислорода. Использование ¹⁴C-меченого L-триптофана (в разных положениях) два исследователя показали, что L-триптофан был внедрен в виолацеин, за исключением карбоксильного углерода (С₁), которого, вероятно, устранили путем декарбоксилирования в ходе биосинтеза [35].

В 1989 году начались исследования по другим важным параметрам в биосинтезе виолацеина. Durán с соавторами в исследовании с радиоизотопом предположили, что помимо L-триптофана C. violaceum способен синтезировать виолацеин, начиная с индол-3-уксусной кислоты, как метаболита, предшествующего L-триптофану, и предложили амидный промежуточный продукт. В этом исследовании был определен свободный дезоксивиолацеин методом производства и очистки виолацеина [36, 37]. Виолацеин и дезоксивиолацеин являются фиолетовыми пигментами, продуцируемыми несколькими грамотрицательными бактериями, включая C. violaceum [10], Janthionobacterium lividum, Pseudomonas sp. 520P1 and 710P1, Pseudoalteromonas luteoviolacea, Dunganella sp., Collimonas sp., и так далее.

Как и в случае E. coli биосинтез триптофана у C. violaceum начинается с синтеза антраниловой кислоты; он кодируется несколькими генами (trpA, trpB, trpC, trpD, trpE, trpF, и trpG), но в отличие от кишечной палочки, эти гены не организованы в оперон. Тем не менее, они, по-видимому, составляют кластеры с генами, не связанными с биосинтезом триптофана [38].

Для биосинтеза виолацеина был клонирован и секвенирован целый оперон [39]. Результаты исследователей были подтверждены при помощи последовательности генома C. violaceum, которая показала, что гены биосинтеза находятся в опероне, состоящий из четырех открытых рамок считывания (open reading frames, ORFs), генов vioD, vioC, vioB и vioA (рисунок 6).

Рисунок 6 – Схематическое изображение структурных генов оперона биосинтеза пигмента виолацеин

Авторы также предложили путь биосинтеза с характерными признаками деятельности каждого продукта гена в этом пути (рисунок 7).

Продукты генов vioD, vioC и vioA представляют сходство с нуклеотид-зависимыми монооксигеназами. В то время как VioD катализирует первую молекулу гидроксилирования триптофана, как предлагают большинство исследований по биосинтезу виолацеина, VioA катализирует окислительное дезаминирование второй молекулы триптофана, и VioC катализирует промежуточное окисление триптофана. Белок VioB гомологичен поликетидной синтазе, ферментом с очень интересной деятельностью, так как он способен катализировать нерибосомальные пептидные связи, и в пути биосинтеза виолацеина очевидно, что этот белок катализирует конденсацию двух молекул, производных триптофана, которые необходимы для продукции пигмента [39].

VioA, VioB, VioC и VioD – продукты генов биосинтеза оперона, кодирующие нуклеотид-зависимые монооксигеназы и белок, схожий с поликетидной синтазой (VioB).

Рисунок 7 – Биосинтез виолацеина

August с соавт. сообщили, что для биосинтеза виолацеина необходимо 4 гена (vioABCD). Однако продукции виолацеина не наблюдалось после инкубации триптофана со смесью четырех ферментов VioABCD, которые индивидуально были экспрессированы в E. coli. Sánchez с соавт. [40] в исследовании биосинтеза виолацеина сообщили важные сведения, что ORF (CV3270), vioE, также необходим для продукции виолацеина, в дополнение к vioABCD. VioE является очень маленьким по размеру белком (21,8 кДа), и поэтому в течение длительного времени считался не ответственным за биосинтез виолацеина. VioE является наиболее интересным среди всех ферментов VioA-E, так как он отвечает за 1,2-сдвиг индольного кольца, которое можно найти только в биосинтезе виолацеина.

Архитектура виолацеина построена по следующему пути биосинтеза: VioA→VioB→VioE→VioD→VioC и последующих неферментативных реакций окислительного декарбоксилирования, и, таким образом, путь состоит из шести шагов [41].

1.2.2 Биопленки: общее представление

На протяжении многих десятилетий микробиологи изучали бактерии, выращиваемые в жидких средах, причем основным критерием при выборе микроорганизма для исследования физиологии и генетики являлась его способность расти в виде суспензионной гомогенной культуры. Существовало общепринятое представление, что и в природных условиях бактерии живут в виде свободно плавающих (планктонных) клеток, например, в поверхностных слоях морских или речных вод [42]. Тот факт, что бактерии способны образовывать сложные бактериальные сообщества, играющие важную роль в природе, микробиологам был известен еще со времен А. Левенгука, но официально до 1978 г. не было признано их доминирование в водных экосистемах [6].

По современным представлениям, от 95 % до 99 % микроорганизмов в природных местах обитания существуют в виде биопленок. Способность к образованию биопленок в последние годы была обнаружена более чем у 50 видов бактерий [43, 44].

Развитие микроскопической техники, в особенности, применение конфокального сканирующего лазерного микроскопа (КЛСМ), позволившее изучать микроструктуру живых биопленок [45], и молекулярно-генетических методов исследования привели к пониманию того, что большинство природных популяций бактерий существует в прикрепленном состоянии, в котором бактерии способны эффективно обмениваться сигналами и проявлять координированную активность, подобно тканям многоклеточных организмов. Развитие биопленочных сообществ является одной из основных стратегий выживания бактерий в занимаемой ими экологической нише. Бактерии в прикрепленном состоянии, будучи интегрированными в биопленку, защищены от повреждающих факторов внешней среды и антибактериальных препаратов в организме хозяина при инфекции [46].

Согласно современным представлениям биопленка – это непрерывный мультислой бактериальных клеток, прикрепленных к поверхности раздела фаз и друг к другу, образованные бактериями одного или нескольких видов и состоящие как из активно функционирующих клеток, так и из покоящихся, или некультивируемых форм, заключенных в экзополимерный матрикс [1, 6]. Межклеточные коммуникации в биопленке осуществляются при участии регуляторного механизма QS, о котором будет сказано далее. Обмен информацией происходит с помощью специализированных химических сигнальных молекул, благодаря которым микробное сообщество действует как единый организм [42, 47].

Ряд авторов считают образование биопленок морфологической дифференциацией в ответ на воздействие факторов внешней среды, таких как изменение температуры, рН среды, осмолярность, что сопровождается изменением метаболизма, гидродинамики, коммуникативных связей и т.д. [48, 49].

Микроорганизмы образуют биопленки на любых биотических и абиотических поверхностях, что создает большие проблемы в различных областях хозяйственной деятельности, например, в промышленности (коррозия) и в медицинской практике. Как теперь установлено, биопленки являются одним из патогенетических факторов формирования хронических инфекционных процессов. В первую очередь это касается заболеваний, связанных с использованием имплантируемых устройств (контактных линз, катетеров, в том числе сердечных, внутривенных и мочевыводящих, а также протезов, эндотрахеальных трубок, искусственных клапанов сердца) [42, 50]. Считается, что около 60 % внутрибольничных инфекций обусловлены биопленками [42].

Бактериальная биопленка образуется в результате сложных координированных взаимодействий микроорганизмов с поверхностью. Благодаря КЛСМ можно наблюдать за самим развитием биопленочных сообществ. Последовательность событий в наиболее общем виде представлена на рисунке 8 и состоит из трех этапов.

Рисунок 8 – Схема процесса формирования бактериальных биопленок

Первый этап представляет собой обратимое прикрепление к поверхности. Чаще всего микроорганизмы существуют в виде свободно плавающих масс или единичных (например, планктонных) колоний. Однако в нормальных условиях большинство микроорганизмов стремятся прикрепиться к поверхности, при котором существенная роль отводится флагеллам и пилям, и, в конечном счете, образовать биопленку.

Второй этап заключается в перманентном прилипании к поверхности. По мере размножения бактерий они более прочно прилипают к поверхности, дифференцируются, обмениваются генами, что обеспечивает их выживаемость. Нарастает пленочная биомасса, формируются трехмерные грибовидные или колоннообразные структуры.

На третьем этапе формируется слизистый защитный матрикс/биопленка. Однажды устойчиво присоединившись, бактерии начинают образовывать экзополисахаридный окружающий матрикс, известный как внеклеточное полимерное вещество (extracellular polymeric substance, EPS). Это предохранительный матрикс или "слизь" (EPS-matrix). Мелкие колонии бактерий затем образуют первоначальную биопленку [4, 50, 51].

Матрикс состоит из смеси компонентов, таких как экзополисахариды, белки, нуклеиновые кислоты и другие вещества. Наиболее изученным компонентом матрикса являются экзополисахариды (ЭПС), играющие, по-видимому, различные роли в структуре и функциях биопленочных сообществ, в зависимости от условий окружения. Показано, что ЭПС матрикса защищает бактерии от различных стрессовых ситуаций, возникающих в окружающей среде, таких как УФ-облучение, радиация, изменения рН-среды, осмотический шок, высыхание, воздействие антибактериальных препаратов и механизмов защиты хозяина [42, 46].

1.2.2.1 Роль целлюлозы в формировании биопленки C. violaceum

C. violaceum отвечает за производство разнообразных вторичных метаболитов с большим биотехнологическим потенциалом, включая характерный пигмент виолацеин, и этот микроорганизм также способен производить ЭПС [52].

Как и упоминалось ранее, в природных условиях биопленки являются микробным образом жизни и представляют своего рода самозащиту, что позволяет микроорганизмам выживать в неблагоприятных условиях [46]. Целлюлоза является наиболее распространенным органическим полимером, встречающимся в природе. Этот полимер состоит из молекул глюкозы, соединенных β(1→4)-гликозидными связями, образующими неразветвленные линейные цепи. Биосинтез целлюлозы представляет собой процесс, регулирующий несколько стадий, в которые входят некоторые отдельные ферменты и комплекс хорошо охарактеризованных ферментов, и другие белки. Процесс включает в себя синтез уридиндифосфат глюкозы (УДФ-глюкоза), который является предшественником молекулы биосинтеза целлюлозы [53].

Производство целлюлозы обеспечивает бактериальные межклеточные взаимодействия, адгезию к абиотическим поверхностям в формировании биопленки и устойчивость к хлору и этанолу у S. enterica [54, 55].

Большинство бактериальных генов, продуцирующих целлюлозу, кодирующих белки, которые участвуют в процессе полимеризации УДФ-глюкозы, организованы в bcs- (синтез бактериальной целлюлозы) оперон [54, 55, 56]. У штаммов LT2 S. typhimurium и K12 E. coli эти гены организованы в два оперона, yhjRQbcsABZC и bcsEFG (оба транскрибируются в разных направлениях) необходимы для биосинтеза целлюлозы [54, 55].

Огромный биотехнологический и биомедицинский потенциал C. violaceum побудил Бразильского национального консорциума геномного проекта секвенировать геном штамма 12472 C. violaceum [57]. Хотя гены, необходимые для биосинтеза целлюлозы, присутствуют и организованы в два bcs-оперона, не было никаких экспериментальных доказательств того, что бактерия фактически способна производить целлюлозу.

Recouvreux с соавт. [58] впервые сообщили о производстве целлюлозы β-протеобактерией C. violaceum. Геномный анализ показал, что гены, ответственные за биосинтез целлюлозы, производимой C. violaceum, организованы в два bcs-оперона: yhjQbcsABZC и bcsGE, гомологичные генам, вовлеченных в биосинтез целлюлозы K12 E. coli и LT2 S. typhimurium. Полученные результаты убедительно наводят на мысль, что целлюлоза присутствует во внеклеточном матриксе биопленки, образуемой C. violaceum.

Последовательность генома C. violaceum также содержит кластер генов, гомологичных другим кластерам генов биосинтеза целлюлозы. Еще два ряда доказательств указывают на то, что целлюлазовосприимчивым материалом матрикса является целлюлоза. Первым доказательством является связывание клеток бактерии с красителями. Бактериальные колонии, выросшие на модифицированной Luria-Bertani (LB)-среде, связывали с красителями Конго красным и Калькофлуором. Это связывание часто ассоциировали с производством целлюлозоподобного материала (внеклеточного матрикса). Колонии C. violaceum флюоресцировали при окрашивании Калькофлуором.

Вторым доказательством является присутствие глюкозы в целлюлозе. Колориметрический анализ гидролизата, полученного из ЭПС внеклеточного матрикса после гидролиза коммерческого фермента целлюлазы, показал высокую концентрацию глюкозы. Это указывает на присутствие β(1→4)-гликозидных связей, что характерно для биополимера целлюлозы. Кроме того, исследования СЭМ (сканирующий электронный микроскоп) подтвердили, что внеклеточный материал содержит волокнистую структуру, что также характерно для бактериальной целлюлозы [58].

Таким образом, доказано, что β-протеобактерия C. violaceum способна производить целлюлозу, присутствующую во внеклеточном матриксе биопленки.

1.2.2.2 Формирование биопленки микроорганизмом C. violaceum

Итак, еще одной важной активностью C. violaceum является производство собственного полимерного матрикса в формировании биопленки, что структурирует бактериальный консорциум и связано с вирулентностью бактерии (устойчивость к антибиотикам, дезинфектантам и фагоцитозу, развитие летальных инфекций) [59].

Формирование биопленок у нескольких микроорганизмов включает в себя наличие комплексного матрикса, где полимер поли(бета-1,6-N-ацетил-D-глюкозамин), поли-NAG, может играть важную роль [60], возможно, связанную с устойчивостью к антибиотикам и развитием бактериальных инфекций. Поли-NAG участвует в образовании биопленок у нескольких патогенных бактерий. Полимер, который участвует в клеточной адгезии Staphylococcus epidermidis [61], также участвует в связывании с абиотической поверхностью, и в межклеточной адгезии формирования биопленки Escherichia coli [60].

Как и некоторые патогенные бактерии, C. violaceum имеет hmsHFR-CV2940 оперон, продукты которого синтезируют N-ацетил-D-глюкозамин и полимеризуют его в экзополисахарид биопленки [62]. Becker с соавт. показали с помощью сравнительного анализа связь генов hmsH, hmsF, hmsR и ORF CV2940 C. violaceum с генами других микроорганизмов (E. coli, S. epidermidis, Y. pestis, B. pertussis), и их связывание с формированием биопленки или продукцией экзополисахаридов, таких как поли-NAG, и с вирулентностью бактерий. Сравнения проводили, используя аминокислотные последовательности этих микроорганизмов.

Белок HmsR является важной гликозилтрансферазой в синтезе полисахаридов, сохраняет критические остатки для своей функции у C. violaceum. Критические остатки в формировании биопленок, в белке HmsR Y. pestis [63], которые совпадают с аспартатами D135 и D228, аргинином R267 и глутамином Q264 C. violaceum, сохраняются во всех бактериях, приведенных в данном исследовании, указывающие на функциональное сходство для этого белка. Пространственное расположение критических остатков для формировании биопленки в активном сайте строго подчеркивает ферментативную роль, которую белок HmsR C. violaceum может выполнять в синтезе полисахаридов [62].

Белок HmsF C. violaceum сохраняет все аминокислоты, которые играют решающую роль в формировании биопленок. Сформированная модель с пространственным расположением критических остатков в формировании биопленок Y. pestis показывает, что они находятся близко друг к другу. Использование деацетилазы в качестве матрицы обусловливало важную роль, которую этот фермент играет в формировании биопленок. Деацитилирование включает в основном остатки аспартата (D) и гистидина (H) [64], и в данном исследовании эти остатки расположены в благоприятном пространственном положении [62].

Во множественном выравнивании HmsH белка было отмечено, что остаток аргинина R113, который показывает умеренное влияние на формирование биопленок Y. pestis [63], и который у C. violaceum представляет собой остаток R104, сохраняется почти у всех изученных микроорганизмов.

Сохранение и благоприятное пространственное расположение тех критических аминокислот, которые представляют белки, кодируемые объясняемым опероном, указывает на то, что они могут выражать необходимые ферментативные функции для прочного формирования биопленки. Поэтому можно сделать вывод, что оперон hmsHFR-CV2940 может быть связан с патогенностью C. violaceum.

Таким образом, мы рассмотрели две важные физиологические особенности бактерии C. violaceum – это биосинтез пигмента виолацеина и формирование биопленки. Далее будет сказано о роли системы QS в этих процессах.

1.3 Система QS и пути ее ингибирования

1.3.1 Регуляторная система QS и ее роль в различных процессах

Достижения в микробиологии за последние несколько лет показали, что бактерии для своего выживания так же как и люди, широко используют преимущества, которые дает коллективное поведение [1]. Данный феномен, как упоминалось ранее, получил название QS. Это особый тип регуляции экспрессии генов, зависящей от плотности популяции бактерий, и более чем у 450 видов грамотрицательных бактерий опосредованный системами образования и восприятия АГЛ [2].

Рассмотрим сравнительно хорошо изученную бактериальную систему, использующую АГЛ. Классическим объектом служит морская светящаяся бактерия Vibrio fischeri, экспрессия lux-генов которой регулируется системой "LuxI-LuxR" (рисунок 9) [3]. Впервые QS-регуляция у этой бактерии была обнаружена Нильсоном и Хастингсом в начале 70-х годов. Ее способность к биолюминесценции обусловлена синтезом люциферазы, кодируемой lux-опероном (luxCDABE), и биолюминесценция наблюдается только при высокой плотности популяции бактерий [65].

luxR – ген рецепторного белка LuxR; luxI – ген синтазы LuxI; luxCDABEG – гены lux-оперона; AI – аутоиндуктор N-ацил-гомосеринлактон (АГЛ).

Рисунок 9 – Схема QS-регуляции lux-оперона Vibrio fischeri

В системе "LuxI-LuxR" синтезируемые под контролем гена luxI АГЛ диффундируют через клеточную мембрану, аккумулируются по мере увеличения плотности бактериальной популяции, после чего взаимодействуют с кодируемым геном luxR рецепторным белком. Итоговым следствием этих событий является димеризация комплекса "рецепторный белок – АГЛ" и его связывание с промоторной областью lux-оперона с последующим запуском транскрипции ферментных систем биолюминесценции, образованием факторов вирулентности и формированием биопленок [3].

Особенно велика роль QS-систем в регуляции процессов взаимодействия патогенных бактерий с эукариотическим организмом-хозяином. Инфекционный процесс начинается, когда популяция патогенных бактерий становится достаточно большой. При этом увеличение концентрации сигнальных молекул в среде приводит к синхронному синтезу факторов вирулентности, вызывающих разрушение тканей организма, что способствует успешному преодолению бактериями иммунного ответа организма-хозяина [3]. Способность бактерии формировать биопленки является существенным фактором патогенности.

Данные об участии системы QS в формировании биопленок получены в основном на бактерии P. aeruginosa. Этот микроорганизм имеет иерархическую организованную структуру чувства кворума типа LuxI-LuxR: LasIR, RhlIR и дополнительные PQS/HHQ/MvfR-системы [66, 67]. Для образования биопленки бактериям P. aeruginosa необходимо наличие полноценной подвижности, зависящей как от флагелл, используемых при свободном движении в жидких средах, так и от сокращения полярных пилей IV типа, используемых при движении по плоскости. Оказалось, что оба типа подвижности P. aeruginosa необходимы для образования биопленок. Мутантные штаммы с дефектными флагеллами очень плохо сорбируются на твердых поверхностях. Штаммы же с дефектами в образовании пилей IV типа сорбируются на поверхности так же, как и штаммы дикого типа, образуют монослой, но не образуют микроколоний и не формируют биопленку [68]. Таким образом, перемещение микроорганизмов по поверхности, обусловленное пилями IV типа, является необходимым для образования биопленок. Оказалось, что мутанты P. aeruginosa, не способные синтезировать АГЛ, лишены этих пилей и не способны к движению по поверхности. Добавление в среду АГЛ восстанавливает синтез пилей и подвижность [69].

В клетках C. violaceum, гены, ответственные за синтез факторов вирулентности, активируются "CviI-CviR" QS-системой типа LuxI-LuxR, где кодирующий белок CviI является синтазой (С₆-АГЛ), и CviR является цитоплазматическим рецепторным белком (ДНК-связывающим фактором транскрипции), который связывается с аутоиндуктором С₆-АГЛ и активирует экспрессию генов [70]. Известно, что продукция пигмента виолацеина контролируется чувством кворума C. violaceum [71]. Промотор vioA оперона биосинтеза виолацеина контролируется белком CviR, как в C. violaceum, так и в рекомбинантном штамме E. coli, демонстрируя, что регулирование является прямым [72]. Также показано прямое регулирование белком CviR продукции хитиназы [73], его участие в экспрессии транскрипционного регулятора, гуанин дезаминазы и генов, связанных с VI типом секреции.

Однако, несмотря на то, что бактерии в биопленке общаются друг с другом с помощью диффузного аутоиндуктора [47, 42], конкретные сайты связывания белка CviR отсутствуют в hmsHFR-CV2940 опероне биосинтеза экзополисахарида [70]. Поэтому контроль чувства кворума над формированием биопленки C. violaceum пока не известен.

Исследования по выяснению участия QS-системы в способности бактерии C. violaceum к формированию биопленки остаются под вопросом, но, несомненно, что она играет ведущую роль в генетическом контроле процесса образования биопленок.

Вследствие того, что QS играет важную роль в регуляции вирулентности бактерий, обусловило появление нового направления, связанного с использованием QS-регуляции в качестве потенциальной мишени для борьбы с инфекционными заболеваниями [74].

1.3.2 Пути ингибирования QS-систем

Ингибирование QS приводит к подавлению синтеза факторов вирулентности бактерий. Лекарственные средства, направленные на подавление QS-систем, предложено называть "антипатогенными ядами" [75], так как они предназначаются для подавления именно патогенности бактерий, в отличие от антибиотиков и других классических антимикробных средств, которые обладают бактерицидным или бактериостатическим действием на патогенные бактерии. Вследствие этого у подобных лекарственных препаратов важно отметить отсутствие селективного давления, ведущего к образованию резистентных к антибактериальным веществам форм.

В последнее время за рубежом образованы биотехнологические компании, которые ставят своей целью разработку средств, подавляющих QS-регуляцию и, вследствие этого, снижающих патогенность бактерий и предотвращающих образование ими биопленок [74].

Процесс QS может быть ингибирован с помощью различных механизмов:

1) ингибирование синтеза АГЛ QS-систем;

2) деградация АГЛ QS-систем;

3) подавление связывания сигнальных молекул (АГЛ) с рецепторными белками;

4) нарушение экспрессии целевых генов QS [76, 77].

1.3.2.1 Ингибирование синтеза АГЛ

Как уже известно, синтез молекул АГЛ у V. fischeri осуществляется с помощью LuxI-синтазы (рисунок 9). Анализ синтеза других молекул АГЛ у различных бактерий четко продемонстрировал, что для этого необходимо присутствие белков LuxI-типа. Субстратами для синтеза АГЛ являются молекулы S-аденозилметионина (SAM) (для образования гомосеринлактонного кольца) и биосинтетические предшественники жирных кислот, синтезируемые при участии ацил-переносящего белка (ACP) (переносчика ацильных групп). Показано, что все гомологи LuxI-белка катализируют реакцию образования АГЛ. Фермент катализирует реакцию образования амидной связи между ацилированной боковой цепью и аминогруппой SAM [78, 79].

Знание о синтезе сигнальных молекул может быть использовано для разработки ингибирующих QS молекул, для которых мишенью является синтез АГЛ. Показано, что различные аналоги SAM, такие как S-аденозилгомоцистеин, S-аденозилцистеин, являются сильными ингибиторами синтеза АГЛ у P. aeruginosa [79]. Реакция взаимодействия АГЛ-синтазы с SAM, по-видимому, уникальна, несмотря на то, что SAM является обычным предшественником во многих прокариотических и эукариотических биохимических путях. Это позволяет надеяться, что аналоги SAM могут быть использованы в качестве специфических ингибиторов синтеза аутоиндукторов QS-систем регуляции, не влияющих на ферменты эукариот, которые используют SAM в качестве субстрата [75].

По последним сообщениям было показано, что определенные антибиотики (макролиды), ингибиторы синтеза белка на рибосомном уровне – в концентрациях, не ингибирующих рост бактерий, способны подавлять синтез АГЛ у P. aeruginosa [80, 81]. Как сообщалось, субингибирующие концентрации эритромицина подавляли синтез АГЛ и факторов вирулентности – гемагглютининов, протеазы, гемолизина у P. aeruginosa [82]. Азитромицин в концентрации 2 мкг/мл, не ингибирующий рост P. aeruginosa, подавлял синтез АГЛ, а также продукцию факторов вирулентности – эластазы и рамнолипидов. При этом добавление в культуру восстанавливало продукцию этих факторов вирулентности, показывая, что именно синтез АГЛ является первичной мишенью антибиотика [80]. Остается не ясным пока механизм действия макролидных антибиотиков на синтез АГЛ [80, 75].

Vattem с соавт. изучали влияние сублетальных концентраций (СЛК) биологически активных фитохимических экстрактов из общих фруктовых, травяных экстрактов на модулированную QS-систему, опосредованную АГЛ, у C. violaceum, E. coli и P. aeruginosa. Результаты показали, что все экстракты значительно ингибировали QS. Исследователи указали, что в их работе активность ингибирования QS состояла из комбинации двух механизмов, главным образом, способностью фитохимических экстрактов препятствовать действию АГЛ, а также способностью изменять синтез АГЛ бактериями. Способность натуральных экстрактов модулировать QS у бактерий на максимальном уровне и особенно ингибировать синтез сигнальных молекул являлась особенностью данного исследования (данные приведены в приложении А) [83].

Norizan, Yin и Chan в своей работе исследовали кофеин в качестве потенциального ингибитора QS у C. violaceum и P. aeruginosa [84]. Кофеин (1,3,7-триметилксантин) является одним из немногих продуктов растительного происхождения, который хорошо известен всеобщей публике благодаря своему широкому распространению в напитках, таких как кофе, чай и различные безалкогольные напитки [85]. Он классифицирован как алкалоид и имеет белый кристаллический внешний вид и горький вкус. Этот известный стимулирующий наркотик в природе действует как пестицид, который парализует и убивает определенных насекомых, личинок и жуков, питающихся растениями. Авторы исследовали влияние кофеина, используя биосенсоры C. violaceum CV026 и P. aeruginosa РАО1. Они подтвердили, что кофеин не деградирует АГЛ, а, как было показано в их работе, ингибирует производство АГЛ и подвижность оппортунистического патогена P. aeruginosa РАО1 и продукцию виолацеина у C. violaceum CV026. Насколько известно, это были первые сведения, содержащие данные о присутствии антикворумной активности в кофеине (данные приведены в приложении А) [84].

1.3.2.2 Деградация АГЛ

Другая стратегия заключается в инактивации или полной деградации сигнальных молекул АГЛ. Это может быть достигнуто различными способами: химической деградацией, ферментативным разрушением и преобразованием АГЛ. Разложение АГЛ может быть следствием действия специфических ферментов бактерий и высших организмов, высоких рН (выше 7), повышенной температуры культивирования бактерий, они могут также подвергаться щелочному гидролизу [86]. В настоящее время проводится активный скрининг ферментов, деградирующих АГЛ, в первую очередь, лактоназ, разрушающих гомосеринлактонное кольцо в молекулах АГЛ [3].

Лактоназы с таким действием были обнаружены у представителей рода Bacillus (белок AiiA), включая B. cereus, B. mycoides и B. thuringiensis [87, 88]. Активность этих ферментов снижала количество биологически активных сигнальных молекул АГЛ. Введение плазмиды, несущей ген aiiA, в клетки фитопатогенной бактерии Erwinia carotovora снижало синтез АГЛ и, вследствие этого, уменьшало синтез факторов вирулентности и заболеваемость растений [87].

Присутствие этого фермента в клетках бактерий в значительной степени определяет их способность к подавлению фитопатогенных бактерий, у которых вирулентность регулируется QS-системами с участием АГЛ, что открывает новые возможности при разработке эффективных бактериальных препаратов в качестве средств для биологической борьбы с заболеваниями растений [89, 90].

Исследуется также метод на основе ферментов для инактивации сигнальных молекул, заключающийся в преобразовании АГЛ. Два микроорганизма Variovorax paradoxus и P. aeruginosa PAI-A способны размножаться с АГЛ, используя его в качестве единственного источника энергии, углерода и азота. Бактерии продуцируют аминоацилазы, которые расщепляют пептидную связь в сигнальной молекуле АГЛ. Боковую цепь используют в качестве источника углерода, азот из амидной связи становится доступным в качестве аммония посредством действия лактоназ, и кольцевая часть используется в качестве донора энергии [91, 92].

Uroz с соавт. изучали возможность использования QS-деградирующих штаммов, чтобы противодействовать QS-регуляторным процессам. Исследователи использовали штамм W2 Rhodococcus erythropolis в качестве препятствующего агента, так как анализ деградации показал, что он обладает очень эффективной АГЛ-разрушающей активностью. По результатам экспериментов установили без сомнений, что этот микроорганизм способен препятствовать трем различным QS-регулируемым функциям у других бактерий, а именно продукции пигмента виолацеина у C. violaceum, распространении Ti-плазмиды у A. tumefaciens и патогенности P. carotovorum (данные приведены в приложении А) [93].

Специфические организмы деградации АГЛ обнаружены также и у высших организмов. Интерес представляют данные о том, что эпителиальные клетки дыхательных путей человека обладают специфичностью по отношению к нарушению молекул АГЛ. Клетки способны инактивировать АГЛ P. aeruginosa – 3-оксо-С₁₂-АГЛ и С₆-АГЛ, но не оказывают влияние на 3-оксо-С₆-АГЛ и С₄-АГЛ, указывая на то, что длины боковой цепи сигнальных молекул и степень окисления являются важными для этого способа инактивации. Способность к деградации АГЛ обнаружена у некоторых клеток млекопитающих [94, 95].

Все это способствует открытию новой области исследований и позволяет надеяться, что человеческий организм имеет еще одну линию защиты от бактериальных инфекций – через взаимодействие с QS-регуляцией вирулентности бактерий [3].

1.3.2.3 Подавление связывания АГЛ с рецепторными белками

Третий подход заключается в подавлении функционирования QS-систем регуляции при помощи антагонистов аутоиндуктора, которые мешают связыванию аутоиндуктора с молекулами рецепторных белков. Показано, что такие ингибиторы могут конкурировать с АГЛ – в этом случае они структурно близки сигнальной молекуле аутоиндуктора и взаимодействуют с участком связывания АГЛ с рецепторным белком, но не активируют этот белок. Неконкурентные ингибиторы могут показывать незначительное сходство, или вообще не иметь структурного сходства с АГЛ, так как они связываются с различными участками рецепторного белка [75].

Несколько докладов описывают in vitro применение аналогов АГЛ для достижения ингибирования QS-систем различных бактерий. Было показано, что аналоги АГЛ, несущие модификации в различных частях молекулы (в ацильных цепях и гомосеринлактонном кольце), подавляют QS-регуляцию бактерий. Длина ацильной цепи имеет важное значение для активности АГЛ. Интересно то, что аналоги АГЛ с более длинными ацильными цепями, чем у нативных АГЛ, обычно кажутся более эффективными ингибиторами, чем аналоги АГЛ с короткими цепями [71, 75]. McClean с соавт. исследовали обнаружение пигмента виолацеина у C. violaceum и его ингибирование в ответ на серию синтетических АГЛ и аналога N-ацилгомоцистеин тиолактона (АГТ). Виолацеин индуцировался в ответ на все соединения АГЛ и АГТ с N-ацильными боковыми цепями длиной от С₄ до С₈ с различной степенью чувствительности. С другой стороны соединения АГЛ с N-ацильными боковыми цепями от С₁₀ до С₁₄ не могли индуцировать производство виолацеина, что указывает на то, что такие длинноцепочечные АГЛ могут быть обнаружены по их способности ингибировать производство виолацеина (данные приведены в приложении А) [71].

Существует 3 основных способа модификации природных АГЛ: введение замен в ацильной боковой цепи, которая в то же время сохраняет гомосеринлактонное кольцо; введение замен и модификации в гомосеринлактонном кольце, которое в то же время оставляло ацильную боковую цепь без изменений и, наконец, значительные модификации и в боковой ацильной цепи, и в гомосеринлактонном кольце [96].

Модификации в гомосеринлактонном кольце молекул АГЛ существенно влияют на их биологическую активность. Природные АГЛ являются L-изомерами, в то время как D-изомеры, обычно, лишены биологической активности. Ацильная цепь представляется необходимой для биологической активности АГЛ, как приводится на примере с E. carotovora. Замена гомосеринлактонного кольца на гомоцистеинлактонное кольцо уменьшало активность аутоиндуктора на порядок, а замена на гомосеринлактамное кольцо приводила к потере активирующих и антагонистических свойств [97, 75]. Интересно то, что изменение структуры гомосеринлактона на гомосеринтиолактон является допустимым в нескольких QS-системах, где активность аутоиндуктора может сохраниться [98, 99].

Недавнее исследование показало, что белки LasR и RhlR QS-систем P. aeruginosa по-разному реагировали на изменения в гомосеринлактонном кольце. Это может указывать на то, что два рецепторных белка P. aeruginosa существенно различаются в участках связывания с АГЛ [100].

В последнее время большое внимание уделяется природным антагонистам QS аутоиндукторов, производным фуранонов. Первое открытие ингибирования QS-систем галогенизированными фуранонами, синтезированными из австралийской красной водоросли Delisea pulchra [101], вызвало интерес среди научного сообщества для того, чтобы оценить различные природные и синтетические соединения в качестве ингибиторов QS-систем C. violaceum in vitro [102] и in vivo [103]. Фураноны Delisea pulchra содержат фурановое кольцо с замещенной в положении С-3 ацильной цепью и атомами брома в положении С-4. Замещения в положении С-5 могут варьировать [75]. Фураноны из природных источников галогенизированы в различных положениях атомам брома, иода или хлора [75] (рисунок 10).

Рисунок 10 – Ингибиторы QS фураноновой природы

Встречающиеся в природе промежуточные бутанолида (2(5Н)-фураноны) в пути бисинтеза Hortonia sp. и Streptomyces antibioticus были признаны эффективными ингибиторами QS-систем C. violaceum (данные приведены в приложении А) [102].

Изучение механизма действия этих веществ на QS-систем показало, что соединения фураноновой природы конкурируют с АГЛ за участок связывания с рецепторными белками типа LuxR. Связывание фуранонов с рецептором влияет на стабильность комплекса белок-лиганд, приводя к быстрому расщеплению рецепторного белка [104]. Было показано, что одно из производных фуранона ингибировало QS с участием аутоиндуктора АИ-2 в клетках E. coli и формирование биопленки [105].

Таким образом, производные фуранонов перспективны для получения на их основе терапевтических агентов, направленных против патогенности бактерий. Однако испытанные к настоящему времени соединения, способные подавлять QS-регуляцию, токсичны для человека [75].

Также в качестве ингибиторов QS-систем C. violaceum были обнаружены растительные экстракты из-за сходства химических структур между ними и химическими сигналами QS (АГЛ), а также из-за их способности разрушать сигнальные рецепторы CviR (данные приведены в приложении А) [106, 107].

В исследовании, проведенном Bosgelmez-Tinaz с соавт., 46 растительных экстрактов, растворимых в хлороформе и экстрагированных из Scorzonera sandrasica доказали свою эффективность в ингибировании продукции виолацеина у C. violaceum, не влияя на рост микроорганизма. Поэтому исследователи предположили, что негативное влияние на производство виолацеина не объясняется с помощью ингибирования роста, но обуславливает нарушение сигнальной системы QS. Это очень важно, так как, когда рост не влияет, нет селективного давления для развития резистентных бактерий по сравнению с антибиотиками. Кроме того, QS-ингибирующие соединения не уничтожают полезные бактерии, существующие в организме хозяина. Таким образом, природные нетоксичные экстракты, такие как S. sandrasica, могут иметь больше преимуществ для их использования человеком, чем токсичные галогенизированные фураноны (данные приведены в приложении А) [108].

Koh и Tham [109] в своем научном исследовании использовали традиционную китайскую медицину. Экстракты некоторых растений, полученных из подземного стебля Imperata cylindrical, из листьев Nelumbo nucifera, из всего растения Prunella vulagris и из коры Puniica granatum были эффективными в ингибировании QS-системы C. violaceum (данные приведены в приложении А).

Экстракт с поверхности листьев P. incarnata, а также экстракты из корня P. sativum сильно ингибировали продукцию виолацеина, в то время как экстракты с поверхности листьев R. trichocalyx, A. maritimum, Ruta graveolens, B. napus и P. sativum вызвали слабое ингибирование QS-системы C. violaceum (данные приведены в приложении А) [110].

Musthafa с соавт. показали, что водные экстракты съедобных растений и фруктов, таких как Ananas comosus, Musa paradiciaca, Manilkara zapota и Ocimum sanctum ингибировали продукцию виолацеина C. violaceum. АГЛ-инактивирующие соединения из этих растительных источников могут быть использованы в качестве альтернативы антибиотических соединений для предотвращения АГЛ-опосредованной бактериальной инфекции у высших организмов (данные приведены в приложении А) [111].

В исследовании Zhu с соавт. [112] было показано, что натуральный пигмент, экстрагированный из гриба базидиомицета Auricularia auricular был оценен как ингибитор чувства кворума. Результаты показали, что пигмент A. auricular ингибировал регулируемую чувством кворума продукцию виолацеина у C. violaceum, не влияя на рост бактерии. Поэтому авторы предположили, что негативное влияние ингибитора на продукцию виолацеина вызвано не ингибированием роста бактерии, а, скорее всего, нарушением сигнальной системы чувства кворума. Это очень важно, так как, как отмечалось выше, нет селективного давления на развитие резистентных бактерий. A. auricular обычно синтезирует и выделяет темные пигменты: меланин, меланоид, эумеланин или феомеланин [113]. Соединения меланина не симметричны, темно-коричневые полимеры, которые часто используются в медицине, фармакологии и косметических препаратах. Конформация соединений близка к молекуле АГЛ, исключая боковую цепь. Таким образом, эти ингибирующие соединения могут конкурировать с АГЛ и взаимодействовать с участком связывания АГЛ с рецепторным белком, не активируя его. Это как раз объясняет причину ингибирования системы QS бактерии C. violaceum природными пигментами, экстрагированными из A. auricular. Таким образом, пигменты или специфические соединения, выделенные из A. auricular могут быть использованы в качестве новых ингибиторов QS для управления и регулирования вредными инфекциями у людей (данные приведены в приложении А) [112].

1.3.2.4 Нарушение экспрессии целевых генов QS

Данные о четвертом пути ингибировании получены в основном на бактерии P. aeruginosa. Учитывая, что QS регулирует такой широкий спектр факторов у P. aeruginosa, не удивительно, что регуляция генов у данной бактерии является самоконтролируемой. Было показано, что несколько факторов вирулентности, включая GacA, Vfr и RelA, положительно регулируют экспрессию LasR [114, 115]. Деградация vfr практически уничтожает всю экспрессию lasR и понижает производство факторов вирулентности. Кроме того, деградация GacA, части двухкомпонентной регуляторной системы, приводит к снижению продукции многих факторов вирулентности. Эти данные свидетельствуют о значимости этих регуляторных факторов в борьбе с продукцией вирулентности P. aeruginosa [116, 117]. На основании этих данных, различные факторы, участвующие в регуляции экспрессии генов QS, многие из которых еще не известны, могут быть идеальными мишенями для потенциального нарушения индукции вирулентности QS.

Альтернативным подходом к ингибированию QS является использование антисмысловых олигонуклеотидов, которые специфически связываются с системами lasR/lasI и rhlR/rhlI и ингибируют экспрессию генов. Использование этого подхода специфически ингибировать трансляцию определенных генов всесторонне изучено в эукариотических системах и оценивается в настоящее время во многих клинических испытаниях [118]. Однако эффективность данной технологии для ингибирования бактериальных генов обширно не изучена. Исследования, проведенные на бактериях Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis и Escherichia coli, успешно продемонстрировали, что антисмысловые олигонуклеотиды могут специфически связываться с целевыми транскриптами и ингибировать экспрессию генов. Хотя такой подход имеет многочисленные препятствия, такие как проницаемость клеточной стенки и эффективность способа связывания, исследования с использованием модифицированных олигонуклеотидов показали значительные перспективы. Преимуществом данной технологии является то, что антисмысловое регулирование – это обычное явление у бактерий, и что этот механизм регуляции существенно отличается от других антимикробных [76].

Несколько соединений было обнаружено у морских организмов, таких как цианобактерий, с их способностями подавлять экспрессию генов QS. Dobretsov с соавт. исследовали способность экстрактов из нескольких видов цианобактерий (штат Флорида, США) нарушать чувство кворума в репортерном штамме C. violaceum CV017. Ингибирующая активность была обнаружена в этилацетате: экстракт метанола (1:1) (Lyngbya spp.) и экстракты Lyngbya majuscula обладали сильным ингибирующим действием. Антибиотик малинголид был определен в качестве ингибитора QS. Деятельность малинголида исследовали с использованием АГЛ на основе рецепторного белка LasR P. aeruginosa. Антибиотик был способен ингибировать производство виолацеина у C. violaceum и продукцию эластазы и пиоцианина у P. aeruginosa (данные приведены в приложении А) [119].

Таким образом, мы рассмотрели 4 пути ингибирования QS-регуляции бактерий, в том числе C. violaceum. Изучены действия различных веществ, полученных из природных источников и в результате химического синтеза, на QS-регуляцию и экспрессию генов, связанных с QS. Обнаружено взаимодействие с QS веществ, относящихся к определенным антибиотикам. Показано, что целый ряд веществ, продуцируемых растениями, способен взаимодействовать с QS-системой C. violaceum.

Тем не менее, некоторые соединения, способные подавлять QS-регуляцию, токсичны для человека. Актуальную задачу представляет их модификация и поиск новых, нетоксичных соединений, пригодных для клинического применения.

2 Материалы и методы

2.1 Штаммы бактерий и условия выращивания бактериальных культур

Бактериальные штаммы, использованные в работе, представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Бактериальные штаммы

Штаммы	Характеристика	Ссылка
C. violaceum ATCC 31532	Природный штамм – продуцирует фиолетовый пигмент – виолацеин (violacein), образует биопленку, синтез пигмента регулируется системой QS, которая включает С₆-АГЛ. Два геномных гена cviI и cviR кодируют белки CviI – С₆-АГЛ синтазы и CviR – регуляторный белок. Система vioABCDE. Обладает хитиназной и экзопротеазной ативностью.	[27, 70, 71, 73]
С. violaceum NCTC 13274	Мини-Tn5 мутантный штамм дикого типа C. violaceum ATCC 31532 – образует бесцветную биопленку, имеет инактивированный cviI ген, что приводит его к неспособности синтезировать АГЛ. Производит виолацеин в ответ на экзогенное внесение АГЛ.	[27, 70, 71, 73]
Escherichia coli pAL 103	Наличие плазмиды pAL 103, в составе которой кассета генов биолюминесценции luxCDABE клонирована под контролем гена luxR, воспринимающего С₆-оксо-АГЛ и С₆-АГЛ.	[122]

2.1.1 Штаммы C. violaceum

Штамм дикого типа C. violaceum ATCC 31532 был приобретен в Американской коллекции типовых культур (LGC Standarts, Великобритания) и С. violaceum NCTC 13274 в Национальной коллекции типовых культур (Health Protection Agency, Великобритания). Этот мини-Tn5 мутантный штамм дикого типа имеет инсерцию в гене cviI и лишен производства собственного аутоиндуктора, но сохраняет способность реагировать на С₆-АГЛ и ряд других (C₄ – C₈) короткоцепочечных АГЛ [120, 121]. Поэтому С. violaceum NCTC 13274 бесцветен, но производит характерный фиолетовый пигмент виолацеин после инкубации с С₆-АГЛ, который широко используется в качестве индикатора в исследовании механизмов чувства кворума.

violaceum ATCC 31532 выращивали в 3 мл LB-бульоне среды (AppliChem GmbH, Германия) с добавлением глюкозы (10 мг/мл) и дрожжевого экстракта (10 мг/мл) при температуре от 27 °C до 30 °C. C. violaceum NCTC 13274 культивировали в тех же условиях в присутствие С₆-АГЛ (Cayman Chemical Company, США) и в его отсутствии.

2.1.2 Люминесцирующий штамм Escherichia coli pAL 103

В качестве объекта исследования биолюминесценции использовали штамм Escherichia coli JLD271, pAL103; luxR+ luxI_luxCDABE; TetR p15A, ранее разработанный A. Lindsay и B.M. Ahmer [122]. Его особенностью являлось наличие плазмиды pAL103, в составе которой кассета генов биолюминесценции luxCDABE клонирована под контролем гена luxR, воспринимающего С₆-оксо-АГЛ и С₆-АГЛ. При этом в отсутствие гена luxI, ответственного за синтез собственного автоиндуктора, биолюминесценция подобной конструкции развивается только в присутствии экзогенно вносимого АГЛ. Кроме того, для повышения чувствительности данной репортерной системы, она клонирована в хозяйском штамме E. coli JLD271 с мутацией в гене sdiA, продукт которого также распознает АГЛ и мог бы конкурировать с luxR за его связывание. В качестве контрольного использован нелюминесцирующий штамм E. coli pAL 104; lux I :: luxCDABE (lux R^-).

Перед проведением исследований E. coli выращивали от 16 до 18 часов при 37 °С в LB-бульоне в присутствии 12 мкг/мл антибиотика доксициклина, являющегося селективным фактором плазмиды pAL103.

2.2 Ауторегуляторные d1-факторы бактерий

Помимо АГЛ QS-систем, которые, как указывалось выше, "оценивают" минимальную плотность клеточной популяции, достаточную для активации собственного синтеза (аутоиндукция) и затем экспрессии ряда генов, ассоциированных со стационарной фазой, существует другой тип ауторегуляторов, также с плотностными функциями, контролирует максимально возможную для данных условий численность клеток в пролиферирующей культуре, при которой она переходит в стационарную фазу. К такого типа ауторегуляторов относятся факторы d₁[7]. Характер физиологического действия факторов d₁, представленных в данной работе алкилоксибензолами (АОБ), обусловлен их способностью к физико-химическим взаимодействиям (водородные связи, гидрофобные и электростатические взаимодействия) и комплексообразованию с клеточными биополимерами (ферментными белками и НК) и фосфолипидами мембран [8]. При достижении порогового концентрационного уровня, коррелирующего с увеличением численности клеток в развивающейся культуре, АОБ индуцируют остановку клеточного деления и переход культуры в стационарную фазу роста, а при дальнейшем повышении их концентрации – образование покоящихся клеток, характеризующихся анабиотическим состоянием [9].

В качестве химических аналогов ауторегуляторных d₁-факторов бактерий нами было использовано четыре гомолога АОБ, различающиеся длиной и расположением гидрофобного углеводородного (алкильного) радикала: метил-оксибензол (С₁-АОБ; «Sigma», США), пентил-оксибензол (С₅-АОБ; «Sigma», США), гексил-оксибенозол (С₆-АОБ; «Sigma», США) и додецил-оксибензол (С₁₂-АОБ; «Enamine», Украина) со степенью очистки 99,9 % Структурная формула и молекулярный вес данных молекул приведены в таблице 2.

Данные вещества изначально растворяли в дистиллированной воде, их рабочие концентрации в исследуемых растворах составляли 1∙10^-2 М.

Таблица 2 Использованные химические аналоги алкилоксибензолов

Обозначение	Структурная формула	Молекулярный вес	Производитель
С₁-АОБ		124	Sigma, США
С₅-АОБ		180	Sigma, США
С₆-АОБ		194	Sigma, США
С₁₂-АОБ		278	Enamine, Украина

2.3 Методы, используемые в работе

2.3.1 Количественная оценка роста

Биомассу собирали в количестве 200 мкл и рост бактерий C. violaceum наблюдали путем измерения оптической плотности при длине волны в 450 нм, используя микростриповый фотометр Stat Fax 303 6VIS (Awareness Technology Inc., США).

2.3.2 Виолацеин-анализ

Бактериальные клетки C. violaceum собирали в эппендорфы в количестве 1 мл с последующим центрифугированием при 10 000 об/мин в течение 5 минут для осаждения клеток, затем супернатант удаляли. Для экстракции пигмента виолацеина к осадку добавляли по 200 мкл 95 % этилового спирта, и образцы тщательно перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут. Повторно центрифугировали при том же режиме, после чего собирали надосадочную жидкость, содержащую виолацеин. Культуру повторно экстрагировали следующим объемом этилового спирта. Это было необходимо для того, чтобы полностью освободить осадочные клетки от виолацеина. Экстракты были едиными, и относительные концентрации виолацеина были измерены на фотометре при длине волны в 575 нм.

2.3.3 Анализ формирования биопленок

Для количественной оценки способности бактерий C. violaceum к формированию биопленок использовали метод, описанный O'Toole с соавт. [123]

Экстрагированную бесцветную, высушенную в воздухе, массу использовали для анализа связывания с кристаллическим фиолетовым. К осадку добавляли по 200 мкл 0,1 % спиртового раствора кристаллического фиолетового и инкубировали в течение 45 минут при комнатной температуре. Затем неадсорбировавшийся краситель аккуратно отбирали, и для удаления несвязавшегося красителя пробы дважды промывали дистиллированной водой объемом в 200 мкл с последующим центрифугированием при том же режиме. Хорошо связавшийся краситель с экзополисахаридом биопленки растворяли в 200 мкл 95 % этилового спирта и оставляли на 45 минут при комнатной температуре. Затем надосадочную жидкость отбирали, и осадок повторно экстрагировали следующим объемом этилового спирта. Оптическая плотность связавшегося клетками красителя в единых образцах была измерена на фотометре при длине волны в 540 нм.

2.3.4 Атомно-силовая микроскопия

В последние годы роль АСМ в биологических исследованиях существенно возросла. АСМ является информативным методом для описательной микробиологии, в частности, позволяет составлять атласы трехмерных изображений бактерий, проводить количественный анализ их морфологических и механических свойств [124].

Для АСМ изображений планктонные и сформированные в биопленке клетки C. violaceum были разделены. Планктонные бактерии были собраны автоматическим дозатором, прикасаясь наконечником ко дну каждого флакона, после чего клетки осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 минут. Затем их однократно отмывали дистиллированной водой от среды культивирования, и смеси суспензии бактерий в объеме 15 мкл наносили на свежесколотую поверхность слюды (5 × 5 мм). Оставшиеся неповрежденные биопленки сразу же осторожно переносили на поверхность слюды. Образцы высушивали в течение 24 часов при относительной влажности 93 % и температуре от 20 °С до 22 °С [125].

Образцы были проанализированы методом АСМ, СММ-2000 (ЗАО «Протон-МИЭТ завод", Россия) в контактном режиме. Принцип работы АСМ основан на регистрации силового взаимодействия между поверхностью исследуемого образца и зондом. В качестве зонда используется наноразмерное острие, располагающееся на конце упругой консоли, называемой кантилевером. Сила, действующая на зонд со стороны поверхности, приводит к изгибу консоли. Появление возвышенностей или впадин под острием приводит к изменению силы, действующей на зонд, а значит, и изменению величины изгиба кантилевера. Таким образом, регистрируя величину изгиба, можно сделать вывод о рельефе поверхности. Под силами, действующими между зондом и образцом, в первую очередь подразумевают дальнодействующие силы Ван-дер-Ваальса, которые сначала являются силами притяжения, а при дальнейшем сближении переходят в силы отталкивания. Луч лазера направляется на внешнюю поверхность кантилевера, отражается и попадает на фотодиод (рисунок 11) [126, 127].

Прибор СММ-2000 оснащен кантилеверами из нитрида кремния MSCT-AUNM (Veeco Instruments Inc, США), которые имеют пирамидальный (V-образный) конец с типичным радиусом ~ 10 нм и жесткостью балки 0,01 Н/м. Во время сканирования АСМ изображений характерные размеры были определены путем проведения чертежного отрезка на выбранном участке поверхности образца и анализировали с помощью штатного программного обеспечения СMM-2000.

Рисунок 11 – Схема работы АСМ [128]

2.3.5 Оценка ингибирования QS

Для каждого АОБ составляли концентрационный ряд разведений в пенициллиновых флаконах, содержащей по 1 мл культивируемой среды (LB-бульона). Из рабочих растворов АОБ добавляли по 1 мл в первый флакон в каждом ряду, в котором концентрация АОБ составила 1∙10^-3 М, производилось двукратное разведение, в последнем флаконе концентрация составила 3,9∙10^-6М. В качестве контрольного варианта использовали такой же ряд, вместо АОБ использовали стерильную дистиллированную воду.

Затем в каждый флакон добавляли по 5 мкл разведенного раствора С₆-АГЛ, конечная концентрация которого составила 5∙10^-9М и по 20 мкл суточной бактериальной культуры C. violaceum. Культивирование производили при температуре 28 °С в течение времени от 18 до 24 часов.

2.3.6 Биолюминесцентный анализ

Перед постановкой эксперимента культуру E. coli разводили свежей питательной средой, LB-бульоном, и дополнительно подращивали в течение времени от 3 до 5 часов до достижения оптической плотности 0,5 ед. при 450 нм. Проверку чувствительности системы проводили путем ее индукции С₆-АГЛ в диапазоне концентраций от 1∙10^-4 до 1∙10^-6М. Исследование влияния АОБ на способность модельных микроорганизмов к восприятию АГЛ проводили в двух вариантах постановки эксперимента. В первом из них в ячейки 96-луночного планшета из непрозрачного пластика («Thermo», США) одномоментно вносили по 100 мкл бактериальной культуры, С₆-АГЛ в концентрации 1∙10^-4М, а также С₁-АОБ, С₆-АОБ и С₁₂-АОБ в концентрациях 1∙10^-3, 1∙10^-4, 1∙10^-5 и 1∙10^-6М. В контрольных вариантах АГЛ или АОБ заменяли равными объемами растворителя. Второй вариант предполагал предварительную часовую инкубацию бактериальной культуры с АОБ в указанных выше концентрациях, после чего в реакционную смесь вносили разрешающую дозу С₆-АГЛ. После этого планшеты помещали в термостатируемый измерительный блок биолюминометра LM 01T («Immunotech», Чехия), с использованием которого в течение 60 минут проводили динамическую регистрацию интенсивности развивающегося свечения опытных и контрольных образцов, осуществляя оценку и архивирование полученных данных с использованием штатного программного обеспечения KILIA.

Степень индукции биолюминесценции (I) определяли по формуле

(1)

где I_o – интенсивность свечения бактерий в опытном образце;

I_k – интенсивность свечения бактерий в контрольном образце.

2.3.7 Статистическая обработка результатов

Все эксперименты, представленные в данной работе, проводились в не менее чем в трех повторностях. Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерных программ "Excel", "Origin", численных и графических методов описательной статистики. Результаты исследований достоверны с уровнем значимости 0,05. Полученные данные обрабатывали статистически, используя параметрические критерии достоверности (Т-критерий Стьюдента) [129]. Приведены средние арифметические значения, стандартные отклонения и среднеквадратические ошибки среднего арифметического.

Первая задача в статистическом исследовании состояла в определении вида уравнений регрессии, соответствующего экспериментальным кривым. Для построения уравнений регрессии оценивали параметры (коэффициенты) уравнений. Это решалось с помощью метода наименьших квадратов. Для этого использовали фактические значения выборок, их средние арифметические значения и расчетные значения. Значимость уравнений регрессии осуществляли с использованием F-критерия, основанного на статистике, имеющего распределение Фишера-Снедекора. В данном случае применяли формулу дисперсии. Используя таблицу F-распределения Фишера-Снедекора, определяли значимы уравнения регрессии или нет. При условии значимости определяли интервальные оценки параметров уравнений для того, чтобы установить их доверительный интервал.

Вторая задача заключалась в сравнении экспериментальных кривых между собой, используя соответствующие им параметры уравнений регрессии. Проверку гипотезы о существенности или несущественности различия двух выборочных средних осуществляли с помощью Т-критерия Стьюдента. Расчеты проводили, используя формулы среднеквадратического отклонения (σ) и ошибки репрезентативности (m). Т-критерий Стьюдента вычисляли по формуле:

(2)

где М₁, М₂ – средние значения двух выборок;

m₁, m₂– ошибки репрезентативности средних величин;

α – уровень значимости;

df – число степеней свободы.

Полученное этим способом значение критерия Т-Стьюдента сравнивали с табличным при выбранном уровне значимости и числе степеней свободы [130]. Вывод о достоверности отличий делали в том случае, если рассчитанное значение превышало табличное, и наоборот [130].

3 Результаты и обсуждение

3.1 Морфологическая дифференцировка клеток C. violaceum, ассоциированная с ростом биопленки и направляемая АГЛ

На первом этапе работы был применен подход, используемый для изучения способности бактерий дикого штамма C. violaceum ATCC 31532, а также мутантного штамма C. violaceum CV026 в отсутствие и в присутствии С₆-АГЛ к росту, биосинтезу пигмента виолацеина и формированию биопленок и их исследование с помощью АСМ.

3.1.1 Рост, биосинтез виолацеина и формирование биопленки диким штаммом C. violaceum ATCC 31532

Для того, чтобы оценить, зависит ли биосинтез виолацеина и формирование биопленки от плотности клеток, штамм C. violaceum АТСС 31532 выращивали в LB-бульоне в течение трех суток (рисунок 12).

Рисунок 12 – Рост, биосинтез виолацеина, формирование биопленки

диким штаммом C. violaceum АТСС 31532

Этот эксперимент показал типичный рост бактерий (OП₄₅₀) (на графике изображено черной линией), максимально прогрессирующий на 1 сутки, с последующим постепенным увеличением до конца стационарной фазы. Биосинтез виолацеина был обнаружен с первых суток (на графике показано синей линией), но наиболее выраженный рост характерной оптической плотности (OП₅₇₅) был установлен при высокой плотности клеток между вторыми и третьими сутками, значение которого увеличилось в 3,4 раза. Зато продукция экзополисахарида биопленкой (на графике отмечено красной линией) была очень схожа с темпами роста, и оптическая плотность биопленки (OП₅₄₀) после окрашивания кристаллическим фиолетовым увеличивалась пропорционально оптической плотности биомассы (OП₄₅₀). Таким образом, биосинтез пигмента и формирование биопленки у дикого штамма C. violaceum ATCC 31532 по-разному соответствуют плотности клеток, и только продукцию пигмента можно оценивать как кворум-зависимый параметр.

3.1.2 АСМ изображения планктонных и клеток в биопленке дикого штамма C. violaceum ATCC 31532

Выросшие на первые, вторые, третьи сутки планктонные и клетки бактерии, сформированные в биопленке, переносили на поверхность слюды, чтобы пронаблюдать за общей морфологией клеток и подробной топографией поверхности (рисунок 13).

Рисунок 13 – АСМ изображения планктонных клеток и клеток в биопленке

C. violaceum ATCC 31532

Суточные отдельные клетки C. violaceum имели характерную для них вытянутую, продолговатую форму, и с помощью инструментов программного обеспечения АСМ было выявлено, что клетки имели следующие размеры: 0,85±0,09 мкм в ширину, 0,34±0,07 мкм в высоту и 2,45±0,31 мкм в длину без отличительных особенностей между планктонными и сформированными в биопленке клетками. Тем не менее, топография поверхности этих клеток значительно отличалась, и были выявлены необычные инвагинации (от 15 до 20 штук на клетку) наружной цитоплазматической мембраны (ЦПМ) в биопленке бактерий. На основе профилей АСМ инвагинации имели диаметр 171±43 нм и глубину 31,1±7,5 нм, в то время как расстояние между их центрами варьировалось около 288±80 нм (рисунок 14 А).

Рисунок 14 – Гистограммы диаметров и расстояний между центрами инвагинаций (А) и экструзий (Б) поверхностей клеток C. violaceum ATCC 31532

Похожие инвагинации были обнаружены на вторые сутки планктонных клеток, в то время как клетки в биопленке существенно изменились (рисунок 13). Благодаря высокому разрешению АСМ изображения поверхностей клеток показали, что бактерии были покрыты выпуклыми гранулярными структурами (экструзиями). Измерены их диаметры по профилям АСМ: 250±61 нм, а расстояние между их вершинами было равно 183±57 нм (рисунок 14 Б). Идентичность расположения и расстояния между центрами суточных инвагинаций и 2-х суточных экструзий (Р=0,467) заверила нас в их пространственной взаимосвязи, о том, что экструзии были сформированы на месте предыдущих инвагинаций. С другой стороны, сравнение роста C. violaceum с АСМ изображениями позволило нам объяснить происходящие события продукцией экзополисахарида биопленкой.

На третьи сутки АСМ показал гранулированную поверхность биопленки и только контуры бактериальных клеток в биопленке (рисунок 13). В то же время планктонные клетки изменились и на их поверхности тоже сформировались выпуклые гранулы (экструзии). Такое наблюдение динамики морфологии клеток и топографии поверхности предполагает, что инвагинации и экструзии планктонных клеток формируются позднее клеток в биопленке, хотя динамики изменений очень похожи. Кроме того, в планктонных клетках могут быть обнаружены жгутики (около 20 нм в диаметре) и некоторые другие тонкие фимбриальные структуры.

Таким образом, с помощью АСМ мы впервые сообщаем о морфологической дифференциации клеток штамма C. violaceum ATCC 31532, которые развиваются с темпом роста и ассоциированные с формированием биопленки. Тем не менее, контроль системы чувства кворума над дифференциацией клеток и формированием биопленок остается не ясным.

3.1.3 Рост, биосинтез виолацеина и формирование биопленки мутантным штаммом C. violaceum NCTC 13274

Для того, чтобы оценить влияет ли система чувства кворума на формирование биопленок, мы исследовали мини-Tn5 мутантный штамм C. violaceum NCTC 13274, который культивировали в отсутствие и в присутствии природного аутоиндуктора С₆-АГЛ (рисунок 15).

Рисунок 15 – Рост, биосинтез виолацеина, формирование биопленки

violaceum

Когда штамм C. violaceum NCTC 13274 выращивали трое суток в LB-бульоне без АГЛ и с 0,1 мкМ С₆-АГЛ, продукция виолацеина кардинально отличалась, в то время как темпы роста и кривые роста были сопоставимы. После 24 часов инкубации, значение оптической плотности (OП₄₅₀) беспигментной культуры, растущей в отсутствие аутоиндуктора, было около 11,0 % выше, чем в присутствии С₆-АГЛ, и около 22,9 % выше ОП штамма дикого типа C. violaceum ATCC 31532. По нашему мнению, это может быть обусловлено экономией АТФ-энергии на биосинтез пигмента, однако на вторые и третьи сутки темпы роста беспигментной культуры снизились, по сравнению с пигментной. С другой стороны производство виолацеина мутантным штаммом C. violaceum NCTC 13274, инкубированной с С₆-АГЛ было чрезвычайно выше, чем диким штаммом C. violaceum ATCC 31532, и с характерной для него оптической плотностью (OD₅₇₅) показало значения выше в 4,2 раза на первые, в 5,3 раза на вторые и в 1,9 раза на третьи сутки, соответственно. Мы полагаем, это обусловлено тем, что экзогенный С₆-АГЛ был внесен в начале роста, и развитие биосинтеза пигмента у штамма C. violaceum NCTC 13274 шло независимо от плотности клеток: кривые роста для дикого и мутантного штамма очень похожи.

В отличие от качественных различий производства виолацеина, формирование биопленки штаммом C. violaceum NCTC 13274 в присутствии и в отсутствие С₆-АГЛ отличалось только количественно. Эти постановки были очень похожи на штаммы C. violaceum NCTC 13274, растущей с С₆-АГЛ и C. violaceum ATCC 31532, в то время как окрашивание кристаллическим фиолетовым бесцветной культуры показало только от 64,0 до 70,3 % продукции экзополисахарида биопленкой в сравнении с пигментной.

В целом, если инсерция в гене cviI mini-Tn5 приводит к блокированию биосинтеза виолацеина, а при внесении экзогенного аутоиндуктора значительно усиливается продукция пигмента, то образование биопленки уменьшается количественно, и аутоиндуктор его только восстанавливает. Таким образом, продукция виолацеина развивается как кворум-зависимый параметр, в то время как образование биопленки доказали как неканонический параметр.

3.1.4 АСМ изображения клеток, сформированных в биопленке C. violaceum NCTC 13274

Чтобы подтвердить или отклонить контроль системы чувства кворума над формированием биопленки штаммом C. violaceum NCTC 13274, культуру культивировали в отсутствие и в присутствии С₆-АГЛ и исследовали с помощью АСМ (рисунок 16).

К удивлению, но суточные бактериальные культуры, растущие без аутоиндуктора показали гладкую поверхность, тогда как клетки в присутствии С₆-АГЛ имели многочисленные инвагинации. Поверхностная топография этих клеток демонстрирует высокое сходство глубины и диаметра с инвагинациями клеток дикого штамма C. violaceum ATCC 31532. В то же время количество инвагинаций в клетке было больше (от 25 до 40 штук на клетку), расстояние между их центрами было меньше. Эти данные заверили нас в том, что раскрываемые дифференциации клеток С. violaceum показывают кворум-зависимый феномен, естественно развиваемый в культуре темп роста отменяется без аутоиндуктора и возвращается с экзогенным С₆-АГЛ.

Рисунок 16 – АСМ изображения клеток в биопленке C. violaceum NCTC 13274

На вторые сутки клетки штамма C. violaceum NCTC 13274, выросшие с С₆-АГЛ, получили многочисленные выпуклости (экструзии), как и клетки в биопленке дикого типа, и их количественные характеристики, такие как расстояние между вершинами, были очень схожи с суточными инвагинациями. С другой стороны штамм С. violaceum 13274 NCTC, культивируемый без С₆-АГЛ, не показывает никаких инвагинаций или экструзии, в то время как высокое разрешение АСМ показало, что поверхность бактериальной клетки была покрыта аморфным полимерным веществом.

Таким образом, система чувства кворума у C. violaceum не контролирует биосинтез экзополисахарида в биопленке, но включает в себя транспорт этих молекул, и АСМ показывает необычные морфологические дифференциации бактериальных клеток, связанные с развитием биопленки и направляемые С₆-АГЛ (аутоиндуктором QS).

3.1.5 АСМ изображения зрелых биопленок C. violaceum, сформированных в присутствии и в отсутствие аутоиндуктора

Поскольку АСМ способен давать изображения морфологии поверхности с нанометровым разрешением, мы использовали этот метод для сравнительной профилометрии зрелой биопленки на третьи сутки, сформированной диким штаммом C. violaceum ATCC 31532 и mini-Tn5 мутантным штаммом C. violaceum NCTC 13274, культивируемым с С₆-АГЛ и без него.

Рисунок 17 показывает, что штамм С. violaceum ATCC 31532 производит относительно гладкую биопленку, состоящую из плотно связанных полимерных блоков, а шероховатость поверхности составляет только 13,0±2,65 нм. Заметно, что мутантный штамм С. violaceum NCTC 13274 без аутоиндуктора показывает более нерегулярную структуру биопленки с шероховатостью 70,2±12,5 нм (Р=0,0007), что вероятно вызвано остановкой кворум-зависимого механизма транспорта экзополисахаридов. Наконец, топография АСМ изображений показывает, что нет существенной разницы между шероховатостью биопленок, сформированных мутантным штаммом C. violaceum NCTC 13274, инкубированным с экзогенным С₆-АГЛ, и диким штаммом (5,08±0,73 нм, Р=0,0018).

Рисунок 17 – Профили и значения шероховатости поверхности биопленок, образованных диким, мутантным штаммом С. violaceum в отсутствие и в присутствии С₆-АГЛ

Эти данные показывают, что контроль системой чувства кворума С. violaceum приводит к высокоорганизованной полимерной матричной структуре, и наше наблюдение делает биопленку сильной и устойчивой к механическим воздействиям.

Таким образом, наш основной вывод состоит в неканонической зависимости между чувством кворума и формированием биопленки C. violaceum. Значимыми результатами для такого сравнения были:

1) различные динамики продукции строго кворум-зависимого виолацеина и синтеза экзополисахарида в течение роста штамма дикого типа C. violaceum ATCC 31532;

2) абсолютное блокирование биосинтеза виолацеина инсерционным мутантным штаммом C. violaceum NCTC 13274, в то время биопленка оставалась, и лишь несколько снижалось ее развитие;

3) значительное увеличение биосинтеза виолацеина C. violaceum NCTC 13274 с экзогенным С₆-АГЛ в сравнении со штаммом дикого типа C. violaceum ATCC 31532, в то время как формирование биопленки только восстанавливалось. Таким образом, подобно P. aeruginosa, штамм дикого типа C. violaceum и мутанты чувства кворума не показывают очевидных количественных различий в продукции экзополисахарида [131, 132].

В целом наши результаты показывают, что чувство кворума управляет качеством биопленки, но не количеством, и без этого контроля бактерии вырабатывают недифференцированные биопленки, что показывает, в отличие от биопленки дикого типа, чувствительность к механическими и химическим факторам.

В рамках нашего экспериментального результата, мы были заинтересованы в понимании механизма морфологической дифференциации и секреции экзополисахарида, контролируемые чувством кворума. Мы считаем, что в настоящем исследовании показана идентичность инвагинаций цитоплазматической мембраны C. violaceum с помощью АСМ, которая ранее была описана методом трансмиссионной электронной микроскопии [133]. На этом фоне мы предсказываем ассоциацию инвагинаций к бактериальным мезосом-подобным структурам, которые богаты энергией и биосинтетическими ферментами (рисунок 18), несмотря на то, что мы еще не знаем какие гены, контролируемые чувством кворума, вовлечены в этот процесс. Например, может участвовать секреция VI типа [70], контролируемая чувством кворума, у которой многокомпонентные машины организуют транспорт экзополисахарида, и которая участвует в формировании биопленки и связанной с ней устойчивости конкретной биопленки к антибиотикам [134].

Рисунок 18 – Предсказанная модель топологической пространственной взаимосвязи мезосом-подобных структур (1), белков VI типа секреции (2) и мембранных инвагинаций (3) клеток C. violaceum

Последующие исследования этого механизма могут показать понимания как функции чувства кворума в формировании биопленки, так и типичность морфологической дифференциации бактериальных клеток, ассоциированной с развитием биопленки и направляемые аутоиндуктором чувства кворума.

3.2 Влияние АОБ на рост, биосинтез пигмента и формирование биопленки С. violaceum

На втором этапе работы, с использованием оптического метода регистрации при различных длинах волн (450, 540 и 575 нм), была проведена оценка биологических эффектов химических аналогов АОБ на рост, биосинтез пигмента виолацеина и биопленочного экзополисахарида мутантным штаммом С. violaceum NCTC 13274 в присутствии C₆-АГЛ. Первый эффект показал бактерицидное действие АОБ на микроорганизм, что проявлялось в ингибировании его роста и количественно зависело от особенностей структуры (в первую очередь длины углеводородного радикала) данных соединений. Данный эффект свидетельствовал о выраженной концентрационной зависимости действия АОБ на рост бактерии и наглядно показан на рисунке 18.

Рисунок 18 – Бактерицидный эффект С₁-, С₅-, С₆-, С₁₂-АОБ

В частности, наиболее короткоцепочечный гомолог С₁-АОБ не вызывал полного подавления бактериального роста, хотя в наибольшей тестируемой концентрации (1 мкМ) обуславливал снижение величины ОП₄₅₀ до 51,7 % от контрольных значений. В то же время более длинноцепочечные гомологи С₅-АОБ, С₆-АОБ и С₁₂-АОБ полностью подавляли рост C. violaceum NCTC 13274 со значениями минимальных ингибирующих концентраций (МИК) равными 0,5 мкМ, 0,25 мкМ и 0,125 мкМ, соответственно (таблица 3). Кроме того, субингибиторные концентрации названных соединений сохраняли умеренно выраженную рост-ингибирующую активность в диапазоне концентраций от 0,125 до 0,03125 мкМ включительно, что заключалось в снижении величин ОП₄₅₀в соответствующих пробах от 77,1 % до 37,9 % от контрольных значений. Тем самым регистрируемые эффекты хорошо согласовывались с данными Ю.А. Николаева с соавт. [135], зафиксировавшим сходную активность у широкого круга природных и химически синтезированных фенольных липидов, а также показавшим рост их антимикробного потенциала при увеличении степени гидрофобности, в свою очередь зависящей от размера и положения углеводородных заместителей в молекулах АОБ.

Таблица 3 Воздействие алкилоксибензолов на рост и кворум-зависимые проявления у С. violaceum NCTC 13274

Исследованные гомологи	Минимальная ингибирующая концентрация, мкМ	Значения EC₅₀, характеризующие эффективность подавления кворум-зависимых параметров, мкМ
Исследованные гомологи	Минимальная ингибирующая концентрация, мкМ	Продукция пигмента виолацеина	Образование биопленочного экзополисахарида
С₁-АОБ	> 1	> 1	0,502
С₅-АОБ	0,5	0,03905	0,046875
С₆-АОБ	0,25	0,023425	0,03905
С₁₂-АОБ	0,125	0,019525	0,023425

В свою очередь анализ эффектов субингибиторных концентраций АОБ позволил констатировать их воздействие на кворум-зависимую продукцию пигмента виолацеина и образование биопленочного экзополисахарида, характеризуемое величинами EC₅₀ – дозами соответствующих соединений, обуславливающими подавление результативного признака на 50 % относительно положительного контроля (таблица 3). При этом наибольшая чувствительность к подобному воздействию была установлена у находящейся под строгим контролем системы «чувства кворума» и индуцируемой только в присутствии С₆-АГЛ продукции виолацеина, где на фоне очень слабой активности С₁-АОБ в ряду С₅-АОБ → С₁₂-АОБ соответствующие значения EC₅₀ прогрессивно уменьшались от 0,03905 до 0,019525 мкМ. На этом фоне находящаяся под частичным контролем системы «чувства кворума» продукция биопленочного экзополисахарида несколько по-иному реагировала на воздействие АОБ. С одной стороны, сказанное заключалось в возможности определения для С₁-АОБ величины EC₅₀=0,502 мкМ, а с другой – при сохранении описанной выше тенденции (росте активности АОБ с увеличением длины углеводородного радикала в структуре их молекул) проявлялось в примерно двукратном росте номинальных значений EC₅₀ для С₅-, С₆- и С₁₂-АОБ до 0,046875 мкМ, 0,03905 мкМ и 0,023425 мкМ, соответственно.

Комплексное влияние АОБ на рост и кворум-зависимые проявления у C. violaceum NCTC 13274 явилось основанием для анализа взаимосвязей между названными параметрами, представленных в виде ряда индивидуальных регрессионных зависимостей (рисунок 19).

Рисунок 19 – Индивидуальные регрессионные зависимости биологических эффектов АОБ на биосинтез пигмента виолацеина (А) и образование биопленки (Б) С. violaceum NCTC 13274

Так взаимоотношения между значениями оптической плотности данной культуры (ОП₄₅₀), достигаемой в присутствии различных АОБ, и соответствующими им величинами продукции виолацеина (ОП₅₇₅) или биопленочного экзополисахарида (ОП₅₄₀) наиболее корректно могли быть описаны экспоненциальными регрессиями соответствующего вида

(3)

где х – значения ОП₄₅₀, y – значения ОП₅₇₅ или ОП₅₄₀;

a и k – нормирующие коэффициенты.

На основе регрессионного анализа для каждой зависимости находили оценки коэффициентов соответствующих регрессий. Для этого использовали метод наименьших квадратов, согласно которому высчитывали сумму разностей средних значений ОП₄₅₀, ОП₅₇₅, ОП₅₄₀ от их фактических. По критерию Фишера-Снедекора было определено, что описываемые экспоненциальные регрессии значимы, что позволило нам использовать их в следующем анализе. Далее представлял интерес определение интервальных оценок коэффициентов регрессий. Для этого нами были проанализированы их σ и m. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4 Интервальные оценки коэффициентов экспоненциальных регрессий

Воздействие АОБ на продукцию пигмента виолацеина
Исследованные гомологи	a±σ	m	a±σ	m
С₁-АОБ	0,4389±0,2827	0,0999	0,8190±0,5735	0,2028
С₅-АОБ	0,0185±0,0075	0,0031	3,0023±0,3491	0,1425
С₆-АОБ	0,0305±0,0362	0,0162	2,4666±0,8903	0,3981
С₁₂-АОБ	0,0560±0,0413	0,0207	1,8443±0,6793	0,3396
Воздействие АОБ на образование биопленки
С₁-АОБ	0,0082±0,0350	0,0124	3,2864±2,0453	0,7231
С₅-АОБ	0,0619±0,0409	0,0167	1,1684±0,5497	0,2244
С₆-АОБ	0,1002±0,0283	0,0127	0,8209±0,2466	0,1103
С₁₂-АОБ	0,0968±0,7402	0,3701	0,8144±2,7174	1,3587

Визуально оценивая регрессионные зависимости, расчетные коэффициенты a и k, их среднеквадратичные отклонения (σ) и ошибки репрезентативности (m), мы выдвинули гипотезу о том, что между коэффициентами регрессий, описывающих графики эффектов С₅-, С₆- и С₁₂-АОБ, существует сходство, в то время как коэффициенты регрессии для графика с эффектом С₁-АОБ отличаются от таковых для графиков с эффектами С₅-, С₆, С₁₂-АОБ. Мы доказали наше предположение, применив математические методы анализа данных, статистическую обработку экспериментальных данных с помощью пакета программ Microsoft Excel, Origin. Достоверность различий и существенную схожесть между номинальными значениями данных коэффициентов с учетом их σ и m оценивали согласно Т-критерию Стьюдента при заданном уровне значимости α=0,05.

Расчеты подтвердили нашу гипотезу, что свидетельствовало о существенном сходстве регрессионных зависимостей при описании эффектов С₅-, С₆- и С₁₂-АОБ (P>0,05). Результаты представлены в таблице 5, 6.

Таблица 5 Сравнение коэффициентов зависимостей, описывающих эффект С₁-, С₅-, С₆- и С₁₂-АОБ на продукцию виолацеина C. violaceum NCTC 13274

По коэффициенту a
	С₁-АОБ	С₅-АОБ	С₆-АОБ	С₁₂-АОБ
С₁-АОБ	-	4,2047 (Р<0,05)	4,0348 (Р<0,05)	3,7520 (Р<0,05)
С₅-АОБ		-	0,7246 (Р>0,05)	1,7967 (Р>0,05)
С₆-АОБ			-	0,9752 (Р>0,05)
С₁₂-АОБ				-
По коэффициенту k
	С₁-АОБ	С₅-АОБ	С₆-АОБ	С₁₂-АОБ
С₁-АОБ	-	8,8089 (Р <0,05)	3,6875 (Р <0,05)	2,5921 (Р <0,05)
С₅-АОБ		-	0,7246 (Р >0,05)	1,7967 (Р >0,05)
С₆-АОБ			-	0,9752 (Р >0,05)
С₁₂-АОБ				-

Таблица 6 Сравнение коэффициентов зависимостей, описывающих эффект С₁-, С₅-, С₆- и С₁₂-АОБ на образование биопленки C. violaceum NCTC 13274

По коэффициенту a
	С₁-АОБ	С₅-АОБ	С₆-АОБ	С₁₂-АОБ
С₁-АОБ	-	2,5854 (Р<0,05)	5,1946 (Р<0,05)	2,6893 (Р<0,05)
С₅-АОБ		-	1,8251 (Р >0,05)	0,0941 (Р >0,05)
С₆-АОБ			-	0,0092 (Р >0,05)
С₁₂-АОБ				-
По коэффициенту k
	С₁-АОБ	С₅-АОБ	С₆-АОБ	С₁₂-АОБ
С₁-АОБ	-	2,7972 (Р<0,05)	3,3704 (Р<0,05)	2,6060 (Р<0,05)
С₅-АОБ		-	1,3896 (Р >0,05)	0,2571 (Р >0,05)
С₆-АОБ			-	0,0048 (Р >0,05)
С₁₂-АОБ				-

Указанное обстоятельство позволило формализовать экспериментальные зависимости «ОП₄₅₀ – ОП₅₇₅» и «ОП₄₅₀ – ОП₅₄₀» с помощью единых коэффициентов a (С₅-, С₆-, С₁₂-АОБ) и k (С₅-, С₆-, С₁₂-АОБ)(рисунок 20), адекватных для характеристики биологической активности группы из трех названных соединений и номинально равных 0,0334±0,0130 и 2,4192±0,3476, а также 0,0868±0,0178 и 0,9097±0,1854, соответственно. В свою очередь аналогичные величины для С₁-АОБ составили 0,4389±0,2827 и 0,8190±0,5735, а также 0,0082±0,0350 и 3,2864±2,0453 (таблица 4) при статистически значимых различиях (P<0,05) как с индивидуальными (таблица 5, 6), так и с групповыми коэффициентами в экспоненциальных регрессиях, описывающих эффекты более длинноцепочечных гомологов АОБ.

Рисунок 20 – Групповые регрессионные зависимости биологических эффектов АОБ на биосинтез пигмента (А), образование биопленки (Б) С. violaceum NCTC 13274

(4)

Далее мы проанализировали влияние эффектов АОБ на кворум-зависимые проявления C. violaceum NCTC 13274, а именно на взаимосвязь продукции пигмента виолацеина и образования биопленочного экзополисахарида. Распределение экспериментальных значений ОП₅₇₅ и ОП₅₄₀ в виде регрессионных зависимостей позволило охарактеризовать их вид. Данные зависимости приобрели линейный характер (рисунок 21 А), формула которого приняла двумерный линейный вид

где х – значения ОП₅₇₅, y – значения ОП₅₄₀;

a и k – нормирующие коэффициенты.

Рисунок 21 – Индивидуальные (А) и групповые (Б) регрессионные зависимости биологических эффектов АОБ на кворум-зависимые проявления C. violaceum NCTC 13274

Также оценивали коэффициенты линейных регрессий на основе регрессионного анализа. При помощи критерия Фишера-Снедекора определили значимость данных регрессий, что позволило нам найти интервальные оценки коэффициентов линейных регрессий путем анализа их σ и m. Результаты представлены в таблице 7.

Таблица 7 Интервальные оценки коэффициентов линейных регрессий

Воздействие АОБ на кворум-зависимые проявления C. violaceum NCTC 13274
Исследованные гомологи	a±σ	m	k±σ	m
С₁-АОБ	-0,5181±0,2353	0,0832	0,7661±0,2237	0,0791
С₅-АОБ	0,0739±0,0244	0,0100	0,2525±0,0335	0,0137
С₆-АОБ	0,1449±0,0817	0,0365	0,1774±0,1170	0,0523
С₁₂-АОБ	0,0956±0,0309	0,0155	0,3091±0,0702	0,0351

Оценивая визуально линейные регрессионные зависимости и их коэффициенты с σ и m, мы также предположили о сходстве при описании эффектов С₅-, С₆- и С₁₂-АОБ на взаимосвязь кворум-зависимых проявлений C. violaceum NCTC 13274 и доказали это. Статистическое сравнение номинальных значений данных коэффициентов с учетом их σ и m свидетельствовало об их существенном сходстве (P>0,05) (таблица 8), что позволило объединить экспериментальные зависимости «ОП₅₇₅ – ОП₅₄₀» в одну групповую линейную зависимость С (С₅-, С₆- и С₁₂-АОБ) (рисунок 21 Б). Единые коэффициенты a (С₅-, С₆-, С₁₂-АОБ) и k (С₅-, С₆-, С₁₂-АОБ), которые характеризовали биологическую активность группы из трех названных соединений, номинально были равны 0,1157±0,0292 и 0,2148±0,0449 (таблица 7), соответственно. В свою очередь значения коэффициентов регрессии для С₁-АОБ, достоверно отличались от индивидуальных и групповых коэффициентов линейных регрессий (P<0,05), описывающих более длинноцепочечные гомологи АОБ.

Таблица 8 Сравнение коэффициентов линейных зависимостей, описывающих эффект С₁-, С₅-, С₆- и С₁₂-АОБ на кворум-зависимые проявления C. violaceum NCTC 13274

По коэффициенту a
	С₁-АОБ	С₅-АОБ	С₆-АОБ	С₁₂-АОБ
С₁-АОБ	-	7,0653 (Р<0,05)	7,2971 (Р<0,05)	7,2532 (Р<0,05)
С₅-АОБ		-	1,8752 (Р >0,05)	1,1819 (Р >0,05)
С₆-АОБ			-	1,2419 (Р >0,05)
С₁₂-АОБ				-
По коэффициенту k
	С₁-АОБ	С₅-АОБ	С₆-АОБ	С₁₂-АОБ
С₁-АОБ	-	6,3993 (Р<0,05)	6,2076 (Р<0,05)	5,2828 (Р<0,05)
С₅-АОБ		-	1,3885 (Р >0,05)	1,5017 (Р >0,05)
С₆-АОБ			-	2,0894 (Р >0,05)
С₁₂-АОБ				-

Таким образом, мы оценили влияние биологических эффектов АОБ на рост, биосинтез пигмента виолацеина и биопленочного экзополисахарида мутантным штаммом С. violaceum NCTC 13274 в присутствии C₆-АГЛ. Установлена рост-ингибирующая активность АОБ, возрастающая в ряду С₅-АОБ → С₁₂-АОБ при ее отсутствии у наиболее короткоцепочечного С₁-АОБ. Субингибиторные концентрации АОБ снижали продукцию биопленочного экзополисахарида и, наиболее выражено – образование виолацеина, что было формализовано в виде индивидуальных и групповых регрессионных зависимостей между анализируемыми параметрами. Мы проанализировали экспериментальные экспоненциальные зависимости «ОП₄₅₀ – ОП₅₇₅» и «ОП₄₅₀ – ОП₅₄₀», а также линейные зависимости «ОП₅₇₅ – ОП₅₄₀» и установили, что оба вида индивидуальных зависимостей, описывающих эффекты длинноцепочечных гомологов АОБ, можно объединить одной групповой, от которой короткоцепочечный гомолог существенно отличался. Полученные результаты подтверждают зависимость выраженности ингибирования АОБ от длины углеводородного радикала, а также показывают существенное сходство длинноцепочечных гомологов.

3.3 Влияние АОБ на восприятие гомосеринлактонов в тесте индукции люминесценции Escherichia coli luxR+ luxI_luxCDABE

На третьем этапе работы было проведено исследование влияния АОБ на способность люминесцирующего штамма Escherichia coli JLD271, pAL103; luxR+ luxI_luxCDABE; TetR p15A с генами биолюминесценции, клонированными под контролем гена luxR. Исследование кинетики биолюминесцентного отклика E. coli в присутствии различных концентраций С₆-АГЛ позволило констатировать дозозависимый характер индукции свечения, после 5-10 минутного инкубационного периода прогрессивно возрастающего к максимумам на 50-60-й минутах контакта (рисунок 22, А).

Рисунок 22 – Динамика биолюминесценции E. coli JLD271, pAL103; luxR+ luxI_luxCDABE; TetR p15A в присутствии различных концентраций С₆-АГЛ (А), а также комбинаций С₆-АГЛ с АОБ в концентрациях 1∙10^-4 М при одновременном (Б) и последовательном (В) воздействии

Характеризующие амплитуду подобного ответа значения биолюминесцентного индекса (I) при использовании С₆-АГЛ в концентрациях 1∙10^-4, 1∙10^-5 и 1∙10^-6М составили 12, 46 и 197 отн. ед. соответственно. При этом достижение выраженного люминесцентного отклика в присутствии максимальной тестированной концентрации ауторегулятора явилось основанием ее использования при последующей оценке эффектов АОБ на способность модельного микроорганизма к восприятию С₆-АГЛ.

В первой серии экспериментов было изучено одновременное сочетанное воздействие смесей С₆-АГЛ с С₁-АОБ, С₆-АОБ и С₁₂-АОБ, каждый из которых был тестирован в концентрациях 1∙10^-3, 1∙10^-4, 1∙10^-5 и 1∙10^-6 М. При этом проведенные измерения и вычисления не выявили существенных различий динамики развития свечения и достигаемых кратностей его индукции (рисунок 22, Б), что свидетельствовало об отсутствии прямой конкуренции между АОБ и АГЛ за связывание с воспринимающим белком luxR.

При проведении второй серии экспериментов, предполагающей предварительное воздействие АОБ на модельный организм, напротив, было зафиксировано подавление интенсивности последующего биолюминесцентного отклика как реакции на индукцию С₆-АГЛ. В частности, в случае использования данных молекул в эквимолярных концентрациях эффекты АОБ заключались в более медленной динамике прироста свечения (рисунок 22, В), а у двух из них также и в значимом снижении величин I к 60-й минуте контакта. Так предварительная обработка бактериальных клеток С₆-АОБ и С₁₂-АОБ в концентрации 1∙10^-4М снижала уровень последующей индукции до 68,1 % и 71,4 % от контрольных значений соответственно (таблица 9).

Таблица 9 Относительные значения биолюминесценции (в процентах от соответствующего контроля), зафиксированные при индукции E. coli JLD271, pAL103; luxR+ luxI_luxCDABE; TetR p15A с использованием С₆-АГЛ после предварительной 60-минутной инкубации в контакте с АОБ.

Концентрации АОБ, М	С₁-АОБ	С₆-АОБ	С₁₂-АОБ
1∙10^-3	110,4	0	0
1∙10^-4	82,7	68,1	71,4
1∙10^-5	100,0	101,2	88,7
1∙10^-6	78,9	99,5	103,5

В свою очередь увеличение действующих концентраций С₆-АОБ и С₁₂-АОБ до 1∙10^-3 М полностью отменяло развитие биолюминесценции, а их снижение до 1∙10^-5 М делало различия в опыте и контроле незначимыми. На этом фоне наиболее короткоцепочечный гомолог С₁-АОБ в использованной системе показывал себя как биологически инертное соединение.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности частичной интерференции между АОБ и АГЛ при развитии направляемого гомосеринлактонами «чувства кворума» у бактерий. При этом природа подобного эффекта не связана с прямой конкуренцией между названными ауторегуляторными молекулами, но опосредована системным воздействием алкилоксибензолов на клеточный метаболизм. Об этом свидетельствуют:

1) зависимость выраженности репрессии биолюминесценции от размера гидрофобного алкильного радикала в молекуле АОБ, коррелирующего с выраженностью рост-ингибирующей активности данных соединений [135];

2) важность предварительного контакта АОБ с бактериальными клетками, необходимого для формирования их устойчивых комплексов с функциональными биополимерами и мембранными структурами [8].

Заключение

В данной исследовательской работе мы рассмотрели два феномена в жизнедеятельности бактерий – это коллективное поведение бактерий и образование ими биопленок. Формирование биопленки является результатом сложного процесса, который включает в себя биосинтез моно- и полисахаридов, их транспорт через микробную клеточную стенку и последующее формирование структуры и архитектуры матрикса биопленки. На основе собранных данных между различными регуляторными механизмами формирования биопленки существует важная система – чувство кворума (QS), которая включает в себя производство, выделение и обнаружение малых сигнальных молекул (АГЛ), что позволяет микробным клеткам активировать экспрессию генов-мишеней в зависимости от плотности клеточной популяции, в том числе генов, вовлеченных в развитие и созревание биопленки.

В практической части на первом этапе мы описываем использование АСМ в сочетании с классическими бактериологическими методами, чтобы показать механизм системы QS и определить количество формирования биопленки Chromobacterium violaceum. Наш вывод заключается в неканонической зависимости между QS и формированием биопленки. Этому способствовали следующие результаты:

различные динамики продукции кворум-зависимого пигмента вилацеина и синтеза экзополисахарида в течение роста штамма дикого типа C. violaceum АТСС 31532;
абсолютное блокирование биосинтеза виолацеина инсерционным мутантом С. violaceum NCTC 13274, в то время как биопленка оставалась, и лишь несколько снижалось ее развитие;
значительное увеличение биосинтеза виолацеина С. violaceum NCTC 13274 с экзогенным внесением С₆-АГЛ в сравнении со штаммом дикого типа C. violaceum АТСС 31532, в то время как формирование биопленки только восстанавливалось. Таким образом, штаммы дикого и мутантного типов С. violaceum не показывают очевидных количественных различий в продукции экзополисахарида.

На втором и на третьем этапе мы проанализировали влияние четырех гомолов АОБ с различной длиной углеводородной цепи на индуцируемый С₆-АГЛ синтез виолацеина и образование биопленки у С. violaceum NCTC 13274, а также биолюминесценцию Escherichia coli pAL103, развивающуюся в присутствии С₆-АГЛ. Была выявлена антибактериальная активность более длинноцепочечных АОБ, возрастающая от С₅-АОБ до С₁₂-АОБ при ее отсутствии у короткоцепочечного С₁-АОБ. Субингибиторные концентрации АОБ снижали продукцию биопленочного экзополисахарида и, наиболее выражено – образование виолацеина, что было формализовано в виде индивидуальных и групповых регрессионных зависимостей между анализируемыми параметрами. С использованием биолюминесцентной модели показано, что регуляторные эффекты АОБ не связаны с их прямой интерференцией с АГЛ, но опосредованы системным воздействием на клеточный метаболизм. Тем не менее, выявленные эффекты представляются достаточно значимыми для характеристики механизмов коммуникации в природных бактериальных сообществах, а также могут рассматриваться в качестве средств контроля бактериальных инфекций с использованием АОБ.

Список использованной литературы

1 Гинцбург, А. Л. «Quorum sensing» или социальное поведение бактерий / А. Л. Гинцбург, Т. С. Ильина, Ю. М. Романова // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. – 2003. – № 5. – С. 86-93.

2 Грузина, В. Д. Коммуникативные сигналы бактерий / В. Д. Грузина // Антибиотики и химиотерапия. – 2003. – Т. 48. – № 10. – С. 32-39.

3 Хмель, И. А. Quorum sensing регуляция экспрессии генов – перспективная мишень для создания лекарств против патогенности бактерий / И. А. Хмель, А. З. Метлицкая // Молекулярная биология. – 2006. – Т. 40. – № 2. – С. 195-210.

4 Ильина, Т. С. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития / Т. С. Ильина, Ю. М. Романова, А. Л. Гинцбург // Генетика. – 2004. – Т. 40. – С. 1445-1456.

5 Costerton, J. W. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections / J. W. Costerton, P. S. Stewart, E. P. Greenberg // Science. – 1999. – V. 284. – P. 318-322.

6 Donlan, R. M. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms / R. M. Donlan, J. W. Costerton // Clin. Microbiol. Rev. – 2002. – V. 15. – P. 167-193.

7 Эль-Регистан, Г. И. Адаптогенные функции внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов / Г. И. Эль-Регистан [и др.] // Микробиология. – 2006. – Т. 75. – № 4. – С. 446-456.

8 Мулюкин, А. Л. Видонеспецифичность действия низкомолекулярных ауторегуляторов – неацилированного лактона гомосерина и гексилрезорцина – на рост и развитие бактерий / А. Л. Мулюкин [и др.] // Микробиология. – 2006. – Т. 75. – № 4. – С. 472-482.

9 Николаев, Ю. А. Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов / Ю. А. Николаев, А. Л. Мулюкин, И. Ю. Степаненко, Г. И. Эль-Регистан // Микробиология. – 2006. – Т. 75. – № 4. – С. 489-496.

10 Durán, N. Chromobacterium violaceum: a review of pharmacological and industiral perspectives / N. Durán, C. F. Menck // Critical Reviews in Microbiology. – 2001. – V. 27. – № 3. – Р. 201-222.

11 De Moss, R. D. Violacein / R. D. De Moss // Antibiotics. – 1967. – V. 2. – P. 77-81.

12 Balows, A. The prokaryots / A. Balows [et al.] / Todar's Online textbook of bacteriology, 2nd ed. Springer-Verlag, N.Y., 1992. – V. 3. – p. 4126.

13 Gallis, M. Chromobacterium bergonzini 1881 / M. Gallis, N. F. Logan / Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. – 2005. – V. 2. – P. 824-827.

14 Caldas, L. R. Preliminary experiments on the photobiological properties of violacein / L. R. Caldas [et al.] // Intern. Symp. Curr. Topics Radiol. Photobiol. Acad. Brazil. Cienc. Rio de Janeiro. – 1978. – P. 121-132.

15 Yang, Y.-H. Chromobacterium violaceum infection: A clinical review of an important but neglected infection / Y.-H. Yang, C.-H. Yang // J. of the Chinese Medical Association. – 2011. – V. 74. – P. 435-441.

16 Richard, C. Chromobacterium violaceum, opportunistic pathogenic bacteria in tropical and subtropical regions / C. Richard // Bull. Soc. Pathol. Exotique. – 1993. – V. 86. – P. 169-173.

17 Midani, S. Chromobacterium violaceum infection / S. Midani, M. Rathore // South Med. J. – 1998. – V. 91. – P. 464-466.

18 Lee, J. Two cases of Chromobacterium violaceum infection after injury in a subtropical region / J. Lee [et al.] // Journal of clinical microbiology. – 1999. – V. 37. – P. 2068-2070.

19 Baldi, M. Chromobacterium violaceum infection in a free-ranging howler monkey in Costa Rica / M. Baldi [at al.] // Journal of wildlife diseases. – 2010. – V. 46. – P. 306-310.

20 Crosse, P. A. Chromobacterium violaceum infection in two dogs / P. A. Crosse [et al.] // J. Am. Anim. Hosp. Assoc. – 2006. – V. 42. – P. 154-159.

21 Bilton, B. D. Recurrent nonfatal Chromobacterium violaceum infection in a nonimmunocompromised patient / B. D. Bilton, L. W. Johnson // Infect. Med. – 2000. – V. 17. – P. 686-690.

22 Sureisen, M. Reccurent Chromobacterium violaceum infection in a patient with chronic granulomatous disease / M. Sureisen [et al.] // Med. J. Malaysia. – 2008. – V. 63. – P. 346-347.

23 Хроническая гранулематозная инфекция. International patient organisation for primary immunodeficiencies (IPOPI) [Электронный ресурс]. Режим доступа: http: // www.ipopi.org. – 20.04.2013.

24 Scholz, H. C. Detection of Chromobacterium violaceum by multiplex PCR targeting the prgl, spaO, invG, and sipB genes / H. C. Scholz [et al.] // Syst. Appl. Microbiol. – 2006. – V. 29. – P. 45-48.

25 Ballantine, J. A. The synthesis of violacein and related compounds / J. A. Ballantine [et al.] // Proc. Chem. Soc. – 1958. – V. 1. – P. 232-234.

26 Laatsch, H. Spectroscopic properties of violacein and related compounds: Crystal structure of tretramethylviolacein / H. Laatsch, R. H. Thomson // J. Chem. Soc. Perkin. Trans. – 1984. – V. II. – P. 1331-1335.

27 Hoshino, T. Violacein and related tryptophan metabolites produced by Chromobacterium violaceum: biosynthetic mechanism and pathway for construction of violacein core / T. Hoshino // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2011. – V. 91. – P. 1463-1475.

28 Nakamura, Y. Production of antibacterial violet pigment by psychrotropic bacterium RT102 strain / Y. Nakamura // Biotechnol. Bioproc. Eng. – 2003. – V. 8. – P. 37-40.

29 Andrighetti-Fröhner, C. R. Cytotoxicity and potential antiviral evaluation of violacein produced by Chromobacterium violaceum / C. R. Andrighetti-Fröhner [et al.] // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. – 2003. – V. 98. – P. 843-848.

30 Durán, N. Evaluation of the antiulcerogenic activity of violacein and its modulation by the inclusion complexation with β-cyclodextrin / N. Duran [et al.] // Can. J. Physiol. Pharmacol. – 2003. – V. 81. – P. 387-396.

31 Ferreira, C. V. Molecular mechanisms of violacein-mediated human leukemia cell death / C. V. Ferreira [et al.] // Blood. – 2004. – V. 104. – P. 1459-1464.

32 Melo, P. S. Violacein and its β-cyclodextrin complexes induces apoptosis and differentiation in HL60 cells / P. S. Melo [et al.] // Toxicology. – 2003. – V. 186. – P. 217-225.

33 Antonisamy, P. Immunomodulatory, analgestic and antipyretic effects of violacein isolated from Chromobacterium violaceum / P. Antonisamy, S. Ignacimuthu // Phytomedicine. – 2010. – V. 17. – P. 300-304.

34 Konzen, M. Antioxidant properties of violacein: possible relation on its biological function / M. Konzen [et al.] // Bioorg. Med. Chem. – 2006. – V. 14. – P. 8307-8313.

35 DeMoss, R. D. Incorporation of C14-labeled substrates into violacein / R. D. DeMoss, N. R. Evans // J. Bacteriol. – 1960. – V. 79. – P. 729-735.

36 Rettori, D. Production, extraction and purification of violacein: an antibiotic produced by Chromobacterium violaceum / D. Rettori, N. Duran // World. J. Micribial. Biotechnol. – 1998. – V. 14. – P. 685-688.

37 Rettori, D. Physico-chemical and biological studies of violacein: A pigment produced by Chromobacterium violaceum (Duran, N., Supervisor), Ph.D. Dissertation, Chemisrty Institute, Universidade Estadual de Campinas, Brazil, 2000.

38 Antônio, R. V. Genetic analysis of violacein biosynthesis by Chromobacterium violaceum / R. V. Antônio, T. B. Creczynski-Pasa // Genet. Mol. Res. – 2004. – V. 3. – P. 85-91.

39 August, P. R. Sequence analyses and functional characterization of the violacein biosynthetic pathway from Chromobacterium violaceum / P. R. August [et al.] // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. – 2000. – V. 4. – P. 513-519.

40 Sánchez, C. Reevaluation of the violacein biosynthetic pathway and its relationship to indolocarbazole biosynthesis / C. Sánchez [et al.] // ChemBioChem. – 2006. – V. 7. – P. 1231-1240.

41 Shinoda, K. Biosynthesis of violacein: a genuine intermediate, protoviolaceinic acid, produced by VioABDE, and insight into VioC function / K. Shinoda [et al.] // Chem. Comm. (Camb.). – 2007. – V. 41. – P. 4140-4142.

42 Романова, Ю. М. Образование биопленок - пример "социального" поведения бактерий / Ю. М. Романова [и др.] // Микробиология. – 2006. – Т. 75. – № 4. – С. 556-561.

43 Николаев, Ю. А. Биопленка – "город микробов" или аналог многоклеточного организма? / Ю. А. Николаев, В. К. Плакунов // Микробиология. – 2007. – Т. 76. – № 2. – С. 149-163.

44 Веселова, М. А. Изучение Quorum sensing систем регуляции у Pseudomonas chlororaphis и Burkholderia cepacia / М. А. Веселова // Автореф. дисс. к.б.н. М. – 2008.

45 Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces / R. M. Donlan // Emerg. Infect. Disease. – 2002. – V. 8. – P. 881-890.

46 Смирнова, Т. А. Структурно-функциональная характеристика бактериальных биопленок / Т. А. Смирнова [и др.] // Микробиология. – 2010. – Т. 79. – № 4. – С. 435-446.

47 Miller, M. B. Quorim sensing in Bacteria / M. B. Miller, B. L. Bassler // Annu. Rev. Microbial. – 2001. – V. 55. – P. 165-199.

48 Davey, M. E. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics / M. E. Davey, G. A. O'Toole // Microbiol. and Molecular Biol. Rew. – 2000. – V. 4. – P. 847-864.

49 Shapiro, J. A. Thinking about bacterial populations as multicellular organism / J. A. Shapiro // Ann. Rev. Microbiol. – 1998. – V. 52. – P. 81-104.

50 Гостев, В. В. Бактериальные биопленки и инфекции / В. В. Гостев, С. В. Сидоренко // Журнал инфектологии. – 2010. – Т. 2. – № 3. – С. 4-15.

51 Афиногенова, А. Г. Микробные биопленки ран: состояние вопроса / А. Г. Афиногенова, Е. Н. Даровская // Травматология и ортопедия России. – 2011. – Т. 61. – № 4. – С. 119-125

52 Martinelli, D. Effect of medium composition, flow rate, and signaling compounds on the formation of soluble extracellular materials by biofilms of Chromobacterium violaceum / D. Martinelli, R. Bachofen, H. Brandl // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2002. – V. 59. – P. 278-283.

53 Ross, P. Cellulose biosynthesis and function in bacteria / P. Ross, R. Mayer, M. Benziman // Microbiol. Rev. – 1991. – V. 55. – P. 35-58.

54 Solano, C. Genetic analysis of Salmonella enteritidis biofilm formation: Critical role of cellulose / C. Solano [et al.] // Mol. Microbiol. – 2002. – V. 43. – P. 793-808.

55 Zogaj, X. The multicellular morphotypes of Salmonella typhimurium and Escherichia coli produce cellulose as the second component of the extracellular matrix / X. Zogaj // Mol. Microbiol. – 2001. – V. 39. – P. 1452-1463.

56 Römling, U. Molecular biology of cellulose production in bacteria / U. Römling // Res. Microbiol. – 2002. – V. 153. – P. 205-212.

57 Brazilian National Genome Project Consortium The complete genome sequence of Chromobacterium violaceum reveals remarkable and exploitable bacterial adaptability // PNAS. – 2003. – V. 100. – P. 11660-11665.

58 Recouvreux, D. O. S. Cellulose biosynthesis by the Beta-Proteobacterium, Chromobacterium violaceum / D. O. S. Recouvreux [et al.] // Curr. Microbiol. – 2008. – V. 57. – P. 469-476.

59 Høiby, N. Foreign body infections - biofilms and quorum sensing / N. Høiby // Ugeskrift for laeger. – 2007. – V. 169. – P. 4163-4166.

60 Itoh, Y. Depolimerization of beta-1,6-N-acetyl-D-glucosamine disrupts the integrity of diverse bacterial biofilms / Y. Itoh [et al.] // J. Bacteriol. – 2005. – V. 187. – P. 382-387.

61 Mack, D. The intercellular adhesion involved in biofilm accumulation of Staphylococcus epidermidis is a linear beta-1,6-linked glucosaminoglycan: Purification and structural analysis / D. Mack [et al.] // J. Bacteriol. – 1996. – V. 178. – P. 175-183.

62 Becker, S. Computational analysis suggests that virulence of Chromobacterium violaceum might be linked to biofilm formation and poly-NAG biosynthesis / S. Becker, C. Soares, L. M. Porto // Genet. Mol. Res. – 2009. – V. 32. – P. 640-644.

63 Forman, S. Identification of critical amino acid residues in the plague biofilm Hms proteins / S. Forman [et al.] // Microbiology. – 2006. – V. 152. – P. 3399-3410.

64 Blair, D. E. Structure and metal-dependent mechanism of peptidoglycan deacetylase, a streptococcal virulence factor / D. E. Blair [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2005. – V. 102. – P. 15429-15434.

65 Fuqua, W. C. Regulation of gene expression by cell-to-cell communication: acyl-homoserine lactone quorum sensing / W. C. Fuqua, M. R. Parsek, E. P. Greenberg // Annu. Rev. Gen. – 2001. – V. 35. – P. 439-468.

66 Schuster, M. Identification, timing, and signal specificity of Pseudomonas aeruginosa quorum-controlled genes: a transcriptome analysis / M. Schuster, C. P. Losrtoh, T. Ogi, E. P. Greenberg // Journal of Bacteriology. – 2003. – V. 185. – P. 2066-2079.

67 Wagner, V. E. Analysis of the hierarchy of quorum-sensing regulation in Pseudomonas aeruginosa / V. E. Wagner, L. L. Li, V. M. Isabella, B. H. Iglewski // Anal Bioanal Chem. – 2007. – V. 387. – P. 469–479.

68 Pearson, J. P. Early activation of Quorum sensing / J. P. Pearson // J. Bacteriology. – 2002. – V. 184. – № 10. – Р. 2569-2571.

69 Parsek, M. R. Quorum sensing signals in development of Pseudomonas aeruginosa biofilms / M. R. Parsek, E. P. Greenberg // Methods Enzymol. – 1999. – V. 310. – P. 43-44.

70 Stauff, L. Quorum sensing in Chromobacterium violaceum: DNA recognition and gene regulation by the CviR receptor / L. Stauff, B. L. Bassler // J. Bacteriol. – 2011. – V. 193. – P. 3871-3878.

71 McClean, K. H. Quorum sensing in Chromobacterium violaceum: exploitation of violacein production and inhibition for the detection of N-acylhomoserine lactones / K. H. McClean [et al.] // Microbiology. – 1997. – V. 143. – P. 3703-3711.

72 Swem, L. R. A quorum-sensing antagonist targets both membrane-bound and cytoplasmic receptors and controls bacterial pathogenicity / L. R. Swem [et al.] // Mol. Cell. – 2009. – V. 35. – P. 143-153.

73 Chernin, L. S. Chitinolytic activity in Chromobacterium violaceum: substrate analysis and regulation by quorum sensing / L. S. Chernin [et al.] // J. Bacteriol. – V. 180. – P. 4435-4441.

74 Хмель, И. А. Quorum sensing регуляция экспрессии генов: фундаментальные и прикладные аспекты, роль в коммуникации бактерий / И. А. Хмель // Микробиология. – 2006. – Т. 75. – № 4. – С. 457-464.

75 Hentzer, M. Pharmacological inhibition of quorum sensing for the treatment of chronic bacterial infections / M. Hentzer, M. Givskov // J. Clin. Invest. – 2003. – V. 112. – P. 1300-1307.

76 Smith, R. S. Pseudomonas aeruginosa quorum sensing as a potential antimicrobial target / R. S. Smith, B. H. Iglewski // J. Clin. Invest. – 2003. – V. 112. – P. 1460-1465

77 Kalia, V. C. Quorum sensing inhibitors: an overview / V. C. Kalia // Biotechnology Advances. – 2013. – V. 31. – P. 224-245.

78 Hanzelka, B. L. Quorum sensing in Vibrio fischeri: evidence that S-adenosylmethionine is the amino acid substrate for autoinducer synthesis / B. L. Hanzelka, E. P. Greenberg. J. Bacteriol. – 1996. – V. 178. – P. 5291-5294.

79 Parsek, M. R. Acyl homoserine-lactone quorum-sensing signal generation / M. R. Parsek [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. – 1999. – V. 96. – P. 4360-4365.

80 Tateda, K. Azithromycin inhibits quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa / K. Tateda [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. – 2001. – V. 45. – P. 1930-1933.

81 Pechere, J. C. Azithromycin reduces the production of virulence factors in Pseudomonas aeruginosa by inhibiting quorum sensing / J. C. Pechere // Jpn. J. Antibiot. – 2001. – V. 54. – P. 87-89.

82 Sofer, D. "Subinhibitory" erythromycin represses production of Pseudomonas aeruginosa lectins, autoinducer and virulence factors / D. Sofer // Chemotherapy. – 1999. – V. 45. – P. 335-341.

83 Vattem, D. A. Dietary phytochemicals as quorum sensing inhibitors / D. A. Vattem [et al.] // Fitoterapia. – 2007. – V. 78. – P. 302-310.

84 Norizan, S. N. M. Caffeine as a potential quorum sensing inhibitor / S. N. M. Norizan, W.-F. Yin, K.-G. Chan // Sensors. – 2013. – V. 13. – p. 5117-5129.

85 Ashihara, H. Caffeine: A well known but little mentioned compound in plant science / H. Ashihara, A. Crosier // Trends Plant. Sci. – 2001. – V. 6. – P. 407-413.

86 Yates, E. A. N-acylhomoserine lactones undergo lactonolysis in a pH-, temperature-, and acyl chain length-dependent manner during growth of Yersinia pseudotuberculosis and Pseudomonas aeruginosa / E. A. Yates [et al.] // Infect. Immun. – 2002. – V. 70. – P. 5635-5646.

87 Dong, Y. H. AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora / Y. H. Dong [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2000. – V. 97. – P. 3526-3531.

88 Dong, Y. H. Quenching quorum-sensing-dependent bacterial infection by an N-acyl homoserine lactonase / Y. H. Dong [et al.] // Nature. – 2001. – V. 411. – P. 813-817.

89 March, J. C. Quorum Sensing and bacterial cross-talk in biotechnology / J. C. March, W. E. Bentley // Current Opin. Biotechnol. – 2004. – V. 15. – P. 495-502.

90 Dong, Y. H. Insecticidal Bacillus thuringiensis silences Erwinia carotovora virulence by a new form of microbial antagonism, signal interference / Y. H. Dong [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2004. – V. 70. – P. 954-960.

91 Leadbetter, J. R. Metabolism of acyl-homoserine lactone quorum-sensing signals by Variovorax paradoxus / J. R. Leadbetter, E. P. Greenberg // J. Bacteriol. – 2000. – V. 182. – P. 6921-6926.

92 Huang, J. J. Utilization of acyl-homoserine lactone quorum signals for growth by a soil pseudomonad and Pseudomonas aeruginosa PAO1 / J. J. Huang [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2003. – V. 69. – P. 5941-5949.

93 Uroz, S. Novel bacteria degrading N-acylhomoserine lactones and their use as quenchers of quorum-sensing-regulated functions of plant-pathogenic bacteria / S. Uroz [et al.] // Microbiology. – 2003. – V. 149. – P. 1981-1989.

94 Chun, C. K. Inactivation of a Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing signal by human airway epithelia / C. K. Chun [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA – 2004. – V. 101. – P. 3587-3590.

95 Hastings, J. W. Bacterial quorum-sensing signals are inactivated by mammalian cells / J. W. Hastings // Proc. Natl. Acad. Sci. USA – 2004. – V. 101. – P. 3993-3994.

96 Rasmussen, T. B. Quorum sensing inhibitors: a bargain of effects / T. B. Rasmussen, M. Givskov // Microbiology. – 2006. – V. 152. – P. 895-904.

97 Chhabra, S. R. Autoregulation of carbapenem biosynthesis in Erwinia carotovora by analogues of N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone / S. R. Chhabra [et al.] // J. Antibiot. – 1993. – V. 46. – P. 441-454.

98 Passador, L. Functional analysis of the Pseudomonas aeruginosa autoinducer PAI / L. Passador // J. Bacteriol. – 1996. – V. 178. – P. 5995-6000.

99 Suga, H. Molecular mechanisms of bacterial quorum sensing as a new drug target / H. Suga, K. Smith // Current. Opin. Chem. Biol. – 2003. – V. 7. – P. 586-591.

100 Smith, K. M. Induction and inhibition of Pseudomonas aeruginosa quorum sensing by synthetic autoinducer analogs / K. M. Smith, Y. Bu, H. Suga // Chem. Biol. – 2003. – V. 10. – P. 81-89.

101 Givskov, M. Eukaryotic interference with homoserine lactone-mediated prokaryotic signalling / M. Givskov [et al.] // J. Bacteriol. – 1996. – V. 178. – P. 6618-6622.

102 Martinelli, D. Effects of natural and chemically synthesized furanones on quorum sensing in Chromobacterium violaceum / D. Martinelli [et al.] // BMC Microbiol. – 2004. – V. 4. – P. 25.

103 Wu, H. Synthetic furanones inhibit quorum-sensing and enhance bacterial clearance in Pseudomonas aeruginosa lung infection in mice / H. Wu [et al.] // J. Antimicrob. Chemother. – 2004. – V. 53. – P. 1054-1061.

104 Manefield, M. Halogenated furanones inhibit quorum sensing through accelerated LuxR turnover / M. Manefield [et al.] // Microbiology. – 2002. – V. 148. – P. 1119-1127.

105 Ren, D. Differential gene expression shows natural brominated furanones interfere with the autoinducer-2 bacterial signaling system of Escherichia coli / D. Ren [et al.] // Biotechnol. Bioeng. – 2004. – V. 88. – P. 630-642.

106 Teplitski, M. Perception and degradation of N-acyl homoserine lactone quorum sensing signals by mammalian and plant cells / M. Teplitski [et al.] // Chem. Rev. – 2011. – V. 111. – P. 100-116.

107 Vattern, D. A. Dietary phytochemicals as quorum sensing inhibitors / D. A. Vattern [et al.] // Fitoterapia. – 2007. – V. 78. – P. 302-310.

108 Bosgelmez-Tinaz, G. Inhibition of quorum sensing-regulated behaviors by Scorzonera sandrasica / G. Bosgelmez-Tinaz [et al.] // Current Microbiology. – 2007. – V. 55. – P. 114-118.

109 Koh, K. H. Screening of traditional Chinese medical plants for quorum-sensing inhibitors activity / K. H. Koh, F.-Y Tham // J of Microbiology, Immunology and Infection. – 2011. – V. 44. – P. 144-148.

110 Karamanoli, K. Disruption of N-acyl homoserine lactone-mediated cell signaling and iron acquisition in epiphytic bacteria by leaf surface compounds / K. Karamanoli, S. E. Lindow // Applied and environmental microbiology. – 2006. – V. 72. – P. 7678-7686.

111 Musthafa, K. S. Evaluation of anti-quorum-sensing activity of edible plants and fruits through inhibition of the N-acyl-homoserine lactone system in Chromobacterium violaceum and Pseudomonas aeruginosa / K. S. Musthafa [et al.] // Chemotherapy. – 2010. – V. 56. – P. 333-339.

112 Zhu, H. Inhibition of quorum sensing in Chromobacterium violaceum by pigments extracted from Auricularia auricular / H. Zhu, C.-C. He, Q.-H. Chu // Let. Appl. Microbiol. – 2011. – V. 52. – P. 269-274.

113 Dastager, S. G. Separation, identification and analysis of pigment (melanin) production in Streptomyces / S. G. Dastager [et al.] // Afr. J. Biotecnol. – 2006. – V. 5. – P. 1131-1134.

114 Van, D. C. Cell-to-cell signaling and Pseudomonas aeruginosa infections / D. C. Van, B. H. Iglewski // Emerg. Infect. Dis. – 1998. – V. 4. – P. 551-560.

115 de Kievit, T. R. Bacterial quorum sensing in pathogenic relationships / T. R. de Kievit, B. H. Iglewski // Infect. Immun. – 2000. – V. 68. – P. 4839-4849.

116 Schuster, M. Identification, timing, and signal specificity of Pseudomonas aeruginosa quorum-controlled genes: a transcriptome analysis / M. Schuster [et al.] // J. Bacteriol. – 2003. – V. 185. – P. 2066-2079.

117 Hentzer, M. Attenuation of Pseudomonas aeruginosa virulence by quorum sensing inhibitors / M. Hentzer [et al.] // EMBO J. – 2003. – V. 22. – P. 3803-3815.

118 Kurreck, J. Antisense technologies. Improvement through novel chemical modifications / J. Kurreck / Eur. J. Biochem. – 2003. – V. 270. – P. 1628-1644.

119 Dobretsov, S. Malyngolide from the cyanobacterium Lyngbya majuscula interferes with quorum sensing circuitry / S. Dobretsov [et al.] // Environ. Microbiol. Rep. – 2010. – V. 2. – P. 739-744.

120 Fuqua, C. Listening in on bacteria: acyl-homoserine lactone signalling / C. Fuqua, P. Greenberg // Molecular cell biology. – 2002. – V. 3. – P. 685-695.

121 Steindler, L. Detection of quorum-sensing N-acyl homoserine lactone signal molecules by bacterial biosensors / L. Steindler, V. Venturi // FEMS Microbiol. Lett. – 2007. – V. 266. – P. 1-9.

122 Lindsay, A. Effect of sdiA on biosensors of N-acylhomoserine lactones / A. Lindsay, B. M. M. Ahmer // J. Bacteriol. – 2005. – V. 187. – P. 5054-5058.

123 O'Toole, G. A. The initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis / G. A. O'Toole, R. Kotler // Mol. Microbiol. – 1998. – V. 30. – P. 295-304.

124 Bolshakova, A. V. Microbial surfaces investigated using atomic force microscopy / A. V. Bolshakova, O. I. Kiselyova, I. V. Yaminsky // Biotechnology Progress. – 2004. – V. 20. – N. 6. – P. 1615-1622.

125 Nikiyan, H. N. Humidity-dependent bacterial cells functional morphometry investigations using atomic force microscope / H. N. Nikiyan, A. S. Vasilchenko, D. G. Deryabin // Int. J. Microbiol. – 2010. – V. 10. – p. 5.

126 Triampo, D. The working of the Atomic Force Microscope for chemical mapping / T. Triampo, W. Triampo // The Open Materials Science Journal. – 2009. – V. 3 – P. 50-55.

127 Миронов В. Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии: учебное пособие / В. Л. Миронов. – Нижний Новогород, 2004. – 110 с.

128 Сканирующая зондовая микроскопия [Электронный ресурс]. Режим доступа: http: // www.nano-technology.org. – 15.01.2013.

129 Лакин, Г. Ф. Биометрия / Г. Ф. Лакин // М.: Высш. шк. – 1990. – С. 1-352.

130 Ивантер, Э. В. Введение в количественную биологию: учебное пособие / Э. В. Ивантер, А. В. Коросов. – Петрозаводск: Изд-во ПетрГУ, 2011. – 302 с.

131 Purevdorj, B. Influence of hydrodynamics and cell signaling on the structure and behavior of Pseudomonas aeruginosa biofilms / B. Purevdorj, J. W. Costerton, P. Stoodley // Appl. Environ. Microbiol. – 2002. – V. 68. – P. 4457-4464.

132 Heydorn, A. Statistical analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm development: impact of mutations in genes involved in twitching motility, cell-to-cell signaling, and stationary-phase sigma factor expression / A. Heydorn [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2002. – V. 68. – P. 2008–2017.

133 Rucinsky, T. E. Mesosome structure in Chromobacterium violaceum / T. E. Rucinsky, E. H. Cota-Robles // Journal of Bacteriology. – 1974. – V. 118. – P. 717–724.

134 Zhang, M. L. Pseudomonas aeruginosa tssC1 links type VI secretion and biofilm-specific antibiotic resistance / M. L. Zhang [et al.] // Journal of Bacteriology. – 2011. – V. 193. – P. 5510-5513.

135 Николаев, Ю. А. Антимикробные свойства фенольных липидов / Ю. А. Николаев [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. – 2010. – Т. 46. – №2. – С.172-179.

Приложение А

(справочное)

Таблица А.1 Пути ингибирования QS C. violaceum

Пути ингибирования QS-систем	QS-ингибиторы	Ссылка
Ингибирование синтеза АГЛ	Фитохимические экстракты; кофеин - продукт растительного происхождения;	[83] [84]
Деградация АГЛ	штамм W2 Rhodococcus erythropolis;	[93]
Подавление связывания АГЛ с рецепторными белками	аналоги АГЛ (длинноцепочечные); Hortonia sp. и S. antibioticus: бутанолиды (2(5Н)-фураноны); Scorzonera sandrasica: растительные экстракты; Imperata cylindrical (стебель), Nelumbo nucifera (лист), Prunella vulagris, Puniica granatum (кора): растительные экстракты; P. incarnata (лист), P. sativum (корень): растительные экстракты; Ananas comosus, Musa paradiciaca, Manilkara zapota, Ocimum sanctum: растительные и фруктовые экстракты; базидиомицет Auricularia auricular: пигмент;	[71] [102] [108] [109] [110] [111] [112]
Нарушение экспрессии целевых генов QS	цианобактерия Lyngbya majuscula: антибиотик малинголид	[119]

Приложение Б

(рекомендуемое)

Список опубликованных работ по теме исследования

1 Камаева А. А. Влияние алкилоксибензолов на восприятие гомосеринлактонов в тесте индукции люминесценции Escherichia coli luxR+ luxI_luxCDABE / А. А. Камаева, А. А. Толмачева, Д. Г. Дерябин // Вестник ОГУ. – 2012. – Т. 142. – № 6. – С. 156-159.

2 Kamaeva, A. A. AFM reveals a morphological differentiation of Chromobacterium violaceum cells associated with biofilm development and directed by N-hexanoyl-L-homoserine lactone (quorum-sensing autoinducer) / A. A. Kamaeva, A. S. Vasilchenko, D. G. Deryabin // Archives of Microbiology (в печати).

Дерябин Д. Г. Влияние алкилоксибензолов на индуцируемые гомосеринлактонами проявления коллективного поведения (чувства кворума) у бактерий / Д. Г. Дерябин, А. А. Камаева, А. А. Толмачева, Г. И. Эль-Регистан // Микробиология (в печати).

Скачать: dis.rar

Категория: Дипломные работы / Дипломные работы по биологии

Уважаемый посетитель, Вы зашли на сайт как незарегистрированный пользователь.
Мы рекомендуем Вам зарегистрироваться либо войти на сайт под своим именем.

Привет студент

Влияние алкилоксибензолов на систему «чувства кворума» и образование биопленки у Chromobacterium violaceum

Влияние алкилоксибензолов на систему «чувства кворума» и образование биопленки у Chromobacterium violaceum

Содержание

Введение

Заключение

Список использованной литературы

Приложение А

(справочное)

Привет студент