Привет студент

 

 

Химико - биологический факультет

Кафедра микробиологии

 

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

 

Дифференциальная оценка бактерицидных систем сыворотки крови с использованием рекомбинантных люминесцирующих штаммов

Escherichia coli и Bacillus subtilis.

 

Аннотация

 

 

В данной выпускной квалификационной работе рассматриваются теоретические и практические вопросы дифференциальной оценки бактерицидных систем сыворотки крови с использованием рекомбинантных люминесцирующих штаммов Escherichia coli и Bacillus subtilis.

Структура данной ВКР выглядит следующим образом.

Первый раздел отражает теоретические основы и общие представления о врожденном иммунитете, а также рассматриваются молекулярные факторы, входящие в его состав.

Во втором разделе рассмотрены и изучены методы оценки молекулярных факторов врожденного иммунитета, на основе которых проводились наши исследования сывороток крови доноров.

В третьем разделе описаны материалы исследования: микроорганизмы (Escherichia coli и Bacillus subtilis) и сыворотки крови, которые мы исследовали и методы оценки бактерицидных свойств сывороток крови.

В четвертом разделе описаны результаты проделанной работы по дифференциальной оценке бактерицидных систем сывороток крови.

Работа выполнена печатным способом на 81 странице с использованием 56 источников, содержит 39 рисунков, 5 таблиц, 4 формул и 3 приложения.

 

 

Abstract

 

 

In this final qualifying work examines the theoretical and practical problems of differential evaluation of bactericidal systems in blood serum using recombinant luminescent strains of Escherichia coli and Bacillus subtilis.

The structure of the GFQ is as follows.

The first section reflects the theoretical foundations and the general idea of innate immunity, and also examines the molecular factors involved in its composition.

The second section discusses the methods of assessment and study of the molecular factors of innate immunity, which were based on our studies of blood serum of donors.

The third section describes the materials research: microorganisms (Escherichia coli and Bacillus subtilis) and serum, which we investigated and methods for assessing bactericidal properties of blood serum.

The fourth section describes the results of work done on the differential evaluation of bactericidal systems of blood serum.

The work was printed in the pages of a way to use sources contain figures, tables, formulas and applications.

The work was printed way to 81 pagе with 56 sources, contains 39 figures,    5 tables, 4 formulas and 3 applications.

 

Содержание

 

 

Введение …………………………..…………………………………………………7

1 Общие представления о врожденном иммунитете ……………………………..8

1.1 Молекулярные факторы врожденного иммунитета ……………………........11

1.1.1 Система комплемента ….……………………………………………………13

1.1.2 Катионные антимикробные пептиды …………….…………………….......18

1.1.2.1 Дефенсины ….....……………………………………………………….......20

1.1.2.2 Кателицидины ….…………………………………………………………..21

1.1.2.3 Элафины ….....……………………………………………………………...22

1.1.2.4 Гепсидины ….....……………………………………………………………23

1.1.2.5 Кальпротектин ….....……………………………………………………….24

1.1.2.6 Бета-лизины …….………………………………………..…...…………….24

1.1.3 Лактоферрин …………….…………………...………………………………26

1.1.4 Лизоцим ………………………………………………………………………28

1.1.5 Антитела ……………………………………………………………………...30

1.2 Методы оценки молекулярных факторов ……………………………....…....33

1.2.1 Нефелометрический метод ………………………………………………….34

1.2.2 Культуральный метод ……………………………………………………….35

1.2.3 Проточная цитофлюориметрия ……………………………………………..35

1.2.4 Иммунофлюоресцентный метод ……………………………………….…...36

1.2.5 Биолюминесцентный метод ………………………………………………....37

2 Материалы и методы …………………………………………………………….39

2.1 Люминесцирующие штаммы бактерий ………………………………………39

2.1.1 Рекомбинантный люминесцирующий штамм Escherichia coli с клонированными в них генами Photobacterium leiognathi …………………........39

2.1.2 Рекомбинантный люминесцирующий штамм Bacillus subtilis с клонированными в них генами Photobacterium leiognathi …………………........41

2.2 Сыворотка крови ……………………………………………………………….42

2.3 Биолюминесцентная оценка активности сывороток крови с использованием штаммов Bacillus subtilis и Escherichia coli ………………....................................42

2.4 Нефелометрический метод оценки бактерицидной активности сыворотки крови ………………………………………………………………………………..44

2.5 Нефелометрический метод оценки активности бета-лизина ..……………...44

2.6 Оценка активности лизоцима ……………………………………………........45

2.7 Определение тотального комплемента ……………………………………….46

2.8 Определение компонентов системы комплемента …………………………..47

2.9 Определение лактоферрина ……………………………………………….......49

2.10 Определение фактора Н ………………………………………………….......51

2.11 Оценка жизнеспособности Bacillus subtilis и Escherichia coli ……………..52

2.12 Определение уровня иммуноглобулинов, специфичных к E.coli и B.subtilis. 53

2.13 Оценка уровня IgG, IgA, IgM ………………………………………………..54

2.14 Иммуносорбция ………………………………………………………………56

3 Обсуждение результатов ………………………………………………………...59

3.1 Оценка бактерицидной активности сыворотки крови с помощью люминесцирующих бактерий ……………………………………………………..59

3.2 Оценка влияния бактерицидных факторов сыворотки крови на люминесцирующие бактерии ……………………………………………………..61

3.3 Изучение активности молекулярных бактерицидных факторов сыворотки крови после иммуносорбции ……………………………………………………...68

Заключение ……………………………………………………………………........71

Список использованных источников ……………………………………………..72

Приложение А (справочное) Определение концентрации лизоцима в сыворотке крови …………………………………………………..............................................76

Приложение Б (обязательное) Корреляционный анализ ………………….........78

Приложение В (справочное) Опубликованные результаты исследования …….81

 

Введение

 

 

Иммунная система наряду с другими система организма функционирует в неразрывной связи с ними и в какой-то мере может рассматриваться как часть других специализированных систем [1].

Несмотря на то, что предметом изучения для иммунологов по-прежнему остается иммунная система в целом и ее роль в защите организма от чужеродных объектов, основные усилия иммунологов начала XXI века направлены на выяснение механизмов регуляции деятельности иммунокомпетентных клеток и конкретной роли образуемых этими клетками молекул в ходе реализации такой защиты. Подобного рода задачи стоят перед так называемой теоретической иммунологией, в то время как прикладная, опираясь на результаты исследований теоретического плана, имеет в качестве главных задач разработку новых и улучшение уже имеющихся вакцинных препаратов, поиск подходов для применения регуляторных молекул в качестве лекарственных средств при инфекционных болезнях и при иммунопатологических состояниях, разработку новых и усовершенствование уже существующих иммунологических методов исследования, применяемых не только в медицинской практике, но и во всех областях современной биологии [2].

Естественно, что все методы в той или иной степени адаптируются и модифицируются применительно к объектам исследования, что и приводит к появлению специфических, применяющихся только в исследованиях иммунной системы методов. В то же время разрабатываемые изначально в рамках иммунологических исследований методы, в которых используются антитела, система комплемента и другие компоненты сыворотки крови в настоящее время приняты на вооружение большинством биологических наук, поскольку их высочайшая разрешающая способность и эффективность доказана всем ходом развития биологии в конце XX века [3].

Исследование и оценка бактерицидных систем человека и животных, формирующих систему их неспецифического врожденного иммунитета, остается одной из важных задач современной биологии и медицины. В связи с этим целью дипломной работы стала дифференциальная оценка бактерицидных систем сыворотки крови с использованием рекомбинантных люминесцирующих штаммов Escherichia coli и Bacillus subtilis. Для решения поставленной цели нами были выдвинуты следующие задачи: оценить характер биолюминесцентного отклика рекомбинантных штаммов E.coli и B.subtilis при воздействии сывороток крови человека; изучить состав образцов сыворотки крови и выделить компоненты, оказывающие влияние на биолюминесценцию двух штаммов E.coli и B.subtilis; выявить основные группы факторов, оказывающие влияние на биолюминесценцию штаммов E.coli и B.subtilis. Для решения поставленных задач используются нефелометрический, биолюминесцентный, культуральный (бактериологический) и другие методы.

1 Общее представление о врожденном иммунитете

 

 

На протяжении многих миллионов лет существования жизни на Земле природа создала сложную, но надежную систему, получившую название иммунной или иммунокомпетентной. Изучение разнообразных видов позвоночных позволяет составить представление об эволюционном развитии иммунной системы вплоть до формирования ее сложноорганизованных механизмов у млекопитающих. Однако изучение беспозвоночных проливает свет на происхождение врожденного иммунитета, полностью сформированного уже у позвоночных. Первые клетки крови образовались, вероятно, из свободноживущих предковых клеток, сходных с простейшими. У примитивных многоклеточных, например, у губок, кишечнополостных и плоских червей, блуждающие фагоцитарные амебоциты не только выполняют функцию защиты, но и участвуют в процессах питания и экскреции [1, 2, 3].

На уровне вторичнополостных, тела которых крупнее и более сложно устроены, возникла необходимость в циркуляторной системе для переноса питательных веществ и отходов внутри организма. Амебоподобные клетки, больше не нужные для собирания пищи, вероятно, мигрировали из соединительной ткани в эту циркуляторную систему. Здесь из них образовалось множество типов клеток, часть которых приобрела специфическую роль в иммунореактивности [2, 3].

У беспозвоночных не обнаружено иммуноглобулинов, но жидкости организма содержат ряд защитных гуморальных факторов – агглютинины, лизоцим и другие лизины, иные антимикробные соединения, лизосомные ферменты, и обездвиживающие факторы. Имеются также данные, указывающие на присутствие компонентов комплемент-подобной системы. Например, у морских ежей на фагоцитах могут присутствовать компонент комплемента – СЗb-подобные рецепторы и обнаружена гуморальная литическая система, сходная с системой комплемента [3].

Однако усложнению строения тела соответствует возрастание специализации лимфоидной ткани и функций лимфоцитов, а также увеличение разнообразия классов иммуноглобулинов. Самой сложной по структуре и функциям иммунной системой обладают млекопитающие [1].

Иммунитет (от лат. immunitas – «избавление», «освобождение от чего-либо») – невосприимчивость к инфекционным болезням, или резистентность организма к действию патогенных бактерий и их ядовитых продуктов [4]. Это значит, что под контролем иммунной системы находится функционирование очень многих органов и систем организма. Общую систему иммунитета можно разделить на два больших отдела, совместное функционирование которых создает очень мощную, имеющую несколько звеньев, защиту: врожденный неспецифический (естественный) иммунитет и приобретенный специфический (адаптивный) иммунитет [1]. Врождённый иммунитет – это способность организма обезвреживать чужеродный и потенциально опасный биоматериал (микроорганизмы, трансплантат, токсины, опухолевые клетки, клетки, инфицированные вирусом), существующая изначально, до первого попадания этого биоматериала в организм. Она реагирует не на конкретные специфические антигены, а на определённые классы антигенов, характерные для патогенных организмов (полисахариды клеточной стенки бактерий, двунитевая рибонуклеиновая кислота (РНК) некоторых вирусов) [4].

Неповрежденные, нормально функционирующие кожа и слизистые оболочки защищают организм от внедрения патогенных бактерий и вирусов. Они не только представляют собой механический барьер, но и обусловливают гибель многих микроорганизмов. Чистота кожи повышает ее бактерицидность. Самостерилизующая функция кожи зависит от кислой реакции пота, содержащего уксусную, молочную и жирные кислоты, которые понижают рН, а также от антагонистического влияния постоянных обитателей – представителей нормальной микрофлоры. Повреждение кожи является условием для развития раневых инфекций [5].

Помимо кожи и слизистой наше тело защищено от внешней среды эпителиальными покровами: эпителиальными клетками, выстилающими желудочно-кишечный тракт, дыхательные пути, урогенитальный тракт. Инфекция возникает лишь тогда, когда патоген способен колонизировать эпителий или когда нарушается целостность эпителиальных покровов в результате механических повреждений (раны, ожоги) или укусов насекомых-переносчиков инфекционных заболеваний (блох, вшей, комаров, москитов, клещей). Кстати, трансмиссивный путь передачи возбудителя с помощью насекомых является основным механизмом поддержания инфекции в природных очагах (чума, клещевой энцефалит, малярия и многие другие) [4, 5].

После проникновения бактерий через кожу или слизистую оболочку они задерживаются в регионарных лимфатических узлах подкожной клетчатки, слизистых оболочек, печени, селезенки. Лимфатические узлы выполняют барьерфиксирующую функцию, могут длительно задерживать патоген, не пропуская его проникновения в кровь. В случае малого количества и небольшой вирулентности бактерии уничтожаются –подвергаются фагоцитозу и перевариваются. При подавлении барьерной функции лимфоузлов могут развиться бактеримия и сепсис [5, 6].

Также защитную роль играет и нормальная микрофлора организма: кожи (эпидермальные стафилококки), слизистых оболочек (коринеформные бактерии, непатогенные нейссерии), особенно кишечника, где находятся бифидумбактерии, лактобактерии, кишечная палочка, обладающие выраженными антагонистическими свойствами в отношении патогенных бактерий семейства Enterobacteriaceae, дрожжеподобных грибов рода Candida и патогенных стафилококков [7].

Растворимые факторы – лизоцим, интерферон, комплемент – также принимают участие в естественной невосприимчивости организма. Лизоцим – гидролитический энзим секретов слизи – способен разрушать пептидогликановый слой клеточной стенки бактерий (преимущественно грамположительных). Интерфероны – группа белков, продуцируемых вирусинфицированными или активированными клетками. Среди прочих иммунорегуляторных функций интерфероны способны прямо подавлять размножение вирусов. Комплемент – группа сывороточных белков, которые циркулируют в неактивной проэнзимной форме. Эти белки могут быть активированы различными специфическими и неспецифическими иммунологическими механизмами, которые конвертируют их в активную форму. Активированные компоненты комплемента принимают участие в контролируемом энзиматическом каскаде, результатом которого является повреждение мембраны бактерий или их опсонизация [8] (таблица 1).

 

Таблица 1 – физические и химические барьеры организма

 

Барьер	Фактор	Механизмы действия
наружный	секрет сальных желез	маслянистая субстанция покрывает кожу тонким защитным слоем антибактериального масла, содержит лактоферрин
	слезы	жидкость, смачивающая и промывающая глазное яблоко, содержит лизоцим, антимикробный фермент, который разрушает клеточную стенку бактерий
	ушная сера	сера, выделяемая сальными железами, предохраняет чувствительную оболочку слухового канала уха
	слизистые оболочки	слизь, предохраняющая внутренние оболочки полых органов; содержит IgА, лизоцим
	реснички	реснички в дыхательном тракте выталкивают слизь, содержащую бактерии
	желудочный сок	кислая пищеварительная жидкость понижает рН, содержит лизоцим
	кишечная флора	симбиотические бактерии конкурируют с патогенными бактериями
	эпидермис	внешний слой кожи, пот, уксусная, молочная и жирная кислоты предохраняют организм
лимфатические узлы	лимфатические узлы	клетки ретикулоэндотелиальной системы с барьерфиксирующей функцией

 

Достаточно мощной преградой на пути распространения патогена по организму является кровь. Бактерицидная активность крови обеспечивается комплексом гуморальных и клеточных факторов естественной резистентности организма. Если кровь перестает выполнять свою бактерицидную функцию, то возбудитель беспрепятственно пребывает и размножается в крови, а через нее проникает в органы и ткани и локализуется в них [5].

Если же микроорганизму все – таки удается проникнуть через первичные барьеры, то он сталкивается с клетками и механизмами системы врождённого иммунитета. Врождённая иммунная защита неспецифична, то есть её звенья распознают и реагируют на чужеродные тела независимо от их особенностей. Эта система не создает длительной невосприимчивости к конкретной инфекции [4].

Попытки построить теорию иммунитета на основе одного принципа – действия антител (гуморальная теория) или деятельности клеток (клеточная теория иммунитета Мечникова) – оказались недостаточными для объяснения многообразия защитных реакций нормального и иммунного организма [9].

Иммунитет различен у разноустроенных организмов по форме своего проявления. У позвоночных основные функции врожденной иммунной системы состоят в следующем:

– рекрутирование клеток иммунной системы в область проникновения патогена путем продуцирования химических факторов, включая специфические химические медиаторы, цитокины;

– активация компонентов системы комплемента;

– обнаружение и удаление инородных тел из органов и тканей с помощью лейкоцитов;

– активация системы приобретённого иммунитета в процессе презентации антигена [10].

 

 

1.1 Молекулярные факторы врожденного иммунитета

 

 

В медицинскую практику термин «иммунитет» вошел во второй половине XІX века – в начальный период активной разработки способов вакцинации для защиты людей от инфекционных заболеваний. По мере развития иммунологии традиционное понимание иммунитета как способа защиты от инфекционных микроорганизмов изменяется [11].

Первыми, кто пролил свет на один из механизмов невосприимчивости к инфекции, были Эмиль фон Беринг и М. Китазато. Они продемонстрировали, что сыворотка от мышей, предварительно иммунизированных столбнячным токсином, введенная интактным животным, защищает последних от смертельной дозы токсина. Образовавшийся в результате иммунизации сывороточный фактор – антитоксин – представлял собой первое обнаруженное специфическое антитело. Работы этих ученых положили начало изучению механизмов гуморального иммунитета [11, 12].

В дальнейшем детальным изучением защитных веществ плазмы крови начал активно заниматься немецкий ученый Пауль Эрлих. Подробно исследуя лечебные свойства сывороток иммунных животных, он показал, что антитела (так стали называть открытые Берингом и Китазато антитоксины) относятся к глобулиновой фракции белков плазмы крови, что они способны передаваться через плаценту из организма матери в организм развивающегося плода, что выработка антител происходит не только при контакте с болезнетворными микроорганизмами или их токсинами, но и при введении в кровь других органических веществ [12]. Пытаясь понять явление специфичности, Эрлих выдвинул теорию «боковых цепей» (1955), по которой антитела в виде рецепторов предсуществуют на поверхности клеток. Попавший в организм антиген находит соответствующее антитело, связывается с ним. Образовавшийся комплекс антиген – антитело (Аг-Ат) поглощается фагоцитами и попадает в клетку, вырабатывающая Ат. Клетки начинают производить Ат данной специфичности. Из его исследований вытекало, что основу защиты организма от чужеродных Аг определяют растворенные в плазме крови вещества, и подобного рода воззрения к концу XIX века получили название гуморальной теории иммунитета [11].

Однако не все занимающиеся проблемой инфекционных заболеваний исследователи придерживались мнения, что защита макроорганизма от инфекции определяется только гуморальными факторами. В 1883 г.          И.И. Мечников сделал первое сообщение по фагоцитарной теории иммунитетам на съезде врачей и естествоиспытателей в Одессе. Когда Мечников наблюдал под микроскопом за подвижными клетками (амебоцитами) личинок морской звезды, ему пришла мысль, что эти клетки, захватывающие и переваривающие частицы, не только участвуют в пищеварении, но и выполняют в организме защитную функцию. Введя в тело прозрачной личинки шип розы, он через некоторое время увидел, что амебоциты скопились вокруг шипа. Эти клетки он назвал – органоцитами, а процесс – фагоцитоз [11, 12].

В дальнейшем М. Грубер и Г. Дархэм выявили агглютинины у больных и иммунизированных лиц и создали предпосылки для разработки серологической диагностики инфекционных болезней [9]. Немного раньше, в 1889 г. X. Бухнер доказал, что бактерицидное действие крови не связано с эритроцитами; он открыл вещество сыворотки крови и назвал его алексином (от греч. alexo, защищать). Через 5 лет В.И. Исаев и Пфейффер описали феномен разрушения холерного вибриона в присутствии Ат и алексина. Уже через год Ж. Борде показал, что алексин взаимодействует с комплексом Аг-Ат, дополняя и завершая антимикробное действие Aт. По этой причине автор присвоил алексину название комплемент (от лат. complementum, дополняющий; делающий полным). Р. Пфейффер и В. Коллё открыли новые горизонты вакцинопрофилактики, применяя убитые микробы. В 1909 г. П.Л. Лащенко открыл протеолитический фермент лизоцим, селективно повреждающий клеточные стенки, содержащие пептидогликаны. Позднее лизоцим выделил в чистом виде А. Флеминг (1922) [13].

Но именно М.Ф. Бернет в значительной степени определил «лицо» современной иммунологии. Рассматривая иммунитет как реакцию, направленную на дифференциацию всего «своего» от всего «чужого», ученый поднял вопрос о значении иммунных механизмов в поддержании генетической целостности организма в период индивидуального развития. Именно он обратил внимание на лимфоцит как на основного участника специфического иммунного реагирования, дав ему название «иммуноцит» [11].

М.Ф. Бернет предсказал, а англичанин П. Медовар и чех М. Гашек экспериментально подтвердили состояние, противоположное иммунной реактивности – толерантности. Бернет остался в истории иммунологии как создатель клонально-селекционной теории иммунитета. Формула такой теории проста: один клон лимфоцитов способен реагировать только на одну конкретную антигенную, специфическую детерминанту [11].

После доказательства П. Медоваром иммунологической природы отторжения чужеродного трансплантата, после накопления факторов по иммунологии злокачественных новообразований стало очевидным, что иммунная реакция развивается не только на микробные Аг, но и тогда, когда имеются любые, пусть незначительные антигенные различия между организмом и тем биологическим материалом, с которым встречается организм [12].

В настоящее время известно, что защитные механизмы, направленные на уничтожение патогенных микробов, чрезвычайно разнообразны и носят как общий, так и строго специфический характер [1].

Все многообразие врожденных факторов, принимающих участие в неспецифическом ответе, условно можно разделить на две группы: группу молекул-эффекторов, которые непосредственно действуют на патоген, обладая цитолитическими или цитостатическими свойствами, и группу молекул, которые выступают в качестве регyляторов, хемоаттрактантов, факторов воспаления или костимуляторов.

К первой группе следует отнести лизоцимы, дефензины, интерфероны, компоненты комплемента заключительного этапа каскада реакций, действующих по альтернативному пути развития системы.

Вторая группа включает различные классы цитокинов (хемокины, интерфероны, факторы некроза опухолей, интерлейкины). Подобное деление, конечно, yсловно, так как среди гyморальных факторов имеются молекулы двойного назначения [13].

 

 

1.1.1 Система комплемента

 

 

На заре развития иммунологии было установлено, что лишенная клеток кровь (сыворотка) обладает бактерицидными свойствами. Причем помимо открытых Берингом и Китазато относительно термоустойчивых белковых молекул, называемых антителами, в реализации бактерицидности сыворотки существенную роль играют термолабильные (теряющие активность при 56 ºС) белки, названные Паулем Эрлихом комплементом, то есть «дополнительными» белками [5].

С развитием в XX веке методов выделения и очистки белков удалось показать, что комплемент (альфа-лизины) – это группа термолабильных белков, состоящая из протеаз и гидролаз, которые циркулируют в крови и выполняют защитную функцию организма [5]. В 1887 г. впервые Ж. Фодор показал, что свежая кровь животного оказывает бактерицидное действие на возбудителя сибирской язвы. А уже в 1889 г. Г. Бухнер сообщил, что бактерицидным действием обладает сыворотка, свободная от клеточных элементов крови. Комплемент обнаружен в нормальной сыворотке многих животных, но в различном количестве. Белки комплемента синтезируются в основном в печени и составляют приблизительно пять процентов от всей глобулиновой фракции плазмы крови [6]. В обычных условиях они неактивны, при активации они участвуют в защитных реакциях. Система активируется спонтанно определенными патогенами или комплексом Аг-Ат. Активированные белки либо непосредственно разрушают патоген (киллерное действие), либо обеспечивают лучшее их поглощение фагоцитами (опсонизирующее действие); либо выполняют функцию хемотаксических факторов, привлекая в зону проникновения патогена клетки воспаления [5]. Факторы комплемента функционируют координированно. Один из белков-комплементов присоединяется к бактерии, затем к нему присоединяется второй, ко второму третий и т. д. Затем они нарушают целостность клеточной стенки бактерии, в результате чего она погибает [13]. Комплемент связывается с комплексом Аг-Ат, в результате чего Ат осуществляют свое разрушающее действие (гемолитическое, бактериолитическое, цитотоксическое). Кроме того, факторы комплемента могут разрушать молекулярную структуру Аг, изменять их поверхность, так что они склеиваются между собой. Комплемент стимулирует приток нейтрофилов и макрофагов в очаг поражения [12].

Комплекс белков комплемента формирует каскадные системы, обнаруженные в плазме крови. Для этих систем характерно формирование быстрого, многократно усиленного ответа на первичный сигнал. В этом случае продукт одной реакции служит катализатором последующей, что в конечном итоге приводит к лизису клетки или микроорганизма [11].

Комплемент активируется тремя биохимическими путями: классическим, альтернативным и лектиновым путем. Все три пути активации производят разные варианты C3-конвертазы (белка, расщепляющего С3). Классический путь (он был открыт первым, но эволюционно является новым) требует Ат для активации (специфический иммунный ответ, приобретённый иммунитет), в то время как альтернативный и лектиновый пути могут быть активизированы антигенами без присутствия Ат (неспецифический иммунный ответ, врождённый иммунитет) [11]. Итог активации комплемента во всех трёх случаях одинаков: C3-конвертаза гидролизует С3, создавая C3a и C3b и вызывая каскад дальнейшего гидролиза элементов системы комплемента и событий активации [11, 12, 13]. Поскольку иммобилизованный C3b обладает максимально высоким сродством к С5-белку, С5-конвертаза присоединяет к себе молекулу С5 и расщеплет ее на С5а и С5b. C5a-важный хемоаттрактант, помогающий привлекать в район активации системы комплемента новые иммунные клетки. И C3a, и C5a имеют анафилотоксическую активность, непосредственно вызывая дегрануляцию тучных клеток (как следствие – выделение медиаторов воспаления) [11]. C5b начинает формирование мембраноатакующих комплексов (МАК), состоящим из поздних компонентов комплемента (C5b, C6, C7, C8 и полимерного C9). МАК – цитолитический конечный продукт активации системы комплемента. Он формирует трансмембранный канал, вызывающий осмотический лизис клетки-мишени [13] (рисунок 1).

Классический путь активации комплемента инициируется взаимодействием компонента комплемента С1q с иммунными комплексами (антителами, связанными с поверхностными антигенами бактериальной клетки); в результате последующего развития каскада реакций образуются белки с цитолитической (киллерной) активностью, опсонины, хемоаттрактанты. Тем самым нарушается осмотический баланс и в результате тургора бактерия погибает [11, 12].

 

С3-конвертаза

 

А – Путь активации системы комплемента; Б – Образование МАК

 

Рисунок 1 – Действие компонентов комплемента на клетки

 

Компонент комплемента С1 состоит из 3 частей: С1q, C1r,C1s. C1q состоит из 6 субъединиц, каждая из которых имеет булавовидную форму и вокруг хвоста С1q обвиты по 2 молекулы С1r, C1s. Для активации С1q необходимо его взаимодействие по меньшей мере с двумя, расположенными рядом фрагментами Fc IgG или одним IgM. C1q последовательно активирует С1r, C1s. C1s приобретает свойства сериновой протеазы. С1s расщепляет компонент комплемента С4 на 2 части С4b и С4a. С4b осаждается на поверхности клетки-мишени. С4а переходит в жидкую фазу. С4b связывается с С2 (распавшегося на С2а и С2b), который становится чувствительный к сериновой протеазе С1s. Далее С2b и С2а. С2а остается присоединенным к С4b. А С2b переходит в комплекс С4bC2a, который называется С3-конвертаза классического пути, которая расщепляет компонент комплемента С3 на С3a и C3b. C3b связывается с поверхностью болезнетворных микроорганизмов, что приводит к большей «заинтересованности» фагоцитов к связанным с СЗb клеткам (опсонизация). Образуется С4bC2aC3b-C5-конвертаза классического пути [11, 12, 13] (рисунок 2).

Такой механизм соединяет приобретенный иммунитет (Ат) с врожденным иммунитетом (комплемент). Классический путь действует более точно по сравнению с альтернативным путем активации системы комплемента, поскольку так уничтожается любая чужеродная клетка [4].

Комплекс С5b, С6, С7, С8 встраивается в мембрану клетки-мишени. К нему присоединяется от 14 до 18 мономеров С9, которые полимеризуясь формируют пору. Происходит ток жидкости в клетку, и она лизирует [13].

 

-конвертаза

-конвертаза

 

Рисунок 2 – Классический путь активации компонентов комплемента

 

Альтернативный путь активации комплемента инициируется взаимодействием компонента комплемента С3b с поверхностью бактериальной клетки; активация происходит без участия антител. Если для классического пути активации комплемента требуется накопление специфических Ат, то альтернативный путь развивается сразу после проникновения патогена. Его активаторами могут быть бактериальные полисахариды и липополисахариды, вирусные частицы, опухолевые клетки [12].

Компонент комплемента С3 постоянно спонтанно расщепляется на С3а и С3b. С3b всегда связывается с клетками хозяина или патогенами. Если он связался с патогеном, то C3b взаимодействует с фактором В. Фактор Д разлагает фактор В, образуя комплекс C3bBb являющийся нестабильным и стабилизируется фактором Р-пропердином. Образующийся комплекс С3bBbP-C3-конвертаза альтернативного пути, которая расщепляет много все новых молекул С3, формируя «петлю усиления». Комплекс же С3bBbC3b является   С5-конвертазой альтернативного пути. Поздние этапы такие же как и при классическом пути активации компонентов комплемента [11] (рисунок 3).

 

 

Рисунок 3 – Альтернативный путь активации компонентов комплемента

 

Лектиновый путь активации системы комплемента – один из трех ныне известных путей активации системы комплемента. Использует белок, похожий на C1q классического пути, который называется лектин, связывающий маннозу (mannose-binding lectin, MBL, называемый также лектин, связывающий маннан, полимер маннозы, или белок, связывающий маннозу). MBL связывает остатки маннозы и некоторых других углеводов, входящих в состав клеточной стенки целого ряда патогенов, тем самым распознает разнообразные болезнетворные микроорганизмы. Это преимущественно сывороточный белок, который секретируется клетками печени и опсонизирует патогены, попавшие в кровь [2, 13] (рисунок 4).

 

 

Обозначения: М – манноза в составе поверхностных структур клетки, например, ЛПС

 

Рисунок 4 – Лектиновый путь активации комплемента

 

Мономеры MBL состоят из двух доменов: глобулярного, который связывает маннозу, и фибриллярного или коллагеноподобного, служащего для полимеризации белка. В результате взаимодействия между фибриллярными доменами образуется олигомер, который, кроме клеточной стенки патогенов, связывает также две сериновые протеазы MASP-I и MASP-II по структуре сходные с C1r и C1s классического пути и возможно имеющие с ними общего предшественника в эволюции. После связывания на клеточной стенке патогена протеазы активируются и расщепляют компоненты комплемента C4 и C2 с образованием C4a, C4b, C2a и C2b. C4b и C2a после этого образуют на поверхности патогена C3-конвертазу, а C4a и C2b являются хемоаттрактантами, которые привлекают клетки иммунной системы [2, 4, 13].

В целом, в функции системы комплемента входит:

1) растворение иммунных комплексов;

2) лизис сенсибилизированных бактерий;

3) опсонизация бактерий к действию фагоцитов;

4) ускорение агрегации некоторых Аг в реакциях агглютинации и преципитации [5].

 

 

1.1.2 Катионные антимикробные пептиды

 

 

Антимикробные пептиды (АМП) являются одними из ключевых эффекторных молекул системы врожденного иммунитета, которая обеспечивает первую линию защиты от инфекций человека и животных. О существовании АМП известно уже несколько десятилетий, но только недавно интерес к этим молекулам перешел из плоскости фундаментальных исследований иммунной системы в клиническую область [14]. Эндогенные антимикробные пептиды (бета-лизины) термостабильны и играют очень важную роль в защитной системе организма. В настоящее время охарактеризованы сотни АМП, которые выявляются в эпителиальных тканях, фагоцитирующих клетках и биологических жидкостях многих многоклеточных животных от моллюсков до человека. Некоторые АМП синтезируются постоянно (конститутивно), синтез других индуцируется в ответ на инфекцию или воспаление [15].

Эндогенные АМП представляют собой небольшие молекулы, построенные из аминокислот. Они являются важной составляющей врожденной иммунной системы эукариот, которая обеспечивает защиту против патогенов. АМП эффективны против широкого спектра бактерий, грибов и вирусов [15, 16].

Действие небольших АМП главным образом приводит к нарушению структуры и функций цитоплазматической мембраны микроорганизмов, что, в свою очередь, ведет к гибели последних [14].

Большинство АМП представлено катионными, гранулы ассоциированными (поли) пептидами с аффинностью к компонентам отрицательно заряженной микробной клеточной стенки [15].

Способы действия, которыми АМП убивают бактерии, достаточно разнообразны и включают в себя нарушения мембраны, нарушая обмен веществ, и целостность цитоплазматических компонентов. Первоначальный контакт между пептидом и бактерией электростатический, так как большинство бактериальных поверхностей анионы, или гидрофобны. Их аминокислотный состав, катионный заряд и размер позволяет им встраиваться в мембранный бислой и формировать поры. Более точно, они способны проникнуть в клетку и взаимодействовать с внутриклеточными молекулами, которые имеют решающее значение в жизнедеятельности клетки. Внутриклеточная модель связывания включает торможение синтеза клеточной стенки, изменения цитоплазматической мембраны, активация автолизиса, ингибирование дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), РНК, синтез белка и торможение определенных ферментов [15, 17, 18, 19] (рисунок 5).

 

 

Рисунок 5 – Механизмы действия КАП на мембрану бактерий (А) и отличия в действии КАП на мембрану бактерий и на мембрану млекопитающих (Б)

 

На сегодняшний день у человека обнаружено несколько семейств пептидов – антибиотиков, одни из которых – дефензины, кателицидины и гистатины и другие.

 

 

 

1.1.2.1 Дефензины

 

У млекопитающих описано несколько структурно-гомологических групп антимикробных пептидов, среди которых наиболее изученным является семейство дефензинов (ДН), которые как в многочисленных опытах in vitro, так и, что особенно важно, in vivo проявляют антимикробную активность против многих грамположительных и грамотрицательных бактерий, микобактерий, низших грибов, оболочечных вирусов [20]. Широкое распространение и высокий уровень экспрессии ДН в эпителиальных тканях и клетках иммунной системы предполагают их важную роль в реализации различных защитно-приспособительных реакций организма. ДН представляют собой низкомолекулярные катионные пептиды с высоким содержанием основных аминокислот аргинина и лизина, а также аминокислот с гидрофобными боковыми группами. Еще одной отличительной структурной особенностью ДН является наличие в составе их молекул шести остатков цистеина, образующих три внутримолекулярных дисульфидных мостика. ДН млекопитающих подразделяются на три группы: альфа-, бета- и тета-ДН, которые различаются структурой кодирующих их генов, длиной препрочастей и аранжировкой дисульфидных связей [19, 20] (рисунок 6).

Альфа-ДН обнаруживаются в основном в нейтрофилах и клетках Панета, что позволяет считать их специфическими клеточными маркерами этих клеток. Активация нейтрофилов при инфекционных и воспалительных процессах приводит к быстрому высвобождению ДН, которые затем обнаруживаются в плазме и других жидкостях организма.

Бета-ДН обнаруживаются в лейкоцитах и эпителиальных клетках. Он экспрессирован в некоторых эпителиальных клетках и нейтрофилах. Бета-ДН изначально были открыты в эпителиальных клетках дыхательного тракта. Всего у человека выявлено 9 видов эпителиальных ДН, три из которых относятся к бета-ДН (human beta-defensins (HBD) 1-3). Бета-ДН 1 (hBD-1) экспрессируется у человека конститутивно, в то время как бета-ДН 2 (hBD-2) и 3 (hBD-3) являются индуцибельными пептидами, которые можно рассматривать как одну из неотъемлемых частей врожденного иммунитета и антимикробного иммунного барьера слизистых оболочек. Экспрессия бета-ДН в кишечнике индуцируется провоспалительными цитокинами, а также микроорганизмами (например, E.coli, H.рylori или P.aeruginosa) [20, 21].

Тета-ДН не обнаруживаются у человека. Пока что известно о наличии тета-ДН в организмах некоторых видов приматов, таких как макака-резус и павиан анубис [21].

 

 

 

Рисунок 6 – Структура дефензинов

 

Иммунные клетки используют ДН для уничтожения бактерий, поглощённых при фагоцитозе. Обычно ДН присоединяются к клеточной мембране микроба и углубляются в неё, формируя порообразные разрывы [20].

Совсем недавно была открыта антивирусная активность некоторых ДН. Считается, что альфа-ДН вносят серьезный вклад в анти-ВИЧ-1 активность антивирусного фактора CD8. Это обстоятельство открывает новые возможности в исследовании ВИЧ. Показано, что пациенты у которых отсутствуют альфа-ДН (синдромом недостаточности специфических гранул) страдают частыми и тяжелыми бактериальными инфекциями [21].

 

 

1.1.2.2 Кателицидины

 

 

Кателицидины (КЦ) – семейство антимикробных белков, которые главным образом обнаружены в пероксидаза – отрицательных гранулах нейтрофилов. Эти соединения синтезируются в виде препробелков. Человеческий катионный антимикробный белок (human cathelicidin antimicrobial proteinh (hCAP18), молекулярная масса 18 kDa) является к настоящему времени единственным идентифицированным человеческим КЦ. Помимо нейтрофилов hCAP18 выявлен в лимфоцитах и моноцитах, в сквамозном эпителии (рта, языка, пищевода, шейки матки и вагины), эпителии легочной ткани, кератиноцитах при воспалительных заболеваниях и эпидидимите [22] (рисунок 7).

 

 

 

Рисунок 7 – Строение кателицидинов

 

Было показано, что антибактериальный С-концевой фрагмент hCAP18-LL37 (37 аминокислот), проявляет антимикробную активность как против грамотрицательных, так и против грамположительных бактерий, грибов, некоторых вирусов и простейших. Этот пептид оказывает синергический антибактериальный эффект с ДН. LL37 может связывать липополисахарид (ЛПС) и нейтрализовать его способность индуцировать эндотоксический шок. Этот пептид является важным фактором реэпителизации ран, также была показана его ангиогенная активность in vivo и in vitro. Более того, LL37 функционирует в качестве хемотаксического агента для нейтрофилов, моноцитов и Т-клеток [15, 22].

 

 

1.1.2.3 Элафин

 

 

Элафин относится к эпителиальным ингибиторам протеиназ. Он также известен под рядом других названий, таких как SKALP и эластаза-специфический ингибитор (ESI) (рисунок 8).

 

 

Рисунок 8 – Структура элафина

 

Предполагается, что он играет важную роль в регуляции процессов воспаления и в защите от тканевых повреждений в многослойном эпителии. Элафин ингибирует лейкоцитарную эластазу и протеиназу-3 и в дополнение к этому служит субстратом для трансглутаминаз. Элафин конститутивно синтезируется в различных видах эпителия, включая волосяные фолликулы, эпителий пищевода, вагины и полости рта. В нормальных клетках кожи человека элафин отсутствует, однако он быстро индуцируется во время воспалительных процессов, таких как псориаз и заживление ран. Пре-элафин или Trappin-2 представляет собой белок с молекулярной массой 12,3 kDa. Пре-элафин может использоваться в качестве маркера при мониторинге лечения псориаза циклоспорином. В сыворотке или плазме здоровых индивидуумов содержится от 10 нг/мл до 50 нг/мл элафина. Во время псориаза наблюдается десятикратное увеличение концентрации этого протеина. Совсем недавно было показано, что элафин также обладает антимикробной активностью против грамположительных и грамотрицательных бактерий [23].

 

 

1.1.2.4 Гепсидин

 

 

Этот АМП, синтезируемый в печени в форме препропептида из 84 аминокислот, секретируется в циркуляцию в форме структурированного пептида из 25 аминокислот (рисунок 9).

 

 

Рисунок 9 – Структурное строение гепсидина

 

Это соединение участвует в регуляции метаболизма железа в организме. Антимикробный эффект гепсидина обусловлен как воздействием на бактериальную мембрану, так и лишением микроорганизмов доступного железа. Определение концентрации про-гепсидина (гепсидин прогормон) в сыворотке используется для диагностики тяжелых нарушений метаболизма железа [17].

 

1.1.2.5 Кальпротектин

 

 

Кальпротектин (КП) представляет собой гетерокомплекс кальций-зависимых белков. КП высвобождается из нейтрофилов и макрофагов во время их активации или гибели и вовлекается в активный воспалительный процесс. КП составляет до 60 % цитоплазматических белков, кроме того, он также обнаружен в моноцитах, макрофагах и в эпителиальных эозинофилах. В моноцитах периферической крови этот белок локализован экстра и внутриклеточно, в нейтрофилах – только внутриклеточно. КП высвобождается из клеток в очаге воспаления, что является примером «голокринной секреции». При воспалении КП экспрессируется сквамозным эпителием (от кожи до кишечного эпителия) [14].

КП имеет антибактериальный, антигрибковый, а также иммуномодулирующий и антипролиферативный эффект. Показано, что этот белок ингибирует рост фибробластов и может индуцировать апоптоз различных типов клеток. Кроме того, он является потенциальным хемотаксическим фактором для нейтрофилов. Концентрация этого белка в плазме возрастает при заболеваниях, ассоциированных с повышением активности нейтрофилов. При воспалении ЖКТ гранулоциты мигрируют в стенку кишечника. Поэтому КП также можно обнаружить в кале. Фекальный КП является маркером интестинального воспаления и позволяет неинвазивно дифференцировать синдром раздраженного кишечника и другие внутренние заболевания кишечника, а также дает возможность мониторировать течение и терапию болезни Крона и язвенного колита. КП является потенциальным скрининговым маркером для колоректальной неоплазии. Известно также, что экспрессия КП сопровождает различные воспалительные заболевания кожи (плоский лишай, красная волчанка, псориаз) [19].

 

 

1.1.2.6 Бета-лизин

 

 

Бета (b)-лизины – катионные сывороточные белки, обладающие бактерицидной активностью к аэробным спорообразующим бактериям, особенно В.subtilis и В.anthracis. Они слабочувствительны к ультрафиолетовым лучам (УФЛ), термостабильны, не диализуются, адсорбируются на бентоните, имеют молекулярную массу около 6 тыс. kDа. В связи с этим b-лизины используют для оценки как состояния естественного иммунитета, так и остроты воспалительного процесса [24].

Основные продуценты b-лизинов являются тромбоциты, поэтому в настоящее время b-лизины получили новое название – антимикробные белки тромбоцитов (АБТ) [25].

Механизм бактерицидного действия b-лизина не вполне ясен. Предполагается, что АБТ нарушают проницаемость мембраны бактерий (рисунок 10).

 

 

Рисунок 10 – Механизм действия b-лизина на бактериальную клетку

 

При исследовании бактерицидного катионного белка тромбоцитов оказалось, что значительное количество остается в мембранных осадках. АБТ в организме существует в двух состояниях – мембраносвязанном и свободном. Мембраносвязанная форма стабилизирует физиологически нормальные клетки. Однако деструкция клеток сопровождается освобождением АБТ и изменением существующего характера взаимодействием с мембранами, что ведет к ускорению распада клетки и ее элиминации [5].

Мембранотропность АБТ относительно бактерий и соматических клеток можно рассматривать как свойство, определяющее начальный этап взаимодействия патогена (бактерий) и клетки-мишени (хозяина). АБТ уменьшает адгезию бактерий на соматических клетках и изменяет персистентные характеристики стафилококков, эшерихий [24].

Связываясь с фосфолипидами поверхности клеток, АБТ экранирует функциональную возможность клеток в явлениях межклеточного взаимодействия и выполняет регуляторную функцию. Стабилизация мембран клетки – одна из сторон поддержания гомеостаза тромбоцитарных белков [5].

Среди других биологических эффекторов АБТ отмечено его участие в фагоцитарной реакции, где он активно включается на первой стадии фагоцитарного процесса (опсонизирующий эффект).

АБТ рассматривается как острофазный белок, так как отражает остроту процесса, степень деструктивных явлений в тканях и их распространенность. Это сигнал напряжения, стресса и нарушения адаптации. Стабильный уровень АБТ крови, слюны, мочи свидетельствует о гомеостазированности организма. Увеличение активности (содержания) – показатель нарушения гомеостаза, понижение концентрации – признак «поломки» гомеостазирующих механизмов или их высокого напряжения [25].

Биологическая активность белков не ограничивается его бактерицидной функцией, она проявляется вовлечением пептида в широкий круг защитно-приспособительных реакций, к сожалению, недостаточно изученных [24].

 

 

1.1.3 Лактоферрин

 

 

Лактоферрин (ЛФ) представляет собой полифункциональный белок из семейства трансферринов – гликопротеинов, переносящих ионы железа с валентностью три (FeІІІ). Этот гликопротеин в основном локализован во вторичных (специфических) гранулах полиморфноядерных нейтрофилов (ПМЯЛ) и высвобождается из них при стимуляции патогенными микроорганизмами [26] (рисунок 11).

 

 

Рисунок 11 – Структура лактоферрина

 

Кроме того, что ЛФ является естественным антибактериальным, антигрибковым и антивирусным белком, обладает антиоксидантными и иммуномодулирующими свойствами, поддерживает микробаланс в гастро-интестинальной системе. Этот белок способен вмешиваться в процессы клеточной пролиферации и дифференцировки, участвует в регуляции гранулопоэза, стимулирует в некоторых клетках синтез ДНК, ингибирует синтез простагландинов в макрофагах женского молока, активизирует неспецифический иммунный ответ организма, стимулируя фагоцитоз и комплемент. ЛФ способен взаимодействовать с ДНК, РНК, белками, полисахаридами, полианионами типа гепарина и так далее; некоторые из своих функций ЛФ проявляет в виде комплексов с этими лигандами. В последние годы показано, что ЛФ является ферментом рибонуклеазой, а также фактором транскрипции. Число различных активностей, обнаруженных у ЛФ, постоянно возрастает. Недавно было показано, что ЛФ способен стимулировать рост костной ткани (в физиологических концентрациях ЛФ усиливает пролиферацию и дифференцировку первичных остеобластов, и ингибирует остеокластогенез) [27].

Он является также мажорным белком других барьерных жидкостей, таких как слеза, слюна, секреты носовых желез. ЛФ присутствует и в плазме крови, но в значительно меньшем количестве [26].

Особо следует отметить, что ЛФ относится к белкам острой фазы, уровень которых существенно возрастает практически при любых воспалительных процессах, а также при некоторых вирусных заболеваниях, что, скорее всего, связано с активизацией этими процессами системы, ответственной за сопротивляемость организма по отношению к заболеваниям. Интересно, что в ходе воспалительных процессов происходит повышение концентрации ЛФ во всех биологических жидкостях человека, но особенно в очаге воспалительного процесса. Повышение концентрации ЛФ в крови, слезе и слюне может быть использовано для оценки остроты и степени тяжести воспалительных процессов [28].

Первоначально считалось, что антимикробные свойства апо-ЛФ обусловлены его исключительной способностью связывать железо из окружающей среды и тем самым лишать патогенную микрофлору необходимого для ее пролиферации микроэлемента. Более поздние исследования показали, что многие микроорганизмы экспрессируют на своей поверхности рецепторы для ЛФ; связывание белка с такими рецепторами приводит к гибели микроорганизма по тому или иному механизму, например вследствие инициации процесса высвобождения липополисахаридов из клеточных стенок. Бактерицидное действие ЛФ было показано в отношении большого числа грамположительных и грамотрицательных бактерий [27]. ЛПС, входящий в состав внешней мембраны грамотрицательных бактерий, и слой тейхоевой кислоты, который окружает цитоплазматическую мембрану грамположительных микроорганизмов, имеют отрицательный заряд, что приводит к электростатическому взаимодействию этих бактериальных компонентов с положительно заряженной частью пептида ЛФ [26]. После первичного связывания с микроорганизмом ЛФ проходит через клеточную стенку и взаимодействует с бактериальной цитоплазматической мембраной. При взаимодействии поликатионной части этого комплекса с полианионной поверхностью бактериальной внешней мембраны происходит нарушение ее целостности, что и позволяет пептидам проникнуть к цитоплазматической мембране, далее внутрь клетки и атаковать внутриклеточные компоненты [29]. Грамположительные бактерии также подавляются ЛФ, что объясняется отсутствием наружной клеточной стенки и прохождением пептида через слой тейхоевой кислоты, образующий мембрану этих микроорганизмов. Эти ЛФ пептиды образуют мицелярные структуры на цитоплазматической мембране микроорганизма с последующим формированием гидрофильного углубления, через которое они проникают в цитозоль. В случае с Bacillus subtilis небольшие концентрации ЛФ в среде приводили к ингибированию синтеза ДНК, РНК, и полипептидов. При этом у бактерии наблюдаются морфологические изменения, приводящие к спорулированию микроорганизма. После закрепления ЛФ на мембране, его липофильная часть взаимодействует с гидрофобным слоем цитоплазматической мембраны и дестабилизирует упаковку фосфолипидов. Для этого этапа очень важен остаток триптофана в структуре ЛФ – если в структуре пептида присутствуют два этих остатка, то бактерицидная активность ЛФ наиболее оптимальна. При добавлении третьего триптофана в производные ЛФ наблюдается максимальное разрушение мембранного слоя вокруг места посадки пептида на мембрану. Белок способен связывать и некоторые Аг вирусной природы. Однако основным механизмом антивирусной активности данного белка, по-видимому, следует считать связывание белка с глюкозоаминогликанами мембран эукариотических клеток, которое препятствует проникновению вирусных частиц, предотвращая таким образом инфекцию на ранней стадии [27, 29].

 

 

1.1.4 Лизоцим

 

 

Лизоцим (мурамидаза, англ. lysozyme) – антибактериальный агент, фермент класса гидролаз, разрушающий клеточные стенки грамположительных кокковых бактерий путём гидролиза пептидогликана клеточной стенки бактерий муреина [5]. Содержится в основном в специфических гранулах, но присутствует также в азурофильных. Главным образом, лизоцим получают из белка куриных яиц. Также аналогичные ферменты содержатся в организмах животных, в первую очередь, в местах соприкосновения с окружающей средой – в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, слёзной жидкости, грудном молоке, слюне, слизи носоглотки и так далее. В больших количествах лизоцимы содержатся в слюне, чем объясняются ее антибактериальные свойства. В грудном молоке человека концентрация лизоцима весьма высока (около 400 мг/л). Это намного больше, чем в коровьем. При этом концентрация лизоцима в грудном молоке не снижается со временем, через полгода после рождения ребенка она начинает возрастать [30].

Hаиболее изучен лизоцим белка куриных яиц: молекула лизоцима имеет форму, близкую к форме эллипсоида с осями 3,0 и 4,5 нм. Ее пересекает косая щель, в которой происходит сорбция и гидролиз субстрата (в ней может быть связано шесть гликопиранозных звеньев). Щель имеет гидрофобный карман, в котором локализуется ацетамидная группа N-ацетилглюкозамина. Важную роль в механизме гидролиза гликозидной связи играют группа С(О)О¯ остатка аспарагиновой кислоты (поляризует связь) и недиссоциированный карбоксил остатка глутаминовой кислоты (донор протона). Оптимальные условия для лизиса микробов Microccocus lysodeikticus (обычного тест-субстрата лизоцима) – рН от 6 до 7, ионная сила раствора 0,1. Ионы Сl¯ несколько активируют лизоцим; в отсутствие солей его активность резко падает. Повышение температуры вплоть до 60 ^оС увеличивает активность лизоцима; дальнейшее нагревание обратимо инактивирует фермент [5, 30] (рисунок 12).

 

 

Рисунок 12 – Структура лизоцимов

 

У позвоночных лизоцим выполняет функции неспецифического антибактериального барьера. При воздействии лизоцима на суспензию грамположительных бактерий наблюдают быстрое ее просветление. Способность к разрушению клеточных оболочек бактерий, с чего и начинается уничтожение, объясняется тем, что лизоцим в высокой концентрации находится в фагоцитах и его активность увеличивается при микробной инфекции [31]. Фермент атакует пептидогликаны (в частности, муреин), входящие в состав клеточных стенок бактерий (особенно много его в клеточных стенках грамположительных бактерий – до 50 % или 80 %). Лизоцим гидролизует (1,4β)-гликозидную связь между N-ацетилмурамовой кислотой и                     N-ацетилглюкозамином. Пептидогликан при этом связывается с активным центром фермента (в форме кармана), расположенным между двумя его структурными доменами. Сорбционный центр лизоцима представляет                6 карманов (A, B, C, D, E, F), причем в A, C и E может связывать только            N-ацетилглюкозамин, а в B, D и F – как N-ацетилглюкозамин, так и                  N-ацетилмурамовую кислоту [32]. Однако у большинства бактерий белковая замена остатка N-ацетилмурамовой кислоты делает такую связь недоступной для лизоцима, из-за чего бактериолитические свойства этого белка весьма ограничены. Активность лизоцима может быть усилена присутствием других веществ, например ЛФ, а также комплемента, Ат, которые, повреждая клеточную стенку бактерий, открывают доступ лизоциму к месту его действия – пептидогликану [31] (рисунок 13).

На грамотрицательную флору фермент лизоцим влияет опосредованно, в частности, как синергист ЛФ, комплемента. Последние исследования показали, что лизоцим играет определяющую роль в предупреждении развития пневмонии [30].

 

 

Рисунок 13 – Механизм действия лизоцима на бактериальную клетку

 

Можно избежать полного разрушения бактериальных стенок, проводя лизис в изотоническом или слабо гипертоническом (от 0,1 до 0,2 М) растворе сахарозы. В этих условиях под действием лизоцима из клеток образуются чрезвычайно чувствительные к осмотическим условиям округлые «протопласты». В гипертонических и изотонических средах протопласты стабильны; в гипотонических средах они лопаются, после чего остаются лишь «тени» (остатки плазматических мембран). Лизис клеточной стенки не приводит к нарушению метаболизма; протопласты дышат подобно интактным клеткам, образуют споры, если процесс споруляции уже был инициирован, но не адсорбируют фагов [32].

Лизоцим применяют в медицине как противомикробное средство (в том числе как добавка в продукты питания для детей) [31].

 

 

1.1.5 Антитела

 

 

Представление об антителах и вызывающих их продукцию антигенах начало формироваться в конце XIX века. Основополагающими стали проведенные в 1890 году исследования Э. фон Беринга и Ш. Китазато, которые доказали наличие в плазме крови млекопитающих особых веществ, способных нейтрализовать действие токсинов бактерий. Ат представляют собой специфические гама-глобулины (иммуноглобулины – Ig), образующиеся под влиянием Аг и взаимодействующие с ним [1].

Любая молекула иммуноглобулина имеет игрик-образную форму и состоит из двух тяжелых (Н) и двух легких (L) цепей, связанных между собой дисульфидными мостиками. Каждая молекула Ig имеет два одинаковых антигенсвязывающих фрагмента Fab (англ. Fragment antigen binding) и один Fc-фрагмент (англ. Fragment cristalisable), с помощью которого Ig комплементарно связываются с Fc-рецепторами клеточной мембраны [2, 3].

Ат, принадлежащие к разным классам, отличаются друг от друга во многих отношениях по периоду полураспада, распределению в организме, способности фиксировать комплемент и связываться с поверхностными          Fc-рецепторами иммунокомпетентных клеток. Поскольку иммуноглобулины всех классов содержат одни и те же капа (κ) и лямбда (λ) легкие цепи, а также одинаковые вариабельные домены тяжелых и легких цепей [11] (рисунок 14).

Изменение уровня иммуноглобулинов наблюдается при многих заболеваниях иммунной системы, в том числе раке, болезнях печени, ревматоидном артрите и системной, красной волчанке. Молекулы каждого класса Ig могут существовать в виде свободных Ат и в виде молекул, прикрепленных к клеточной мембране (то есть служить в качестве рецепторов В-лимфоцитов), что обеспечивается структурными различиями концевых участков этих двух разновидностей молекул [4].

 

3

2

1

 

Рисунок 14 – Структурное строение иммуноглобулинов класса G (1), A (2), M (3)

 

Важнейшей функцией IgG является его способность связывать белок C1q из системы комплемента и тем самым запускать классический путь ее активации. Предполагается, что у свободно двигающегося в плазме крови или тканевой жидкости IgG вследствие постоянного перемещения в пространстве его Fab-частей сайт связывания C1q является недоступным для взаимодействий. Когда же Ig связывается с Аг на поверхности чужеродной клетки, движение Fab ограничивается и C1q имеет возможность начать активацию. Тем самым комплемент не может запускаться свободными, не связанными с Аг, Ат, постоянно присутствующими в значительном количестве в крови [11].

Подобный механизм, вероятно, реализуется и при запуске активации системы комплемента иммуноглобулинами класса М, у которых сайт связывания с белком C1q расположен на третьем константном домене тяжелой цепи. Этот участок также становится доступным для взаимодействий только после связывания нескольких Fab-частей IgМ и приобретения им особой, так называемой «крабовидной», конфигурации, что происходит именно на поверхности чужеродной клетки и не может происходить у несвязанного с Аг иммуноглобулина класса М [11, 12].

IgА характерен для секретов организма (слюна, пот, молоко) и синтезируется под эпителиальными клетками слизистых оболочек. Взаимодействует с Fc-рецептором на базальной стороне эпителиальных клеток. Данный комплекс подвергается эндоцитозу и транспортируется к поверхности клетки, обращенной в просвет органа. Рецептор подвергается протеолизу и часть его вместе с димером IgА путем экзоцитоза выходит на поверхность слизистой [12].

Ig синтезируются В-лимфоцитами (плазматическими клетками), экспрессируются в виде мембраносвязанных рецепторов на поверхности        В-клеток и в виде растворимых молекул, присутствующих в сыворотке и тканевой жидкости. Они используются иммунной системой для идентификации и нейтрализации чужеродных объектов – например, бактерий и вирусов [13]. Ат выполняют две функции: антиген-связывающую функцию и эффекторную (например запуск классической схемы активации комплемента и связывание с клетками), являются важнейшим фактором специфического гуморального иммунитета. Ат в сочетании с комплементом могут оказывать прямое повреждающее действие на бактерии. Особенно чувствительна к литическому действию Ат внешняя липидная оболочка грамотрицательных бактерий. Ig любого типа распознает и связывает Аг, а затем усиливает киллинг и (или) удаление иммунных комплексов, сформированных в результате активации эффекторных механизмов [11].

Таким образом, функцией системы врожденного иммунитета состоит в том, чтобы отличить и защитить «свое» от «не своего». Подобная дифференциация в системе комплемента осуществляется благодаря присутствию на собственных клетках организма регуляторных молекул, подавляющих активацию комплемента [5].

Другие факторы врожденного иммунитета также обладают защитным действием организма от патогена путем прямого воздействия на клеточную стенку или выступая синергистами других факторов.

Областью применения молекулярных факторов врожденного иммунитета является клиническая иммунология, лабораторная диагностика, научные исследования. Например, в клинической лабораторной практике определение уровней АМП может быть полезно в качестве маркеров системной активации нейтрофилов, при мониторинге течения инфекционных и воспалительных заболеваний. Результаты последних исследований привели к однозначным выводам о том, что дефекты в экспрессии или функционировании АМП могут объяснить некоторые аспекты патогенеза самых разнообразных заболеваний человека, таких как атопический дерматит, кистозный фиброз, дизентерия, вызванная Shigella, кариес и другие. [33].

 

1.2 Методы оценки молекулярных факторов

 

 

Методы оценки гуморальных факторов неспецифического иммунитета основываются на активности сыворотки крови.

Бактерицидная активность сыворотки (БАС) – свойство свежей сыворотки крови вызывать гибель проникших или внесенных в нее бактерий. Обусловливается раздельным или совокупным действием Ат, компонентов комплемента, лизоцима, b-лизина и других факторов. Изучение соотносительного значения перечисленных факторов показало, что инактивация комплемента существенным образом снижает БАС, добавление Ат резко повышает ее, отсутствие лизоцима и b-лизина приводит к более или менее выраженному снижению БАС в зависимости от чувствительности к ним бактерий [33]. Механизм кооперативного действия представляется так: система антитело-комплемент разрушает и клеточную стенку, и цитоплазматическую мембрану; лизоцим действует аналогично на пептидогликан клеточной стенки; b-лизин разрушает цитоплазматическую мембрану. Уровень БАС является интегральным показателем антимикробных свойств сыворотки крови. Падение его указывает на глубокие нарушения в иммунитете и служит неблагоприятным прогностическим признаком, повышение уровня БАС оценивается положительно. Тем не менее БАС – самостоятельный показатель активности естественного иммунитета, так как прямой связи между БАС и активностью системы комплемента нет. При практическом использовании также следует иметь в виду, что показатель БАС колеблется в зависимости от пола, возраста, времени года и других факторов [34].

Для определения БАС существуют две группы методик. Методики первой группы основаны на нефелометрическом установлении степени задержки роста стандартной бактериальной суспензии под влиянием бактерицидных факторов исследуемой сыворотки по отношению к контролю, содержащему бактериальную взвесь без сыворотки. Методика второй группы основана на установлении количества выживших бактерий после воздействия свежей исследуемой сывороткой. В одном варианте определяют титр сыворотки крови, задерживающий размножение стандартного количества бактерий, в другом – вычисляют отношение колоний образующих единиц (КОЕ) контроля к КОЕ опыта и выражают его в виде десятичного логарифма, называемого бактерицидным индексом (БИ). В практике чаще используют второй вариант [35].

В качестве тест-штаммов традиционно используются различные представители вида Escherichia coli: 0111, 675, f2 и другие, что, с одной стороны, определяется особенностями строения их клеточной стенки, эффективно разрушаемой под действием комплекса сывороточных факторов, а с другой – близостью ее организации со многими патогенными грамотрицательными эубактериями [34].

1.2.1 Нефелометрический метод

 

 

В нашей стране в большинстве случаев БАСК определяют нефелометрическим методом О.В. Смирновой, Т.А. Кузьминой (1966), хотя в последующем их методику модифицировали многие авторы [36].

Метод включает приготовление тест-микроба, получение сыворотки крови, внесение тест-микроба в сыворотку, инкубирование. Перед инкубированием и после него определяют оптическую плотность (optical density (ОD)) сыворотки крови с тест-микробом и по ее изменению определяют бактерицидную активность. Бактерии в процессе размножения уменьшают прозрачность среды, сыворотка крови этому препятствует [36]. Способ позволяет повысить точность определения БАСК. Результат реакции вычисляют по формуле

                                                                  (1)

 

 

где D1 – оптическая плотность пробы до термостата;

D2 – оптическая плотность пробы после 3 ч в термостате;

D1k – оптическая плотность контроля до термостата;

D2k – оптическая плотность контроля после 3 ч в термостате [37].

 

Для более точного определения БАС желательно применять микроорганизмы с различным типом клеточной стенки, в частности Е.coli и B.subtilis, что позволяет оценить все составляющие сыворотки (лизоцим, система комплемента и так далее) [38].

Недостатком данного способа является то, что OD смеси, состоящей из трех компонентов: жидкой питательной среды, сыворотки крови и бактерий, увеличивается не только в результате размножения бактерий, но и в процессе склеивания органических веществ мясного бульона, что снижает достоверность полученного результата. Ферменты и прочие белки крови реагируют не только с микробными, но вообще с любыми аминокислотами, которых в мясопептонном бульоне содержится, независимо от того, есть в нем бактерии или нет, поэтому смешивание крови с каким бы то ни было мясным отваром снижает точность оценки ее защитных свойств.

Белки сыворотки крови, соединяясь с мясным бульоном, вступают в серологические и биохимические реакции, дающие осадок. Это заведомо лишает нефелометрический метод объективности.

Кроме того, после выдержки данной смеси в термостате дольше 6 ч, в ней невооруженным глазом обнаруживается процесс агглютинации бактерий иммуноглобулинами крови [37].

1.2.2 Культуральный метод

 

 

Бактериологический посев (культуральное или микробиологическое исследование) – лабораторное исследование, при котором биоматериал, в котором предположительно могут находиться патогенные микроорганизмы, помещают в благоприятную для их размножения среду при определенных температурных параметрах с последующей оценкой результатов и определения чувствительности к антибактериальным препаратам и подсчетом КОЕ [39]. КОЕ – одна живая микробная клетка, из которой вырастает колония, по другим определениям – видимая колония микроорганизмов, выросшая из одной клетки или из группы клеток. Определение КОЕ теоретически позволяет определить концентрацию (количество) микроорганизмов в единице объема [33].

БАС выражают либо БИ – частное от логарифма количества бактерий в опыте (lg No) к количеству бактерий в контроле (lg Nk), либо в процентах по формуле

                                                                  (2)

 

Между уровнем БАС и показателем БИ имеется прямая связь, между уровнем БАС и процентом БАС – обратная [32].

Преимуществом культурального метода является относительно высокая специфичность исследования и возможность лабораторного моделирования терапевтического воздействия на микроорганизмы и учет его эффективности – то есть то, что обычно называют антибиотикограммой.

Недостатками являются длительность исследования, высокие требования к забору материала, повышенные требования к квалификации персонала лабораторий, что ведет к значительному удорожанию стоимости исследования и удлинению сроков лечения.

 

 

1.2.3 Проточная цитофлюориметрия

 

 

Проточная цитофлюориметрия начала широко используется с 70-ых годов ХХ века, главным образом, для быстрого определения субпопуляций клеток в периферической крови, образцах ткани и клеточных суспензиях, и связывания гормонов и вирусов к рецепторам на поверхности клеток, измерения внутриклеточных компонентов (общей ДНК, новосинтезированной ДНК и так далее) и процессов (апоптоз, мобилизация внутриклеточного кальция и другие) [40]. Принцип метода проточной цитометрии основан на регистрации флюоресценции и светорассеяния от каждой отдельно взятой клетки в клеточной суспензии. Суспензия, предварительно окрашенная мечеными моноклональными Ат клеток, под высоким давлением подается в проточную ячейку, где за счет разности давлений между образцом и обтекающей жидкостью клетки, находясь в ламинарном потоке жидкости, выстраиваются в цепочку друг за другом (так называемое гидродинамическое фокусирование). Клетки одна за другой проходят через лазерный луч, а высокочувствительные детекторы, расположенные вокруг проточной ячейки регистрируют флюоресценцию и рассеянное лазерное излучение каждой клетки [41] (рисунок 15).

 

 

Рисунок 15 – Принцип работы цитофлюориметра

 

Полученный сигнал передается в компьютер, обрабатывается, и полученные данные отображаются в виде различных графиков и гистограмм.

Использование многоцветного флуоцитометрического исследования позволяет одновременно получить информацию о нескольких Аг на поверхности клеток [41].

 

 

1.2.4 Иммунофлюоресцентный метод

 

 

Иммунофлюоресценция (ИФ) разработана Кунсом в 1942 г. и применяется как метод экспресс – диагностики инфекционных болезней. ИФ представляет собой люминесценцию (свечение) при микроскопии в ультрафиолетовом спектре биологического объекта, предварительно обработанного меченными флюорохромом Ат [42].

Бывает прямая и непрямая ИФ, отличие заключается в том, что при прямой ИФ флюорохромом мечены Ат, связывающиеся непосредственно с Аг, а при непрямой ИФ меченными являются антиантитела к собственным Ат, которые связаны с Аг бактерии (рисунок 16).

 

 

Б

А

 

Рисунок 16 – Взаимодействие люминесцирующей сыворотки крови с бактериальной клеткой методом прямой (А) и непрямой (Б) ИФ

 

Люминесцирующие сыворотки получают путём химической реакции между антителами иммунной сыворотки и флюоресцирующим красителем (флюорохромом). Такая сыворотка образует на поверхности клетки или ткани комплекс Аг-Ат, который виден под микроскопом в ультрафиолетовых лучах, возбуждающих свечение флюорохрома [34].

 

 

1.2.5 Биолюминесцентный метод

 

 

Новые возможности исследования БАСК возникли в результате открытия люминесценции микроорганизмов. Изучение феномена бактериальной люминесценции в последние десятилетия стало одним из интенсивно разрабатываемых направлений в микробиологии.

Биолюминесценция (БЛ) – это свечение живых организмов, видимое простым глазом. Способностью к БЛ обладают организмы, принадлежащие к самым разным систематическим группам: бактериям, грибам, моллюскам, насекомым. Механизм реакций, сопровождающихся свечением, различен у разных видов, однако обычно включает в себя химическое превращение определенного низкомолекулярного субстрата, называемого люциферином, катализируемое ферментом люциферазой (формула 3) [43].

                (3)

 

Первые указания на возможность использования феномена бактериальной люминесценции в исследовательских, в том числе аналитических целях, представлены в работах M.W. Beijerinck. В России системные исследования феномена бактериальной БИ были начаты в Институте биофизики СО РАН на рубеже 60-ых годов XX века [44].

Возможность совершенствования технологии тестирования БАСК, основанной на использовании люминесцирующих бактерий, впервые была рассмотрена в работе израильских исследователей M. Barak, S. Ulitzur и D. Merzbach [39]. При этом в качестве потенциального тест-штамма для проведения подобных исследований ими был предложен природный изолят Vibrio cholerae biotype albensis, демонстрирующий высокую чувствительность к повреждающему действию бактериолитических систем, присутствующих в сыворотке крови человека и животных. При проведении подобных исследований впервые показана зависимость выраженности тушения БИ от присутствия в сыворотке крови специфических Ат к поверхности Vibrio cholerae biotype albensis, белков системы комплемента и лизоцима, последний из которых был наименее значим для формирования наблюдаемых эффектов [46].

Достаточно детально этот вопрос освещен в работах группы исследователей из университета города Турку (Финляндия), предложивших проведение оценки БАСК в отношении клеток E. coli JM109, несущих плазмиду pCSS962 с клонированными в ней генами люциферазы насекомого Pyrophorus plagiophthalamus [47]. Особенностью подобной модели является необходимость дополнительного внесения в бактериальные суспензии субстрата для светлячковой люциферазы (D-люциферина), каковой при значениях pH равной 7,0 достаточно слабо диффундирующего через цитоплазматическую мембрану. Ну а так как обработка бактериальных клеток сывороткой крови повышает ее проницаемость, регистрируемая кинетика свечения имеет «колоколообразный» характер со временем наступления максимума, зависящим от концентрации действующего агента [48].

На данной основе М. Virta с соавторами был разработан метод оценки комплемент-зависимого киллинга бактериальных клеток, демонстрирующий высокую степень согласования с результатами, полученными с использованием классического бактериологического метода и проточной цитофлюориметрии [47].

Общим же моментом названных технологий оценки БАС является проведение тестирования в отношении непатогенных лабораторных тест-штаммов микроорганизмов, удовлетворяющих требованиям высокой серочувствительности с одновременной возможностью экстраполяции полученных данных в отношении основных возбудителей инфекционных заболеваний, развитие которых контролируется активностью гуморальных бактерицидных систем [47].

 

 

 

2 Материалы и методы

 

2.1 Люминесцирующие штаммы бактерий

 

 

В настоящее время ведется широкий поиск биологически активных веществ, оказывающих свое воздействие, как через стимуляцию, так и через подавление иммунных реакций организма. Потребность в специфической направленной регуляции защитных функций имеется в различных областях медицины.

За последние десять лет люминесцентные микроорганизмы стали популярным инструментом для исследования различных как абиотических, так и биотических сред [49].

Экспрессия биолюминесцентных оперонов – параметр, зависящий от структуры оперона и метаболической активности клетки-хозяина. В свою очередь метаболическая активность клетки определяется условиями среды обитания. Количественными критериями эффективности экспрессии БИ служили: копийность lux-оперона (уровень репликации) на клетку, длительность латентного периода в индукции БИ (уровень транскрипции), максимальная интенсивность свечения (уровень трансляции). [48] Клонирование различных lux-оперонов в различных микроорганизмах, к примеру бактерий Escheriсhia coli, проявляющих свойства как комменсалов (в толстом кишечнике человека и млекопитающих), так и потенциальных патогенов (при переходе через эндоэкологические барьеры), создало условия для формирования принципиально нового направления использования биолюминесцентного анализа в биологии и медицине – тестирование различных биологических жидкостей и биосред макроорганизма.

 

 

2.1.1 Рекомбинантный люминесцирующий штамм Escherichia coli с клонированными в нем генами Photobacterium leiognathi

 

 

При проведении исследований в качестве основного объекта для дифференциальной оценки БАСК использовали рекомбинантный штамм E.coli, несущий полную кассету lux-генов Photobacterium leiognathi, в дальнейшем обозначаемый как E.coli lux+, выпускаемый МГУ им. М.В. Ломаносова под коммерческим названием «Эколюм-9» и демонстрирующий способность к конститутивному свечению без дополнительного внесения субстратов люминесцентной реакции.

При клонировании генов люминесценции данный штамм трансформирован плазмидой pUC19, в которую методами генной инженерии встроена кассета luxCDABE-генов природного морского микроорганизма P.leiognathi, штамм 54D10 (рисунок 17).

 

 

Рисунок 17 – Встраивание плазмиды в бактериальную клетку

 

Клонированная конструкция является необходимой и достаточной для воспроизведения конституитивной люминесценции реципиентного штамма, что определяется наличием в ее составе генов luxAB, кодирующих альфа- и бета-субъединицы бактериальной люциферазы (ферментного комплекса, ответственного за БИ), а также генов luxCDE, кодирующих редуктазу жирных кислот (один из окисляемых субстратов в ходе люциферазной реакции, приводящей к испусканию кванта света) [50] (рисунок 18).

 

 

Рисунок 18 – Гены luxCDABE

 

Температурный оптимум для функционирования данных ферментов в исходном штамме составляет от 28 °С до 30 °С, но может повышаться до 36 °С или 37 °С при взаимодействии с белками-шаперонами в реципиентном штамме E.coli.

Возможность стабильной люминесценции созданной генетической конструкции также обеспечивается имеющейся у реципиентного штамма E.coli собственной FMN-редуктазы, способной образовывать с люциферазами природных люминенсцирующих микроорганизмов функционально активные комплексы.

Наконец, способность данной генетической конструкции к стабильной транскрипции и трансляции обеспечивается ее клонированием под контролем lac-промотора, а ее сохранение в ряду поколений наличием гена устойчивости к ампициллину с соответствующим культивированием в присутствии данного антибиотика [51].

Конструирование рекомбинантных штаммов E.coli, встраивание люкс-оперонов природных люминесцентных бактерий расширили область применения люминесценции для анализа биологических жидкостей людей, где кишечная палочка является постоянным симбионтом [52].

 

 

2.1.2 Рекомбинантный люминесцирующий штамм Bacillus subtilis с клонированными в нем генами Photobacterium leiognathi

 

 

С другой стороны в нашей работе был использован рекомбинантный люминесцирующий штамм B.subtilis 168, несущий luxAB-гены P.leognathi, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ГосНИИгенетика, Москва) под номером B-10548. Особенностью последнего явилась интродукция перед каждым из luxAB-генов рибосом-связывающего сайта (последовательность Шайна-Дальгарно), характерного для грамположительных бактерий. В качестве матрицы для получения фрагментов ДНК с lux-генами использована плазмида с полным    lux-опероном P.leiognathi. Фрагменты ДНК, содержащие гены luxA и luxB были амплифицированы с использованием соответствующих праймеров.

Очищенные при помощи элюции из геля фрагменты ДНК были рестрицированы и лигированы. Из полученной лигазной смеси были амплифицированы фрагменты ДНК, содержащие искомые гены в последовательности luxAB, в дальнейшем клонированные в векторе pLF14. Для экспрессии в B.subtilis кодирующую область гена rhtA был клонирован в челночный вектор pLF14. Клонирование было проведено таким образом, чтобы ген rhtA экспрессировался под контролем промотора гена кап плазмиды pLF14 и имел сайт связывания рибосом гена rhtA из B.subtilis 168. Рекомбинантную плазмиду pLF-rhtA, а также исходный вектор трансформировали в штамм B.subtilis 168, в дальнейшем обозначаемый как B.subtilis lux+.

Способность данной генетической конструкции к стабильной транскрипции и трансляции обеспечивается ее клонированием, а ее сохранение в ряду поколений наличием гена устойчивости к канамицину с соответствующим культивированием в присутствии данного антибиотика [51].

В результате B.subtilis lux+ характеризовался высоким уровнем трансляции конститутивно транскрибируемых генов бактериальной люциферазы и при добавлении субстрата люминесцентной реакции (длинноцепочечного альдегида деканаля) демонстрировал интенсивность свечения не менее чем в 10 раз превышающую таковую у ранее использованного штамма B.subtilis с немодифицированными рибосом-связывающими сайтами luxAB-генов Vibrio harveyi.[52].

 

 

2.2 Сыворотка крови

 

 

В качестве источника бактерицидных факторов использовали сыворотку крови, представляющую собой плазму крови, лишённую фибриногена и потому не свертывающуюся в присутствии коагулазы, в том числе бактериальной.

Сыворотки получали путём естественного свёртывания плазмы (нативные сыворотки). В сыворотках сохранена большая часть Ат, а за счёт отсутствия фибриногена резко увеличивается стабильность.

Сыворотку выделяют при анализе крови на инфекционные заболевания, при оценке эффективности вакцинации. Сыворотки используют в качестве лекарственных препаратов при многих инфекционных заболеваниях (столбняке, дифтерии, гриппе и других) и отравлениях (яды змей, ботулотоксин и других). Сыворотки крови, меченые ферментами, радионуклидами и люминофорами применяют в диагностике некоторых заболеваний и в научных исследованиях [53].

Для получения сыворотки стерильно взятую кровь ставили в термостат от 30 до 60 минут, пастеровской пипеткой отслаивали сгусток от стенки пробирки и помещали в холодильник до следующего дня. Отстоявшуюся сыворотку отсасывали стерильным дозатором в стерильную микропробирку.

Нами были использованы 30 индивидуальных образцов сывороток крови человека различного компонентного состава полученные от здоровых доноров. Компонентный состав каждой из которых был исследован с использованием ряда иммунохимических методов.

 

 

2.3 Биолюминесцентная оценка активности сыворотки крови с использованием штаммов E.coli и B.subtilis

 

 

Для определения подавления свечения бактерий сывороткой крови использовали биолюминесцентный метод [48].

Перед проведением исследований штаммы выращивали в течение 24 ч при 37 °С на LB-агаре с добавлением селективного фактора – 100 мкг/мл ампициллина для E.coli lux+ и 40 мкг/мл канамицина для B.subtilis lux+. Непосредственно перед проведением исследований полученную биомассу смывали стерильным LB-бульоном, после чего суспензию стандартизировали до OD 1,2 отн. ед, при длине волны 540 нм, проводя подобные измерения в кюветах с длиной оптического пути 1 см на спектрофотометре СФ – 46 (ЛОМО, Россия).

В кюветы микробиологической пипеткой закапывали по 0,1 мл сыворотки и суспензии бактерий. Инкубировали 30 мин в термостате при 37 °С. В случае исследования B.subtilis lux+ дополнительно вносили 2×10^-3 мл деканаля с концентрацией 7×10^–6 М непосредственно перед измерением. В качестве контролей использовали те же люминесцирующие бактерии, в равных объемах смешанные с 0,85 % физиологическим раствором (NaCl) (рисунок 19).

 

 

Рисунок 19 – Схема постановки биолюминесцентного метода

 

Измерение интенсивности свечения в сравниваемых пробах осуществляли в непрерывном режиме с использованием программного обеспечения биохемилюминометра «БЛМ-8802М2К» (СКТБ «Наука», Россия) в случае оценки реакции E.coli lux+ или «Биотокс-7» (ООО «Нера», Россия) при проведении аналогичных исследований на B.subtilis lux+. После чего итоговый расчет изменения биолюминесценции бактериальных клеток – мишений (I_бл) осуществляли по формуле

                                                                         (4)

 

где Ik и Io – интенсивность свечения контрольных и опытных проб на нулевой (0) и тридцатой (30) минутах измерения

 

 

2.4 Нефелометрический метод оценки бактерицидной активности сыворотки крови

 

 

БАСК оценивали нефелометрическим способом, учитывая изменения OD жидкой питательной среды, содержащей микробную взвесь и испытуемую сыворотку крови. Бактерии в процессе размножения уменьшают прозрачность среды, сыворотка крови этому препятствует.

В качестве микробной взвеси использовали суспензию в NaCl суточной культуры штамма E.coli с OD 0,6 отн. ед., стандартизованной на планшетном фотометре «Униплан» (ЗАО «Пикон», Россия) при длине волны 450 нм. Бактерии выращивали на LB-агаре в течении 24 ч при 37 °С.

В качестве исследуемого материала были использованы полученные ранее описанным способом сыворотки от 30 здоровых доноров (рисунок 20).

 

 

Рисунок 20 – Схема проведения нефелометрического метода оценки бактерицидной активности сыворотки крови

 

В каждую лунку планшета закапывали по 0,045 мл исследуемой сыворотки, по 0,2 мл LB-бульона и по 9×10^-3 мл суспензии бактерий. Внутренним контролем служила лунка с питательной средой и микробной взвесью без сыворотки крови. Измерение OD испытуемых проб и контроля проводили на планшетном фотометре при длине волны 540 нм дважды: сразу после смешивания ингредиентов и через 3 ч инкубации в термостате при 37 °С.

 

 

2.5 Нефелометрический метод оценки активности бета-лизина

 

 

О.В. Бухарин и А.П. Луда предложили вариант описанной ранее методики определения b-лизина нефелометрическим способом с расчетом показателей БАСК при помощи таблиц и меньшего объема сыворотки (рисунок 21).

 

 

 

Рисунок 21 – Постановка нефелометрического метода определения активности бета-лизина

 

Сначала из суточной культуры B.subtilis, выращенной на LB-агаре готовили суспензию в NaCl и стандартизовали на фотометре до OD 0,5 отн. ед. Далее в лунках планшета смешивали 75×10^-3 мл суспензии с 0,015 мл сыворотки и инкубировали на шейкере на 4000 об/мин при 37 °С 15 минут. Для контроля вместо сыворотки использовали NaCl. Далее во все лунки добавляли по 0,202 мл LB-бульона и измеряли OD на 0 минуте и после 2; 4 и 6 ч инкубации на шейкере при 37 °С.

 

 

2.6 Оценка активности лизоцима

 

 

Для определения активности сывороточного лизоцима использовали суточную культуру Micrococcus luteus, выращенную на LB-агаре в термостате при 37 °С. Из культуры готовили суспензию клеток в фосфатном буфере с рН 6,2 и стандартизовали на планшетном фотометре «Униплан» до OD 0,66 отн. ед. (рисунок 22).

 

 

Рисунок 22 – Схема определения активности лизоцима

 

В каждую лунку планшета вносили микробиологической пипеткой по 0,2 мл фосфатного буфера (рН 6,2), 0,050 мл исследуемой сыворотки крови и по 0,1 мл стандартизованной взвеси микрококка. Смесь инкубировали 30 мин при 37 °С на шейкере, планшет предварительно заклеив липкой пленкой. После инкубации измеряли OD на планшетном фотометре «Униплан» с длиной волны 540 нм. В качестве внутреннего контроля выступал фосфатный буфер, добавленный вместо сыворотки.

Для определения концентрации лизоцима в исследуемых образцах сывороток пользовались таблицей Урбаха В.Ю., приведенной в приложение А, позволяющей по степени лизиса культуры живого микрококка судить о концентрации фермента в сыворотке крови в мкг/мл.

 

 

2.7 Определение тотального комплемента

 

 

Количественное определение комплемента производили методом иммунного гемолиза. Метод основан на комплементзависимом лизисе нагруженных Ат эритроцитов барана. Для этого необходимо было получить эритроциты барана. Сначала готовили раствор для хранения эритроцитов: во флакон наливали 100 мл дистиллированной воды, взвешивали 400 мг NaCl, 800 мг цитрата натрия и 2100 мг глюкозы, все смешивали и автоклавировали при    1 атм 40 мин. В полученную смесь добавили кровь барана, взятую непосредственно из вены, в соотношении 1:1 и тщательно перемешали. Для хранения сыворотку поставили в холодильник ввиду термолабильности комплемента.

Перед постановкой опыта необходимо было получить 4 % суспензию эритроцитов барана и развести человеческий Ig. Для этого в пробирке №1 смешивали 0,12 мл эритроцитов и 1,38 мл NaCl. В пробирке №2 смешивали 0,15 мл Ig человеческого и 1,35 мл NaCl. Затем из пробирки №1 и пробирки №2 в количестве по 1,5 мл отбирали содержимое и смешали в пробирке №3, инкубировали 15 мин в термостате при 37 °С. На следующем этапе смесь разделили на две микропробирки и центрифугировали 10 минут при 5 тыс об/мин. Удалив супернатант, в каждую микропробирку добавили по 1,5 мл NaCl для получения 2 % раствора эритроцитов. Далее определяли тотальный комплемент согласно схеме (рисунок 23).

 

эритро- циты

 

Рисунок 23 –Схема определения СН50

 

В лунки стрипов вносили 0,025 мл исследуемой сыворотки, 0,05 мл 2 % эритроцитов и 0,04 мл 0,85 % NaCl и инкубировали 15 мин на шейкере при 37 °С на 4000 об/мин. Измерение OD производили на 15 и 30 мин инкубации на иммуноферментном анализаторе «Униплан» при длине волны 620 нм. Для определения правильности результатов делали два контроля: К⁺ (0,065 мл NaCl, 0,05 мл 2 % эритроцитов) – для полного лизиса; К^– (0,025 мл сапонина, 0,05 мл 2 % эритроцитов, 0,040 мл NaCl) – для отсутствия лизиса.

 

 

2.8 Определение компонентов системы комплемента

 

 

Определение компонентов комплемента (С3, С4, С5) обычно проводят при обследовании больных с аутоиммунными заболеваниями и при подозрении на генетический дефект комплемента.

Количественное присутствие С3- ,С4- ,С5-компонентов комплемента определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем фирмы «ЦИТОКИН» (Россия).

Для определения С3 компонента комплемента человека в сыворотке крови использовали количественное анализ. Перед работой во флаконы с калибровочными пробами добавили по 1,0 мл дистиллированной воды, выдержали в течение 1 мин и затем тщательно перемешали до полного растворения, избегая пенообразования. Вскрыли и установили на рамку необходимое количество стрипов. Затем приготовили промывочный раствор, для чего в стакан с 480 мл дистиллированной воды добавили содержимое флакона с маркировкой «Буфер Р». Тщательно перемешали, избегая пенообразования. Далее приготовили рабочий раствор коньюгата путем смешивания 0,04 мл концентрированного Коньюгата Е с 1 мл промывочного буфера из расчета на один стрип. Сыворотку крови развели в 10000 раз в промывочном буфере.

Во все лунки вносили по 0,1 мл «Буфер А». В соответствующие лунки добавляли по 0,2 мл калибровочных проб или приготовленные разведения исследуемых сывороток, внесение образцов не занимало более 15 мин. Затем инкубировали стрипы на шейкере при 37 °С в течение 1 ч. По окончании инкубации удаляли содержимое лунок декантированием и промывали лунки три раза. При каждой промывки во все лунки добавляли по 0,2 мл промывочного буфера и встряхивали рамку на шейкере от 5 до 10 сек с последующим декантированием. При каждом декантировании тщательно удаляли остатки жидкости из лунок путем постукивания рамки со стрипами в перевернутом положении по фильтровальной бумаге.

Далее вносили во все лунки по 0,1 мл раствора коньюгата Е анти-С3-пероскидазы и инкубировали стрипы на шейкере при 37 °С в течение 1 ч. По окончании инкубации лунки повторно промывали.

За 5 мин до окончания инкубации готовили субстратную смесь, для приготовления которой на 8 стрипов брали 1,6 мл раствора ТМБ и 8 мл Буфер С. Тщательно перемешивали и убирали в темное место до использования.

Вносили во все лунки по 0,1 мл субстратной смеси и инкубировали стрипы в темноте от 18 °С до 20 °С в течение 20 или 30 мин. Затем вносили по 0,05 мл «Стоп-реагента» для остановки ферментативной реакции, встряхивали на шейкере от 5 до 10 мин.

По завершению времени измеряли OD на фотометре вертикального сканирования при длине волны 450 нм. Рассчитывали среднее значение для калибровочных и исследуемых проб и строили для калибровочных проб график зависимости OD в единицах OD от концентрации С3 в калибровочных пробах нг/мл. Определяли содержание С3 в пробах по калибровочному графику и умножали на коэффициент разбавления крови 10000 (рисунок 24).

Для определения С4 компонента комплемента человека в сыворотке крови использовали количественный анализ. Растворы для анализа готовили аналогично указанному выше методу.

Во все лунки вносили по 0,1 мл «Буфар А». В соответствующие лунки вносили по 0,1 мл калибровочных проб или исследуемые сыворотки. Инкубировали стрипы на шейкере при 37 °С в течение 1 ч. По окончании инкубации удаляли содержимое лунок декантированием и промывали лунки три раза. Затем во все лунки вносили по 0,1 мл раствора коньюгата Е анти-С4-пероксидазы и инкубировали стрипы на шейкере при 37 °С в течение 1 ч. По окончании инкубации лунки промывали 3 раза.

За 5 мин до окончания инкубации приготавливали субстратную смесь: на 8 стрипов брали 1,6 мл раствора ТМБ и 8 мл Буфера С, тщательно перемешивали и убирали в темное место до использования. Во все лунки вносили по 0,1 мл субстратной смеси и инкубировали стрипы в темноте от 18 °С до 20 °С от 15 до 20 мин.

Затем во все лунки вносили с той же скоростью и в той же последовательности, как и субстратная смесь, по 0,05 мл «Стоп-реагента» для остановки ферментативной реакции, встряхивали на шейкере от 5 до 10 мин.

По завершению времени измеряли OD на фотометре вертикального сканирования при длине волны 450 нм. Рассчитывали среднее значение для калибровочных и исследуемых проб и строили для калибровочных проб график зависимости OD в единицах OD от концентрации С4 в калибровочных пробах нг/мл. Определяли содержание С4 в пробах по калибровочному графику и умножали на коэффициент разбавления крови 10000.

Для определения С5 компонента комплемента человека в сыворотке крови пользовались указанным ранее методом. Перед проведением анализа исследуемые сыворотки необходимо было разбавить в 1000 раз в промывочном буфере. Использовался коньюгат Е анти-С5-пероксидаза.

 

 

 

Рисунок 24 – Схема «сендвич-ИФА» для определения С3 компонента комплемента (аналогично для С4 и С5 с небольшими изменениями)

 

Концентрацию компонентов комплемента (в мг/мл) в исследуемых образцах определяли, нанося полученные значения OD на калибровочный график. На основании кривой рассчитывали количество компонентов комплемента в исследуемых пробах, учитывая концентрацию в них эритроцитов.

 

 

2.9 Определение лактоферрина

 

 

Количественное определение содержания ЛФ в сыворотке крови может быть использовано для оценки функционирования иммунной системы и иметь диагностическое и прогностическое значение при различных заболеваниях.

Метод основан на твердофазном иммуноферментном анализе с применением поликлональных Ат к ЛФ.

Перед проведением анализа исследуемые образцы и все компоненты набора выдержали при 25 °С не менее 30 мин.

Вскрыли пакет и установили на рамку необходимое для анализа количество стрипов. Исследуемые сыворотки развели в 50 раз раствором для разведения сывороток: 0,01 мл исследуемой сыворотки плюс 0,49 мл раствора для разведения сывороток. Далее готовили рабочий буферный раствор: на 8 стрипов брали 16 мл концентрата фосфатно-солевого буферного раствора с твином (ФСБ-Т) и до 400 мл дистиллированной воды; рабочий раствор коньюгата: 0,2 мл коньюгат, концентрат и 8 мл рабочего буферного раствора, тщательно перемешали; рабочий раствор тетраметилбензидина (ТМБ): 0,56 мл концентрат ТМБ на 8 мл субстратного буферного раствора.

После приготовления рабочих растворов приступили к анализу, для чего в соответствующие лунки вносили по 0,1 мл каждой калибровочной пробы и по 0,1 мл контрольного образца. В остальные лунки вносили по 0,1 мл анализируемых сывороток в рабочем разведении. Время внесения образцов не превышало 20 мин.

Планшет заклеивали пленкой и инкубировали в термостате в течение 30 мин при температуре 37 °С. По окончании инкубации снимали липкую пленку и помещали ее в сосуд с дезинфицирующим раствором. Содержимое лунок удаляли в сосуд с дезинфицирующим раствором и промывали лунки планшета 5 раз рабочим буферным раствором. При этом в каждую лунку вносили не менее 0,35 мл жидкости в процессе одного промывания. По окончании каждой промывки остатки влаги из лунок тщательно удаляли, постукивая перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге.

Далее вносили во все лунки по 0,1 мл рабочего раствора коньюгата, заклеивали пленкой и инкубировали в термостате при 37 °С в течение 30 мин. По окончании второй инкубации удалили содержимое лунок и промыли планшет 5 раз рабочим буферным раствором так, как это указано выше.

Затем во все лунки вносили по 0,1 мл рабочего раствора ТМБ и инкубировали в темноте в течение 15 мин при температуре от 18 °С до 25 °С. После инкубации во все лунки внесли с той же скоростью и в той же последовательности, как и ТМБ, по 0,1 мл «Стоп-реагента». Встряхивали планшет на шейкере в течение 10 или 15 сек; при этом содержимое лунок окрашивалось в желтый цвет (рисунок 25).

 

 

Рисунок 25 – Схема определения концентрации лактоферрина в сыворотке крови

 

Результаты анализа регистрировали с помощью спектрофотометра, измеряя OD в двухволновом режиме: основной фильтр – 450 нм, референс-фильтр – в диапазоне от 620 до 650 нм. Измерение производили через 2 мин или 3 мин после остановки реакции. Время между остановкой реакции и измерением OD не превышала 10 мин.

По результатам измерения вычисляли среднее арифметическое значение OD в лунках с анализируемыми образцами. И строили калибровочный график зависимости OD (ось ординат) от концентрации ЛФ (ось абсцисс) в калибровочных пробах.

 

 

2.10 Определение фактора Н

 

 

Количественное содержание фактора Н компонента человека в плазме крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа, используя набор реагентов «ИФА – фН».

Перед началом анализа во флаконы с калибровочными пробами добавляли по 0,8 мл дистиллированной воды, содержали в течение 30 мин и затем тщательно перемешали до полного растворения, избегая пенообразования. В стакан с 480 мл дистиллированной воды добавляли содержимое флакона с маркировкой «Буфер Р». Тщательно перемешивали, избегая пенообразования. В зависимости от количества используемых стрипов подготовили необходимый объем однократного раствора антител фН-Биотин путем смешивания 0,04 мл концентрированных Ат с 1 мл промывочного буфера из расчета на 1 стрип. Аналогично готовили коньюгат (авидин-пероксидаза).

Перед проведением анализа исследуемые сыворотки разбавили в 10000 раз в промывочном буфере.

Во все лунки вносили по 0,25 мл промывочного буфера, через 5 мин содержимое лунок удалили. И внесли во все лунки по 0,1 мл «Буфер А». В соответствующие лунки вносили по 0,05 мл калибровочных проб или приготовленные исследуемые сыворотки, внесение образцов не занимало более 15 мин. Инкубировали стрипы на шейкере при 37 °С в течение 2 ч. По окончании инкубации удаляли содержимое лунок декантированием и промывали лунки три раза. При каждой промывке во все лунки добавляли по 0,2 мл промывочного буфера, встряхивали рамку на шейкере от 5 до 10 сек с последующим декантированием.

Затем вносили во все лунки по 0,1 мл раствора Ат, инкубировали стрипы на шейкере при 37 °С в течение 1 ч. По окончании инкубации лунки промывали.

Далее во все лунки вносили по 0,1 мл раствора авидин-пероксидаза и инкубировали стрипы на шейкере при температуре 37 °С в течение 30 мин. По окончании инкубации лунки промывали три раза.

За 5 мин до окончания инкубации готовили необходимое количество субстратной смеси: из расчета на 1 стрип мерно отбирали 1 мл субстратного буфера из флакона с маркировкой «Буфер С» и добавляли 0,2 мл раствора ТМБ. Тщательно перемешивали и убрали в темное место до использования.

После промывки во все лунки вносили по 0,1 мл субстратной смеси, инкубировали в темноте с температурным режимом от 18 °С до 20 °С в течение 30 мин. После вносили во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и субстратная смесь, по 0,05 мл «Стоп-реагента» для остановки ферментативной реакции, встряхивали на шейкере до 10 мин.

OD измеряли на фотометре вертикального сканирования при длине волны 450 нм (рисунок 26).

 

 

Рисунок 26 – Схема определения концентрации фактора Н

 

Рассчитывали среднее значение OD калибровочных и исследуемых проб.

 

 

2.11 Оценка жизнеспособности E.coli и B.subtilis

 

 

Жизнеспособность бактериальных клеток оценивали методом культурального посева на LB-агаре в чашках Петри (рисунок 27).

 

инкубация

инкубация

культура

сыворотка

                                                                                

Рисунок 27 – Схема оценки жизнеспособности бактерий

 

Для этого использовали суточные культуры E.coli и B.subtilis, выращенные на LB-агаре в термостаре при 37 °С. Готовили суспензии бактерий в 0,85 % NaCl и стандартизовали на планшетном фотометре «Униплан» до OD около 0,1 отн. ед. Затем смешивали в планшете 0,05 мл суспензии бактерий (E.coli или B.subtilis) и 0,05 мл исследуемой сыворотки. Контролем выступал NaCl с культурой. Смесь инкубировали 1 ч на шейкере при 37 °С и 4000 об/мин. Далее готовили их разведение в планшетах до 10^-3, 10^-4 и 10^-5: в соседние лунки закапывали по 0,09 мл NaCl и добавляли из лунок с культурой и сывороткой по 0,01 мл, аккуратно пипетировали и продолжали разведение.

Чашку Петри делили на три зоны для каждого разведения и производили посев смеси по 0,025 мл шпателем Дригальского. Чашки инкубировали 18 ч в термостате при 37 °С. После чего производили подсчет выросших колоний.

 

 

2.12 Определение уровня иммуноглобулинов, специфичных к E.coli и B.subtilis

 

 

Для определения уровня Ig, специфичных к данным штаммам, использовали метод аналогичный иммуноферментному анализу. За 30 мин до работы приготовили фосфатно-солевой буферный раствор: на 8 стрипов брали флакон ФСБ-Т и смешивали с 0,3 мл дистиллированной воды. 0,8 мл коньюгата разводили в 7,2 мл NaCl.

Для постановки опыта использовали суточную культуру бактерий (E.coli или B.subtilis), из которой готовили суспензию в физиологическом растворе и стандартизовали на планшетном фотометре «Униплан» до OD 0,4 отн. ед. (рисунок 28).

 

 

Обозначение: ЦФ – центрифугирование

 

Рисунок 28 – Схема определения уровня иммуноглобулинов, специфичных к бактериям

 

 

В микропробирках в термите при 56 °С по отдельности инкубировали исследуемые сыворотки и суспензии бактерий 15 мин. Затем соединили по    0,05 мл исследуемой сыворотки и суспензию бактерий и проинкубировали      30 мин при 37 °С. Далее центрифугировали при 13000 об/мин 5 мин. Удаляли супернатант и проводили отмывку фосфатным буфером дважды: добавляли    0,2 мл ФСБ-Т, затем центрифугировали 5 мин при 13000 об/мин, снова удаляли супернатант, добавляли ФСБ-Т и центрифугировали. Удалив супернатант закапывали 0,01 мл коньюгата и инкубировали 30 мин в термостате при 37 °С для связывания коньюгата. Снова центрифугировали и повторяли отмывку для удаления не связавшегося коньюгата. Далее закапывали 0,1 мл ТМБ и инкубировали при комнатной температуре в темноте 15 мин. На последнем этапе вносили «Стоп-реагент» в объеме 0,1 мл и производили измерение OD на фотометре при длине волны 450 нм. Для подтверждения результатов использовали два внутренних контроля: первый контроль служил для проверки коньюгата (К) – на первом этапе вместо сыворотки добавляли NaCl; второй (Кк) – для проверки бактерий – на первом этапе также вместо сыворотки добавляли NaCl, а затем вместо коньгата.

 

 

2.13 Оценка уровня IgG, IgA, IgM

 

 

Для оценки уровня Ig использовали иммуноферментный анализ (рисунок 29).

 

 

Обозначение: РРС – раствор для разведения сыворотки; РРК – рабочий раствор конъюгата; ФСБ-Т – фосфатно-солевой буфер с твином

 

Рисунок 29 – Оценка уровня иммуноглобулинов класса G, A, M.

 

Перед работой все компоненты набора выдержали при комнатной температуре не менее 30 мин. В это время приготавливали на 5 стипов рабочие растворы. Приготовление промывочного раствора: брали 8 мл ФСБ-Т и до      0,2 мл дистиллированной воды. Приготовление рабочего раствора для разведения сывороток (РРС): 8 мл РРС и до 200 мл дистиллированной воды. Приготовление рабочего раствора коньюгата (РРК): 0,4 мл коньюгата и 3,6 мл РРК. Приготовление рабочего раствора ТМБ: 0,2 мл ТМБ и 4 мл субстратный буферный раствор (СБР).

За 30 мин до работы развели исследуемые сыворотки в 1000 раз: на        5 стрипов брали 8 мл РРС и 0,2 мл дистиллированной воды. В лунки первого ряда планшета микробиологической пипеткой вносили по 0,31 мл РРС и      0,01 мл сыворотки, тщательно перемешали наконечником пипетки, избегая образования пены. Далее из этих лунок отбирали по 0,01 мл, разведенной в      32 раза сыворотки и добавляли в следующий ряд лунок с 0,31 мл РРС, тщательно перемешивали.

Во все лунки стрипов вносили по 0,1 мл РРС. В первый стрип вносили по 0,02 мл калибровочных и контрольного образцов. В остальные лунки вносили по 0,02 мл разведенных анализируемых сывороток, каждый раз меняя наконечник.

Стрипы закрыли липкой лентой и инкубировали 30 мин в термостате при 37 °С. По окончании инкубации сняли липкую пленку и поместили в сосуд с дезинфицирующим раствором. Содержимое лунок удалили в сосуд с дезинфицирующим раствором и промыли планшет 5 раз промывочным раствором (ФСБ-Т) с помощью многоканальной пипетки. При этом в каждую лунку вносили не менее 0,35 мл жидкости в процессе одного промывания. По окончании промывки остатки влаги из лунок тщательно удалили, постукивая перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге.

Затем в каждую лунку вносили по 0,1 мл РРК, стрипы закрыли липкой пленкой и инкубировали в течении 30 мин в термостате при 37 °С. После инкубации стрипы обработали, как описано выше. После во все лунки стрипов вносили по 0,1 мл рабочего раствора ТМБ. Стрипы закрыли липкой пленкой и инкубировали в термостате в течение 15 мин при 25 °С.

На последнем этапе, после инкубации, во все лунки стрипов вносили по 0,1 мл «Стоп-реагента» и производили регистрацию результатов с помощью спектрофотометра, измеряя OD в двухволновом режиме: основной фильтр – 450 нм, референс-фильтр – в диапазоне от 620 до 650 нм.

Измерение OD производили в один прием во всех использованных лунках планшета через 2 или 3 мин после остановки реакции.

По результатам измерения рассчитывали средние арифметические значения оптической плотности OD для дублей. Строили калибровочный график зависимости OD от концентрации Ig, по которому определяли содержание Ig в контрольном образце и в анализируемых образцах.

 

 

2.14 Иммуносорбция

 

     

В основе метода аффинной хроматографии лежат биологически важные взаимодействия, происходящие на поверхности белковых молекул. При аффинной хроматографии используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определенный белок [54]. Однако главным недостатком до определенного времени была узкая специфичность таких систем очистки – каждая система могла использоваться только для очистки лишь единичного белка. Разработанный в конце двадцатого века метод использования аффинных лигандов для очистки позволил преодолеть этот недостаток аффинной хроматографии, сделав ее универсальной. Аффинные лиганды представляют собой полипептидные вставки, встраиваемые в структуру целевого рекомбинантного белка с С- или N-конца, и имеющие высокое сродство к сорбенту. Их использование позволяет производить одностадийную высокоэффективную очистку различных целевых белков из сложной смеси, используя при этом одну и ту же систему аффинной хроматографии. Более того в некоторых случаях использование аффинного лиганда может способствовать улучшению растворимости целевого белка [51].

Связываемые иммобилизованным субстратом молекулы фермента можно элюировать концентрированными растворами субстрата в свободной форме, а молекулы, связанные с иммобилизованными антителами, можно элюировать за счет диссоциации комплекса Аг-Ат концентрированными растворами соли или растворами низкого или высокого рН. Однократная хроматография на такой колонке позволяет зачастую достигнуть очень высокой степени очистки препарата [55].

Аффинная хроматография является мощным средством для очистки многих белков в плазме крови человека в исследовательских целях.

Для специфического удаления Ат в сыворотки крови широко используют иммуносорбенты – нерастворимые носители, на которых фиксирован Аг. Одним из таких сорбентов является сефароза-4В, которая использовалась для очистки сыворотки крови от IgG. Через такой сорбент пропускают кровь или плазму, в процессе чего и достигают эффекта очищения от конкретного агента (рисунок 30).

 

 

комплекс Ат-лиганды на сефарозе-4B

антитела

сефароза-4В

 

 

Рисунок 30 – Иммуносорбция на сефарозе-4В

 

Отличие этого метода от других методик заключается в способности сорбента извлекать из крови строго определенные компоненты: аутоантитела, иммунные комплексы, ревматоидный фактор и Ig, которые вызывают развитие иммунологических, аутоиммунных заболеваний [55].

Так как в гуморальный иммунитет не входят присутствующие в сыворотке крови Ig, то необходимо было очистить сыворотку от них. Данный способ проводился с помощью иммуносорбции на сефарозе-4В (рисунок 31).

 

 

Рисунок 31 – Постановка иммуносорбции

 

Перед началом очистки необходимо было приготовить рабочие растворы: раствор для посадки и раствор для элюции. Для этого делали навески NaCl 8,775 мг и натрий фосфат 1,82 мг, необходимые для приготовления раствора для посадки, умножая на соответствующий объем (10 мл) дистиллированной воды. Для достижения рН 6,0 пользовались рН-метром. Измерения производили по воздуху. Для раствора для элюции с рН 2,5 делали навеску 5,85 мг NaCl и 8,2 мг натрий-ацетат умноженные на 10 мл дистиллированной воды. Использовали подкислитель соляную кислоту. Раствор для хранения использовали тот же, отобранный после первого центрифугирования.

На первом этапе в микропробирки дозатором отбирали по 0,3 мл сорбента S-S Рgg («Имтек», Россия), центрифугировали при 13,5 тыс об/мин 1мин. На третьем этапе удаляли раствор для хранения (около 0,15 мл) в отдельный флакон и добавляли 0,85 % NaCl равный количеству убранного супернатанта (около 0,2 мл) и снова центрифугировали. Далее удалив супернатант, добавляли 0,3 мл раствора для посадки и инкубировали на шейкере при 37 °С на 4000 об/мин 15 мин. После инкубации встряхнули на вортексе несколько секунд и центрифугировали. Затем добавили 0,3 мл исследуемой сыворотки и снова вортексировали. Инкубировали на шейкере    15 мин. Снова центрифугировали 5 мин. После чего отбирали сыворотку, очищенную от Ig, и замораживали. А к оставшемуся осадку добавляли 0,15 мл раствора для элюции и вортексировали. Далее центрифугировали 5 мин и убирали супернатант. Снова добавляли раствор для элюции, вортексировали и центрифугировали. На последнем этапе, удалив супернатант, добавляли раствор для хранения, отобранный на втором этапе, и ставим в холодильник при 4 °С для хранения.

 

3 Обсуждение результатов

 

3.1 Оценка бактерицидной активности сыворотки крови с помощью люминесцирующих бактерий

 

 

В основе биолюминесцентного метода лежит оценка изменения (снижения) интенсивности БИ после воздействия анализируемой сыворотки крови. При этом важными особенностями люминесцентных тест-систем, выгодно отличающими их от прочих инструментов биоиндикации, являются быстродействие, точность и чувствительность к интегральному действию поллютантов [46]. Новые возможности исследования БАСК возникли в результате создания широкой панели люминесцирующих рекомбинантных штаммов на основе представителей вида E.coli, традиционно использующихся при реализации бактериологических и нефелометрических технологий определения БАСК [34]. Данные штаммы, несущие luxCDABE гены природных светящихся микроорганизмов, демонстрировали прямую зависимость между уровнем подавления БИ и числом погибших клеток [47], обеспечивая экспрессность и технологичность данной методики по сравнению с классическими технологиями.

Однако сыворотка крови обладает широким спектром бактерицидных агентов, действующих на различные клеточные структуры (в первую очередь барьерные), в связи с чем адекватным подходом к оценке ее бактерицидной активности является использование микроорганизмов, различающихся по типу строения клеточной стенки.

Так количественный учет интенсивности БИ штаммов E.coli lux+ и B.subtilis lux+ при контакте с индивидуальными сыворотками 30 здоровых доноров позволил констатировать как общность тенденции, так и значимые особенности реагирования каждого из названных сенсорных микроорганизмов, потенциально определяемые различиями строения поверхностных структур клеток-мишеней.

Результатом воздействия сывороток крови на уровень БИ E.coli lux+ стало выраженное подавление интенсивности свечения, характеризующееся достаточно широким диапазоном итоговых значений: от 15,76 % до 85,17 % от соответствующего контроля (рисунок 32 А). При этом сопоставление полученных данных с определенным с помощью бактериологического метода количеством клеток E.coli lux+, сохранивших свою жизнеспособность при подобном воздействии, позволило зафиксировать между ними достоверную положительную корреляционную взаимосвязь (r = 0,530; P < 0,01), подтверждающую универсальность причин подавления БИ бактериальных клеток-мишеней.

В свою очередь контакт B.subtilis lux+ с исследованными образцами сывороток крови во всех случаях также вел к выраженному подавлению уровня свечения, к 30-ой минуте контакта переводящему его в относительно узкий диапазон от 64,52 % до 79,42 % от контрольных значений (рисунок 32 Б). В свою очередь параллельно оцененное бактериологическим методом количество клеток, сохранивших свою жизнеспособность при подобном воздействии, позволило зафиксировать сходное ассиметричное распределение результативного параметра. При этом величины остаточной БИ и количества жизнеспособных клеток B.subtilis lux+ вновь оказывались связанными между собой достоверным положительным коэффициентом корреляции (r = 0,372;      P < 0,05), соответствующим экспериментально зафиксированному ассиметричному распределению результативных параметров.

 

 

Рисунок 32 – Соответствие величин подавления свечения E.coli lux+ (А) и B.subtilis lux+ (Б) при воздействии 30 индивидуальных сывороток крови (по оси ординат, %) от интенсивности развивающегося в данных условиях бактерицидного эффекта (по оси абсцисс, %).

 

Однако, несмотря на сонаправленность эффектов сывороток крови на уровень свечения E.coli lux+ и B.subtilis lux+, их количественная выраженность для каждой индивидуальной сыворотки имела достаточно выраженные различия, в результате чего параметры изменения БИ двух сравниваемых микроорганизмов во всей анализируемой выборке оказывались корреляционно несвязанными (P > 0,05). Сказанное потребовало детализации причин регистрируемых эффектов с акцентом на выявление зависимостей реагирования каждого из использованных сенсорных штаммов от детализированного компонентного состава воздействующих сывороток крови, предварительно оцененного с использованием представительного ряда иммунохимических методов.

 

 

3.2 Оценка влияния бактерицидных факторов сыворотки крови на люминесцирующие бактерии

 

 

Сыворотка крови в своем составе содержит ряд компонентов, которые по отношению к температуре были поделены на две группы – термолабильные (альфа-лизины) и термостабильные (бета-лизины) [10]. При этом первая группа в последующих работах была ассоциирована с белками системы комплемента, а вторая – с катионными антимикробными пептидами.

Изучаемые образцы сыворотки крови были нами проанализированы на содержание иммуноглобулинов классов A, M, и G, активность комплемента и концентрацию отдельных компонентов данной системы (белков C3, C4, C5 и фактора H), лизоцима, бета-лизина и специфических Ат к поверхности бактериальных клеток E.coli и B.subtilis, а также на БАСК (таблица 2).

Полученные данные были обработаны методом корреляционного анализа, при этом выборка составила 30 образцов и был рассчитан коэффициент корреляции по Стьюденту. При этом было получено 15 коэффициентов корреляции со значением Р < 0,05 и 9 со значением Р < 0,01, в соответствии с приложением Б.

Проведение подобного анализа применительно к E.coli lux+ позволило говорить о структурированной «корреляционной плеяде», связывающей интенсивность подавления свечения с активностью целого ряда бактерицидных факторов и систем (рисунок 33). При этом наиболее значимый коэффициент корреляции (r = - 0,427; P < 0,01) был зафиксирован между остаточной биолюминесценцией и характеризуемой значениями СН50 общей активностью комплемента, что хорошо согласуется с представлениями о ведущей роли данной системы в развитии бактерицидного эффекта сывороток крови в отношении грамотрицательных микроорганизмов с соответствующим подавлением уровня БИ.

 

Таблица 2 – Показатели изученных образцов сывороток крови

 

 

Несколько меньший (r = - 0,395), но значимый (P < 0,01) коэффициент корреляции связывал величины подавления свечения E.coli lux+ с содержанием в исследуемых сыворотках бактериолитического фермента лизоцима. При этом существование подобной зависимости могло определяться как собственной биологической активностью данного фактора, вовлекаемого в процесс разрушения бактериальных клеток после формирования мембраноповреждающих комплексов из «поздних» белков системы комплемента, так и особенностями исследуемой выборки сывороток крови, в которых присутствие лизоцима положительно коррелировало с активностью названной системы (r = 0,308; P < 0,05) и количественным содержанием входящих в нее С3- и С5-компонентов (r = 0,309 и r = 0,295; P < 0,05). В свою очередь сами названные компоненты, а также вовлекаемый в альтернативный путь активации системы комплемента фактор Н, также объединялись между собой положительными корреляционными связями (r = 0,339; P < 0,05 и            r = 0,516; P < 0,01).

 

 

Обозначения: непрерывные линии – прямые; прерывистые – обратные корреляционные связи; * – P < 0,05; ** – P < 0,01.

 

Рисунок 33 – Корреляционные зависимости, связывающие остаточную биолюминсценцию E.coli lux+ и B.subtilis lux+ при воздействии сыворотки крови с присутствием в них отдельных бактерицидных факторов и систем.

 

На этом фоне интенсивность подавления свечения B.subtilis lux+ достоверно коррелировала только с количественным присутствием в исследуемых сыворотках бета-лизина (r = - 0,481; P < 0,01), тем самым полностью соответствуя представлениям о спектре антимикробной активности данного фактора. Одновременно количественное содержание бета-лизина демонстрировало обратные взаимосвязи с входящими в описанную выше «корреляционную плеяду» лизоцимом (r = – 0,382; P < 0,01) и фактором Н        (r = - 0,341; P < 0,01), что характеризовало бактерицидные системы исследуемых сывороток крови, определяющие их активность в отношении использованных грамположительного и грамотрицательного микроорганизмов, не только как независимые, но и, в известной степени, как альтернативные.

Таким образом, ведущим компонентом, оказывающим воздействие на грамотрицательные бактерии (штамм E.coli lux+) является система комплемента, белки которой формируют на наружной мембране МАК, в результате чего через сформированные поры проходит лизоцим, разрушающий связи между N-ацетилмурамовой кислотой и N-ацетилглюкозамином, что ведет к последующей гибели бактериальной клетки. С другой стороны, грамположительные бактерии демонстрируют чувствительность лишь к КАП (b-лизинам) в силу особенностей организации своих поверхностных структур, одновременно демонстрируя относительную устойчивость к литическому действию прочих гуморальных бактерицидных факторов [56].

Детализация данного положения была получена с использованием факторного анализа, позволившего структурировать причины подавления свечения E.coli lux+ и B.subtilis lux+ в виде трех основных факторов, каждый из которых объяснял не менее 10 %, а в сумме – около половины дисперсии анализируемой выборки, и характеризовался положительными или отрицательными значениями факторных нагрузок (ФН), ассоциирующих его с компонентным составом изученных сывороток крови (таблица 3).

 

Таблица 3 – Факторный анализ

 

 

Первым из них по значимости (абсолютное значение 2,716; объясняемая дисперсия 18,11 %) был фактор с высоким номинальным значением ФН = 0,474 для параметра угнетения интенсивности свечения B.subtilis lux+ при близкой к нулю ФН для E.coli lux+ (рисунок 34). При этом структура данного фактора включала присутствие b-лизина (ФН = 0,608), специфических Ат к поверхности B.subtilis (ФН = 0,321), а также иммуноглобулинов классов А и М (ФН = 0,262 и 0,280), что позволяет предполагать существование дополнительного опосредованного ими механизма повреждения соответствующих клеток-мишеней. В то же время присутствие в сыворотках подобного типа С3- и        С5-компонентов комплемента, фактора Н и лизоцима характеризовалось высокими отрицательными значениями ФН от - 0,504 до - 0,711.

 

 

Обозначения: 1 – интенсивность свечения B.subtilis lux+; 2 – интенсивность свечения E.coli lux+; 3 – IgM; 4 – IgG; 5 – IgA; 6 – Ат к E.coli; 7 – Ат к B.subtilis; 8 – C3; 9 – C4; 10 – C5; 11 – фактор H; 12 – CH50; 13 – лизоцим; 14 – b-лизин.

По осям – значения соответствующих ФН.

 

Рисунок 34 – Структура ведущих факторов, описывающих зависимость подавления свечения B.subtilis lux+ от компонентного состава воздействующих на них сывороток крови.

 

На этом фоне второй по значимости фактор, объясняющий 15,61 % дисперсии анализируемой выборки и имеющий собственное значение 2,341, демонстрировал высокое номинальное значение ФН = 0,720 для параметра угнетения интенсивности свечения E.coli lux+, но не для B.subtilis lux+ (рисунок 35). Он же характеризовался положительными значениями ФН для параметра активности системы комплемента (ФН = 0,518), а также суммарного содержания иммуноглобулинов классов А, М, G (0,513; 0,308 и 0,629) и лизоцима (ФН = 0,437), что соответствует перечню основных сывороточных компонентов, запускающих и дополняющих комплемент-зависимую бактерицидность в отношении грамотрицательных микроорганизмов. Сказанное позволило обозначить нам данный фактор как «фактор сывороток, проявляющих преимущественную активность в отношении E.coli».

 

 

 

Обозначения: 1 – интенсивность свечения B.subtilis lux+; 2 – интенсивность свечения E.coli lux+; 3 – IgM; 4 – IgG; 5 – IgA; 6 – Ат к E.coli; 7 – Ат к B.subtilis; 8 – C3; 9 – C4; 10 – C5; 11 – фактор H; 12 – CH50; 13 – лизоцим; 14 – b-лизин.

По осям – значения соответствующих ФН.

 

Рисунок 35 – Структура ведущих факторов, описывающих зависимость подавления свечения E.coli lux+ от компонентного состава воздействующих на них сывороток крови.

 

Наконец третьим по значимости (абсолютное значение 1,721; объясняемая дисперсия 11,47 %) был фактор, описывающий сыворотки, биологическая активность которых распространялась как на B.subtilis lux+    (ФН = 0,475), так и на E.coli lux+ (ФН = 0,355). При отрицательных или стремящихся к нулю значения ФН для общего содержания иммуноглобулинов классов А, М, G, своеобразие данного фактора определялось присутствием специфических Ат к поверхности как B.subtilis (ФН = 0,345), так и E.coli        (ФН = 0,271), что позволило обозначить его как «фактор специфической бактерицидности» (рисунок 36). При этом, условием для формирования подобного запускаемого в присутствии Ат эффекта, являлось значимое присутствие в подобных сыворотках С3-, С4- и С5-компонентов комплемента, определяемой ими активности данной системы, а также дополняющих их действие лизоцима (значения ФН от 0,257 до 0,616).

 

 

 

Обозначения: 1 – интенсивность свечения B.subtilis lux+; 2 – интенсивность свечения E.coli lux+; 3 – IgM; 4 – IgG; 5 – IgA; 6 – Ат к E.coli; 7 – Ат к B.subtilis; 8 – C3; 9 – C4; 10 – C5; 11 – фактор H; 12 – CH50; 13 – лизоцим; 14 – b-лизин.

По осям – значения соответствующих ФН.

 

Рисунок 36 – Структура ведущих факторов, описывающих зависимость подавления свечения как B.subtilis lux+ так и E.coli lux+ от компонентного состава воздействующих на них сывороток крови.

 

Таким образом, полученные данные подтверждают существование двух различных антибактериальных систем, определяющих выраженность ингибирующего эффекта сыворотки крови на уровень БИ E.coli lux+ и  B.subtilis lux+ и связанных с преимущественной активностью системы комплемента и лизоцима в отношении грамотрицательных, а b-лизина в отношении грамположительных микроорганизмов.

Поэтому более адекватным подходом к решению задачи биолюминесцентного тестирования БАСК является использование люминесцирующих рекомбинантных штаммов на основе B.subtilis и E.coli с клонированными в них полными lux-оперонами морских или почвенных люминесцирующих бактерий. При этом свойства доноров обеспечивают самодостаточность подобных генетических конструкций для обеспечения высокого уровня конституитивной БИ без внесения каких-либо дополнительных субстратов для E.coli или внесение деканаля для B.subtilis [46, 47].

С другой стороны, свойства реципиентов (в первую очередь, особенности строения их поверхностных структур) обуславливают высокую чувствительность к присутствующим в сыворотке крови бактерицидным факторам, что является одним из ведущих требований к тест-штаммам, используемым при тестировании БАСК. Эффект действия сыворотки крови на рекомбинантные штаммы E.coli с клонированными lux-оперонами P.leiognathi заключался в прогрессирующем снижении уровня свечения, по увеличению концентрации действующего агента и времени контакта, что связано с гибелью бактериальных клеток. При этом в развитии подобных эффектов принимал участие целый ряд присутствующих в сыворотке крови бактерицидных факторов, частично воспроизводящих тушение БИ и по своей значимости убывающих в ряду «комплемент → b-лизин → лизоцим» [46].

Однако третий фактор, описывающий сыворотки, показал наличие влияния специфических компонентов, а именно наличие Ig к поверхности клеток E.coli и B.subtilis на уровень свечения данных штаммов, в связи с чем следующим этапом нашей работы стала сравнительная оценка активности молекулярных бактерицидных факторов сыворотки крови нативной и после очистки от Ig.

 

 

3.3 Изучение активности молекулярных бактерицидных факторов сыворотки крови после иммуносорбции

 

 

Процедура иммуносорбции позволяет осуществить очистку сыворотки крови от присутствующих в ней Ig, в первую очередь иммуноглобулинов класса G. В основе метода лежит использование нерастворимого матрикса, ковалентно связанного со специфичными лигандами, которые присоединяют определенный белок [54]. Аффинные лиганды представляют собой полипептидные вставки, встраиваемые в структуру целевого рекомбинантного белка с С- или N-конца, и имеющие высокое сродство к сорбенту. Их использование позволяет производить одностадийную высокоэффективную очистку различных целевых белков из сложной смеси, используя при этом одну и ту же систему аффинной хроматографии. Более того в некоторых случаях использование аффинного лиганда может способствовать улучшению растворимости целевого белка [51].

В результате проведенной иммуносорбции образцов сыворотки крови с использованием сефарозы-4В, несущей рекомбинатный стрептококковый белок G, было зарегистрировано снижение концентрации иммуноглобулина класса G на 68,56%.

 

 

Рисунок 37 – Концентрация IgG (мг/мл) в сыворотке крови до и после иммуносорбции

 

При определении Ат к поверхности бактериальных клеток наблюдалось падение концентрации даных Ат на 23,75 % для E.coli, а для B.subtilis на 22,35 %.

Последующая оценка активности сыворотки крови после иммуносорбции показала снижение ее бактерицидной активности для E.coli на 69,37 %, а для B.subtilis на 39,40 % что связано с выключением классического пути активации системы комплемента (рисунок 38).

 

 

Рисунок 38 – Активность сыворотки крови после иммуносорбции по отношению к бактериям

 

Данные результаты подтверждают бактерицидный вклад действия Ат на жизнеспособность клеток штамма E.coli.

Аналогично были исследованы БАСК и активность b-лизина. Показатель БАСК выявил также снижение данного параметра на 30,17 %, а активность b-лизина практически не изменилась.

При оценке общей активности комплемента (CH50) было выявлено падение его активности после иммуносорбции на 23,36 %, что указывает на усиление антибактерицидного действия при совместной работе СН50 и Ig (рисунок 39).

 

 

Рисунок 39 – Оценка активности комплемента до и после иммуносорбции

Заключение

 

 

Исследование и оценка бактерицидных систем человека и животных, формирующих систему их неспецифического врожденного иммунитета, остается одной из важных задач современной биологии и медицины.

Установлено, что при воздействии сыворотки крови человека на штаммы B.subtilis и E.coli наблюдается подавление свечения во всех случаях.

При оценке влияния компонентного состава сыворотки крови на параметры свечения B.subtilis и E.coli было выяснено, что на БИ B.subtilis наибольшее влияние оказывает b-лизин, на E.coli – лизоцим и общий компонент комплемента.

Выявлено три ведущих фактора бактерицидности сыворотки крови. Первые два описывают неспецифическое подавление свечения B.subtilis или E.coli. Третий фактор обусловленный действием специфических Ат.

Совокупность полученных результатов позволяет констатировать достаточную селективную чувствительность рекомбинантных штаммов B.subtilis lux+ и E.coli lux+ к названным бактерицидным факторам, что позволяет рекомендовать их взаимодополняющее использование в составе панели бактериальных люминесцирующих биосенсеров, ориентированных на оценку входящих в систему неспецифического врожденного иммунитета гуморальных и клеточных бактерицидных систем человека и животных. При этом единым принципом функционирования подобной диагностической панели является количественная оценка подавления свечения бактериальных клеток-мишеней в присутствии исследуемой сыворотки крови, а требования к ее составу определяются наличием рекомбинантных люминесцирующих микроорганизмов, особенности строения поверхностных структур каждого из которых позволяет относительно специфично оценивать состоятельность определенной бактерицидной системы.

Поэтому продолжение исследований в данном направлении позволит существенно модернизировать и унифицировать ряд лабораторных технологий, позволив на основе анализа световой эмиссии в режиме реального времени получать информацию об активности гуморальных и клеточных бактерицидных систем в большом количестве биологических проб сложного компонентного состава, сократив время проводимого анализа, а также существенно повысив производительность и технологичность выполняемых клинико – лабораторных исследований.

По данным исследовательской работы была опубликована статья «» в журнале , указанной в приложении В.

Список использованных источников

 

 

• Преснякевич, А. Г. Основы иммунологии: курс лекций / А.Г. Преснякевич. – М., 2007. – 202 с.
• Gura, T. Innate immunity: ancient system gets new respect / T. Gura // Science. – 2001. – Vol. 291. – № 5511. – P. 2068 – 2070.
• Nizet, V. Surviving innate immunity / V.Nizet, R.L. Gallo // Trends in Microbiology. – 2002. – Vol. 10. – № 8. – P. 358 – 359.
• Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии: учеб. для студентов / под ред. А.А. Воробьева, Ю.С. Кривошеина. – М.: Мастерство: Высш. шк. 2001. – 224 с.
• Бухарин, О. В. Медицинская микробиология (компендиум): учебное пособие / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвяцов.: Екатеринбург: УрОРАН, 2009. ISBN 978 – 5 – 7691 – 2033 – 6.
• Борисов, Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология: учебник / Л.Б. Борисов. – М., 2002. – 217 с.
• Воробьева, А. А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология / А.А. Воробьева. – М., 2006. – 197 с.
• Хаитов, Р. М. Иммунология. Медицина: учебник / Р.М. Хаитов. 2000. – 437 с.
• Иммунология / учредитель: Б. В. Пиненгин, С. В. Дамбаева, 2007. – № 2.
• Микробиология / учредитель: Н. Г. Плехова. 2006. – № 6. – С. 89 – 96.
• Галактионов, В. Г. Иммунология: учебник / В.Г. Галактионов – 3-е изд., испр. и доп. – М.: Академия, 2004. – 528 с.
• Ройт, А. Иммунология: учебник: пер. с англ. / А. Ройт, Д. Бростофф, Д. Мейл. – М.: Мир, 2000. – 593 с.
• Шигина, Ю. В. Иммунология: учебное пособие / Ю.В. Шигина: Издательство РИОР. 2007. – 43 с.
• Hancock, R. E. Cationic peptides: effectors in innate immunity and novel antimicrobials / R.E. Hancock. Lancet Infect. Dis. 2001. – № – 156 р.
• Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms / M. Zasloff. Nature. – 2002. – V.415. – 389 р.
• Клиническая биохимия: классический университетский учебник / под редакцией В. А. Ткачука. – М.: Изд-во Моск. гос. ун-та и Проспект, 2002. – 515 с.
• Ganz, T. Antimikrobielle Peptide von Wirbeltieren / T. Ganz, R.I. Lehrer. Opin. Immunol. 1998. – № – 44 р.
• Mackintosh, J. A. In Developmental and Comparative Immunology: A gloverin – like antibacterial protein is synthesized in Helicoverpa armigera following bacterial challenge / J.A. Mackintosh, A.A. Gooley, P.H. Karuso, A.J. Beattie. 2000.
• Hancock, R. E. Cationic antimicrobial peptides: towards clinical applications / R.E. Hancock. Expert. Opin. Investig Drugs. 2000. – 9. – P. 1723 – 1729.
• Suresh, A. Modelling study of dimerization in mammalian defensins / А. Suresh, C. Verma.: BMC Bioinformatics 7. 2006. – 17 р. DOI: 1186/1471 – 2105 – 7 – S5 – S17. PMID 17254301.
• Schneider, J. J. Menschliche Defensine / J.J. Schneider, A. Unholzer, M. Schaller, M. Schäfer – Korting, H.C. Korting. 2005. 9. April. Review. PMID 15821901.
• Bonnart, C. Kallikrein mediated proteolysis regulates the antimicrobial effects of cathelicidins in skin / С. Bonnart, Р. Descargues, А. Hovnanian. 2006. – Р. 2068 – 2080.
• Sallenave, J. M. The role of secretory leukocyte proteinase inhibitor and elafin (elastase – specific inhibitor/skin – derived antileukoprotease) as alarm antiproteinases in inflammatory lung disease. Respir. Res. 1 (2). 2003. – Р. 87–92.
• Бухарин, О. В. Система бета – лизина и ее роль в клинической и экспериментальной медицине / О.В. Бухарин, Н.В. Васильев. Томск, ТГУ, 1977. – 6 с.
• Бухарин, О. В. Антимикробный белок тромбоцитов. / О.В. Бухарин, В.А. Черешнев, К.Г. Сулейманов. Екатеринбург: УрО РАН, 2000. – 18 с.
• Nguyen, L. T. Structural studies and model membrane interactions of two peptides derived from bovine lactoferricin / L.T. Nguyen, D.J. Schibli and H.J. Vogel. J. Pept. Sci. 11, 2005. – Р. 379–389.
• Gifford, J. L. Лактоферрицин: пептид лактоферрина с антимикробными, антивирусными, антиканцерными, и иммунологическими свойствами / J.L. Gifford, H.N. Hunter, and H.J. Vogel.
• Samuelsen, O. Anti – complement effects of lactoferrin – derived peptides / O. Samuelsen, H.H. Haukland, H. Ulvatne, L. Vorland. H FEMS Immunol. Med. Microbiol. 41. 2004. – Р. 141–148.
• Strom, M. B. Important structural features of 15 – residue lactoferrin derivatives and methods for improvement of antimicrobial activity / M.B. Strom, B.E. Haug, O. Rekdal, M.L. Skar, W. Stense et al. Biochem. Cell Biol. 80, 2002. –Р. 65–74.
• Барановский, П. В. Содержание сывороточного лизоцима, ß – лизинов и гетерофильных антител / П.В. Барановский, Н.Д. Лобанова. Лаб. дело. – 1981. – № 12. – С. 750 – 751.
• Бухарин, О. В. Лизоцим и его роль в биологии и медицине / О.В. Бухарин, Н.В. Васильев. Томск: Изд – во Томского университета, 1974. – 209 с.
• Бухарин, О. В. Микробные ингибиторы лизоцима / О.В. Бухарин, А.В. Валышев. ЖМЭИ. 2006. – №4. – С. 8 – 13.
• Биргер, М. С. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / М.С. Биргер. М., 1982. — 464 с.
• Кондратьева, И. А. Практикум по иммунологии: учебное пособие для ВУЗов / И.А. Кондратьева: – М.: Академия. 2004.
• Дерябин, Д. Г. Бактериальная биолюминесценция: фундаментальные и прикладные аспекты / Д.Г. Дерябин; Оренбургский гос. ун-т. – 2008. – 322 с.
• Бухарин, О. В. Фотонефелометрический метод определения бактерицидной активности сыворотки крови / О.В. Бухарин, В.Л. Созыкин. В сб.: Факторы естественного иммунитета, Оренбург. 1979. – С. 43 – 45.
• Кишкун, А. А. Иммунологические исследования и методы диагностики инфекционных заболеваний в клинической практике / А.А. Кишкун: – Медицинское информационное агентство. 2009.
• Дерябин, Д. Г. Определение бактерицидной активности сыворотки крови с использованием рекомбинантных штаммов Escherichia coli / Д.Г. Дерябин, Е.Г. Поляков. Клиническая лабораторная диагностика. 2005. – № 2. – С. 53 – 55.
• Дьячкова, С. Я., Лоншакова А. А. Чашечный способ количественной оценки бактерицидных свойств химиотерапевтических препаратов. – ЦНТИ: информационный листок / ВЕСТНИК ВГУ. Серия химия, биология, фармация. 2003. – № 1. – С. 96 – 98.
• Никитин, В. Ю. Основные принципы и диагностические возможности проточной цитометрии в клинической иммунологии и эндокринологии / В.Ю. Никитин. 2000.
• Пособие для врачей. Применение проточной цитометрии для оценки функциональной активности иммунной системы человека.: Москва, 2001.
• Fritschy, J. M. Immunofluorescence / J. M. Fritschy, Hartig, W. 2001.
• Baldwin, T. Structure, folding and mechanism of bacterial luciferase / T. Baldwin, M. Zeigler, F. Raushel.: Bioluminescence and chemiluminescence. Perspective for the 21st Centrury. John Wiley & Sons, England. 2000. – P. 376 – 379.
• Roda, A. The possibility of detecting a few molecules using bioluminescence and chemiluminescence is exciting, especially in the context of miniaturized analytical devices. / A. Roda, M. Guardigli, E. Michelini et al. Anal. Chem. 2003. – P. 462 – 470.
• Barak, M. Determination of serum bactericidal activity with the aid of luminous bacteria / M. Barak, S. Ulizyr, D. Merzbach. J. Clin. Microbiol. 1983. – Vol. 18. – № 2. – P. 248 – 253.
• Кратасюк, В. А. Использование светящихся бактерий в биолюминесцентном анализе / В.А. Кратасюк, И.И. Гительзон. Успехи микробиологии. 1987. – Т. 21. – С. 3 – 30.
• Дерябин, Д. Г. Особенности использования биолюминесцентных тест-систем при исследовании абиотических сред и биологических жидкостей / Д.Г. Дерябин, Е.Г. Поляков, И.Ф. Каримов. Вестник Оренбургского государственного университета. – № 5. – С. 101 – 104.
• Virta, M. Determination of complement – mediated killing of bacteria by viability staining and bioluminescence / M. Virta, S. Lineri, P. Kankaanpaa et al. Lilius Appl. Environ. Microbiol. 1998. – Vol. 64. – № 2. – Р 515 – 519.
• Дерябин Д. Г. Бактериальная биолюминесценция: фундаментальные и прикладные аспекты / Д.Г. Дерябин; Оренбургский гос. ун-т. 2008. – 322 с. – ISBN.
• Rodicheva, E. K. Biokhim / E.K. Rodicheva, S.E. Medvedeva, G.A. Vydryakova, et al. Mikrobiol., 34, 1998. – № 1. – Р. 75 – 82.
• Belkin, S. Curr. Oph. Microbiol., 6. 2003. – № – P. 206 – 212.
• Deryabin, D. G. Polyakov E. G. and Karimov I. F. Vestn. Orenburg Gos. Univer. 2004. – № – Р. 101 – 104.
• Саруханов, В. Я. Метод определения бета – литической активности крови сельскохозяйственных животных / В.Я. Саруханов, Н.Н. Исамов, П.Г. Царин // Сельскохозяйственная биология. 2007. – № 4. – С. 123 – 125.
• Affinity chromatography principles and metods. – Uppsala. Sweden. 1976.
• Friemel, H. Immunologische Arbeitsmethoden / H. Friemel. // Bereich Medizin der Wilhelm. Veb Gustav Fischer Verlag Jena. 1984. – 472 P.
• Саруханов В.Я., Исамов Н.Н., Царин П.Г. Метод определения бета-литической активности крови сельскохозяйственных животных // Сельскохозяйственная биология. – 2007. – № 4. – С. 123 – 125.

 

 Скачать:

DIPLOM-Vosstanovlen.doc

 

Prilozhenie-A.docx