Контроль трансляции
Каждый непредубежденный «трансляционист», так же как и я, скоро оказывается перед необходимостью объяснить, каким образом в цитоплазме происходит регуляция синтеза белка. Меня всегда смущает мысль, что, хотя сейчас вполне доказано существование цитоплазматической рефляции синтеза белка, я не могу привести достаточно серьезных экспериментальных данных о химической природе такой регуляции. Вероятно, это происходит по двум причинам. Во-первых, на разработку и проверку моделей регуляции, действующей на уровне генов, было затрачено гораздо больше усилий, чем на исследование цитоплазматической регуляции. Во-вторых, многие аспекты синтеза белка мы все еще представляем себе очень туманно и схематично. Например, почти в любом учебнике часто можно встретить рисунок, где изображены рибосомы, двигающиеся вдоль нити РНК-посредника и выполняющие, таким образом, роль «считывающего» механизма.
В некоторых клетках, особенно в тех, которые синтезируют и секретируют большие количества специализированных белков, рибосомы присоединены к мембранам хорошо развитой эндоплазматической сети, причем прикреплены настолько прочно, что их удается отделить, только применив крайние меры, как, например, растворив клеточную мембрану. Рибосомы располагаются в ряд на одной из поверхностей мембраны, иногда прилегая друг к другу вплотную, совсем как тесно пришитые пуговицы. Было показано, что синтез белка в цитоплазме таких клеток действительно происходит в основном на рибосомах, присоединенных к мембране. Но ни расположение этих рибосом на мембране, ни прочность их прикрепления к ней не дают нам оснований считать, что они скользят вдоль гипотетических линейных нитей. Более того, в бесклеточной системе, где синтез полипептидов определяется добавляемыми искусственными полинуклеотидами, та небольшая фракция полинуклеотидов, которая используется в качестве матриц, прочно связывается с рибосомами, причем связывается таким образом, что оказывается защищенной от действия рибонуклеаз, всегда находящихся в большом количестве в препаратах разрушенных клеток.
Эти данные едва ли подтверждают представление о том, что в бесклеточной системе рибосомы скользят вдоль незащищенной вытянутой нити или (в сущности это одно и то же) что эта нить двигается вдоль ряда неподвижных рибосом.
Я говорю о подобных трудностях вовсе не для того, чтобы еще и еще раз подчеркнуть, как мало обоснованы некоторые современные воззрения, но для того, чтобы показать, как сложно предложить какую-либо конкретную модель регуляции белкового синтеза, если мы не имеем четкой пространственной картины синтеза белка. В настоящее время обсуждаются две основные модели цитоплазматической регуляции. В одной из них предполагается существование особых форм транспортной РНК, тогда как другая основана на изменении конформации частично синтезированного белка. Мысль о том, что трансляция может регулироваться особыми формами транспортных РНК, впервые, по-видимому, была высказана Эймсом и Гартманом, когда они пытались объяснить поведение мутантов Salmonella с полярной мутацией в гистидиновом локусе. У таких мутантов мутация в каком-либо из генов, составляющих тесно сцепленную группу и ответственных за синтез гистидина, характерным образом влияет на скорость синтеза ферментов, контролируемых соседними генами этого локуса: задеты бывают только те гены, которые расположены дистально (в направлении транскрипции ДНК) по отношению к мутантному локусу, причем чем дальше от мутантного находится данный ген, тем меньше синтезируется фермента, контролируемого этим геном.
Эймс и Гартман предположили, что есть особые семейства транспортных РНК («переключающие» транспортные РНК), которые, помимо выполнения своей основной роли — присоединения аминокислот, — способны ограничивать скорость трансляции матричных РНК. Думали, что «переключающие» транспортные РНК могут снимать рибосомы с нити РНК-посредника или препятствовать движению активной рибосомы вдоль нити, вытесняя тем самым все последующие рибосомы. За это время свободный дистальный конец нити может разрушиться, и вероятность его трансляции в результате оказывается сниженной.
Позже эту схему разрабатывали другие исследователи, и были предложены более конкретные модели, где «переключающие» транспортные РНК или «аналоги транспортных РНК» играют главную роль в механизме, управляющем скоростью синтеза белков. Но мне кажется, что объяснять регуляцию синтеза белка с помощью статистических понятий, в частности рассматривать вероятность снятия рибосомы с нити матричной РНК, — это значит выдвигать гипотезу, слишком уж мало связанную с имеющимися экспериментальными данными. И если эта модель, кроме того, осложняется предположением об избирательном разрушении только одного конца нити, то перед нами вновь встают те же трудности, о которых я упоминал в связи с попыткой объяснить регуляцию синтеза белка избирательным разрушением матриц.
Известно, что у грамотрицательных бактерий для репрессии биосинтеза гистидина и валина иногда необходимо образование комплексов гистидил- и валил-тРНК, но в случае фенилаланина и тирозина это, по-видимому, не так. Тщательное изучение биосинтеза аргинина показало, что комплексы аргинил-тРНК (по крайней мере, большая часть их) не участвуют в репрессии биосинтеза этой аминокислоты. Слабое место всех моделей регуляции, в которых предполагается участие особых молекул транспортных РНК, состоит prima facie в том, что для осуществления регуляции необходимо множество таких молекул. Если главный механизм регуляции основан на переключении синтезов с помощью транспортных РНК, то число «переключающих» молекул, казалось бы, должно быть примерно равно числу матриц или превышать его. Нам же неизвестно, сколько разных типов молекул транспортных РНК требуется для осуществления регуляции, если исходить даже из простейшей модели регуляции этого процесса. Стент указывал, что это возражение можно было бы обойти, если бы в самой матрице для узнавания и присоединения «переключающей» транспортной РНК вместо триплетов нуклеотидов имелись секступлеты или если бы в присоединении этой РНК участвовали одновременно два разных триплета. Всем ясно, что можно придумать множество способов обойти эту трудность, но все они слишком умозрительны и совсем лишены экспериментального подтверждения.
Меня всегда привлекала мысль, что регуляция синтеза белка должна осуществляться с помощью механизмов, которые действуют именно там, где происходит сам синтез, и что специфичность этих механизмов определяется уникальной способностью белков с высокой степенью точности узнавать другие (как большие, так и малые) молекулы. Именно поэтому наиболее приемлемыми мне кажутся схемы, основанные на способности белков к узнаванию. Самая простая из них была предложена впервые Фогелем более десяти лет назад. Согласно этой модели, регуляторные механизмы контролируют процесс отделения полипептидов от матриц, на которых они синтезируются. Легко представить себе, что скорость снятия полипептидов с матриц может регулироваться, и, действительно, это подтверждается целым рядом фактов. Однако любая обобщающая модель должна удовлетворять основному требованию, предъявляемому к таким моделям: учитывать строгую специфичность регуляции и объяснять, например, как продукты обмена углеводов подавляют синтез в-галактозидазы у Е. coli или как наличие гема регулирует синтез глобина в ретикулоцитах.
Требование специфичности в данном случае означает, что молекула, осуществляющая регуляцию, и полипептид, скорость синтеза которого она регулирует, должны узнавать друг друга еще тогда, когда полипептид тем или иным способом прекреплен к матрице. Если для отделения какой-то части полипептида от матрицы необходимо, чтобы синтезировалась вся молекула целиком, то остается непонятным, каким образом может происходить такое взаимное узнавание: ведь стерическая специфичность белковых молекул непосредственно связана с их пространственной конфигурацией. Поэтому следует рассмотреть другую возможность: полипептид отделяется от матрицы по мере того, как идет его синтез, и освободившаяся часть приобретает характерную пространственную конфигурацию еще до того, как будет готова вся полипептидная цепь. Таким образом полипептид, еще не полностью отделившись от матрицы, может принять форму, способную узнавать другие молекулы. Можно предположить далее, что при взаимодействии частично синтезированной полипептидной цепи с узнающей ее молекулой прекращается дальнейшее свертывание полипептида и отделение его от матрицы.
Исследования третичной структуры лизоцима, проведенные сравнительно недавно, подтвердили правомерность такой модели. Структура этого фермента дает нам достаточно веские основания считать, что свертывание полипептидной цепи действительно происходит по мере ее синтеза и что конфигурация освободившейся начальной части молекулы может определять ход дальнейшего свертывания всей остальной молекулы. Кроме того, ингибитор, присоединяясь к ферменту, вызывает изменение формы его молекулы, поэтому весьма вероятно, что ингибитор специфически связывается с частично синтезированным белком и этим препятствует его дальнейшему отделению от матрицы.
Итак, можно представить, что синтез белка регулируется соотношением числа свободных и связанных молекул ингибитора: когда в клетке возрастает концентрация молекул ингибитора, растет частота их связывания с не полностью синтезированными молекулами белка, в результате чего синтез белка подавляется, когда же концентрация ингибитора уменьшается, синтез восстанавливается. Это не просто предположение. Имеется множество данных, свидетельствующих о том, что молекулы белка участвуют в регуляции собственного синтеза. Так, описаны случаи, когда мутация, затрагивающая область фермента, ответственную за регуляцию конечным продуктом, одновременно влияет на репрессибельность синтеза этого же фермента
. Известно также, что некоторые мутации структурного гена нарушают не только каталитическую активность фермента, но и его индуцибельность или репрессибельность. Эти наблюдения трудно объяснить, исходя только из того, что агент, ответственный за репрессию синтеза, каким-то образом взаимодействует с самим синтезируемым ферментом. Модели, основанные на подобном взаимодействии еще недостроенной полипептидной цепи, допускают возможность как непосредственной регуляции малыми молекулами, так и опосредованной — с участием других белков. Тогда регуляция синтеза какого-нибудь фермента могла бы осуществляться либо посредством прямого взаимодействия этого фермента с субстратом или конечным продуктом, либо посредством его взаимодействия с каким-то другим белком, способным узнать частично синтезированный фермент, а значит, и присоединяться к нему.
Однако при сравнительном изучении индукции многих ферментов у самых разных организмов оказалось, что продолжительность лаг-периода, предшествующего индуцированному синтезу, очень варьирует. Поэтому следует постулировать существование механизмов, позволяющих метаболиту регулировать синтез соответствующего фермента, не только непосредственно соединяясь с частично синтезированным белком, но и каким-то другим косвенным путем. Так, лаг-период при индукции синтеза в-галактозидазы у Е. coli составляет 2—3 мин, при индукции ацетилорнитинтрансаминазы — примерно 8 мин, а при индукции пенициллиназы В. cereus — 10—15 мин. У животных клеток лаг-период обычно измеряется часами. И если в одних случаях можно предположить, что по крайней мере часть этого периода составляет время, необходимое для установления соответствующей концентрации метаболита внутри клетки, то в других случаях такое объяснение не годится.
Взаимодействие между метаболитом и узнающим его белком должно происходить фактически без задержки, а, следовательно, там, где, несмотря на соответствующую концентрацию метаболита, все же имеется лаг-период, синтез белка, очевидно, контролируется более сложной цепью событий.
Контроль транскрипции
Перейдем теперь к обсуждению генетической регуляции в собственном смысле этого слова, т. е. регуляции первичной активности генов — синтезу РНК на ДНК. В принципе транскрипция ДНК может регулироваться двумя способами: изменением скорости считывания какого-либо одного гена или же изменением числа активных генов. Не исключено, конечно, что меньшая скорость транскрипции одних генов по сравнению со скоростью транскрипции других зависит от их внутренней структуры. Если бы это было так, то вся регуляция сводилась бы к различиям в скорости транскрипции, обусловленным особенностями внутренней структуры генов. Такая точка зрения до сих пор ничем не подтверждена. Однако несомненно, что регуляция активности генов может осуществляться с помощью двух других вышеупомянутых механизмов, т. е. путем изменения количества транскрибируемой ДНК и общей скорости считывания.
Общая скорость транскрипции, как и всякий синтетический процесс, зависит от энергетического баланса клетки, наличия необходимых предшественников и концентрации участвующих в этом синтезе ферментов. Известно, что изменения во внешней среде, причем зачастую самые незначительные, могут вызывать очень резкие сдвиги в скорости синтеза РНК. Но изучение такой формы регуляции дает нам слишком мало для понимания механизма действия генов. По существу в центре внимания должны быть механизмы, от которых зависит специфичность регуляции генов, т. е. механизмы, определяющие, с каких генов будет происходить считывание и с каких нет.
Ранее уже обсуждались опыты, проведенные на бактериях; результаты этих опытов показали, что присоединение специфичных репрессоров может выключать отдельные гены или небольшие группы генов. Недавно был предложен другой механизм, контролирующий транскрипцию, который основан на взаимодействии ДНК с РНК-полимеразой — ферментом, ответственным за транскрипцию. Несомненно, должны существовать какие-то механизмы, с помощью которых считывание начинается с самого начала гена и прекращается на его конце, иначе большинство молекул матричных РНК оказались бы незавершенными или частично перекрывающимися.
В настоящее время мы располагаем достаточно убедительными данными о том, что на самом деле такого хаоса не наблюдается благодаря наличию в начале каждого гена (или последовательности генов) специфичного участка, который РНК-полимераза может распознавать как точку инициации транскрипции (например, область р для лак-тозных генов Е. coli). Соответственно на другом конце гена (или группы генов) имеются, по-видимому, участки, распознаваемые ферментом как точки, в которых синтез должен прекратиться. Некоторое представление о том, каким образом происходит такое распознавание, недавно было получено при изучении РНК-полимеразы Е. coli. Этот фермент состоит, повидимому, из двух частей, одна — так называемый основной фермент (core enzyme) — представляет собой собственно РНК-полимеразу, обладающую, однако, низкой специфичностью к субстрату, тогда как другая — так называемый сигма-фактор, — вероятно, ответствен за узнавание точек инициации транскрипции. Например, в отсутствие сигма-фактора РНК-полимераза Е. coli может начинать транскрипцию ДНК бактериофага Т4 с любой точки, но если добавить этот фактор, то считываются только те гены, которые обычно проявляются in vivo в первую минуту после начала транскрипции.
Когда РНК-полимераза Е. coli транскрибирует ДНК бактериофага fd в отсутствие сигма-фактора, то образующиеся нити РНК начинаются с таких нуклеотидов, которых обычно не бывает в начале молекул, синтезированных in vivo; однако после введения сигма-фактора синтез таких аномальных нитей резко уменьшается. Итак, ясно, что сигма-фактор в какой-то степени обеспечивает специфичность РНК-полимеразы, но трудно поверить, что системы распознавания, заложенные в структуре РНК-полимеразы, могут быть единственным механизмом, обеспечивающим избирательную транскрипцию отдельных генов или небольших групп генов. Это потребовало бы не только существования целого набора сигма-факторов, число которых должно было бы соответствовать числу транскрибирующихся единиц, но и существования специальных механизмов, контролирующих синтез самих сигма-факторов, а также наличия кофакторов, регулирующих присоединение этих сигма-факторов к распознаваемым генам. Таким образом, мы просто-напросто приходим к другой версии модели генетического оператора, где в качестве регулирующих единиц выступают сигма-факторы РНК-полимераз. Трудности объяснения регуляции синтеза белка на основе механизмов, действующих только на уровне ДНК, не снимаются, если ввести в модель, помимо репрессоров, еще и сигма-факторы, сложность же такой модели непомерно возрастает.
Имеются ли какие-нибудь доказательства, позволяющие применить модель генетического оператора к клеткам высших организмов? Существуют ли хоть какие-то указания на то, что в этих клетках транскрипция отдельных генов или небольших групп генов может избирательно подавляться? Вот список всех известных мне случаев, где имеются прямые доказательства избирательного подавления синтеза РНК у эукариотов:
1) Инактивация всего отцовского набора хромосом у червеца Pseudococcus obscurus.
2) Инактивация одной из половых хромосом у некоторых видов позвоночных.
3) Инактивация конденсированных участков хроматина в интерфазных ядрах некоторых дифференцированных соматических клеток животных.
4) Инактивация дисков или сегментов гигантских политенных хромосом в клетках желез некоторых насекомых.
Я не буду обсуждать здесь вопрос о регуляции генетической активности гетерохроматиновых хромосом или гетерохроматиновых участков, выявляемых в хромосомах на препаратах метафазных пластинок. Сейчас уже ясно, что во многих этих гетерохроматиновых участках находятся гены, активность которых выявляется фенотипически. Но в огромном большинстве случаев мы не знаем, идет ли синтез РНК в гетерохроматиновых участках в течение всей интерфазы, как это, вероятно, происходит в гетерохроматиновых участках, ответственных за образование ядрышек, или РНК синтезируется в определенное строго установленное время, или, наконец, эти участки, как и гетерохроматиновые Х-хромосомы, чрезвычайно мало активны. Таким образом, мне придется ограничить обсуждение четырьмя случаями, где действительно есть прямые доказательства общего или частичного подавления синтеза РНК. Следовательно, выводы, которые я могу сделать, основываются на очень небольшом экспериментальном материале.
Инактивация отцовского набора хромосом у червеца, так же как и инактивация одной из Х-хромосом у некоторых позвоночных, — это, мне кажется, частный случай более широко распространенного явления — полной элиминации пекоторых или всех хромосом одного из родительских наборов. Например, у самцов грибного комарика Sciara элиминируются все отцовские хромосомы и функционирует лишь один материнский набор. У других родственных видов самцы развиваются из неоплодотворенных яиц и содержат поэтому только материнские хромосомы. Вполне вероятно, что инактивация отцовского набора у червеца — это просто другой способ достижения той же цели, и возможно, что инактивация возникла в эволюции как альтернатива элиминации. Этот вывод, очевидно, применим и к инактивации одной из Х-хромосом у самок некоторых позвоночных. У некоторых видов насекомых одна из половых хромосом обычно элиминируется на ранних стадиях развития; то же самое наблюдается у некоторых высших млекопитающих и сумчатых, у которых самки имеют всего одну Х-хромосому. И здесь инактивация (но сохранение) одной из Х-хромосом в эволюционном аспекте, вероятно, равнозначна полному ее удалению.
Эти два случая избирательного подавления синтеза РНК не имеют, я думаю, ничего общего с теми явлениями цитоплазматической регуляции, которые я обсуждал в предыдущих главах. Инактивация этих хромосом, как правило, постоянная и фактически полная; за редкими исключениями, она происходит во всех тканях организма и затрагивает только одну из двух гомологичных хромосом или один из хромосомных наборов. Эта форма инактивации хромосом играет, по-видимому, большую роль в эволюции и онтогенезе, но трудно представить себе, каким образом с помощью инактивации может контролироваться скорость синтеза отдельных цитоплазматических белков.
Несмотря на то, что прямые измерения были проведены только для очень небольшого числа типов клеток, вполне вероятно, что и в других конденсированных гетерохроматиновых или гетеропикнотических участках интерфазных ядер синтезируется гораздо меньше РНК, чем в эухроматине. В некоторых высокодифференцированных клетках в процессе дифференцировки значительно уменьшается объем ядра, что сопровождается уплотнением большей части хроматина. В таких участках конденсированного хроматина синтез РНК подавляется, а иногда синтез РНК может полностью прекратиться во всем ядре. Этот процесс наиболее четко проявляется в дифференцирующихся эритроцитах некоторых позвоночных, где постепенная конденсация хроматина сопровождается уменьшением синтеза РНК, по мере того, как клетка приобретает специальные морфологические признаки.
Такой тип ядерной дифференцировки — это, по-видимому, один из способов погружения клетки в своего рода «спячку», когда клетка утрачивает многие виды активности и даже способность к размножению. В тех случаях, когда такое состояние обратимо (например, у малых лимфоцитов или фибробластов позвоночных), при возобновлении высокой метаболической активности ядро вновь увеличивается и конденсированный хроматин диспергируется. И здесь инактивация ядра, если рассматривать этот процесс в эволюционном аспекте, очевидно, соответствует его элиминации: у млекопитающих в ходе дифференцировки ядро эритроцита элиминируется полностью, тогда как у амфибий, рептилий, птиц и некоторых других классов животных ядра в эритроцитах сохраняются, но, по-видимому, полностью инактивируются.
В ядрах активных клеток могут иногда содержаться небольшие участки конденсированного хроматина (хромо-центры) в дополнение к тому, который образуется при конденсации одной из Х-хромосом. Быть может, такой хроматин и представляет собой гетерохроматиновые участки, выявляемые в метафазных хромосомах, но пока это не доказано. Не удивительно, если окажется, что в хромоцентрах синтезируется очень мало РНК или она не синтезируется вовсе. Однако, насколько мне известно, такие опыты еще не проведены. Хромоцентры могут сохраняться в течение всей жизни клетки или же возникать только на определенных стадиях клеточного цикла; кроме того, они содержатся не во всех клетках одной и той же ткани или органа. Для образования даже самых мелких хромоцентров должно инактивироваться огромное число генов. Пока у нас еще нет точных данных о том, к каким фенотипическим последствиям приводит такая частичная инактивация больших участков генетического материала. Суть вопроса заключается в том, является ли подавление синтеза РНК, вызываемое этим механизмом, одним из способов достижения клетками дифференцированного состояния, или же это подавление активности генов само является следствием специализации. В следующей главе я приведу доводы в пользу второго предположения. Здесь же достаточно сказать, что эта форма генетической инактивации, хотя и возможна для отдельных участков хроматина, значительно меньших, чем целая хромосома, все же еще не достаточно тонка, чтобы служить основой механизма регуляции синтеза специфических белков в цитоплазме.
Пуффы в политенных хромосомах
Мы подошли теперь к тому единственному случаю, который, по крайней мере на первый взгляд, как будто бы служит морфологическим подтверждением модели генетического оператора регуляции синтеза белка, — речь пойдет о гигантских политенных хромосомах некоторых насекомых. Такие хромосомы обнаружены у личинок многих видов двукрылых в клетках некоторых тканей, особенно в производных кишечника. Наиболее тщательно изучены слюнные железы, хромосомы которых необычны в двух отношениях. Во-первых, они высокополитенны. Каждая хромосома содержит тысячи копий исходной диплоидной генетической структуры. Степень политении может варьировать у разных видов. Например, оказалось, что у Chironomus tentans каждая хромосома содержит в 16 000 раз больше ДНК, чем хромосомы нормальных диплоидных клеток. Этим объясняется гигантский размер политенных хромосом, а также то, что в них можно обнаружить такие морфологические особенности (резко увеличенные благодаря политении), какие не выявляются в обычном диплоидном наборе. По-видимому, далеко не все гены исходного диплоидного набора реплицируются в одинаковой степени; очевидно, в процессе политенизации не участвуют гетерохроматиновые области, и поэтому в гигантских хромосомах они представлены минимально. Второе необычное свойство политенных хромосом состоит в том, что в течение большей части жизненного цикла клетки они сохраняют вид дискретных уплотненных образований. Поэтому физиологическое состояние гигантских хромосом напоминает затянувшуюся и, поскольку клетка не делится, абортивную профазу. Трудно сказать, насколько результаты изучения физиологии этих необычных хромосом можно экстраполировать на нормальные, диплоидные клетки. Но если экстраполяция возможна, то есть основания проводить параллель между этими клетками и обычными диплоидными клетками в той стадии профазы митоза, когда хромосомы уже сконденсированы в дискретные единицы, но тем не менее синтезируют некоторое количество РНК.
Большая часть генетического материала гигантских хромосом неактивна. Во всем хромосомном наборе у Drosophila имеется примерно 2000 дисков, а у Chironomus, по-видимому, примерно 5000 дисков, но всего лишь приблизительно в 300 из них удалось наблюдать синтез РНК или образование «пуффов» — характерных изменений морфологии дисков, возникающих при их активации. Максимальное число дисков, активных одновременно, и того меньше: никогда не наблюдали, чтобы синтез РНК в какой-то момент происходил более чем в 200 дисках. Определение содержания ДНК в отдельных дисках показало, что диск средних размеров возникает при политенизации первичной единицы, содержащей такое количество ДНК, которого достаточно примерно для 100 генов, а во многих дисках находится значительно больше ДНК. Таким образом, даже в этих хромосомах мы имеем дело с активацией и инактивацией сравнительно крупных единиц генетического материала. Активация их происходит в результате политении. Синтез РНК в каждом отдельном диске зависит от возникновения пуффа, в котором открываются и становятся доступными для считывания многочисленные политенные копии основной генетической единицы. Активность каждой генетической единицы определяется числом политенных копий, доступных для считывания.
Трудно себе представить, как такой регуляторный механизм, целиком зависящий от степени политении хромосомы, может функционировать в неполитенных хромосомах. Если в нормальных диплоидных клетках цепи двойной спирали ДНК расходятся в процессе транскрипции, то процесс транскрипции можно уподобить образованию пуффов; но у нас нет доказательств, что обе цепи ДНК действительно расходятся во время транскрипции, и уж во всяком случае в отличие от образования пуффов такой процесс не может обеспечить регуляцию синтеза РНК в отдельных локусах.
Считалось, что характер распределения пуффов специфичен для каждого органа, однако имеющиеся доказательства кажутся недостаточно убедительными. Более того, выяснилось, что характер распределения пуффов в хромосомах может быть различен не только в разных тканях, но и в клетках одной и той же ткани у одной и той же особи и что он зависит от физиологического состояния животного или от стадии развития личинки. Когда приняли во внимание физиологически обусловленные изменения в расположении пуффов, то оказалось, что тканеспецифичных пуффов, т. е. таких, которые имеются в клетках только одной ткани, очень мало, а возможно, их и вообще нет.
В некоторых локусах пуффы обнаруживаются на многих стадиях развития личинки, тогда как в других они возникают только на определенных стадиях. В слюнных железах наибольшее количество пуффов наблюдается непосредственно перед линькой, особенно перед выходом мухи из кокона, когда происходит метаморфоз и слюнные железы рассасываются. Распределение пуффов, характерное для этой стадии, сохраняется даже тогда, когда начинается аутолиз клеток слюнных желез.
Фенотипические проявления таких различий в распределении пуффов еще далеко не ясны, но кажется маловероятным, что образование пуффов может немедленно определять синтез каких-либо цитоплазматических белков. Участок хромосомы, в котором образуется пуфф, слишком велик не только для того, чтобы контролировать синтез одного-единств енного белка, но и для того, чтобы координированно регулировать синтез функционально связанной группы ферментов; исключение составляют двукрылые, у которых размер таких групп на порядок или более превышает размер групп у бактерий. Как я уже отмечал, только 200— 300 дисков образуют пуффы, причем во многих из них пуффы сохраняются более или менее постоянно. Имеются данные, что в слюнных железах некоторые пуффы определяют синтез секреторных белков, хотя, вероятно, многие белки, выделяемые слюнными железами, не синтезируются в них, а только поглощаются клетками из гемолимфы. Некоторые пуффы из гигантских клеток, находящихся в лапках мухи, по-видимому, определяют синтез и созревание кутикулы.
Высокая активность пуффов в период линьки позволяет предположить, что в некоторых из них синтезируется матричная РНК для ферментов, находящихся в составе лизо-сом, которые разрушают железу в процессе метаморфоза; возможно также, что пуффы участвуют в образовании веществ, необходимых уже после метаморфоза. В самом деле, почему бы некоторым РНК, синтезированным на пуффах, не нести информацию для специфичных белков; но едва ли можно согласиться с предположением, будто бы появление и исчезновение пуффов определяют начало и конец синтеза какого-то конкретного белка (как это следует из модели генетического оператора). Даже когда в слюнных железах Chironomus tentans синтез РНК ингибировали в течение 48 ч с помощью актиномицина D, образование белков слюнных желез продолжалось с обычной скоростью, а в клетках Chironomus pollidiuittatus попрежнему синтезировался материал специфичных гранул, связанных с секрецией слюны. Образование альбумина в слюнных железах также нечувствительно к ингибированию синтеза РНК актиномицином. Таким образом, картина регуляции синтеза белка в клетках этих желез, несмотря на образование в них пуффов, соответствует в основном той общей картине, которую мы уже наблюдали при исследовании ацетабулярии и других высших клеток.
Механизмы, управляющие транскрипцией
Теперь нам необходимо рассмотреть механизмы, с помощью которых происходит подавление синтеза РНК в хромосомах клеток эукариотов. Модель генетического оператора постулирует очень высокую точность регуляторных механизмов, действующих на уровне генов: они должны «включать» или «выключать» единичные гены или небольшие группы генов. При таком типе регуляции сигналы, приходящие к генам из цитоплазмы, должны обладать соответствующей степенью специфичности, т. е. отличать один ген от другого. Жакоб и Моно предполагали, что в цитоплазме имеется большой набор специфичных молекул (репрессоров), которые могут узнавать соответствующие гены и, присоединяясь к этим генам, ингибировать их транскрипцию.
При координированной регуляции группы тесно сцепленных генов молекула репрессора подавляет транскрипцию всей этой группы генов. Но всегда, когда мы встречаемся со случаями локализованного подавления транскрипции больших участков генома у высших организмов, механизм этого подавления, по-видимому, обусловлен другими причинами. Например, когда происходит инактивация гаплоидного набора хромосом или одной из половых хромосом, очевидно, что цитоплазматические сигналы (если они в этом участвуют) не способны отличить один локус от другого и должны действовать на совершенно ином уровне. В первом случае им необходимо просто отличать весь отцовский хромосомный набор от всего материнского, причем инактивация отцовского набора не может определяться кумулятивным действием широкого круга специфичных генных репрессоров, так как основная часть генетического материала в отцовском и материнском наборах одинакова.
При инактивации половой хромосомы предполагаемые цитоплазматические сигналы даже не отличают отцовскую Х-хромосому от материнской. За исключением нескольких особых случаев, инактивация материнской или отцовской Х-хромосомы не подчиняется какой-либо закономерности; когда же этих хромосом больше двух, инактивируются все Х-хромосомы, кроме одной. Контролирующий механизм, очевидно, действует таким образом, чтобы обеспечить сохранение только одной активной Х-хромосомы, а не выбирает тот или другой ген.
И в самом деле, транслокации, локализованные в Х-хромосоме, с очевидностью доказывают, что при инактивации хромосомы отдельные гены не распознаются. Когда фрагмент обычно инактивированной Х-хромосомы переносят в активную область аутосомы, этот фрагмент не инактивируется; когда же в неактивную Х-хромосому переносят фрагмент обычно активной аутосомы, то этот фрагмент инактивируется. Ясно, что для механизма инактивации важно не то, какие это гены, а то, где они находятся.
У позвоночных в процессе окончательной дифференцировки определенных типов специализированных клеток происходит конденсация и, вероятно, инактивация больших участков хроматина, что скорее всего связано с постепенным уменьшением размеров ядра. Появление в клетках, не достигших окончательной дифференцировки, небольших хромоцентров, очевидно, также связано с изменением объема ядра. И в этих случаях, вероятнее всего, имеются какие-то цитоплазматические сигналы, которые способны инактивировать очень большие участки хроматина, но не отдельные гены или группы тесно сцепленных генов.
Некоторые сведения о природе механизмов, обеспечивающих избирательную конденсацию отдельных участков хроматина, недавно получили Крегер и др. Эти исследователи показали, что расположение пуффов в политенных хромосомах двукрылых не зависит от потока специфичных сигналов, приходящих из цитоплазмы. Если с помощью микрургических процедур удалить из клетки фактически всю цитоплазму, то оставшиеся в ядре хромосомы сохранят способность образовывать пуффы, локализованные в соответствующих местах. Замещение большей части цитоплазмы в клетке одного типа цитоплазмой клетки другого типа, обладающей иным характером распределения пуффов, также не сказывается на картине распределения пуффов в клетке-реципиенте. Когда микрургическим путем удаляют большую часть хромосомы, распределение пуффов в оставшемся фрагменте почти не изменяется. Эти опыты показывают, что расположение пуффов не зависит не только от специфичных репрессоров, поступающих из цитоплазмы, но также и от каких-либо иных сигналов, передающихся из одной части ядра в другую.
По-видимому, на политенные хромосомы оказывает влияние движение воды и электролитов через ядерную мембрану, и характер расположения пуффов, по крайней мере отчасти, определяется неодинаковой чувствитель ностью разных участков хромосомы к изменениям осмотического давления и концентрации некоторых катионов.
Более того, Левенштейн и Канно показали, что ядерная мембрана клеток слюнных желез, хотя и содержит «поры», но тем не менее представляет собой барьер, препятствующий свободному передвижению ионов. Отсюда можно сделать вывод, поддерживающий представление о том, что картина распределения пуффов в политенных хромосомах есть результат взаимодействия этих хромосом с ионами, определяющими конденсированно или диспергированное состояние хроматина в каждом конкретном локусе. С этой точки зрения специфичность распределения пуффов зависит не от специфичности сигналов, поступающих в хромосому, а от особенностей структуры самой хромосомы, разные локусы которой по-разному реагируют на изменения концентрации электролитов в окружающей среде.
Хотя до сих пор прямой экспериментальный подход к этой проблеме в силу чисто технических причин ограничен исследованиями крупных клеток двукрылых, Зиберту и др. недавно удалось показать, что концентрация электролитов в ядрах соматических клеток позвоночных очень сильно отличается от концентрации их в цитоплазме. А Рингерц и Боланд обнаружили, что первоначальные цитохимические изменения хроматина в ядре эритроцита, возникающие при возобновлении его активности в гетерокарионе, можно воспроизвести в изолированных ядрах эритроцитов, если удалить из среды двухвалентные катионы.
Поэтому мне кажется вполне вероятным, что избирательная конденсация хроматина, наблюдающаяся в интерфазных ядрах большинства клеток, может оказаться следствием неодинаковой чувствительности разных участков хроматина к изменениям концентрации электролитов во внешней среде.
Все это мало напоминает схемы, основанные на высокой специфичности узнавания, которые предусматриваются моделью генетического оператора, и в сущности свидетельствует против широкого применения таких схем по отношению к клеткам высших организмов. Ведь если основная масса генетического материала репрессируется механизмами, обладающими слабой специфичностью, то сфера действия высокоспецифичных механизмов должна быть очень ограниченной. Рассматривая любую возможную аналогию между формами генетической регуляции, которые могут наблюдаться в клетках высших организмов, и любыми сходными процессами, имеющимися у бактерий, следует принять во внимание один важный факт. Если избирательная конденсация хроматина в высших клетках действительно зависит от изменения концентраций электролитов в ядре, то трудно понять, каким образом подобный тип регуляции может осуществляться у бактерий, у которых в отличие от высших форм нет ядерной мембраны и ДНК не связана со структурным белком. Поэтому, мне кажется, нет достаточных оснований считать, что у бактерий имеется какой-то механизм регуляции, подобный тому, который я только что рассмотрел, говоря о высших клетках.
Используемая литература: Г. Харрис
Перевод с английского: М. И. Маршак
Ядро и цитоплазма: под ред. и с предисловием д-ра биол. наук Н. И. Шапиро
Москва 1973 год.
Скачать реферат:
Пароль на архив: privetstudent.com