Привет студент

При изучении дифференцировки у многоклеточных возникает совершенно особая проблема. И если, что вполне вероятно, основополагающий биохимический механизм любого типа дифференцировки может быть сходным у одноклеточных и у многоклеточных, то в последнем случае необходимо еще объяснить, как обеспечивается согласованная деятельность множества отдельных клеток. Кооперативный эффект может возникать двумя путями: если один и тот же стимул действует одновременно и одинаково на каждую клетку в отдельности или если клетки, взаимодействуя друг с другом, вместе вырабатывают общий ответ на любой стимул. Конечно, второе предположение намного вероятнее, и сейчас уже получены убедительные экспериментальные данные, показывающие, что взаимодействие клеток — это не просто способ, позволяющий клеткам одинаково реагировать на какой-либо стимул, но во многих случаях необходимое условие для осуществления самой дифференцировки. Например, как я уже рассказывал, зачаток поджелудочной железы зародыша мыши, помещенный в искусственную среду, при определенных условиях может дифференцироваться в функционирующую ткань поджелудочной железы. Если такой зачаток разрезать на мелкие кусочки и культивировать их отдельно, то дифференцировки эпителия в ткань поджелудочной железы не наблюдается. Если же эти кусочки вновь поместить так близко друг от друга, что они могут слиться в сплошную массу, то дифференцировка происходит. Аналогичное явление описано для других видов эпителия. Понятно, что в таких случаях дифференцировка не может осуществляться без совместной активности большого числа клеток и что одна клетка или небольшая группа клеток не в состоянии создать условия, необходимые для дифференцировки.

Определив, таким образом, две главные особенности дифференцировки, я хотел бы обсудить те отрывочные сведения, которые мы о них имеем, чтобы выяснить, можно ли на основе этих сведений сделать хоть какие-то выводы о механизмах, лежащих в основе дифференцировки. Помоему, наиболее четкие опыты по изучению этого процесса были поставлены на одноклеточных организмах: и, поскольку самые убедительные результаты были получены на ацетабулярии, нам придется вернуться к этой гигантской одноклеточной водоросли. Напомню, что у ацетабулярии в течение многих недель растет только стволик и лишь затем при благоприятных условиях происходит дифференцировка и образуется плодовое тело или зонтик, с помощью которого рассеиваются споры. Образование зонтика — это классический пример дифференцировки, когда в клетке происходят глубокие морфологические и биохимические сдвиги; этот процесс во всех отношениях сходен с образованием плодовых тел у родственных многоклеточных организмов. Я уже говорил, что рост стволика у ацетабулярии и полная дифференцировка видоспецифичного зонтика могут происходить спустя много времени после удаления клеточного ядра. Следовательно, мы вправе заключить, что у этого организма явно выраженная дифференцировка никак не может быть непосредственным результатом избирательной транскрипции генетического материала. Стволик растет в какое-то определенное время вовсе не потому, что в это время транскрибируются ответственные за него гены; также и зонтик формируется в соответствующее для него время вовсе не потому, что в это же время начинают считываться гены, контролирующие его рост. Очевидно, гены, участвующие в образовании стволика и зонтика, считываются задолго до возникновения этих структур. Опыты по преждевременной индукции формирования зонтика, о которых упоминалось ранее, показали, что транскрипция генов, ответственных за его образование, у отдельных видов ацетабулярии должна происходить по крайней мере за 70 дней до того, как обычно образуется зонтик; из опытов по накоплению и сохранению информации в цитоплазме клетки стало ясно, что матрицы для образования и стволика, и зонтика поступают в цитоплазму в течение большей части периода роста клетки. Более того, формирование зонтика можно задержать на неопределенно долгий срок, выращивая клетки в условиях недостаточной освещенности. При этом стволик продолжает расти и становится гораздо длиннее, чем всегда. При увеличении освещенности на таких необычно длинных стволиках могут образоваться зонтики, даже если из этих клеток предварительно удалили ядра. Отсюда ясно, что у ацетабулярии акт видимой дифференцировки осуществляется в цитоплазме на подготовленных заранее матрицах и что для этого присутствие соответствующих генов не обязательно.

В принципе у нас остаются три другие возможности: во-первых, дифференцировка может происходить благодаря неодновременной избирательной транскрипции тех или иных участков ДНК, так что разные матрицы синтезируются в разное время; во-вторых, дифференцировка может осуществляться в результате избирательной и неодновременной трансляции разных матриц; и, наконец, в-третьих, дифференцировку могут обеспечивать оба эти механизма вместе. Последнее предположение сейчас вполне обоснованно, и я обсуждал его в гл. IV, когда говорил о регуляции синтеза белка; и хотя совершенно очевидно, что дифференцировка включает такую форму регуляции, возникают еще две проблемы, которых я пока не касался. Большая часть работ последних лет по регуляции синтеза белка проводилась на таких системах, где сохранение любого изменения в синтезе белка зависит от постоянного присутствия стимула, который это изменение вызвал. Например, какая-то определенная малая молекула может индуцировать синтез какого-то белка, но стоит удалить из среды эту молекулу, как синтез белка немедленно прекратится, и, наоборот, другая малая молекула способна подавлять синтез какого-то белка, но, как только ее удаляют, синтез сразу же восстанавливается. Хотя совершенно ясно, что дифференцировка включает в себя подобные изменения, она включает, кроме того, такие изменения, которые сохраняются в клетках после удаления вызвавших их стимулов. В некоторых случаях исходный стимул запускает сложную цепь реакций, конечный результат которых — синтез специфичного белка — наблюдается через много часов или дней после исчезновения первичного стимула. Это явление эмбриологи называют детерминацией. Вторая характерная особенность дифференцировки состоит в том, что фенотипические изменения, вызванные в клетке определенным стимулом, сохраняются после его удаления во многих клеточных генерациях, а в некоторых случаях могут сохраняться неограниченно долго.

Исследователи, которые впервые занялись изучением дифференцировки, пришли к заключению, что процесс этот является результатом постепенных изменений в генетическом материале клетки. На эту мысль их навело простое наблюдение, что некоторые признаки очень устойчивы и могут сохраняться в течение многих клеточных генераций. В какой-то мере такая точка зрения подтверждается тем, что дифференцировка некоторых клеток сопровождается очевидными изменениями морфологии ядра и хромосом. Более современная и точная формулировка этого предположения звучала бы приблизительно так: дифференцировка — это результат изменений нуклеотидной последовательности в ДНК. В случае одной особой формы дифференцировки — образования антител клетками лимфоидного ряда — сейчас принято считать, что специфичность антител определяется какой-то формой соматической вариабельности в нуклеотидной последовательности ДНК этих клеток. Однако более общую теорию, согласно которой дифференцировка в целом происходит за счет изменений ДНК, теперь почти никто не поддерживает.

Дифференцировкой обычно называют процесс образования специализированных клеток, тканей и органов во время развития организма из оплодотворенного яйца. Чаще всего этот термин употребляют, когда говорят о многоклеточных организмах, и, следовательно, под ним подразумевается процесс возникновения из одной клетки — яйца — многочисленных клеток-потомков, гетерогенность которых возрастает по мере развития организма. Но эквивалентные в биологическом смысле процессы наблюдаются и у некоторых одноклеточных. В этом случае морфологической и функциональной специализации подвергается только часть клетки и в конце концов образуются структуры, подобные тем, которые имеются у многоклеточных организмов, но у последних они состоят из множества клеток. Поэтому я предлагаю называть дифференцировкой любой процесс специализации независимо от того, происходит ли он в одноклеточных или многоклеточных организмах. Хотя мы и употребляем термины «дифференцированный», «недифференцированный» и «дедифференцированный», тем не менее установить их точный эмпирический смысл совсем не так просто. Если считать яйцо недифференцированной клеткой, то тогда можно сказать, что клетки становятся дифференцированными по мере того, как они приобретают признаки, отличающие их как от самого яйца, так и друг от друга. Однако, поскольку уже две дочерние клетки, образующиеся после первого деления, отличаются от яйца, правда, всего лишь своими размерами, началом клеточной дифференцировки принято считать другое — возникновение выраженной гетерогенности у клеток-потомков. Конечно, это чистая условность. Само яйцо представляет собой продукт сложного процесса дифференцировки, протекающего в яичнике, и мы могли бы разработать иную терминологию, приняв за точку отсчета какую-то другую клетку. Но я буду придерживаться общепринятых представлений и считать недифференцированными клетками такие производные яйца, которые еще не приобрели заметных отличий, а дифференцированными — те, в которых они уже есть.

Гибридизация клеток, принадлежащих к разным видам

Существуют три основные проблемы: 1) природа и специфичность цитоплазматических сигналов, регулирующих синтез РНК в ядрах соматических клеток; 2) механизм репрессии синтеза ядерной РНК; 3) механизм передачи генетической информации из ядра в цитоплазму. Исследования начались в 1965 году с опыта, который мы поставили вместе с Дж. Ф. Уоткинсом. Мы показали, что вирус животных, после инактивации ультрафиолетовыми лучами, может быть использован для индукции слияния клеток мыши и человека и образования их гибридов. Мысль использовать для этой цели вирусы возникла в связи с наблюдениями, сделанными более ста лет назад. Давно известно, что при многих заболеваниях в пораженных тканях обнаруживаются многоядерные клетки. В медицинской литературе XIX века велась длительная и оживленная полемика о механизмах их образования. Многоядерные клетки находят главным образом в очагах поражений, вызванных некоторыми патогенными вирусами. В последнее десятилетие стало ясно, что, по крайней мере в некоторых случаях, вирус вызывает появление многоядерных элементов, индуцируя слияние отдельных клеток. Оставалось сделать всего один шаг, а именно узнать, нельзя ли использовать вирус для того, чтобы индуцировать слияние клеток разных типов, а также выяснить, будут ли жизнеспособными гибриды, если они вообще образуются. Поскольку при заражении живым вирусом гибриды могли погибнуть, обработку производили убитым вирусом. При этом оказалось, что вирус, инактивированный ультра-фиолетовыми лучами, можно использовать для индукции слияния дифференцированных и недифференцированных клеток разных видов и даже разных классов позвоночных. Такой метод дал возможность получать межвидовые гибридные клетки, которые длительное время жили в культуре и во многих случаях обладали способностью к неограниченному размножению. По этой причине они оказались удобной моделью для изучения ядерно-плазменных отношений и дали возможность поставить такие опыты, которые раньше были нереальны. Результаты некоторых опытов я намереваюсь обсудить.

Помимо регуляции транскрипции и трансляции, у высших клеток существуют три других способа регуляции, которые, по-видимому, влияют на проявление генетической информации. Это, во-первых, механизмы, регулирующие отделение матриц от ДНК, во-вторых, механизмы, контролирующие переход этих матриц через ядерную мембрану, и, в-третьих, механизмы, отбирающие для передачи в цитоплазму только какую-то часть матриц, синтезированных на ДНК. На основании результатов опытов, проведенных на бактериях, было сделано предположение, что процессы трансляции и транскрипции тесно связаны друг с другом, причем связь эта не ограничивается автоматическим прекращением трансляции с прекращением синтеза самой матрицы.

На электронных микрофотографиях препаратов разрушенных бактерий видно, что во время транскрипции к ДНК присоединяются рибосомы; опыты с меткой подтвердили, что в таких препаратах РНК, синтезированная на этой ДНК, действительно переносится на рибосомы. Это наблюдение обычно считают подтверждением гипотезы об участии рибосом в отделении матриц от ДНК у бактерий. Что касается клеток высших организмов, то по отношению к ним такое предположение вряд ли приемлемо. В ядрах высших клеток очень мало сформировавшихся рибосом, возможно, их нет совсем; те же структуры, которые на основании морфологических критериев можно принять за какие-то виды рибосом, локализованы, по-видимому, исключительно в области ядрышка. О юм, что в непосредственной близости от основной массы хроматина располагается сколько-нибудь заметное количество сформировавшихся рибосом, также нет никаких сведений. И если нам не приходится сомневаться, что скорость отделения РНК от хромосом зависит от многих факторов, то, насколько мне известно, мы не располагаем какими-либо данными, которые подтверждали бы существование некоего механизма, производящего это отделение избирательно.

Контроль трансляции

Каждый непредубежденный «трансляционист», так же как и я, скоро оказывается перед необходимостью объяснить, каким образом в цитоплазме происходит регуляция синтеза белка. Меня всегда смущает мысль, что, хотя сейчас вполне доказано существование цитоплазматической рефляции синтеза белка, я не могу привести достаточно серьезных экспериментальных данных о химической природе такой регуляции. Вероятно, это происходит по двум причинам. Во-первых, на разработку и проверку моделей регуляции, действующей на уровне генов, было затрачено гораздо больше усилий, чем на исследование цитоплазматической регуляции. Во-вторых, многие аспекты синтеза белка мы все еще представляем себе очень туманно и схематично. Например, почти в любом учебнике часто можно встретить рисунок, где изображены рибосомы, двигающиеся вдоль нити РНК-посредника и выполняющие, таким образом, роль «считывающего» механизма.

В некоторых клетках, особенно в тех, которые синтезируют и секретируют большие количества специализированных белков, рибосомы присоединены к мембранам хорошо развитой эндоплазматической сети, причем прикреплены настолько прочно, что их удается отделить, только применив крайние меры, как, например, растворив клеточную мембрану. Рибосомы располагаются в ряд на одной из поверхностей мембраны, иногда прилегая друг к другу вплотную, совсем как тесно пришитые пуговицы. Было показано, что синтез белка в цитоплазме таких клеток действительно происходит в основном на рибосомах, присоединенных к мембране. Но ни расположение этих рибосом на мембране, ни прочность их прикрепления к ней не дают нам оснований считать, что они скользят вдоль гипотетических линейных нитей. Более того, в бесклеточной системе, где синтез полипептидов определяется добавляемыми искусственными полинуклеотидами, та небольшая фракция полинуклеотидов, которая используется в качестве матриц, прочно связывается с рибосомами, причем связывается таким образом, что оказывается защищенной от действия рибонуклеаз, всегда находящихся в большом количестве в препаратах разрушенных клеток.

Наиболее веское подтверждение гипотезы РНК-посредника было получено при изучении бесклеточной системы. Синтетические полинуклеотиды, добавленные к препаратам рибосом, несомненно выполняют функцию матрицы при синтезе полипептидов, и поэтому здесь незачем указывать, как много мы узнали о природе генетического кода из опытов с использованием этих искусственных посредников. Однако, помоему, успехи, достигнутые при исследовании таких систем, еще не доказывают, что синтез белка в цитоплазме интактной клетки программируется матрицами, которые тем же способом прикрепляются к рибосомам. В бесклеточную систему искусственные полинуклеотиды добавляют в большом избытке, но только очень малая их часть прочно присоединяется к рибосомам и используется в качестве матриц.

Можно возразить, что добавленный полинуклеотид накладывается на обычную матричную поверхность рибосомы и что синтез полипептида происходит на нем только потому, что естественная рибосомная матрица маскируется этим искусственным полинуклеотидом. Поведение РНК-содержащих бактериофагов внутри клетки подтверждает эту идею.

Уже давно известно, что рибосомы в цитоплазме клетки часто образуют скопления разной величины, иногда приобретающие удлиненную конфигурацию. Когда появилась гипотеза посредника, было высказано предположение, что рибосомы в группах соединены нитями матричной РНК и, следовательно, являются тем основным участком, где происходит синтез белка в клетке. Мысль о том, что рибосомы в этих группах соединены друг с другом нитью мРНК, основывается главным образом на следующем наблюдении: когда препарат обрабатывали РНКазой в низких концентрациях, эти группы распадались. На некоторых электронных микрофотографиях изолированных полисом также как будто видно, что рибосомы соединены чем-то вроде нити. Поскольку биохимическими методами такую нить в цитоплазме клетки выявить не удалось, возникает вопрос, действительно ли рибосомы соединены РНК.